Name: Automatische Trennung von C. elegans Variabel durch einen bakteriellen Erreger kolonisiert (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Erfahren Sie die automatische Trennung von C. elegans durch Wormsorter basierend auf der Kolonisierung mit GFP-markiertem Pseudomonas aeruginosa. Diese Methode ermöglicht die Analyse angeborener Immunantworten unabhängig vom Infektionsgrad.

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Die Autoren danken der Ellison Medical Foundation für ihre Unterstützung. Wir möchten auch die Mitglieder der Abby Dernburg Labor für die Unterstützung bei Verwendung des wormsorter danken.

1. Die Erteilung einer Synchronized Kultur Junger Erwachsener Tiere <ol><li> Würmer wachsen auf mehreren NGM-Platten mit OP50-1 E. ausgesät coli-Bakterien (aus einer gesättigten Kultur 10x konzentriert), bis viele Würmer haben die schwangeren Stadium erreicht. </li><li> Gönnen trächtige Tiere mit Ei-Prep-Lösung, um eine synchronisierte Kultur (Eier) zu erhalten. </li><li> Platte Eier auf mehrere 60-mm NGM-Platten ausgesät mit 10x konzentrierter OP50-1 mit einer Dichte von etwa 150-200 Eier / Platte. </li><li> Platten bei 25 ° C für 2 Tage (bis Würmer haben die L4 erreicht - Young Adult Stufe). </li></ol> 2. Vorbereiten Pseudomonas aeruginosa infiziert Platten und Worms <ol><li> Am Tag des Ei-Prep (Schritt 1.1) beimpfen eine PA14 :: GFP Kultur in 2 ml King-B-Medium, das Rifampicin in einer Endkonzentration von 100 ug / ml. Inkubieren der Kultur bei 37 ° C unter Rühren O / N. </li><li> Platte der PA14 :: GFP Kulturtur auf so viele Slow-Killing-Platten (SKP), die für den Test benötigt. Auf jeder SKP 150 mm Petrischale Pipette 75-100 ul gesättigten Kultur und mit einem sterilen Glasverteiler gleichmäßig verteilt. Die Inkubation bei 37 ° C für 20-24 Stunden. </li><li> Platten entfernen Inkubator und es ihnen ermöglichen, auf RT (~ 20 min) zu kühlen. Mit M9 Puffer, Wasch Würmer aus Schritt 1.4 auf PA14 :: GFP-Platten in einem minimalen Volumen der Flüssigkeit. Bei Verwendung von 150-mm-Platten, kann mehrere hundert Würmer auf einer einzigen Platte angeordnet sein. </li><li> Platten bei 25 ° C für 18-21 Stunden. Für P. aeruginosa-exponierten jungen erwachsenen Würmer, ist dies die Zeit Fenster, die optimale Verteilung der kolonisierten vs noncolonized Tiere. </li></ol> 3. Einrichten des Wormsorter Vor der Durchführung der Proben Art, sicherzustellen, dass die Maschine richtig funktioniert. Details finden Sie in http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43 erhalten werden kann, und the wesentlichen Schritte sind unten aufgeführt. <ol><li> Stellen Sie den Mantel Ventildruck auf ca. 5 psi (4,5-5,5 Bereich). </li><li> Um zu überprüfen, dass Mantel Fluiddurchsatz geeignet ist, legen Sie eine 15 ml konischen Röhrchen unter dem Spender, schalten Sie den Mantel-Ventil, und schalten Sie den Sorter-Ventil. Halten Sie das Röhrchen unter dem Spender für 60 