Name: Feinabstimmung der Größe und Minimierung der Lärm von Solid-State-Nanoporen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-31T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Festkörper-Nanoporen für biomolekulare Sensorexperimente präparieren, indem Sie deren Größe präzise steuern und elektrisches Rauschen minimieren. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Einzelmolekül-Detektion.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken für die Unterstützung durch die Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Canada Foundation for Innovation, und dem Ontario Research Fund. Wir danken Y. Liu für Hilfe in Nanoporen-Herstellung und Charakterisierung, L. Andrzejewski für wertvolle Diskussionen und technische Unterstützung, und A. Marziali für die Hilfe bei Nanoporen-Software und Mess-Design.

1. Nanopore Herstellung und Reinigung Anmerkung: Wenn eine Nanopore in einer isolierenden Membran vorhanden ist, kann es direkt in der Flüssigzelle ohne weitere Aufarbeitung oder Reinigung montiert werden, wie in Schritt 2 beschrieben. Oder durch die Einwirkung von Sauerstoff-Plasma 2: Wenn es jedoch notwendig ist, um Spuren von Verunreinigungen zwischen den Experimenten zu entfernen, Nanopore Chips können entweder 3,15,16 Piranha-Lösung (H 2 O 2 3.01 H 2 SO 4) gereinigt werden. Als solche werden die Schritte 1,2 bis 1,9 in dem folgenden Protokoll sind optional, wenn eine Vorreinigung durch Belichtung mit Piranha-Lösung ist nicht notwendig. <ol><li> Entgasen filtriert deionisiertem (DI) Wasser, indem unter Vakuum in ein Ultraschallbad für 30 min bei 40 ° C. </li><li> Vorbereitung Piranha-Lösung in einem 10 ml-Becherglas durch vorsichtige Zugabe von 3 ml Schwefelsäure, gefolgt von 1 ml Wasserstoffperoxid. Mischen Sie gründlich unter Rückfluß in der Pipette. ACHTUNG: Piranha-Lösung ist extrem gefährlich. Bitte ta<html> ke alle Vorkehrungen. </li><li> Mit säurebeständige Pinzette vorsichtig Kanten zuerst in die Piranha-Lösung legen Sie die Nanoporen-haltigen Membranchip vollständig versenken den Chip und vermeiden Sie es auf der Oberfläche schwimmen. </li><li> Pinzette gründlich spülen in gefiltertes Wasser. </li><li> Becherglas auf einer Heizplatte voreingestellt auf 90 ° C und lassen Sie es für mindestens 30 Minuten zu reinigen. </li><li> Die Piranha-Lösung vorsichtig aus dem Becherglas mit einem sauberen Glaspipette und entsorgen in reichlich Wasser. </li><li> Mit einem sauberen Glaspipette 5 ml des entgasten entsalztem Wasser aus Schritt 1.1 in den Becher zu spülen. Entfernen Sie den Wasser und wiederholen Sie mindestens 5x. </li><li> Die Nanopore Chip vorsichtig aus dem Becherglas mit sauberen scharfen Spitze Pinzette. Mit äußerster Sorgfalt wie die Nanoporenmembran ist sehr zerbrechlich. </li><li> Trocknen Sie den Chip vorsichtig eine Saugwirkung zu deren Rand unter Verwendung eines Gebläses. Lagern Sie den Chip in einem sauberen Petrischale bis zur Verwendung. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. Montage der Nanopore <ol><li> Reinigen des Teflon Nanopore Zelle (Fig. 1), indem sie in 20%-iger Salpetersäure-Lösung und Kochen für 10 Minuten. VORSICHT: Verwenden Sie alle notwendigen persönlichen Schutzausrüstung und Griff Säuren mit Sorgfalt. </li><li> Die Zelle vorsichtig aus Salpetersäure und in koch DI-Wasser für 10 min. </li><li> Man kocht die Zelle in DI-Wasser für weitere 10 Minuten, um eine vollständige Entfernung der Salpetersäure zu gewährleisten. Das Becherglas von der Heizplatte und lassen es auf Raumtemperatur abkühlen. </li><li> Entfernen Sie die Zelle aus dem Becher und trocken blasen mit gefilterter Luft oder N 2. Bewahren Sie die Zelle in einer sauberen Petrischale. </li><li> Entgasen filtriert KCl-Lösung (mit HEPES bei pH 8 gepuffert), indem unter Vakuum in ein Ultraschallbad für 30 min bei 40 ° C. </li><li> Rein zwei Silikonelastomer-Dichtungen für jede Nanopore Chip im Ultraschallbad in Ethanol für mindestens 10 min. </li><li> Legen Sie die Nanopore Chip auf einem sauberen Elastomerdichtung Befinden careful die Membranfenster mit der Dichtungsöffnung auszurichten. Zeigen und richten Sie eine zweite Dichtung oben auf dem Chip. </li><li> Platzieren des Chips und die Dichtungen auf der Behälter-Einlaß von einer Hälfte der Zelle gereinigt Nanopore. Montieren Sie die Zelle durch Einschrauben die andere Hälfte an Ort und Stelle. Eine Explosionsansicht der Nanopore Zellkomponenten ist in Fig. 1 gezeigt. </li><li> Befeuchten Sie die Nanoporen-Chip durch Pipettieren von Ethanol in der Zellreservoirs und Platzierung in einer Vakuumkammer, bis ein paar Blasen gesehen werden, um die Eingänge zu verlassen. </li><li> Entfernen von Ethanol durch Spülen der Vorratsbehälter mit mindestens 3 ml KCl-Lösung filtriert, entgast. Achten Sie darauf, um den Überlauf unter Verwendung eines Gebläses entfernen. </li></ol> 3. Nanopore Charakterisierung <ol><li> Legen Sie die Zelle in der Nanoporen elektrisch abgeschirmt Versuchsaufbau und legen Ag / AgCl-Elektroden in jedem Reservoir. Diese Einrichtung ist ähnlich der in Fig. 2 mit Ausnahme der externen Stromversorgung und der Stromverstärker, die dargestellt sindmit einer geräuscharmen Widerstandsrückkopplungsverstärker ersetzt. </li><li> Mit dem rauscharmen Verstärker in Voltage-Clamp-Modus gelten Potentiale Kehren von -200 mV bis 200 mV und notieren Sie die IV-Kennlinien. </li><li> Setzen Sie die IV-Kurve zu nanopore Leitfähigkeit, die verwendet werden kann, um seinen Durchmesser in Lösung 17 berechnen zu erhalten. Wenn die berechnete Durchmesser viel kleiner als von TEM erwartet, ist die Poren wahrscheinlich nicht vollständig benetzt und / oder Schmutz oder Verunreinigungen enthält. </li><li> Tragen Sie eine 200 mV Potential über die Nanoporen und Aufzeichnung der Ionenstrom für 30 Sekunden. </li><li> Durchführen einer spektralen Leistungsdichte (PSD) Analyse der Ionenstrom zu integrieren und um die elektrischen Rauscheigenschaften der Nanopore zu quantifizieren. Wenn das Rauschen oberhalb von 15 pA RMS bei 5 kHz-Bandbreite ist, dann ist die Poren wahrscheinlich nicht vollständig benetzt und / oder Verunreinigungen enthält, und können nicht zuverlässig in Experiment verwendet werden. </li></ol> 4. Anlage Nanoporen Mit High Elektro Fields Hinweis: Wenn die IV-Kurve ausgestellten Asymmetrie erzeugt oder weniger als erwartet Leitfähigkeit oder die aktuelle Spur zeigte Instabilität und hohe Geräuschpegel bei niedrigen Frequenzen ist es notwendig, die Nanoporen mit hohen elektrischen Feldern zu konditionieren, um Verunreinigungen zu entfernen, von der Poren Oberfläche und / oder Benetzung der Pore. Während dieses Verfahren keinen Einfluss auf die Hochfrequenzrauschen von der Membrankapazität oder eine parasitäre Kapazität mit dem Eingang des Stromverstärkers gekoppelt Messungen verursacht werden, Niederfrequenzrauschen (auch als 1 / f Rauschen) 18 stark reduziert werden. Eine schematische Darstellung der Einrichtung verwendet werden, um diese Konditionierung durchzuführen, ist in Fig. 2 gezeigt. <ol><li> Trennen Sie die Elektroden von der Patch-Clamp-Verstärker. </li><li> Schließen Sie eine der Elektroden mit einem Computer-gesteuerte Stromversorgung in der Lage ist&gt; 6 V (&gt; 0,2 V / nm elektrischen Feldstärke für die 30 nm dicke Membranen verwendet) und die andere an einen EXternal Stromverstärker, die in Echtzeit überwacht werden können. Hinweis: Die Anwendung von hohen elektrischen Feldern verwendet werden, um Nanoporen in verschiedenen Membranmaterialien und-dicken zu konditionieren. Während die beiden 30-nm-und 10-nm-Membranen hier diskutiert werden, beschrieben Spannungen beziehen sich auf die 30-nm dicke Membranen verwendet, wenn nicht anders angegeben. </li><li> Anwenden einer Potentialdifferenz von 400 mV (Messspannung) über die Nanopore für mindestens 5 Sekunden. </li><li> Berechnen der Durchschnittsstromwert von der letzten 1 s von Daten, um die Leitfähigkeit der Nanopore zu bestimmen. Berechnen des Durchmessers der Nanopore auf der Grundlage dieser Leitfähigkeit, die automatisch über die Software und die Nanopore Leitwert Modell der Wahl auf Basis der wahrscheinlichsten Geometrie durchgeführt werden sollte. Es sollte dem Durchmesser der IV-Kurve gemessen entsprechen. </li><li> Anwenden eines 200 ms-Impuls von 6 V (Netzspannung) über die Nanopore um ein elektrisches Feld von 0,2 V / nm, gefolgt von einer 5 sec Messdauer zu erzeugenbei 400 mV. Wiederum berechnen einen Durchmesser der Nanopore mit der Abschluss 1 sec von Daten und Vergleichen mit dem Wert aus TEM-Messungen erwartet, dass die Nanoporen vollständig naß. Wenn nötig, mehrmals wiederholen. </li><li> Falls erforderlich, wiederholen Sie die Anwendung hoher elektrischer Feldpulse mit steigender Spannung, bis die aktuelle Signal während der Messperiode ist stabil und zeigt die erwartete Leitfähigkeit. Es wird nicht empfohlen, 10 V (dh&gt; 0,3 V / nm) überschreiten, da dies wesentlich vergrößern oder Nanoporen schnell beschädigen. </li></ol> 5. Vergrößern Mit Nanoporen hohe elektrische Felder Hinweis: Der Durchmesser der Nanopore ist entscheidend bei der Bestimmung ihrer Funktionalität für einen bestimmten biomolekularen Erfassungsanwendung. Zu diesem Zweck mit einem TEM kann auf eine gewünschte Größe durch die Anwendung hoher elektrischer Felder vergrößert, bis der geeignete Durchmesser ist mit dem gleichen Aufbau verwendet, zu reinigen und zu befeuchten erreicht werden erzeugt ein die NanoporeNanopore (Abbildung 2). <ol><li> Mit der gleichen Elektronenkonfiguration wie in Teil 4, gelten ein 200-500 mV Vorspannung über den Porendurchmesser, um eine Messung zu erhalten. Während weniger präzise als Anpassung einer IV-Kurve kann eine Einzelpunktmessung zur groben schnell schätzen die Nanoporen-Größe werden. </li><li> Anwenden eines 2 sec Impuls von 8 V über die Nanopore, gefolgt von einer Messzeit von mindestens 5 sec bei 400 mV. Die Berechnung der neuen Durchmesser wird in der Regel zeigen eine sehr geringe Erhöhung der Nanoporengröße (&lt;0,1 nm). </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang zyklisch, im Wechsel zwischen Erweiterung und Messspannungen in-situ-und Echtzeit-Messungen der zunehmenden nanopore Durchmesser zu erhalten. </li><li> Wenn schnellere Wachstumsrate ist wünschenswert, erhöhen die Grße der schrittweise bis zu 10 V. Wachstum angelegte Spannung beschleunigt die typischerweise Poren vergrößert sich mit der Rate der Zunahme der Leitfähigkeit im Bereich von 0,03 nS / s ec &amp; #160; 10 nS / sec, je nach der Größe der Nanoporen, der Stärke des elektrischen Feldes und Elektrolytlösungseigenschaften. </li><li> Wenn der gewünschte Durchmesser erreicht ist, beenden Sie die Anwendung von hohen elektrischen Feldern. Dies kann automatisch mit Hilfe des Computerprogramms erfolgen. </li><li> Schließen Sie die Patch-Clamp-Verstärker an den Elektroden. </li><li> Gewinnen Sie neue IV und aktuelle Trace-Daten bei 200 mV, um den Durchmesser der Nanoporen zu bestätigen und geräuscharme Stromsignale wie in Schritten von 3,2 bis 3,5 höher. Falls erforderlich, wiederholen Anlage und Erweiterung Protokoll (Schritte von 4,1 bis 5,5). </li></ol> 6. DNA-Translokation <ol><li> Vor der Zugabe einer biomolekularen Probe, eine Kontrollexperiment durchzuführen, um sicherzustellen, dass es keine Kontamination in dem Reservoir. Erwerben eine aktuelle Trace unter einem angelegten Potential von 150 bis 300 mV in Abwesenheit einer Probe, um zu überprüfen, dass keine Strom Blockaden nach 2 min festgestellt. </li><li> In λ-DNA (48,5 kbp Doppelstrang) zu der &lt;em&gt; cis Reservoir für eine Endkonzentration von 0,5-2 ng / ul. Vorsichtig mit einer Pipette unter Rückfluß für mindestens 10 Sekunden, um eine homogene Verteilung der Probe während des Reservoirs zu gewährleisten. </li><li> Für eine 30 nm dicke Nanoporen, gelten eine mögliche Verzerrung von 150 bis 300 mV an das transBehälter und messen den Ionenstrom durch die Nanopore. Für sehr kurze Translokationsereignisse, ist es erwünscht, bei einer hohen Frequenz (250 kHz oder höher) mit einem relativ hohen Tiefpaßfilterung Frequenz (100 kHz) abzutasten. </li><li> Überwachen Sie den Ionenstrom mit Hilfe von Software transiente Strom Blockaden erkennen als Moleküle Translokation durch die Nanopore. Die Ionenstrom-Spuren Molekular Translokation kann analysiert werden, um Verstopfungen Tiefe, Dauer und Frequenz, um Informationen über die Probe von Interesse schließen bestimmen. Umgekehrt, wenn Informationen über die zu translozieren Molekülen bekannt ist, können diese Daten verwendet, um die Eigenschaften der Nanopore sich zu untersuchen. </li></ol>

