Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, posttranslationale Modifikationen von Proteinen zu identifizieren, die in pflanzlichen Protein-Komplexen vorkommen und zunächst transient oder stabil in Pflanzen exprimiert werden, wobei das Protein von Interesse getaggt ist. Anschließend werden die Gesamtproteine aus dem Pflanzengewebe extrahiert und das Protein von Interesse immunpräzipitiert. Danach werden die immunpräzipitierten Proteine mittels eines Acrylamid-Gels getrennt, und die Proteine aus dem gewünschten Band des Gels werden extrahiert und verdaut.

Reichen Sie nun die Proteinproben zur Massenspektrometrie ein. Letztendlich können die Ergebnisse der Massenspektrometrie dynamische Veränderungen bei posttranslationalen Modifikationen wie der Phosphorylierung nachweisen. Im Gegensatz zu alternativen Methoden wie der In-vitro-Inkubation von Kinase mit Substrat exprimiert diese Methode Proteine in Planter.

Sie müssen also nicht wissen, welcher Kinas für die Phosphorylierung verantwortlich ist. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Pflanzenbiologie zu beantworten, beispielsweise wie Signale als Reaktion auf Stress, Umweltveränderungen oder die Erkennung von Pathogenen weitergeleitet werden. Neben der Identifizierung von Phosphorylierungsstellen aktivierter Resistenzproteinkomplexe kann diese Methode allgemein auf jede posttranslationale Modifikation beliebiger pflanzlicher Proteinkomplexe angewendet werden.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da sie nicht daran gewöhnt sind, mit großen Mengen von Extrakt zu arbeiten und mehrere Schritte des Protokolls an einem einzigen Tag durchzuführen. Für die transiente Expression die Agrobacterium-tumefaciens-Stämme bis zur stationären Phase kultivieren. Die Agrobakterien durch Zentrifugation bei 3000 ×g für fünf Minuten pellettieren.

Suspendieren Sie die Pellets erneut und verwenden Sie Infiltrationspuffer. Infiltrieren Sie nun vier Wochen alte N. benthamiana-Pflanzen mit Agrobakterien manuell mittels einer einkomponentigen Spritze ohne Nadel mit einem Volumen von einem Milliliter oder durch Vakuuminfiltration mit 0,02 % Tensid, zwei bis fünf Tage nach der Infiltration.

Die infiltrierten Blätter ernten, einfrieren in flüssigem Stickstoff und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Danach 20 Gramm Pflanzengewebe mit flüssigem Stickstoff in einem Mörser fein mahlen und zu den 20 Gramm 80 Milliliter kalte Pufferlösung C hinzufügen. Gut mischen und auf Eis auftauen lassen.

Homogenisieren Sie nun mit drei Impulsen zu je 10 Sekunden bei voller Geschwindigkeit. Filtern Sie das Homogenat und zentrifugieren Sie es 30 Minuten bei 30.000 G bei vier Grad Celsius. In der Zwischenzeit geben Sie 100 Mikroliter einer geeigneten Affinitätsmatrix mit 500 Mikrolitern kaltem Blockierpuffer D fünf Minuten bei vier Grad Celsius und waschen Sie dreimal mit je einem Milliliter kaltem Puffer D. Entfernen Sie anschließend den Überstand des Blattextrakts und filtrieren Sie ihn durch eine 0,45-Mikrometer-Spritze.

Abfiltrieren in ein neues Gefäß auf Eis. Aliquote des rohen Extrakts herstellen. Für eine Immunblot-Analyse.

Geben Sie fünf XSDS-Puffer zum Probenaufschluss hinzu, wirbeln und erhitzen Sie die Proben zum Denaturieren. Geben Sie 50 Mikroliter der Affinitätsmatrix, in Puffer D suspendiert, zu jedem Reaktionsgefäß hinzu. Inkubieren Sie unter leichtem Rühren zwei Stunden bei vier Grad Celsius, zentrifugieren Sie, um die Affinitätsmatrix zu pelletieren.

Entnehmen Sie dann eine Aliquot aus dem ungefundenen Extrakt für eine Immunblot-Analyse. Entsorgen Sie den Rest der Probe, wobei etwa 500 Mikroliter am Boden des Röhrchens verbleiben. Resuspendieren Sie die Trübungslösung mit einer Weitbohrpipettenspitze.

Vereinigen Sie die gemischte Suspension beider Röhrchen in einem einzigen 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie dreimal kurz für jeweils fünf Sekunden in einer Tischzentrifuge, um die Affinitätsmatrix zu pelletieren, und entfernen Sie danach den Überstand nach drei bis fünf Waschschritten mit je einem Milliliter kaltem Puffer D. Entfernen Sie den überschüssigen Puffer D und eluieren Sie mit 200 Mikrolitern des geeigneten Elutionspuffers unter kontinuierlichem Schütteln. Sammeln Sie die drei EITs in einem einzigen Röhrchen.

Anschließend konzentrieren Sie die Proteine durch Verwendung von 30 Mikroliter Absorptionsharz im Vortex. Lassen Sie fünf Minuten stehen, um das Harz auszufällen, und entfernen Sie den Überstand. Geben Sie 50 Mikroliter eines 1×-SDS-PAGE-Lade-Puffers auf die präzipitierte Affinitätsmatrix oder das Absorptionsharz im Vortex und erhitzen Sie zehn Minuten bei 80 bis 100 Grad Celsius in einem Heizblockzentrifugen.