Sekunden. Das Volumen in dem Rohr sollte 9-10 ml betragen. Wenn es außerhalb dieses Bereichs ist, passen Sie die Hülle Ventildruck. </li><li> Um sicherzustellen, dass Mantel Fluiddurchsatz (wie in Schritt 3.2 festgelegt) werden genaue Sortierung zu ermöglichen, testen Sie die Sortierrate mit 40 um Steuer Partikel: </li><li> Schalten Sie den Mantel Ventil. In etwa 25 ml der Kontrolle Partikellösung zum Stausee. </li><li> Schalten Sie den Ventilmantel und dem Probenventil. </li><li> Auf der Computer-Software, gehen Sie zum &quot;Steuerpartikel Modus&quot; und klicken Sie erwerben. </li><li> Stellen Sie sicher, dass der Partikeldurchflussrate ~ 5-8 Teilchen / sec, mit einem TOF (Time Of Flight) in etwa der Breitedes Teilchens, 40 um. Solch ein TOF bedeutet, dass nur ein einziges Objekt 40 um durchläuft in einer Zeit. Wenn die Werte außerhalb dieses Bereiches, passen Sie die Einstellungen (nach der Beschreibung oben) entsprechend. </li></ol> 4. Die Sortierung kolonisiert vs Noncolonized Worms <ol><li> Mit M9, waschen Würmer in 15 ml konischen Röhrchen. Lassen erwachsenen Würmer auf den Boden der Röhre durch die Schwerkraft sinken, und entfernen Sie den Überstand. Das Rohr wird mit frischem M9. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3-4x. Dies entfernt einen großen Anteil der Larven sowie überschüssige Bakterien und dauert etwa 10 min. </li><li> In Würmer an die wormsorter Behälter mit einem sanft-Mischen kleiner Rührstab. </li><li> Stellen anfänglichen Signalverstärkung durch Einstellen der Grün PMT auf 600 und die rote und gelbe PMT 200. </li><li> Start der Datenerfassung, um die Einstellungen anzupassen. </li><li> Ziel für eine Art Rate von 25 bis 30 Veranstaltungen (Würmer) pro Sekunde. Wenn die Anzahl Rate zu hoch ist, verdünnte die Würmer in dem Reservoir mit M9 entsprechend. Wenn die Rate ano niedrig ist, mehr Würmer in einem kleinen Volumen M9. </li><li> Wenn das Experiment erfordert eine sehr strenge Trennung der kolonisierten vs noncolonized Würmer, stellen Sie die &quot;Koinzidenzprüfung&quot; auf &quot;reine&quot;. Dies gewährleistet, dass im Falle zweier Objekte zu nahe aneinander auftreten oder in der gleichen Tropfen, die Maschine weist die Tropfen nicht gesammelt wird. </li><li> Um die Bevölkerung von Interesse zu sortieren, ziehen Toren um die Achsen der Größe anzeigt (zu erwachsenen Würmern zu erhalten) und Fluoreszenz-Intensität (dh hoch für kolonisiert, niedrig für noncolonized). Die Werte für die Fluoreszenz Gating muss empirisch ermittelt werden. </li><li> Legen Sie ein Multi-Well-Platte oder eine Petrischale unter dem Spender, um Würmer zu sammeln öffnen Sie dann die Art Ventil Sortier Würmer zu beginnen. </li><li> Sammeln Sie eine kleine Population von Tieren, die unter dem Mikroskop, dass die Bevölkerung sortiert ist die Bevölkerung von Interesse zu überprüfen. Wenn nicht, passen Sie die Gating-Parameter und weiterhin mit Probenentnahme. </li></ol>