<ol><li>Venkatesan, B. M., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+sensors+for+nucleic+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanopore sensors for nucleic acid analysis.</a> Nat. Nanotechnol. 6 (10), 615-624 (2011).</li>
<li>Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Dekker, N. H., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+in+Solid-State+Nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Noise in Solid-State Nanopores.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (2), 417-421 (2008).</li>
<li>Tabard-Cossa, V., Trivedi, D., Wiggin, M., Jetha, N. N., Marziali, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+analysis+and+reduction+in+solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Noise analysis and reduction in solid-state nanopores.</a> Nanotechnology. 18, 4484-4418 (2007).</li>
<li>Wu, M. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Shape+and+Material+Composition+of+Solid-State+Nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Control of Shape and Material Composition of Solid-State Nanopores.</a> Nano Lett. 9 (1), 479-484 (2009).</li>
<li>Prabhu, A. S., Freedman, K. J., Robertson, J. W. F., Nikolov, Z., Kasianowicz, J. J., Kim, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEM-induced+shrinking+of+solid-state+nanopores+for+single+molecule+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">SEM-induced shrinking of solid-state nanopores for single molecule detection.</a> Nanotechnology. 22, 425302(2011).</li>
<li>Li, J., Stein, D., McMullan, C., Branton, D., Aziz, M. J., Golovchenko, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-beam+sculpting+at+nanometre+length+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ion-beam sculpting at nanometre length scales.</a> Nature. 412 (6843), 166-169 (2001).</li>
<li>Rosenstein, J. K., Wanunu, M., Merchant, C. A., Drndic, M., Shepard, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+nanopore+sensing+platform+with+sub-microsecond+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Integrated nanopore sensing platform with sub-microsecond temporal resolution.</a> Nat. Methods. 9 (5), 487-492 (2012).</li>
<li>Vanden Hout, M., Hall, A. R., Wu, M. Y., Zandbergen, H. W., Dekker, C., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+nanopore+size%2C+shape+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Controlling nanopore size, shape and stability.</a> Nanotechnology. 21, 115304(2010).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+evolution+and+surface+characterization+of+solid-state+nanopores+in+different+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Size evolution and surface characterization of solid-state nanopores in different aqueous solutions.</a> Nanoscale. 4 (5), 1572-1576 (2012).</li>
<li>Smeets, R., Dekker, N., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-frequency+noise+in+solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-frequency noise in solid-state nanopores.</a> Nanotechnology. 20, 095501(2009).</li>
<li>Beamish, E., Kwok, H., Tabard-Cossa, V., Godin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+control+of+the+size+and+noise+of+solid-state+nanopores+using+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Precise control of the size and noise of solid-state nanopores using high electric fields.</a> Nanotechnology. 23 (40), 405301(2012).</li>
<li>Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Wu, M. Y., Dekker, N. H., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobubbles+in+Solid-State+Nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanobubbles in Solid-State Nanopores.</a> Phys. Rev. Lett. 97 (8), 088101(2006).</li>
<li>Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Observation+of+Protein+Adsorption+onto+an+Inorganic+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Observation of Protein Adsorption onto an Inorganic Surface.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (31), 10816-10822 (2010).</li>
<li>Niedzwiecki, D. J., Movileanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Protein+Adsorption+with+Solid-state+Nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores.</a> J. Vis. Exp. (58), e3560(2011).</li>
<li>Wanunu, M., Meller, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWanunu%2C+M+%22Single-molecule+analysis+of+nucleic+acids+and+DNA-protein+interactions.+Single-molecule+techniques%3A+a+laboratory+manual%22">Single-molecule analysis of nucleic acids and DNA-protein interactions. Single-molecule techniques: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 395-420 (2008).</li>
<li>Tabard-Cossa, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instrumentation+for+Low-Noise+High-Bandwidth+Nanopore+Recording%5BTitle%5D)+AND+%22Engineered+Nanopores+for+Bioanalytical+Applications%22%5BJournal%5D)">Instrumentation for Low-Noise High-Bandwidth Nanopore Recording.</a> Engineered Nanopores for Bioanalytical Applications. , 59-93 (2013).</li>
<li>Kowalczyk, S. W., Grosberg, A. Y., Rabin, Y., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+conductance+and+DNA+blockade+of+solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Modeling the conductance and DNA blockade of solid-state nanopores.</a> Nanotechnology. 22 (31), 315101(2011).</li>
<li>Siwy, Z., Fuliński, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+1%2Ff%CE%B1+Noise+in+Membrane+Channel+Currents%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Origin of 1/fα Noise in Membrane Channel Currents.</a> Phys. Rev. Lett. 89 (15), 158101(2002).</li>
<li>Liebes, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructing+solid+state+nanopore+shape+from+electrical+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Reconstructing solid state nanopore shape from electrical measurements.</a> Appl. Phys. Lett. 97 (22), 223105(2010).</li>
<li>Kim, M. J., Wanunu, M., Bell, D. C., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Fabrication+of+Uniformly+Sized+Nanopores+and+Nanopore+Arrays+for+Parallel+DNA+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Rapid Fabrication of Uniformly Sized Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis.</a> Adv. Mater. 18 (23), 3149-3153 (2006).</li>
<li>Smeets, R. M. M., Keyser, U. F., Krapf, D., Wu, M. -Y., Dekker, N. H., Salt Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+Ion+Transport+and+DNA+Translocation+through+Solid-State+Nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Dependence of Ion Transport and DNA Translocation through Solid-State Nanopores.</a> Nano Lett. 6 (1), 89-95 (2006).</li>
<li>Wanunu, M., Dadosh, T., Ray, V., Jin, J., McReynolds, L., Drndić, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+electronic+detection+of+probe-specific+microRNAs+using+thin+nanopore+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Rapid electronic detection of probe-specific microRNAs using thin nanopore sensors.</a> Nat. Nanotechnol. 5 (11), 807-814 (2010).</li>
<li>Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Solid-state nanopores.</a> Nat. Nanotechnol. 2 (4), 209-215 (2007).</li>
<li>Powell, M. R., Cleary, L., Davenport, M., Shea, K. J., Siwy, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric-field-induced+wetting+and+dewetting+in+single+hydrophobic+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Electric-field-induced wetting and dewetting in single hydrophobic nanopores.</a> Nat. Nanotechnol. 6 (12), 798-802 (2011).</li>
<li>Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+damage+in+the+TEM+and+SEM%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Radiation damage in the TEM and SEM.</a> Micron. 35 (6), 399-409 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Kontrolle der Nanoporengröße ist von grundlegender Bedeutung in der biomolekularen Erfassungsanwendungen. Nanoporendurchmessern muss die Reihenfolge der Größe der Moleküle, die geprüft werden, sie müssen groß genug sein, um die Probe aufzunehmen, aber klein genug, um eine optimale Signal-zu-Rauschen zu erreichen. Während die Steuerung der Größe der Anwendung mit der hohen elektrischen Feldern vorgestellte Methode ist unidirektional, dass Nanoporendurchmesser sind nur während des Prozesses erhöht wird, kann Nanoporen mit Durchmessern zwischen 3-100 nm fashioned sein, mit Sub-Nanometerpräzision. Wie 3-4 nm Poren kann leicht mit einem TEM 23 hergestellt werden, ermöglicht dies für die zuverlässige Herstellung von Festkörper-Nanoporen für eine breite Palette von Anwendungen von Sondierungs ssDNA Struktur der Wechselwirkung von sperrigen Protein-Ligand-Komplexe. Während Nanoporen-Wachstum von über 100 nm sehr schnell und weniger genau zu sein, können weitere moderate Vergrößerung Bedingungen eingesetzt werden, um eine bessere Kontrolle über den Prozess zu erreichen. Als such, ist der wichtigste Schritt für eine wirksame Steuergröße die Wahl der Impulsstärke und Dauer, um die Effizienz und die Vergrößerung Präzision bei der Erreichung eines gewünschten Porendurchmesser erforderlich auszugleichen. Dies wird auch durch die Erweiterung der dünner Nanoporen (10-nm Dicke), wobei die Erweiterung wird eine geringere Vorspannung aber vergleichbare elektrische Feldstärke beobachtet hervorgehoben. Abhängig von der endgültigen Größe, ist es generell möglich, zu vergrößern, um eine Nanoporen-Sub-100-nm Durchmesser in ein paar Minuten. Ähnlich große Niederfrequenzstromschwankungen ausschließen Einzelmolekülstudien, wie es ist fast unmöglich, Translokation Signale vom Hintergrundrauschen zu unterscheiden. Unvollständige Benetzung 24, kann die Anwesenheit von kohlenstoffhaltige Rückstände nach der ersten Herstellung 25 und Adsorption von Schmutz auf der Nanoporenwand 13 verbleibenden Signalqualität verschlechtern, die zusätzliche Reinigung mit aggressiven chemischen Behandlungen, die oft inefficacious. Interessanterweise ist es üblich, für Festkörper-Nanoporen-Protokolle, um die Bedeutung der Reinigung der Nanoporen in Piranha-Lösung oder mit Sauerstoffplasma vor der Montage um die Benetzung zu unterstützen oder eine Kontamination über von den Bohr-, Imaging-und Abwicklungsprozesse zu entfernen verließen betonen. Auch mit dieser Behandlung jedoch Nanoporen oft nicht nass oder weiterhin hohe Lärm zeigen und die vorgeschlagene Lösung für die fehlgeschlagenen Versuche ist es, zusätzliche Reinigung, die sehr zeitaufwendig sein kann, 14 durchzuführen. Mit der Anwendung von hohen elektrischen Feldern, diese langen Protokollen nicht notwendig in Abhängigkeit von der Anwendung sein. Es wurde festgestellt, dass die meisten Geräte könnten in situ unter Verwendung der hier beschriebenen Methode überholt werden, damit die Vorbereitungszeit zu reduzieren und die Notwendigkeit, mit ätzenden Chemikalien umzugehen. Die wichtigsten Schritte bei der Eindämmung des elektrischen Störungen ist eine einfache Erhöhung der Spannung und / oder Pulsdauer vollständig benetzen die Poren und entfernt lose gebundenen Schmutz.Nanoporen in dieser Weise behandelt werden können, zuverlässig Biomolekül Translokation Experimente, wie den Durchgang von DNA und Proteinen verwendet werden. Wenn diese Moleküle an die Porenwand, die zu einer Verstopfung und laut elektrisches Signal halten, können hohe elektrische Feldimpulse erneut angewendet werden, um das Hindernis zu entfernen und wieder geräuscharmen Eigenschaften für weitere Experimente, ohne Aushängen der Nanopore Chip von fluidischen Zelle. Die Anwendung von hohen elektrischen Feldern mit dem beschriebenen Aufbau wird durch die Anforderung von einer externen Stromversorgung, die bis zu 10 V und Stromverstärker, der die Empfindlichkeit und geräuscharmen Eigenschaften bei hohen Bandbreiten (&gt; 1 kHz) fehlt beantragen kann, begrenzt Einzelmolekül-Erkundung. Während typische molekularbiologische Experimente stützen sich auf eine geräuscharme Stromverstärker, die begrenzt auf ± 1 V ist, ist es einfach, ein einzelnes System, das sowohl hohe elektrische Feldanlage und empfindliche Strommessung mit einem einstell erreichen könnte entwerfenstabile Verstärkung. Trotz dieser Einschränkung ist der Übergang von einer Einrichtung in die andere schnell und unkompliziert. Im Vergleich zu bestehenden Techniken zur Steuerung nanopore Größe wie der Einsatz von SEM 5, thermische Oxidation und Membran Neugestaltung 8, bieten einen hohen elektrischen Feldern ein schneller, präziser und kostengünstiger Methodik, die mit Standard-Ausrüstung auf dem Labortisch durchgeführt werden können und bieten ein breiteres Spektrum von Nanoporen-Größen. Die Fähigkeit, schnell und reproduzierbar zu reduzieren niederfrequente Rauschen macht auch erste Herstellung zuverlässiger und verlängert die Lebensdauer von Festkörper-Nanoporen, wie vorher verwendet Poren für weitere Experimente verjüngt werden. Insgesamt wurden über 95% der Nanoporen unterschiedlicher Dicke mit hohen elektrischen Feldern Anlage zeigte sehr wenig Niederfrequenzrauschcharakteristik, geeignet für Biomolekül Erfassungs wodurch sie. Die Herstellung ist somit einfacher und zuverlässiger, so dass Solid-State-Nanoporen Experimente mehr ZugänglichkeitBLE, die Forscher und können potenziell für einen Weg zur Kommerzialisierung von Nanoporen-Technologien durch robuste Fertigungsprozesse.

