Automatische Trennung von C. elegans Variabel durch einen bakteriellen Erreger kolonisiert

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, den Beitrag der Besiedlung und der damit verbundenen Schäden zur Initiierung angeborener Immunantworten in der Meereseleganz zu bewerten. Dies wird erreicht, indem eine synchronisierte Population junger adulter Meereseleganz Pseudomonas arosa ausgesetzt wird, das grün fluoreszierendes Protein oder GFP exprimiert, was eine Population von Würmern erzeugt, die variabel vom Erreger besiedelt sind. Nach dem Waschen des Differentials werden kolonisierte Populationen von Würmern in reine Populationen unterteilt, wobei der Schwerpunkt auf den beiden Extremen von vollständig besiedelten und nicht besiedelten Würmern liegt.

Als nächstes wird RNA aus diesen Populationen extrahiert und die Immungenexpression im Vergleich zu Würmern bewertet, die auf nicht-pathogenen E. coli gezüchtet wurden. Um den Zusammenhang zwischen der Immunantwort und der Besiedlung zu untersuchen, werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass die angeborene Immunantwort der Meereseleganz auf Rosa von der Erregerbesiedlung entkoppelt werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Ansätzen zur Untersuchung der Initiierung der Immunantwort bei Meereseleganz besteht darin, dass sie die Variabilität der Infektion in warmen Populationen berücksichtigt und es uns ermöglicht, verschiedene Aspekte des Infektionsprozesses auseinanderzuhalten.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zur maritimen Eleganz und zur angeborenen Immunität zu beantworten, z. B. was die Grundlage für die Initiierung der angeborenen Immunantwort ist, und zwar in einer Weise mit hohem Durchsatz. Welche Auswirkungen haben verschiedene genetische oder umweltbedingte Manipulationen auf die Fähigkeit, der Besiedlung durch Krankheitserreger zu widerstehen? Zu Beginn züchten Sie Würmer auf mehreren Nematoden, Wachstumsmedium oder NGM-Platten, die mit E-Coli-Bakterien besiedelt sind, bis viele Würmer das Grabstadium erreicht haben.

Behandeln Sie dann Grabtiere mit Eivorbereitungslösung, um eine synchronisierte Kultur zu erhalten. Nächster Teller. Die Eier auf mehreren 60 Millimeter großen NGM-Platten sind mit Bakterien in einer Dichte von etwa 150 bis 200 Eiern pro Platte besiedelt.

Mindestens 15 bis 20 Platten werden benötigt, um mehrere tausend Würmer zu erhalten. Für das Sortierexperiment sollten die Benutzer skalieren, indem sie Platten mit größerem Durchmesser und mehr Eiern pro Platte verwenden, wenn eine größere Anzahl von Würmern benötigt wird. Inkubieren Sie die Platten zwei Tage lang bei 20 Grad Celsius, bis die Würmer das Stadium L 4 oder des jungen Erwachsenen erreicht haben.

Am nächsten Tag der Eivorbereitung wird ein GFP, das die POSA-Kultur, PA 14 GFP, exprimiert, in zwei Milliliter Kings B.Medium impfen und das Antibiotikum enthalten. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius unter Rühren über Nacht. Am nächsten Tag wird die PA 14 GFP-Kultur auf so viele langsam abtötende Platten aufgefüllt, wie für den Assay auf jeder 150-Millimeter-Petrischale benötigt werden.

Pipettieren Sie 75 bis 100 Mikroliter der gesättigten Kultur und verteilen Sie sie gleichmäßig. Inkubieren Sie die Platten mit einem sterilen Glasspreizer 20 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie die Platten mit PA 14 GFP aus dem Inkubator und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen.

