Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, posttranslationale Modifikationen von Proteinen zu identifizieren, die an pflanzlichen Proteinkomplexen beteiligt sind, die zuerst transient oder stabil in Plana exprimiert werden. Extrahieren Sie dann die Gesamtproteine aus dem Pflanzengewebe und fällen Sie das Protein von Interesse mit Immun. Trennen Sie anschließend die immunpräzipitierten Proteine auf einem Acrylamid-Gel und extrahieren und verdauen Sie die Proteine aus der interessierenden Gelbande.

Reichen Sie nun die Proteinproben für die Massenspektrometrie ein. Letztendlich können die Ergebnisse der Massenspektrometrie dynamische Veränderungen in posttranslationalen Modifikationen wie der Phosphorylierung nachweisen. Im Gegensatz zu alternativen Methoden wie der in vitro Inkubation von Kinase mit Substrat exprimiert diese Methode Proteine im Pflanzgefäß.

Sie müssen also nicht wissen, welche Kinase für die Phosphorylierung verantwortlich ist. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Pflanzenbiologie zu beantworten, z. B. wie Signale als Reaktion auf Stress, Umweltveränderungen oder die Erkennung von Krankheitserregern übertragen werden. Neben der Identifizierung von Phosphorylierungen, Stellen aktivierter Resistenzproteinkomplexe, kann diese Methode auf breite Palette auf jede posttranslationale Modifikation eines beliebigen pflanzlichen Proteinkomplexes angewendet werden.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie es nicht gewohnt sind, mit großen Mengen an Extrakt zu arbeiten und mehrere Schritte des Protokolls an einem einzigen Tag durchzuführen. Für eine transiente Expression züchten Sie die Agrobacterium-Tohin-Stämme in die stationäre Phase. Ernten Sie die Agrobakterien durch Zentrifugation bei 3000 g für fünf Minuten.

Resuspendieren Sie die Pellets und den Infiltrationspuffer. Puffer. Infiltriert jetzt. Vier Wochen alte NCOA-Hamana-Pflanzen mit Agrobakterien manuell mit einer Ein-Milliliter-Nadelspritze oder durch Vakuum mit 0,02 % Tensid, zwei bis fünf Tage nach der Infiltration.

Ernten Sie die infiltrierten Blätter, Blätter, frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Als nächstes mahlt er 20 Gramm Pflanzengewebe und flüssigen Stickstoff mit einem Mörser und Stößel bei 80 Millilitern Kaltpuffer C auf 20 Gramm. Gut vermischen und auf Eis auftauen.

Homogenisieren Sie nun mit drei Bursts à 10 Sekunden bei voller Geschwindigkeit. Filtrieren Sie das Homogenat und zentrifugieren Sie es bei 30.000 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Währenddessen 100 Mikroliter geeigneter Affinitätsmatrix bei 500 Mikrolitern Kältepuffer D für fünf Minuten bei vier Grad Celsius erhitzen und dreimal mit einem Milliliter Kältepuffer D waschen. Als nächstes wird das Supernat des Blattextrakts entfernt und durch eine 0,45 Mikrometer Spritze geleitet.

In eine neue Tube auf Eis filtrieren. Aliquotieren Sie den Rohextrakt. Für einen Immun-Blot.

Fügen Sie fünf XSDS-Pufferwirbel zum Laden von Seiten hinzu und kochen Sie die Proben, um sie zu denaturieren. Geben Sie 50 Mikroliter der Affinitätsmatrix, suspendiert in Puffer D, zu jedem Röhrchen. Zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius in sanfter Rotation inkubieren, zentrifugieren, um die Affinitätsmatrix zu pelletieren.

Nehmen Sie dann ein Aliquot des ungebundenen Extrakts für einen Immunblot. Entsorgen Sie den Rest des Sanes und lassen Sie etwa 500 Mikroliter am Boden des Röhrchens. Resuspendieren Sie die Güllelösung mit einer Spitze mit breiter Bohrung.

Die gemischte Güllelösung aus beiden Röhrchen in einem einzigen 1,5-Milliliter-Röhrchen zusammenfassen. Pulsieren Sie dreimal für fünf Sekunden mit einer Tischzentrifuge, um die Affinitätsmatrix auszufällen, und entfernen Sie das Supernat nach drei bis fünf Wäschen mit einem Milliliter Kaltpuffer D. Entfernen Sie den überschüssigen Puffer D mit einer Spritze, die Nadel eluiert mit 200 Mikrolitern des entsprechenden Elutionspuffers unter ständigem Schütteln. Ziehe die drei EITs in ein einziges Rohr.

Konzentrieren Sie dann die Proteine mit 30 Mikrolitern Absorptionsharzwirbel. Lassen Sie uns fünf Minuten stehen bleiben und das Harz ausfällen, entsorgen wir das Supernat. Geben Sie 50 Mikroliter eines XSDS-Seitenladepuffers in die ausgefällte Affinitätsmatrix oder den Absorptionsharzwirbel und kochen Sie 10 Minuten lang bei 80 bis 100 Grad Celsius in einer Heizblockzentrifuge.