Biologische und Festkörper-Nanoporen ein Mittel zur Erfassung biomolekulare Analyten auf der Einzelmolekülebene ein. Einzelne Nanoporen sind in der Regel in dünne isolierende Membranen eingebettet und bietet den einzigen Kanal für Ionenstrom zwischen zwei Flüssigkeitsreservoirs geben. Unter Verwendung der Prinzipien der größeren Coulter-Zähler, nanopore Experimente betreffen Änderungen im Ionenstrom, um die Länge, Größe, Ladung und Konformation von geladenen Biomolekülen zu bestimmen, wie sie elektrophoretisch durch eine Nanoporen in der Gegenwart von einem äußeren elektrischen Feld angetrieben. Während biologische Nanoporen wie α-Hämolysin bieten in der Regel eine höhere Empfindlichkeit und niedrigem Rauscheigenschaften 3 ist die Unterstützung von Lipid-Doppelschicht zerbrechlich und eine feste Größe, was ihre Anwendbarkeit. Festkörper-Nanoporen, auf der anderen Seite, sind in dünnen (10-50 nm), Siliziumnitrid oder Siliziumoxid-Membranen hergestellt und kann von verschiedenen siz werdenes, leicht mit Wafer-Scale-Technologien 6,7 integriert und sind robuster, so dass für ein breiteres Spektrum von experimentellen Bedingungen. Trotz dieser Vorteile leiden Festkörper-Nanoporen-Technologien aus mehreren praktischen Nachteile, die ihre Nützlichkeit für molekularbiologische Untersuchungen zu begrenzen. Während die Steuerung des Nanoporengröße möglich ist, ist es in der Regel teuer und mühsam zu erreichen, spezialisierte Ausrüstung und qualifiziertem Personal erfordern. Beispielsweise wurden Nanoporen durch fokussierten Ionenstrahl gebohrt kürzlich gezeigt worden, dass unter bestimmten experimentellen Bedingungen in einem Rasterelektronenmikroskop (SEM) 5 schrumpfen. In anderen Ansätzen kann Nanoporen durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) gebohrt vergrößern oder verkleinern, je nach Strahlbedingungen und anschließende Einwirkung von wässrigen Lösungsmitteln 8. In diesen Fällen ist die erzielbare Reichweite von Nanoporengrößen begrenzt, schwer zu kontrollieren und auch unzuverlässig, da die Größe der Nanoporen können folgende chemische Behandlung ändern oderwenn in einem bestimmten flüssigen Umgebung 9 eingetaucht. Der Ionenstrom durch Festkörper-Nanoporen können auch von hohen Lärm leiden, deren Quellen sind ein intensiv untersuchten Thema in Nanoporen-Literatur 2,3,10,11. Obwohl verschiedene Verfahren vorgeschlagen worden, um elektrisches Rauschen zu reduzieren, die Ausbeute zuverlässige, stabile rauscharme Nanoporen in der Regel gering. Die Abscheidung von kohlenstoffhaltige Rückstände beim Bohren und Bildgebung kann nachteilige Auswirkungen auf die elektrische Signalqualität haben, machen oft eine vollständige Benetzung eine Herausforderung und was die Bildung von Nanobläschen, die schwer zu entfernen 12 sein kann. Außerdem Verstopfung der Nanoporen durch Analyt-Moleküle abbaut Signalqualität Rendering Poren unbrauchbar weiteren Versuch 13,14. Insgesamt diese Effekte stark Ausbeute von funktionellen Nanoporen-Geräte zu reduzieren und die Kosten, die mit Festkörper-Nanoporen-Forschung verbunden. Die Anwendungtion einer Spannung mit Ag / AgCl-Elektroden zu hohe elektrische Felder im Bereich von 0,15 bis 0,3 V / nm erzeugen präsentiert eine überraschend einfache Lösung für diese Herausforderungen. Durch die zyklische Anwendung von kurzen Spannungsimpulse, eine saubere, geräuscharme Nanoporen-Oberfläche ideal für Einzelmolekülstudien erzeugt. Längerer Einwirkung von hohen elektrischen Feldern zur Beseitigung von Membranmaterial der Porenwand bildet, was zu einer Erhöhung der Nanoporendurchmesser. Dieses Wachstum kann genau durch Abstimmen der Impulsstärke und Dauer gesteuert werden. Umlaufbahnen verschlechtern sich im Laufe eines Versuchs durch Verstopfung der Nanopore als Moleküle adsorbieren Fläche der Nanopore kann dieser Vorgang wiederholt werden, um verstopfte Geräte, die ansonsten verworfen worden wäre erholen. Als solches ist die Ausbeute an funktionsNanoPoren durch die Fähigkeit, die gleiche Vorrichtung mehrere Male verwenden erhöht. Dieses Verfahren bietet mehrere Vorteile, da sie sich schnell in Flüssigkeit unter experimentellen durchgeführtBedingungen, erfordert nur Standard-Laborgeräte, können mit der Software automatisiert werden, und produziert Funktions hochwertigen Nanoporen mit einer Ausbeute von über 95%.