Um die auf NGM-Platten gewachsenen Würmer zu sammeln, fügen Sie in der Zwischenzeit eine kleine Menge M neun Puffer hinzu, um die Platte abzudecken. Schwenken Sie die Platte vorsichtig und geben Sie die Flüssigkeit in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Lassen Sie die Würmer am Boden absetzen und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, bevor Sie die Würmer auf PA 14 GFP-Platten umfüllen. Bei einem minimalen Flüssigkeitsvolumen können bei der Verwendung von 150-Millimeter-Platten mehrere hundert Würmer auf einer einzigen Platte platziert werden.

Inkubieren Sie die Platten bei 25 Grad Celsius für 18 bis 21 Stunden für p arosa exponierte junge adulte Würmer. Dies ist das Zeitfenster, in dem die optimale Verteilung von besiedelten und nicht besiedelten Tieren angezeigt wird, bevor die Probensortierung durchgeführt wird, um sicherzustellen, dass die Maschine ordnungsgemäß funktioniert. Die wesentlichen Schritte werden hier skizziert und können online abgerufen werden.

Stellen Sie den Druck des Mantelventils auf ca. fünf PSI ein, um sicherzustellen, dass die Durchflussrate der Mantelflüssigkeit angemessen ist. Legen Sie ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen unter den Spender. Schalten Sie das Mantelventil ein und schalten Sie das Sortierventil aus.

Halten Sie die Tube 60 Sekunden lang unter den Spender. Das Volumen in der Tube sollte neun bis 10 Milliliter betragen. Wenn er außerhalb dieses Bereichs liegt.

Passen Sie den Druck des Mantelventils entsprechend an, um sicherzustellen, dass die Durchflussrate der Mantelflüssigkeit eine genaue Sortierung ermöglicht. Testen Sie die Sortierrate, indem Sie zuerst das Mantelventil ausschalten. Geben Sie dann etwa 25 Milliliter Kontrollpartikellösung in das Reservoir

Schalten Sie das Mantelventil und das Probenventil in der Computersoftware ein. Navigieren Sie zum Partikelmodus "Steuern" und klicken Sie auf "Erfassen". Stellen Sie sicher, dass der Partikeldurchfluss etwa fünf bis acht Partikel pro Sekunde beträgt, wobei die Laufzeit ungefähr der Breite des 40-Mikrometer-Partikels entspricht.

Dadurch wird sichergestellt, dass jeweils nur ein einzelnes 40-Mikron-Objekt durchdringt wird. Wenn die Werte außerhalb dieses Bereichs liegen, passen Sie die Einstellungen entsprechend an. Mit M neun Puffer waschen Sie Würmer in konische 15-Milliliter-Röhrchen, lassen Sie erwachsene Würmer durch die Schwerkraft auf den Boden des Röhrchens sinken und entfernen Sie den Überstand.

Füllen Sie die Tube mit frischem M nine Puffer. Wiederholen Sie diesen Vorgang drei- bis viermal. Dabei wird ein großer Teil der Larven sowie überschüssige Bakterien entfernt und es dauert ca. 10 Minuten.

Geben Sie Würmer in das Reservoir des Schneckensortierers, das einen leicht mischenden kleinen Rührstab enthält. Passen Sie die anfängliche Signalverstärkung an, indem Sie die grüne Photomultiplier-Röhre auf 600 und die rote und gelbe Photomultiplier-Röhre auf 200 einstellen. Beginnen Sie mit der Datenerfassung, um die Einstellungen anzupassen.

Streben Sie eine Sortierrate von 25 bis 30 Ereignissen oder Würmern pro Sekunde an. Ist die Zahl zu hoch, verdünnen Sie die Würmer im Reservoir mit M neun. Puffern Sie entsprechend.

Wenn die Rate zu niedrig ist, fügen Sie weitere Würmer in einem kleinen Volumen von M neun hinzu. Wenn das Experiment eine sehr strenge Trennung zwischen kolonisierten und nicht besiedelten Würmern erfordert, setzen Sie die Koinzidenzprüfung auf rein. Dadurch wird sichergestellt, dass die Maschine den Sturz zurückweist, wenn zwei Objekte zu nahe beieinander oder im selben Fall auftreten.