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<li>Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+immune+responses+from+pathogen+colonization+supports+pattern+recognition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans.</a> PLoS One. , 7 (2012).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Methode, die wir beschreiben, nutzt Fluoreszenzmarkierung von Einrichtungen außerhalb der Schnecke, um Wechselwirkungen zwischen der Schnecke und ihrer Umgebung zu folgen. In dem Fall, wir präsentieren, wurde die Trennung über die Kennzeichnung von einem Krankheitserreger und wurde zu trennen Würmer mit schweren Krankheitserreger Last von diejenigen, die keine (oder Licht) Last eingesetzt. Nachfolgende Genexpressionsanalyse fanden keinen Unterschied in der Immunantworten zwischen den beiden Gruppen nahe legt, dass s...

Automatische Sortierschnecke ist ähnlich wie FACS, Betriebs durch Messen eines Fluoreszenzsignals in einer Schnecke (typischerweise durch transgene Expression von Reporterproteinen zur Verfügung gestellt), wie es geht in ein Rohr gerichtet, so dass die Umleitung entweder zu einem Sammelrohr / Vertiefung oder zu einem Abfallbehälter nach um Gating Parameter durch den Forscher 1 gesetzt. Die wormsorter kann die Forschung in vielerlei Hinsicht zu erleichtern, ein Beispiel der Verwendung es als analytisches Werkzeug ist eine Studie, die räumlich-zeitliche Muster der Promotoraktivität für fast 1.000 Gene 2 gefolgt. Jedoch ist die Hauptanwendung des wormsorter in genetischen Screens, folgende Zielgenexpressionsniveaus oder Lokalisation des fluoreszierenden Proteins entlang der Achse der Schnecke 3-5. Hier beschreiben wir eine neue Anwendung für die wormsorter, in folgenden Kolonisierung der Wurm von einem fluoreszenzmarkierten Erregers. Mit diesem als ein Werkzeug, das wir auf die Beziehung zwischen pathog fokussierten Kolonisation / Last und der Immunantwort, um neue Einblicke in die Mechanismen für die Initiierung von Immunreaktionen in der Wurm verantwortlich zu gewinnen. In praktisch allen bisher untersuchten Organismen, Initiierung der angeborenen Immunantwort gegen mikrobielle Krankheitserreger, hängt von der Anerkennung pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) und / oder Gefahr / Schaden-associated molecular patterns (gedämpft) 6,7. Die ersten konserviert sind mikrobielle Strukturen, Komponenten der mikrobiellen Zellwand, seine Flagellum oder dessen Lipid-Doppelschicht 6 umfassen, der zweite umfassen sowohl freigesetzten Moleküle (z. B. ATP 8), veränderte Proteine ​​oder andere Marker von veränderten zellulären Prozessen 9,10. Beide Arten von Signalen sind als Mustererkennungsrezeptoren (PRRS), die auf spezifische Bindung eines Moleküls aktivieren Muster eine Kette von Ereignissen, die eine schützende Antwort bezeichneten Proteinen erkannt. C elegans ist extrem nützlich als tracta gewesenble Modell, um verschiedene Aspekte der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu sezieren, aber eine Sache, die nicht gut verstanden wird, ist, wie Immunantworten werden in der Wurm gestartet. Keiner der vermeintlichen Rezeptoren, die orthologen zu pattern recognition receptors (PRR) in anderen Organismen haben gezeigt, dass PAMPs zu binden, und viele der Orthologen von PRRS, die entscheidend für Immunreaktionen in andere Organismen sind eine überraschend begrenzten Beitrag zur Schnecken Erreger Antworten und Widerstand. Zum Beispiel wird das Drosophila Toll-Rezeptor, die für Gram-positive Pathogene Widerstand ist, in C dargestellt elegans durch eine einzige Homolog, tol-1, die Schutz gegen gramnegative Erreger Salmonella Typhimurium 11 trägt, nicht aber von anderen getesteten Gram-negative oder-positive Erreger 11,12. Diese Beobachtungen, zusammen mit Daten, die anzeigen, dass Immunantworten konnte durch Unterbrechung zellulären Proteintranslation h induziert werdenso führte einige darauf hin, dass C. elegans erkennt vor allem dämpft 9,13,14. Dennoch deuten Berichte beschreiben Fähigkeit von toten Krankheitserreger, Immunantworten zu induzieren, dass PAMP Bindung kann eine wichtige Rolle in Krankheitserreger Anerkennung in C haben werden elegans 15,16. Frühere Arbeiten mit Schwerpunkt auf Immunantworten in alters synchronisiert genetisch identisch C. elegans Populationen zeigten große individuelle Unterschiede in der Darmbesiedlung durch die bakterielle Gram-negative Krankheitserreger Pseudomonas aeruginosa. Allerdings Transkriptionsprofilierung Studien behandelt diese variabel kolonisierten Bevölkerung als eine Einheit 17,18. Unter Ausnutzung dieser Variabilität, wir ein Protokoll Fokussieren eines automatisierten wormsorter differentiell kolonisiert Populationen von Caenorhabditis elegans an GFP-exprimierenden S. ausgesetzt trennen entwickelten aeruginosa. Untersuchung der Genexpression in unterschiedlich kolonisierten Bevölkerung Facilitated Beurteilung der Beziehung zwischen Keimmenge (und der damit verbundenen Schädigung) und Immunreaktionen und lieferte neue Erkenntnisse über Pathogen Erkennung in C. elegans 19. Nachfolgend beschreiben wir das Protokoll, die angewendet könnten, um Würmer mit einem Fluoreszenz-markierten Erreger infiziert zu sortieren. Potenziellen Anwendern ist anzumerken, dass die Anzahl der Würmer erforderlich aussortiert werden müssen, hängt von der Art der nachfolgenden Analysen und Protokolle benutzt werden. Zum Beispiel im Fall von Microarray-Genexpressionsanalyse,&gt; 1.000 Würmer werden benötigt, um genügend RNA zu erhalten, wenn Standard-Protokolle verwendet werden, aber ~ 100 Würmer würde genügen, wenn Verstärkung eingesetzt wird, die eine schnelle Sammlung von Material und damit Minimierung von Stress zu die Würmer.