<table><tbody><tr><td>JEM-2100F TEM</td><td>JEOL</td><td></td><td>Bohren erfordert eine Beschleunigungsspannung von 200 kV</td></tr><tr><td>Axon Axopatch 200B Patch-Clamp-Verstärker</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Rauscharmer Spannungs- und Stromverstärker Datenerfassungskarte</td></tr><tr><td>der X-Serie</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6351</td><td>Schnittstelle zum Setup, Anlegen hoher elektrischer Felder</td></tr><tr><td>LabVIEW 2012 Software</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Anlegen von Spannungen, Aufzeichnen von Strom, Datenanalyse</td></tr><tr><td>Stromverstärker</td><td>Keithley</td><td></td><td>Stromverstärkung bei hohen elektrischen Feldimpulsen</td></tr><tr><td>30 nm Dickes Siliziumnitrid TEM-Membranfenster</td><td>Norcada Inc.</td><td>NT005X</td><td>Substrat, in dem Nanoporen erzeugt werden</td></tr><tr><td>10 nm dicke Siliziumnitrid-TEM-Membranfenster</td><td>Norcada Inc.</td><td>NT005Z</td><td>Substrat, in dem Nanoporen erzeugt werden</td></tr><tr><td>Silikonelastomer O-Ringe</td><td>Marian Chicago</td><td>HT6135</td><td>Gestanzt zum Versiegeln des Nanoporen-Chips</td></tr><tr><td>Ag/AgCl-Elektroden</td><td>In Vivo Metric</td><td>E255</td><td></td></tr><tr><td>Salpetersäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>52004P</td><td>Wird zur Reinigung von Zellen verwendet - mit Vorsicht umgehen</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>H323</td><td>Wird für Piranha-Lösung verwendet - mit Vorsicht umgehen</td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300</td><td>Verwendet für Piranha-Lösung - mit Vorsicht umgehen</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>P335</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td>Pufferung KCl-Lösung</td></tr><tr><td>Primärer Faradayscher Käfig</td><td></td><td></td><td>Abschirmung Nanoporenzelle, Elektroden</td></tr><tr><td>Sekundärer Faradayscher Käfig</td><td></td><td></td><td>Abschirmung des Kopftisches, Elektrodendrähte</td></tr><tr><td>Teflonzelle</td><td></td><td></td><td>Zur Aufnahme von Nanoporen-Chips und -Reservoirs</td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>VWR</td><td></td><td>Heizung Piranha-Lösung</td></tr></tbody></table>