Anstatt sie zu sammeln, um die interessierende Grundgesamtheit zu sortieren, zeichnen Sie Gates um die Achse, die Größe und Fluoreszenzintensität anzeigen. Die Werte für das Fluoreszenz-Gating müssen empirisch bestimmt werden. Stellen Sie als Nächstes eine Multi-Well-Platte oder Petrischale unter den Spender, um die Würmer aufzufangen.

Öffnen Sie dann das Sortierventil, um mit dem Sortieren der Würmer zu beginnen. Sammeln Sie eine kleine Population von Tieren, um unter dem Mikroskop zu überprüfen, ob es sich bei der sortierten Population um die interessierende Population handelt. Wenn nicht, passen Sie die Gating-Parameter entsprechend an und fahren Sie mit der Probenentnahme fort.

Bei entsprechendem Alter der genetisch identischen Meereseleganz, die GFP exprimierenden Posa-exprimierenden Würmern ausgesetzt sind, führte dies zu einer breiten Verteilung der Besiedlungsgrade, und eine effiziente Trennung von nicht besiedelten von besiedelten Würmern wurde mit Hilfe eines Wurmsortierers erreicht. Im Gegensatz zu nicht besiedelten Würmern zeigen kolonisierte Würmer offensichtliche Anzeichen wie Trägheit und reduzieren den Stuhlgang. Letzteres kann ein Grund dafür sein, dass Würmer, die von P arosa besiedelt sind, Schwierigkeiten haben, die Infektion zu beseitigen.

Vier Gene wurden ähnlich wie die Pink-Exposition induziert, unabhängig vom Besiedlungsstatus der Würmer, und es wurde quantitatives R-T-P-C-R verwendet, um die Expression der Gene zu messen. Es ist bekannt, dass die vier Gene Teil der Immunantwort des CL egan sind. Lys zwei kodiert für ein Lysozym, zwei uncharakterisierte Gene, die spezifisch auf Infektionen reagieren, von denen eines auch zur Infektionsresistenz beiträgt, und PGP fünf reagiert sowohl auf Infektionen als auch auf Schwermetallstress.

Die Ergebnisse bestätigen bereits veröffentlichte Ergebnisse, die darauf hindeuten, dass eine Besiedlung und die damit verbundenen Schäden für eine Immunantwort nicht erforderlich sind. Stattdessen verweisen sie auf pathogenassoziierte molekulare Muster als Signaldaten, die zeigen, dass PGP five in nicht besiedelten Tieren induziert wird, von denen nicht erwartet wird, dass sie auftreten. Umfangreiche Schäden deuten auf eine Überlappung der Regulationsprogramme hin, die die Immunreaktionen und die allgemeinen Stressreaktionen in der maritimen Eleganz kontrollieren.

Diese Methode kann neue Einblicke in die Initiierung von Immunantworten in der Meereseleganz liefern, aber sie könnte auch auf andere Fragen angewendet werden, wie z.B. die Auswirkungen von Umweltbedingungen oder genetischer Manipulation auf die Besiedlung oder Konkurrenz zwischen verschiedenen Krankheitserregern neben Infektionsprozessen. Diese Methode könnte auch angewendet werden, um andere Wechselwirkungen von Würmern mit ihrer Umwelt zu verfolgen, wie z. B. die Aufnahme oder Sequestrierung von Metaboliten oder Chemikalien. Nach diesem Verfahren können die sortierten Populationen von Interesse für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, die über die Genexpression hinausgehen.

Dazu gehören das Sammeln lebender Tiere für nachfolgende Infektions- oder Überlebenstests oder Verhaltensexperimente. Diese Technik bietet ein nützliches Mittel, um die Auswirkungen der Exposition und Besiedlung von Krankheitserregern auf die angeborene Immunität und die Eleganz des Meeres zu untersuchen.