<table><tbody><tr><td>M9 Puffer</td> im <td>Haus</td><td></td> zubereitet <td>Rezept bei wormbook.org</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma R3501</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eizubereitungslösung</td> im <td>Haus</td><td></td><td>hergestellt 50 ml Wasser; 40 ml Bleichmittel; 10 ml 10 N Natriumhydroxid</td></tr><tr><td>NGM-Platten</td><td>im Haus</td><td></td> hergestellt <td>Rezept bei wormbook.org</td></tr><tr><td>SKP-Platten</td> im <td>Haus hergestellt</td><td></td><td>Rezeptur wie NGM, nur 0,35 % Pepton statt 0,25 %</td></tr> <tr><td>Kontrolltestpartikel</td><td>Union Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr></tbody></table>

automatische trennung von<em&gt; c. elegans</em&gt; variabel durch einen bakteriellen erreger kolonisiert

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Die wormsorter ist ein Instrument analog zu einem FACS-Maschine, die in den Studien von Caenorhabditis elegans verwendet wird, in der Regel, um Würmer, basierend auf der Expression eines fluoreszierenden Reporter sortieren. Hier stellen wir eine alternative Nutzung dieses Instruments für die Sortierung Würmer nach dem Grad der Kolonisierung durch einen GFP-exprimierenden Erregers. Diese neue Nutzung gestattet uns die Beziehung zwischen Kolonisierung des Darms Schnecke und Induktion von Immunreaktionen zu adressieren. Während C. elegans Immunreaktionen auf verschiedene Erreger dokumentiert worden ist, ist es noch nicht bekannt, was sie veranlasst. Die beiden wichtigsten Möglichkeiten (die nicht gegenseitig ausschließen) sind Anerkennung der pathogen-associated molecular patterns, und den Nachweis von Schäden, die durch eine Infektion verursacht. Um zwischen den beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, muss die Exposition gegenüber dem Erreger aus der von ihm verursachten Schäden getrennt werden. Die wormsorter aktiviert Trennung von Würmern, die durch Gram-n extensiv besiedelt wurdenegative Erreger Pseudomonas aeruginosa, mit dem Schaden wahrscheinlich durch Erreger Last verursacht, von Würmern, die in ähnlicher Weise exponiert waren, aber nicht, oder geringfügig besiedelt. Diese unterschiedliche Populationen wurden verwendet, um die Beziehung zwischen Keimmenge und der Induktion von Immunantworten Transkriptions beurteilen. Die Ergebnisse legen nahe, dass die beiden dissoziiert, unterstützt die Möglichkeit der Krankheitserreger Erkennung.