feinabstimmung der größe und minimierung der lärm von solid-state-nanoporen

Fine-tuning the Size and Minimizing the Noise of Solid-state Nanopores

Solid-State-Nanoporen wurden als vielseitiges Werkzeug für die Charakterisierung von einzelnen Biomolekülen, wie Nukleinsäuren und Proteine ​​1 entstanden. Allerdings bleibt die Schaffung eines Nanoporen in eine dünne isolierende Membran herausfordernd. Herstellungsverfahren mit Fach fokussierten Elektronenstrahl-Systeme können gut definierte Nanoporen zu produzieren, aber Ausbeute von zuverlässigen und geräuscharmen Nanoporen in kommerziell erhältlichen Membranen bleibt niedrig 2,3 und Größenkontrolle nicht trivial ist 4,5. Hier ist die Anwendung von hohen elektrischen Feldern, um die Feinabstimmung der Größe der Nanoporen, während eine optimale Geräuscharmut demonstriert. Diese kurzen Impulse des hohen elektrischen Feld werden verwendet, um eine unberührte elektrisches Signal zu erzeugen und damit zur Vergrößerung von Nanoporen mit Sub-Nanometer Genauigkeit bei längerer Exposition. Dieses Verfahren wird in situ in einer wässrigen Umgebung unter Verwendung von Standardlaborausrüstung durchgeführt wird, die Verbesserung der Ausbeute und der Reproduzierbarkeit solid-Zustand nanopore Fertigung.