Die gekochte Affinitätsmatrix besteht aus Harz für zwei Minuten bei 10.000. GS aliquotieren Sie fünf Mikroliter des Supernats für den Immunblock und lassen Sie es mit anderen Fraktionen auf eine 10 Zentimeter lange SDS-Seite laufen. Gel zur Trennung und Identifizierung von phosphorylierten Proteinen mittels Massenspektrometrie.

Laden Sie die restlichen 45 Mikroliter auf einen SDS-Page-Gel-Fleck. Das SDS-Seitengel mit kolloidalem Kamasi Brilliance Blue. Bewahren Sie das Gel dann mit reichlichem Waschen und Wasser auf, vorzugsweise über Nacht.

Schneiden Sie nun mit einem sauberen Skalpell die interessierende Bande aus dem Gel aus, würfeln Sie die Gelscheibe in Würfel von zwei bis vier Millimetern und geben Sie die Probe in ein Röhrchen. Waschen Sie die Gelstücke mit 50% Acetonitril und 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat, bis sie verfärbt sind. Pipettieren Sie dann die Lösung ab.

Achten Sie darauf, keine Gelstücke zu entfernen. Dehydrieren Sie die Probe fünf Minuten lang mit 100 % Acetonitril und entfernen Sie die freie Flüssigkeit. Um dann die Protein-Di-Sulfid-Bindungen bei 10 Millimolar DTT zu reduzieren und 30 bis 45 Minuten bei 56 Grad Celsius unter Schütteln zu inkubieren, entfernen Sie nun die freie Flüssigkeit zu Alkylat-Cystein-Rückständen.

Geben Sie 55 millimolare Chloracetamid für 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln hinzu. Entfernen Sie die freie Flüssigkeit und waschen Sie die Gelstücke zweimal 10 Minuten lang mit 50% Acetonitril. Freie Flüssigkeit entfernen.

Dehydrieren Sie nun die Gelstücke fünf Minuten lang mit 100% Acetonitril und entfernen Sie die freie Flüssigkeit für den Triptychon Digest. Lassen Sie die Gelstücke bei 40 Mikrolitern Trypsin-Arbeitslösung 10 Minuten lang mit genügend Verdauungspuffer rehydrieren, um die Gelstücke zu bedecken. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius, um die Verdauung zu stoppen, und extrahieren Sie die Peptide aus den Gelstücken bei 5 % Ameisensäure-Ultraschall für fünf bis 10 Minuten.

Dann überführen Sie das Supernat in ein neues Röhrchen, trocknen die Peptide durch Lyophilisation oder einen Vakuumkonzentrator und lagern die Proben bei minus 20 Grad Celsius. Dieses Experiment reinigt den P-R-F-P-T-O-Kinase-Komplex aus Nacoa Hamana, ein transgenes NACOA hamana, das 35 SPTO exprimiert, wurde transient mit 35 SPRF Flag transformiert, und der Komplex wurde mit Anti-Flag M zwei aros immunpräzipitiert. Die Immuno-Blots veranschaulichen die effiziente Immunpräzipitation des zielgerichteten PRF-Proteins, wobei sowohl PTO als auch das interagierende Effektorprotein mit PRF co-gereinigt wurden, wie durch Antikörperdetektion und Massenspektrometrie-Analyse gezeigt.

Hier bestand die Strategie darin, das PTO-Protein mit Anti-Flag zu bekämpfen. Die Strategie wurde geändert. Zur Identifizierung von PTO-Phosphorylierungsstellen.

Die Gesamtmenge des PTO-Proteins, die sowohl den PRF-Komplex als auch die Freiform umfasste, wurde mit Anti-Flag M zwei aros immunpräzipitiert und einer SDS-Seitenfraktionierung, einem Ingel-Triptychon-Verdau und einer massenspektrometrischen Analyse unterzogen, was zu PTO-Peptiden führte, die etwa 80 % ihrer Sequenz umfassten. Interessanterweise wurde eine Reihe von einzelnen Phosphorylierungsstellen für PTO-Peptide identifiziert. Es ist zu beachten, dass doppelte Phosphorylierungsstellen nur in Gegenwart eines der beiden Effektorproteine identifiziert wurden.

Es ist wichtig, genügend pflanzliche Proteinmengen zu erhalten, um Bestandteile eines Proteinkomplexes zu identifizieren und auch die posttranslationale Modifikation eines Proteins von Interesse zu erkennen. Denken Sie daran, dass die Kartierung von Modifikationen wie der Phosphorylierung eine angemessene Menge an Protein aus der Massenspektrometrie erfordert, so dass zumindest eine schwache Bande auf Ihrem Gel sichtbar sein sollte. Nach diesem Verfahren gehen Sie vor. Andere Methoden, wie z.B. die Identifizierung komplexer Komponenten, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. wie die Aktivierung des Immunkomplexes zu einer funktionellen Immunität führt.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit organischen Puffern, Bakterien und Rasier-BBLs äußerst gefährlich sein kann, also treffen Sie Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Schoßmänteln.