Wenn bei gleichaltrigen, genetisch identisch C. elegans sind P. ausgesetzt aeruginosa, wird eine breite Verteilung in Stufen der Kolonisation (Fig. 1A) beobachtet. Mit Hilfe des hier beschriebenen effiziente Trennung von noncolonized kolonisiert Würmer erreicht werden (Abbildung 1B) Protokoll. Im Gegensatz zu noncolonized Würmer, Würmer kolonisiert zeigen Anzeichen von Schäden, wie Trägheit und reduziert Stuhlgang 19. Letzteres kann ein Grund, warum...

Die wormsorter erleichtert genetische Screens in Caenorhabditis elegans durch Sortieren Würmer nach Ausdruck von fluoreszierenden Reporter. Hier beschreiben wir eine neue Nutzung: Sortierung nach einer Besiedlung durch GFP-exprimierenden Krankheitserreger, und wir beschäftigen sie, um die schlecht verstanden Rolle der Erreger Anerkennung bei der Einleitung Immunantwort zu untersuchen.

Automatische Trennung von<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabel durch einen bakteriellen Erreger kolonisiert

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Beiträge der Kolonisation und der damit verbundenen Schädigungen für die Initiation der angeborenen Immunantwort bei See-Asseln zu bewerten. Dies wird erreicht, indem man eine synchronisierte Population junger erwachsener See-Asseln Pseudomonas arosa aussetzt, die das grün fluoreszierende Protein oder GFP exprimieren, wodurch eine Population von Würmern entsteht, die unterschiedlich stark durch den Erreger kolonisiert sind. Nach dem Waschen werden die unterschiedlich kolonisierten Würmerpopulationen in reine Populationen aufgeteilt, wobei der Fokus auf den beiden Extremen – vollständig kolonisierte und nicht kolonisierte Würmer – liegt.Anschließend wird RNA aus diesen Populationen extrahiert und die Expression von Immunogenen im Vergleich zu Würmern, die auf nicht-pathogenem e coli gezüchtet wurden, bewertet. Um den Zusammenhang zwischen Immunantwort und Besiedlung zu untersuchen, werden Ergebnisse erhalten, die zeigen, dass die angeborene Immunantwort von sea elegance gegenüber p arosa von der Pathogenbesiedlung entkoppelt werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Ansätzen zur Untersuchung der

automated-separation-c-elegans-variably-colonized-bacterial

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Taylor, M. N., et.al. Verwendung von Einzelwurmdaten zur Quantifizierung der Heterogenität bei Caenorhabditis elegans-bakteriellen Interaktionen. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt die Exposition von keimfreien, altersangepassten Caenorhabditis elegans-Würmern gegenüber einem Bakterienstamm zur Darmbesiedlung. Sie erklärt die selektive Entfernung von nicht anhaftenden und externen Bakterien, wobei nur lebensfähige Bakterien, die am Darmepithel haften, zur Quantifizierung übrig...

Bewertung der bakteriellen Besiedlung im Darm bei keimfreien C. elegans

Quelle: Petersen, C. et al., Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt die Isolierung und Kultivierung von Bakterienarten, die mit Caenorhabditis elegans assoziiert sind. Eine perlenbasierte Lyse von C. elegans, gefolgt von selektiver Kultivierung, ermöglicht die Isolierung verschiedener mikrobieller Stämme für weitere Analysen.