Die gekochte Affinitätsmatrix wird zwei Minuten bei 10.000 als Harz zentrifugiert. Entnehmen Sie fünf Mikroliter der Überstandsaliquot für die Immunblockade und laufen Sie diese zusammen mit den anderen Fraktionen auf einer 10 Zentimeter langen SDS-Page-Gel auf. Das Gel dient der Trennung und Identifizierung phosphorylierter Proteine mittels Massenspektrometrie.

Laden Sie die verbleibenden 45 Mikroliter auf ein SDS-Page-Gel ein und färben Sie es. Das SDS-Page-Gel mit kolloidalem Kamasi-Brilliantblau. Danach fixieren Sie das Gel durch mehrfaches Waschen mit Wasser, vorzugsweise über Nacht.

Entfernen Sie nun mit einem sauberen Skalpell die gewünschte Bande aus dem Gel, schneiden Sie den Gelausschnitt in Würfel von zwei bis vier Millimetern Größe und überführen Sie die Probe in ein Röhrchen. Waschen Sie die Gelstücke mit 50 % Acetonitril und 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat, bis die Färbung entfernt ist. Danach pipettieren Sie die Lösung ab.

Darauf achten, dass die Gelstücke nicht entfernt werden. Die Probe mit 100 % Acetonitril fünf Minuten lang dehydrieren und die freie Flüssigkeit entfernen. Dann die Disulfidbindungen der Proteine mit 10 Millimolar DTT reduzieren und 30 bis 45 Minuten bei 56 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren, anschließend die freie Flüssigkeit entfernen, um die Cysteinreste zu alkylieren.

Fügen Sie 55 Millimolar Chloracetamid für 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln hinzu. Entfernen Sie die freie Flüssigkeit und waschen Sie die Gelstücke anschließend zweimal mit 50 % Acetonitril für jeweils 10 Minuten. Entfernen Sie die freie Flüssigkeit.

Dehydrieren Sie die Gelstücke nun mit 100 % Acetonitril für fünf Minuten und entfernen Sie die freie Flüssigkeit für die Trypsverdauung. Geben Sie 40 Mikroliter Trypsinarbeitslösung hinzu und lassen Sie die Gelstücke 10 Minuten lang in ausreichend Verdauungspuffer, um die Gelstücke zu rehydrieren. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius, um den Verdau zu stoppen, und extrahieren Sie die Peptide aus den Gelstücken durch Ultraschallbehandlung in 5 %iger Ameisensäure für fünf bis 10 Minuten.

Anschließend das Überstand auf ein neues Röhrchen überführen, die Peptide durch Lyophilisierung oder einen Vakuumkonzentrator trocknen und die Proben bei minus 20 Grad Celsius lagern. Dieses Experiment dient der Reinigung des P-R-F-P-T-O-Kinase-Komplexes aus Nacoa hamana. Eine transgene NACOA hamana, die 35 SPTO exprimierte, wurde vorübergehend mit 35 SPRF Flag transformiert, und der Komplex wurde mittels Anti-Flag M zwei Aros immunpräzipitiert. Die Immunblots zeigen eine effiziente Immunpräzipitation des gezielten PRF-Proteins; sowohl PTO als auch das interagierende Effektorprotein wurden zusammen mit PRF mitgereinigt, wie durch Antikörpernachweis und Massenspektrometrie-Analyse belegt wird.

Hier bestand die Strategie darin, das PTO-Protein mit Anti-Flag zu targetieren. Die Strategie wurde geändert, um die Phosphorylierungsstellen von PTO zu identifizieren.

Die gesamte Menge des PTO-Proteins, bestehend aus dem PRF-Komplex und der freien Form, wurde mit Anti-Flag M zwei aros immunpräzipitiert und einer SDS-Page-Fraktionierung, In-Gel-Tryptisch-Digestion sowie einer massenspektrometrischen Analyse unterzogen, wodurch PTO-Peptide ermittelt wurden, die etwa 80 % seiner Sequenz abdecken. Interessanterweise wurden eine Reihe einzelner Phosphorylierungsstellen für PTO-Peptide identifiziert. Beachten Sie, dass doppelte Phosphorylierungsstellen nur in Gegenwart eines der Effektorproteine nachgewiesen wurden.

Es ist wichtig, ausreichende Mengen an pflanzlichem Protein zu erhalten, um Komponenten eines Protein-Komplexes identifizieren und posttranslationale Modifikationen eines Proteins von Interesse nachweisen zu können. Beachten Sie, dass die Kartierung von Modifikationen wie Phosphorylierung eine angemessene Menge an Protein für die Massenspektrometrie erfordert, sodass nach diesem Verfahren mindestens ein schwacher Band auf Ihrem Gel sichtbar sein sollte. Weitere Methoden, wie beispielsweise die Identifizierung von Komplexbestandteilen, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, etwa wie die Aktivierung von Immunkomplexen zu funktionaler Immunität führt.

Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit organischen Puffern, Bakterien und Rasierklingen äußerst gefährlich sein kann; treffen Sie daher Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Labormänteln.