Die in dieser Studie verwendeten Nanoporen wurden in 30-nm bzw. 10 nm dicke Siliziumnitrid-Membran Fenster gebohrt. Während das beschriebene Protokoll kann zu Festkörper-Nanoporen verschiedener Material hergestellt unter Verwendung von Verfahren angewendet werden, werden sie häufig von TEM gebohrt mit vorher festgelegten Protokolle 11,14. Nanoporen durch TEM gebohrt sind typischerweise zwischen 4-8 nm Durchmesser (Fig. 2). Während die beiden 30-nm-und 10 nm dicke Membranen befestigt und mit dem obigen Protokoll konditioniert werden, beschrieben Vorspannungen beziehen sich die 30 nm dicke Membranen erforderlich, sofern nicht anders angegeben. Für Membranen von unterschiedlicher Größe, sollte die angelegte Spannung eingestellt, um ein elektrisches Feld im Bereich von 0,15-0,3 V / nm innerhalb der Nanoporen zu erzeugen. 3a zeigt zwei typische Leitfähigkeit Spuren einer 10-nm-Nanoporen in einem 30-nm dicke Membran vor und nach der Behandlung mit hohen elektrischen Feldern. Bei der Montage eines neu dgerillt Nanoporen, ist die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens eines instabilen und laut Ionenstromsignal, einen hohen Grad von Niederfrequenzschwankungen, in der Regel hoch. Die in Fig. 3a gezeigt Nanopore hebt dieses Verhalten. Dessen Leitfähigkeit wesentlich geringer ist wegen unvollständiger Benetzung als eine Nanopore seiner Größe, wahrscheinlich zu erwarten. Bei der Anwendung von hohen elektrischen Feldern von 0,27 V / nm in der Größe von 8 V Impulsen (90 Impulse von 2 sec Dauer) erzeugt, wird die Nanopore vollständig zu benetzen und anschließend bis 21 nm im Durchmesser vergrößert. An dieser Stelle weist die Poren eine stabile Leitfähigkeit mit geräuscharmen Eigenschaften. Quantitative Analyse von Rauschen in ähnlicher Nanoporen als spektrale Leistungsdichtedarstellungen in Fig. 3b gezeigt. Das niederfrequente Rauschamplitude unwet und / oder verstopfte Poren ist sehr hoch (&gt; 20 Pa RMS), wodurch sie unbrauchbar Experiment. Nach Anlage mit hohen elektrischen Feldern, Rauschleistung bei niedrigen Frequenzen (&lt;10 kHz) ist diminisum bis zu drei Größenordnungen und bereit für den Low-Noise-Experimente hed. Figur 4a zeigt eine typische Strommessung als das Potential angelegt wird zwischen hohen elektrischen Feldern zum Vergrößern und niedrigen elektrischen Feldmessperioden gepulst. Nach jedem nachfolgenden Impuls, der resultierende Ionenstrom durch die Nanopore zu der Messspannung (dh die Nanopore Leitfähigkeit) erhöht um einen endlichen Betrag. Dies zeigt, dass die Nanopore wird vergrößert, wenn der Durchmesser d von seiner Leitfähigkeit G in einer Lösung von Leitfähigkeit σ abgeleitet werden, wie in etwa der Nanopore mit zylindrischer Geometrie der effektiven Länge L eff. Während verschiedene andere Modelle für Nanopore bezüglich Leitfähigkeit seiner Geometrie 17,19-21 bestehen, die folgende Beziehung, die einen geometrischen Begriff und einer Zugangswiderstand Begriff umfasst, ist gültig für TEM bohrt Nanoporen in hoher Salz erwiesenKonzentrationen über einen weiten Bereich von Durchmessern von Interesse für dsDNA Translokation 17,22. <img alt="" src="/files/ftp_upload/51081/51081eqn.jpg" width="150px" /> Sobald der gewünschte Durchmesser erreicht ist, wird der Prozess durch die Software automatisch gestoppt. Die resultierende Nanopore Durchmesser kann dann unter Verwendung präziser IV-Messungen bestätigt werden, wie in Fig. 4b gezeigt. Es ist wichtig zu bemerken, dass Nanoporen mit hohen elektrischen Feldern behandelt sind voll funktionsfähig. Dies wird durch den Nachweis von λ DNA Translokation validiert, wie in den Spuren Leitfähigkeit in 5a dargestellt gezeigt. In dieser Figur ist dsDNA durch zwei Nanoporen, die auf 11 nm und 32 nm mit dem beschriebenen Verfahren ein gefahren wurden. In jedem Fall ist die Grundlinie Leitfähigkeit extrem stabil und klar Blockaden beobachtet, wie dsDNA-Moleküle Translokation durch die Nanopore, zeigt hohes Signal-Rauscheinzelmolekül Translokationsereignisse im Vergleich zu unbehandelten Poren, die hohe Rausch aufweist. Wie in den Einsätzen von 5a dargestellt ist, sind mehrere diskrete Blockade Ebenen beobachtet, wie einzelne Moleküle gefaltet transloziert, wie Nanoporen dieser Größen erwartet. Histogramme der Nanopore während der Translokation Leitfähigkeit Ereignisse durch jede Pore in Fig. 5b gezeigt. Die geräuscharmen Eigenschaften der Nanoporen zeigen deutlich, leicht auflösbare Peaks, die der Grundlinie (keine DNA), Single (ein DNA-Strang - aufgeklappt) und Doppel Blockade-Staaten (zwei DNA-Stränge - gefaltet). Bemerkenswert ist die Tatsache, dass die Änderung der Leitfähigkeit entsprechend einem einzelnen dsDNA-Molekül besetzen die Poren ist für die großen und kleinen Nanoporen. Dies ist ein indirekter Beweis, daß die Anwendung von hohen elektrischen Feldern ist in der Tat Erweiterung bestehender Nanoporen, die gleiche Amplitude Blockierung würde beobachtet werden, wenn andere Poren oder Risse wurden in t erzeugtMembran er während des Prozesses 17. Ähnlich Fig. 6 veranschaulicht die Wirksamkeit von hohen elektrischen Feldern zur Vergrößerung Nanoporen in Membranen unterschiedlicher Dicke hergestellt. Hier ist ein Nanoporen in einem 10-nm SiNx Membran erstellt zunächst teilweise unwet, die Anzeige instabil und relativ geringe Leitfähigkeit. Bei der Anwendung von Wechselstrom ± 3 V (± 0,3 V / nm) Impulse von 4 sec Dauer (30 insgesamt), wird die Nanopore nassen und IV zeigt ideale Eigenschaften für eine 3 nm Poren. Die Methodik wurde dann für 400 aufeinanderfolgenden Impulsen wiederholt und die Nanopore auf 8 nm vergrößert. Diese Erweiterung, bei vergleichbaren elektrischen Feldern durchgeführt, aber niedrigere angelegte Vorspannung als bei Nanoporen in 30-nm-Membranen hergestellt werden, zeigt, dass der Prozess in erster Linie elektrischen Feld angetrieben. Da die Translokation durch eine dünnere Membran erzeugten Strom-Blockade ist größer als bei dickeren Poren Nanoporen in dünnen Membranen hergestelltauf diese Weise behandelt werden können, verwendet werden, um kürzere Moleküle wie Proteine ​​mit erhöhter Empfindlichkeit zu untersuchen. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51081/51081fig1.jpg" width="600px" /> Fig. 1 ist. Nanopore Zellenanordnung. Ein Silizium-Nitrid-Membran, die eine Nanoporen zwischen Silikon-Elastomer-Dichtungen, die wiederum durch zwei Teflon Halbzellen haltigen Elektrolyten Druckbehältern sind platziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51081/51081fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51081/51081fig2.jpg" width="600px" /> 2. Nanopore Anlage und Erweiterung Setup. Ein Nanoporen in einer 30 nm dicken Silizium-Nitrid-Membran (links) gebohrt verbindet zwei Elektrolyt-Stauseen. AComputer verwendet wird, um entweder eine Patch-Clamp-Verstärker oder externe Stromversorgung (DAQ-Karte), die eine potenzielle Verzerrung über Ag / AgCl-Elektroden in den Elektrolyten eingetaucht Stauseen gilt über die Nanopore steuern. Der Stromverstärker leitet die Ionenstrom gemessen, um die in Echtzeit unter Verwendung von Computer-Software überwacht werden. Diese Zahl wurde von [11] geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51081/51081fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51081/51081fig3.jpg" width="600px" /> 3. Strombahnen vor und nach Anwendung von hohen elektrischen Feldern. (A) Bei der Montage und auch nach der Reinigung mit Piranha-Lösung ist die Leitfähigkeit der Nanopore instabil und kleiner als bei einem zylindrischen 10-nm-Poren (blau) erwartet. Nach der Anwendung von 2 sec Impulse von 8 V, dasNanopore vollständig benetzt und vergrößert, zeigt eine stabile Leitfähigkeit und kann für molekularbiologische Experimente Erkundung (grün) verwendet werden. (B) spektrale Leistungsdichte Plots von einem unvollständig benetzt und verstopft Nanoporen (blau und orange, beziehungsweise). Bei Anwendung von 200 ms Impulsen von 8 V wurden die Nanoporen benetzt und Schmutz entfernt (grün bzw. rot). Diese Zahl wurde von [11] geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51081/51081fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51081/51081fig4.jpg" width="600px" /> 4. Nanopore Erweiterung mit hohen elektrischen Feldern. (A) Der Wechsel zwischen Erweiterung und Mess potentielle Vorurteile (rot) zeigt, dass der Ionenstrom durch die Nanopore (blau) in endlichen Schritten erhöht. Die daraus resultierende Verhaltenrungs Messung kann verwendet werden, um Nanoporen-Durchmesser abzuleiten. Sobald der gewünschte Durchmesser erreicht worden ist, wird der Prozess beendet. (B) Präzise IV-Messungen der Leitfähigkeit bestätigen, dass Nanoporen-Größen haben sich erhöht. Solche Grundstücke bieten eine bessere Abschätzung der Porengröße als Einzelpunkt-Stromwerte, wie sie fit werden können und deren symmetrische und Ohmsche Verhalten kann bestätigt werden. Diese Zahl wurde von [11] geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51081/51081fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51081/51081fig5.jpg" width="600px" /> 5. DNA-Translokation durch Anlage Nanoporen. (A) Die Zugabe von dsDNA (48,5 kbp) zu einer Seite der Nanopore bei einer Vorspannung von 150 mV erzeugt transiente Blockaden in den Spuren Leitfähigkeit von 11 nm (blau) und 32-nm-porES (rot). (B) Histogramme der Leitfähigkeit von jedem der Nanoporen zeigen diskrete Peaks, die der Grundlinie, Einzel-und Doppel Translokation Veranstaltungen. Diese Zahl wurde von [11] geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51081/51081fig5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51081/51081fig6.jpg" width="600px" /> 6. Erweiterung der Nanoporen in 10 nm Membranen. Ein Nanoporen in einem 10-nm-Membran ursprünglich eine sehr geringe Leitfähigkeit und asymmetrische IV-Charakteristiken (orange). Bei Anwendung von 30 Impulsen von abwechselnd ± 3 V (4 sec Dauer), die Nanopore benetzt und zeigt ideale Eigenschaften IV mit einer Leitfähigkeit im Einklang mit der für eine 3 nm Poren (blau) erwartet. Weitere 400 Impulse von ± 3 V vergrößert die Nanopore zu einem Durchmesser von 8 nm(Grün). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51081/51081fig6highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

Eine Methodik zur Herstellung von Festkörper-Nanoporen in Lösung für biomolekulare Translokation Experimente vorgestellt. Durch Anlegen kurzer Impulse hoher elektrischer Felder kann die Nanoporendurchmesser steuerbar mit Sub-Nanometergenauigkeit vergrößert und seine elektrischen Rauscheigenschaften deutlich verbessert. Dieses Verfahren wird in situ unter Verwendung von Standard-Laborausrüstung unter experimentellen Bedingungen durchgeführt.