Isolierung und Kultivierung von Caenorhabditis elegans-assoziierten Bakterien

Quelle: Chen, Y., et al. Bewertung von Virulenz und Pathogenese der Aeromonas-Infektion in einem Caenorhabditis elegans-Modell . J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video demonstriert einen Überlebenstest mit C. elegans , um die Pathogenese von Aeromonas zu modellieren, bei der die orale Aufnahme der Bakterien zu Darminfektionen und Sterblichkeit führt und so eine quantitative Bewertung der bakteriellen Virulenz in einem lebenden Wirtssystem ermöglicht.

Modellierung der Aeromonas-Pathogenese bei C. elegans mit einem Überlebenstest

Quelle: Le, T. A. N. et al., Messung der Auswirkungen von Bakterien und Chemikalien auf die Darmdurchlässigkeit von Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video demonstriert einen fluoreszenzbasierten Test zur Quantifizierung der Darmpermeabilität von C. elegans, der Pseudomonas aeruginosa ausgesetzt ist. Im Vergleich zu Kontrollen, die mit Escherichia coli gefüttert wurden, zeigen pathogen-behandelte Würmer eine erhöhte Fluorophor-Leckage in die Körperhöhle, was auf Schäden an der...

Beurteilung der Darmpermeabilität bei C. elegans nach bakterieller Exposition

Hier präsentieren wir Ihnen den Fadenwurm Caenorhabditis Elegans als eine vielseitige Grundmodell, mikrobielle Wechselwirkungen zu studieren.

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans - ein vielseitig In Vivo Modell zur Host-Mikroben-Interaktionen

Hier beschreiben wir eine Protokoll, die ist ein anpassungsfähiges, ganze Host, High-Content-Screening-Tool, das genutzt werden kann, um Wirt-Pathogen Interaktionen zu untersuchen und für die Wirkstoffforschung verwendet werden.

Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem

Wilde Caenorhabditis-Nematoden sind mit vielen Mikroben assoziiert, oft im Darmlumen oder im Darm. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Anreicherung von nicht kultivierbaren Mikroben, die den Darm besiedeln, unter Ausnutzung der Widerstandsfähigkeit der Dauerkutikula.

Selektive Reinigung von wilden Caenorhabditis-Nematoden zur Anreicherung von Darmmikrobiombakterien

Darmmikroben, einschließlich extrazellulärer Bakterien und intrazellulärer Krankheitserreger wie dem Orsay-Virus und Mikrosporidien (Pilze), sind oft mit wilden Caenorhabditis-Nematoden assoziiert. Dieser Artikel stellt ein Protokoll zum Nachweis und zur Quantifizierung von Mikroben vor, die C. elegans-Nematoden besiedeln und/oder infizieren, und zur Messung der Erregerlast nach kontrollierten Infektionen im Labor.

RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung mikrobieller Besiedlung und Infektion im Darm von Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll beschreibt eine 96-Well-Störung einzelner bakteriell besiedelter Caenorhabditis elegans nach Kältelähmung und Oberflächenbleiche, um externe Bakterien zu entfernen. Die resultierende Suspension ist auf Agarplatten plattiert, um eine genaue Quantifizierung der Keimbelastung in einer großen Anzahl einzelner Würmer mit mittlerem Durchsatz zu ermöglichen.

Verwendung von Einzelwurmdaten zur Quantifizierung der Heterogenität bei Caenorhabditis elegans-bakteriellen Interaktionen

Caenorhabditis elegans ist eine der wichtigsten Modellarten in der Biologie, aber fast alle Forschungen werden in Abwesenheit ihrer natürlich assoziierten Mikroben durchgeführt. Die hier beschriebenen Methoden werden dazu beitragen, die Vielfalt assoziierter Mikroben als Grundlage für zukünftige funktionelle C. elegans-Forschung besser zu verstehen.

Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans

Erfahren Sie die automatische Trennung von C. elegans durch Wormsorter basierend auf der Kolonisierung mit GFP-markiertem Pseudomonas aeruginosa. Diese Methode ermöglicht die Analyse angeborener Immunantworten unabhängig vom Infektionsgrad.

Automatische Trennung von

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