Feinabstimmung der Größe und Minimierung der Lärm von Solid-State-Nanoporen

Solid-state nanopores have emerged as a versatile tool for the characterization of single biomolecules such as nucleic acids and proteins1. However, the ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, einen festkörperbasierten Nanoporenträger für biomolekulare Sensorexperimente vorzubereiten, indem seine Größe präzise kontrolliert und die Rauscheigenschaften des ionischen Stroms verringert werden. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Festkörper-Nanoporen-Chip in einer Flüssigzelle montiert wird, um einen nanometerskaligen Kanal zwischen zwei Elektrolytbehältern zu schaffen. Als zweiter Schritt wird ein moderates elektrisches Feld von etwa 0,01 Volt pro Nanometer über die Nanopore angelegt, um deren anfängliche Größe sowie elektrische Rauscheigenschaften zu charakterisieren. Danach werden kurze Impulse mit hohen elektrischen Feldern von etwa 0,3 Volt pro Nanometer über die Membran angelegt.Um den Nanoporenkanal vollständig zu benetzen, elektrisches Rauschen zu verringern und ihn schrittweise auf eine gewünschte Größe bis hinunter zu diskreten subnanometrischen Schritten zu erweitern. Die Ergebnisse zeigen, dass ein vollständig benetzter, funktionaler, geräuscharmer Nanopore erstellt wird, basierend auf der Analyse des ionischen Stromsignals und der erfolgreichen Translokation von Biomolekülen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur Größenkontrolle von Nanoporen, wie der Verwendung eines Transmissions- oder Rasterelektronenmikroskops, liegt darin, dass sie in einer Salzlösung unter Verwendung standardmäßiger Laborgeräte in derselben Anordnung durchgeführt wird, die auch für die Detektion von Biomolekülen genutzt wird.Dies gewährleistet eine präzise Kontrolle der tatsächlichen Nanoporengröße während biomolekularer Sensierungsversuche. Das Verfahren reduziert zudem elektrisches Rauschen mit niedriger Frequenz und ermöglicht es, verstopfte Nanoporen für weitere Experimente wieder nutzbar zu machen. In diesem Video wird vorausgesetzt, dass ein Nanoporen-Chip bereits in einer Nanoporenzelle montiert wurde.Der nächste Schritt besteht darin, die Zelle für die Experimentierung vorzubereiten. Dazu Platin-Silberchlorid-Elektroden in jedes Reservoir geben. Anschließend einen rauscharmen Stromverstärker zwischen den Reservoirs der Zelle anschließen.Bringen Sie die gesamte Nanoporen-Zellanordnung in einem elektrisch abgeschirmten Gehäuse unter. Schalten Sie den rauscharmen Stromverstärker in den externen Befehlsmodus. Um eine automatisierte Computersteuerung zu ermöglichen, sollte der Computer das angelegte Potential zwischen minus 200 Millivolt und 200 Millivolt abtasten und die Strom-Spannungs-Kennlinie (IV-Charakteristik) aufzeichnen, um die IV-Kurve anzupassen, die Nanoporenleitfähigkeit in Durchmesser zu ermitteln und die Konsistenz zu überprüfen, insbesondere eine niedrigere als erwartete Leitfähigkeit, wie in diesem Beispiel beobachtet, oder eine Asymmetrie in der hier gezeigten IV-Kurve.Kennzeichnet ein unvollständig benetztes oder verstopftes Nanopore, das einer Konditionierung bedarf. Um mit der Charakterisierung fortzufahren, legen Sie eine Potentialdifferenz von 200 Millivolt über die Nanopore an und nehmen Sie den Ionenstrom 30 Sekunden lang auf. Dieser Abschnitt einer Spur von einer unkonditionierten Nanopore weist ein hohes Maß an elektrischem Rauschen auf, wodurch die Probe für biomolekulare Sensorexperimente bei sämtlichen Messungen des Ionenstroms ungeeignet ist.Quantifizieren Sie die Rauschcharakteristika bei niedriger Frequenz mittels einer spektralen Leistungsdichte-Analyse. Das hier beobachtete hohe Rauschen bei niedriger Frequenz ist typisch für unvollständig benetzte oder verstopfte Nanoporen. Die Charakterisierungsdaten können darauf hinweisen, dass eine Nanopore einer Konditionierung bedarf.Trennen Sie dazu die Elektroden vom rauscharmen Stromverstärker. Schließen Sie eine der Leitungen an eine computerkontrollierte Stromversorgung an, die eine Ausgangsspannung von mehr als sechs Volt bereitstellen kann. Schließen Sie die Erdungselektrode an einen externen Stromverstärker an, um den Aufbau zu testen.Legen Sie eine Potentialdifferenz von 400 Millivolt über der Nanopore für mindestens fünf Sekunden an und messen Sie den Strom; verwenden Sie die letzten eine Sekunde der Daten, um die Konsistenz mit den IV-Kurven-Messungen zu überprüfen. Anschließend geben Sie einen 200 Millisekunden langen Impuls von sechs Volt über die Nanopore. Darauf folgt eine Messphase von fünf Sekunden bei 400 Millivolt, wobei die letzte Sekunde der Daten zur Bestimmung des Durchmessers verwendet wird.Wiederholen Sie diese Sequenz nach Bedarf, bis der Nanoporendurchmesser mit den aufgenommenen TEM-Bildern übereinstimmt. Bevor die Nanopore montiert oder Leitfähigkeitsmessungen durchgeführt werden, können verstopfte Nanoporen auf eine gewünschte Größe vergrößert werden, indem längere Impulse und/oder höhere Potentiale in der Konditionierungsanordnung für eine 30 Nanometer dicke Membran angelegt werden. Beginnen Sie damit, eine Vorspannung von 400 Millivolt über die Nanopore für mindestens fünf Sekunden anzulegen.Daten zur Abschätzung der Nanoporengröße bereitstellen. Anschließend einen zwei Sekunden langen Impuls von acht Volt darauf anlegen. Danach eine Messphase von mindestens fünf Sekunden bei 400 Millivolt durchführen.Um den vergrößerten Durchmesser zyklisch zu bestimmen, wiederholen Sie den zwei Sekunden dauernden Acht-Volt-Vergrößerungsimpuls und die fünf Sekunden dauernden 400-Millivolt-Messschritte, bis der gewünschte Porendurchmesser erreicht ist. Sobald der Ziel-Durchmesser erreicht ist, trennen Sie die Stromversorgung und den Stromverstärker ab. Schließen Sie den störarmen Stromverstärker erneut an die Elektroden an.Neue Strom-Spannungs- (IV) und momentane Stromspuren erfassen, um den Durchmesser der Nanopore zu bestätigen und die geringe Rauschintensität der Ionenströme zu verifizieren, wie hier im Vergleich zu nicht behandelten und asymmetrischen Nanoporen dargestellt. Die IV-Kennlinien der vergrößerten Nanopore zeigen einen signifikanten Anstieg der Leitfähigkeit sowie ideales ohmsches Verhalten. Hier unsere typischen Leitfähigkeitskurven einer 10 Nanometer großen Nanopore und einer 30 Nanometer dicken Membran vor und nach Behandlung mit hohen elektrischen Feldern.Achten Sie auf den Knick in der Leitfähigkeitskala. Die in blau dargestellte PO-Leitfähigkeit ist deutlich geringer als für eine 10-Nanometer-Öffnung erwartet; dies liegt höchstwahrscheinlich an unvollständiger Benetzung. Nach 92 Sekunden langen Impulsen mit acht Volt ist die Nanopore vollständig benetzt und hat einen Durchmesser von 21 Nanometern erreicht.Außerdem ist die Leitfähigkeit stabil mit geringem Niederfrequenzrauschen. Eine Darstellung der Leistungsspektraldichte zeigt, dass die Amplitude des Niederfrequenzrauschens des nicht konditionierten Pour in blau sehr hoch ist, wodurch er für Einzelmolekül-Experimente unbrauchbar wird. Nach der Konditionierung mit hohen elektrischen Feldern.Die Rauschleistung bei Frequenzen unterhalb von 10 hoch vier Hertz wird um bis zu drei Größenordnungen verringert, wodurch sie für empfindliche biomolekulare Untersuchungen zur DNA-Translokation geeignet ist. Stellen Sie sicher, dass der niedergeräuschige Stromverstärker mit den Elektroden verbunden ist.Bevor eine biomolekulare Probe dem Reservoir zugegeben wird, eine Potentialdifferenz von positiven 150 bis positiven 300 Millivolt mindestens zwei Minuten lang anlegen. Die Stromkurve beobachten und auf ionische Stromblockaden prüfen, die auf eine Kontamination hinweisen.Es sollten keine Blockaden vorhanden sein, wie in dieser Spur gezeigt. Greifen Sie auf den Chip zu und geben Sie 48,5 Kilobasen gepaarte, doppelsträngige Lambda-DNA auf eine Seite des Nanopores, sodass ihre Endkonzentration 0,5 bis zwei Nanogramm pro Mikroliter beträgt. Vorsichtig rückfließen lassen, indem mindestens 10 Sekunden lang durch Pipettieren eine homogene Verteilung der Probe im gesamten Reservoir sichergestellt wird. Sobald die DNA hinzugefügt wurde, bringen Sie den Chip in das abgeschirmte Gehäuse zurück.Für ein 30 Nanometer dickes Nanopore wenden Sie eine Potentialdifferenz von 150 bis 300 Millivolt an, um negativ geladene DNA elektrophoretisch durch die Nanopore zu treiben. Überwachen Sie mithilfe einer Software den Ionenstrom durch die Nanopore und detektieren Sie vorübergehende Stromblockaden. Aufgrund der DNA-Translokation können die Ionenstromspuren analysiert werden, um zusätzliche Informationen über die DNA-Probe abzuleiten.Nanoporen, die mit hohen elektrischen Feldern behandelt wurden, sind voll funktionsfähig, wie diese Leitfähigkeitskurven zeigen, in denen die Detektion einzelner Lambda-DNA-Moleküle in der oberen Kurve dargestellt ist. Die doppelsträngige DNA wird durch eine auf 32 Nanometer vergrößerte Nanopore transportiert. Die untere Kurve zeigt die DNA auf, die durch eine auf 11 Nanometer vergrößerte Nanopore bewegt wird.Beachten Sie den Knick in der Leitfähigkeitskala. In jedem Fall ist die Grundlinienleitfähigkeit äußerst stabil und sauber. Leitfähigkeitsblockaden werden beobachtet, wenn einzelne Moleküle durch die Nanopore translozieren.Die Insekten zeigen mehrere diskrete Blockierungsstufen als einzelne gefaltete Moleküle. Durch die Translokation der niederfrequenten Rauscheigenschaften der Nanoporen ergeben sich in diesen Histogrammen der Nanoporenleitfähigkeit leicht unterscheidbare Peaks, sowohl für die 32 Nanometer-Pore oben als auch für die 11-Pore unten, wobei drei Peaks aufgelöst werden. Der erste entspricht der Basislinie ohne DNA, der zweite einem einzelnen linearen Strang und der dritte gefalteter DNA.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man feste Nanoporen für Einzelmolekül-Nachweisexperimente vorbereitet. Diese Technik kann die experimentellen Ausbeuten erheblich verbessern und letztlich die Forschung an festen Nanoporen für eine breite Palette von Einzelmoleküluntersuchungen zugänglicher und zuverlässiger machen.

fine-tuning-the-size-and-minimizing-the-noise-of-solid-state-nanopores

Research

Forschung

JoVE Journal

Engineering

Ingenieurwesen

Eine Methode der Verwendung von Solid-State-Nanoporen, die unspezifische Adsorption von Proteinen auf einer anorganischen Oberfläche überwachen beschrieben. Die Methode nutzt die resistive-Puls-Prinzip, so dass für die Adsorption in Echtzeit und in der Einzel-Molekül-Ebene untersucht werden. Da der Prozess der einzelnen Protein-Adsorption ist fern vom Gleichgewicht, schlagen wir den Einsatz von parallel Arrays von synthetischen Nanoporen, so dass für die quantitative Bestimmung der scheinbaren...

Überwachung Proteinadsorption mit Solid-State-Nanoporen

Die folgenden Setup-Ansatzes Details Low-Power-optische Fallen von dielektrischen Nanopartikel mit einem Doppel-nanohole in Metallfolie.

Optical Trapping von Nanopartikeln

Extrazellulären Vesikeln spielen eine wichtige Rolle in physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich Gerinnung, Immunreaktionen und Krebs oder als potentielle therapeutische Mittel bei der Arzneimittelabgabe oder der regenerativen Medizin. Dieses Protokoll stellt Methoden zur Quantifizierung und Charakterisierung von Größe isoliert und nicht-isoliert extrazellulären Vesikeln in verschiedenen Flüssigkeiten mit abstimmbaren Widerstandspulsmessung.

Quantifizierung und Größe-Profilierung der extrazellulären Vesikeln Mit Tunable Resistive Pulse Sensing

Wir schlagen eine einfache Selbstorganisationstechnik von kolloidalen Siliziumdioxid-Nanopartikeln vor, um eine nanofluidische Verbindung zwischen zwei Mikrokanälen in Polydimethylsiloxan (PDMS) zu erzeugen. Mit dieser Technik wurde eine nanoporöse Kügelchenmembran mit einer Porengröße von bis zu ~45 nm in einem Mikrokanal aufgebaut und auf die elektrokinetische Vorkonzentration von DNA-Proben aufgebracht.

Erstellen von Unter 50 Nm nanofluidische Junctions in PDMS mikrofluidischen Chip über Selbstorganisation von kolloidalen Teilchen

Einheitlicher Größe Nanopartikel können in Poly (methylmethacrylat) (PMMA) Photoresistfilme durch Elektronenstrahl (E-Strahl) Lithographie gemustert Schwankungen in Kontaktlochabmessungen entfernen. Das Verfahren beinhaltet die elektrostatische funnelling zum Zentrum und Ablagerung Nanopartikel in Kontaktlöchern, gefolgt von Photoresist-Reflow-und plasma- und Nassätzen Schritte.

Die Verwendung von Aufopferungs Nanopartikel zu entfernen, die Auswirkungen von Shot-Rauschen in Kontaktlöchern Vorgefertigte durch Elektronenstrahl-Lithografie

Wir präsentieren ein Verfahren zum Erreichen einer Sub-Nanometer Auflösung Bilder mit Amplituden-Modulation (Tapping-Modus) Rasterkraftmikroskopie in Flüssigkeit. Das Verfahren ist auf kommerzielle Atomkraftmikroskope demonstriert. Wir erläutern die Gründe für unsere Entscheidungen von Parametern und schlagen Strategien zur Auflösung Optimierung.

Sub-Nanometer Auflösung Belichtung mit Amplituden-Modulation der Rasterkraftmikroskopie in Liquid

Dieses Protokoll beschreibt den Betrieb eines Flüssigkeitshalteströmungs Probe zum Abtasten Transmissionselektronenmikroskopie von AuNPs in Wasser, wie für die Beobachtung von nanoskaligen dynamischen Prozessen.

Studium dynamischer Prozesse von Nano-Größe Objekte in Liquid Scanning Transmission Electron Micros mit

Ein Mikrochip Herstellungsverfahren, die Plasmonen Pinzette umfasst wird hier vorgestellt. Der Mikrochip ermöglicht die Abbildung eines eingeschlossenen Teilchen maximal Trapping Kräfte zu messen.

Plasmonische Trapping und Freisetzung von Nanopartikeln in einer Monitoring-Umgebung

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Optimierung der Größe und Vernetzung Dichte kovalent vernetzt Nanopartikel aus linearen Polyestern mit Anhänger-Funktionalität. Durch maßgeschneiderte Synthese Parameter (Molekulargewicht Polymer, Anhänger Funktionalität Einarbeitung und Vernetzer Äquivalente), kann eine gewünschte Nanopartikel Größe und Vernetzung Dichte für Drug Delivery Anwendungen erreicht werden.

Nanosponge Einstellbarkeit in Größe und Dichte Vernetzung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Detektion diskreter Metallsauerstoffcluster, Polyoxometallate (POMs) an der Grenze zu einzelnen Molekülen, mithilfe einer biologischen Nanoporen-basierten elektronischen Plattform vor. Die Methode bietet einen komplementären Ansatz zu traditionellen analytischen Chemiewerkzeugen, die bei der Untersuchung dieser Moleküle verwendet werden.

Physikalische Charakterisierung einzelner metallischer Nanopartikel in hoher Auflösung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Fertigung einer Elektrode geschlossen Typ drahtlose Nanopore und elektrochemische Folgebewertung des einzigen Nanopartikel Kollisionen.

Eine geschlossene drahtlose Nanopore Elektrode für die Analyse von einzelnen Nanopartikel

Erfahren Sie, wie Sie Festkörper-Nanoporen für biomolekulare Sensorexperimente präparieren, indem Sie deren Größe präzise steuern und elektrisches Rauschen minimieren. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Einzelmolekül-Detektion.

Feinabstimmung der Größe und Minimierung der Lärm von Solid-State-Nanoporen

Weitere Videos entdecken