Name: Zellbasierter Durchflusszytometrie-Assay zur Messung der zytotoxischen Aktivität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Lernen Sie einen zellbasierten Durchflusszytometrie-Assay zur Messung der zytotoxischen Aktivität antigen-spezifischer CD8+ T-Zellen gegen CD4+ Zielzellen. Diese Methode ermöglicht die präzise Quantifizierung lyrischer Einheiten.

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Diese Arbeit wurde vom Office of Tourism, Trade, and Economic Development of Florida unterstützt.

1. Präparation von Effektor-CD8+ T-Zellen
<ol>
	<li>Tauen Sie autologe kryokonservierte PBMC (2-3 Fläschchen à 50 x 106 Zellen) auf, indem Sie das Kryofläschchen von flüssigem Stickstoff in ein 37 °C warmes Wasserbad überführen.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen, indem Sie das Röhrchen auf 50 ml mit vollständigem RPMI füllen (4 mM L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin und Streptomycin, ergänzt mit 10% FBS). Zählen Sie PBMCs und resuspendieren Sie Zellen in einer Konzentration von 5 x 106/ml in vollständigem RPMI.</li>
	<li>Geben Sie spezifisches Peptid (5 μg/ml) und IL-2 (10 ng/ml) zu PBMCs.</li>
	<li>Aufbau der Kultur in einer 96-Deep-Well-Platte; 1 ml Zellsuspension in jede Vertiefung aussäen.</li>
	<li>Ersetzen Sie nach 3 Tagen Kultur die Hälfte des Zellkulturmediums durch frisches, vollständiges RPMI.</li>
	<li>Nach 6-tägiger Kultivierung werden alle PBMCs mit einer Mehrkanalpipette gesammelt und die Zellen in ein steriles Reservoir übertragen.</li>
	<li>Zählung, Waschen und Resuspendieren von PBMCs mit 5 x 107/ml im empfohlenen Trennpuffer in 14 ml Röhrchen mit rundem Boden. Geben Sie einen humanen CD8+ T-Zell-Anreicherungscocktail mit 50 μl/ml Zellen hinzu. Mischen und bei Raumtemperatur 10 min inkubieren. Magnetische Partikel mit 150 μl/ml zugeben und 5 min inkubieren.</li>
	<li>Bringen Sie die Zellsuspension auf bis zu 7 ml, indem Sie den Trennpuffer hinzufügen. Fahren Sie mit der immunomagnetischen Isolierung der unberührten CD8+ T-Zelle fort, indem Sie das Röhrchen in den Magneten einsetzen. Gießen Sie nach 5 Minuten, während sich das Röhrchen noch im Magneten befindet, die gewünschten Zellen in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen. Nehmen Sie ein kleines Aliquot und färben Sie die Zellen mit Antikörpern gegen CD3 und CD8 in 1X PBS-2% FBS für 30 min bei 4 °C. Die Reinheit der CD8+ T-Zellen kann dann mittels Durchflusszytometrie mit einer erwarteten Reinheit von 95% oder höher gemessen werden.</li>
	<li>Resuspendieren Sie CD8+ T-Zellen in 450 μl mit vollständigem RPMI.</li>
	<li>Geben Sie 225 μl des kompletten RPMI in 5 Schraubverschlussröhrchen.</li>
	<li>Bereiten Sie serielle Verdünnungen (von 1:2 bis 1:32) vor, indem Sie 225 μl CD8+ in das nächste Röhrchen überführen (siehe Abbildung 1 oben).</li>
</ol>
2. Präparation von CD4+ T-Zielzellen
<ol>
	<li>Tauen Sie autologe kryokonservierte PBMC (1 Fläschchen mit 50 x 106 Zellen) auf, indem Sie das Kryofläschchen von flüssigem Stickstoff in ein 37 °C heißes Wasserbad überführen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 10 ml RPMI.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen und resuspendieren Sie PBMCs bei 5 x 107/ml mit Trennpuffer in 14 ml Rundbodenröhrchen. Geben Sie einen humanen CD4+ T-Zell-Anreicherungscocktail mit 50 μl/ml Zellen hinzu. Mischen und bei Raumtemperatur 10 min inkubieren. Magnetische Partikel mit 100 μl/ml zugeben und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Bringen Sie die Zellsuspension auf bis zu 7 ml, indem Sie Trennpuffer hinzufügen. Fahren Sie mit der Isolierung von CD4+ T-Zellen fort, indem Sie das Röhrchen in den Magneten einsetzen. Gießen Sie nach 5 Minuten, während sich das Röhrchen noch im Magneten befindet, die gewünschten Zellen in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen. Nehmen Sie ein kleines Aliquot und färben Sie die Zellen mit Antikörpern gegen CD3 und CD4 in 1x PBS-2% FBS für 30 min bei 4 °C. Die Reinheit der CD4+ T-Zellen kann dann mittels Durchflusszytometrie mit einer erwarteten Reinheit von 95% oder höher gemessen werden.</li>
	<li>CD4+ T-Zellen zählen, in zwei konische 15-ml-Röhrchen aufteilen und in warmem 1x PBS waschen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 0,4 μM CFSE-hohe Arbeitslösung in warmem PBS vor.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 0,04 μM CFSE-Arbeitslösung mit niedriger Arbeitsleistung vor, indem Sie einen Teil der 10-fachen CFSE-Arbeitslösung in warmem PBS verdünnen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie Zellen bei 20 x 106/ml PBS (wenn die Anzahl der CD4+ T-Zellen weniger als 10 x 106/ml beträgt, resuspendieren Sie Zellen in 0,5 ml PBS) und färben Sie die Hälfte der CD4+ T-Zellen durch Zugabe eines gleichen Volumens 0,4 μM CFSE-Arbeitslösung (Endkonzentration 0,2 μM). Fügen Sie beispielsweise für 1 ml Zellen 1 ml der CFSE-Arbeitslösung hinzu. Die verbleibende Hälfte des CD4+ wird durch Zugabe eines gleichen Volumens von 0,04 μM CFSE-Arbeitslösung (Endkonzentration 0,02 μM) gebeizt. Zellen 15 min bei 37 °C in 5 % CO2 -Atmosphäre färben.</li>
	<li>Nach der Inkubation werden die Pelletzellen 5 Minuten lang bei 1.500 U/min gedreht und in 1 ml warmem vollständigem RPMI resuspendiert, um die Markierungsreaktion zu löschen.</li>
	<li>Pulsieren Sie CFSE-niedrige CD4+ T-Zellen durch Zugabe des interessierenden Peptids in einer Endkonzentration von 5 μg/ml im vollständigen RPMI und inkubieren Sie 45 Minuten lang in 5% CO2 -Atmosphäre bei 37 °C.</li>
	<li>Waschen Sie CFSE-hohe und CFSE-niedrige CD4+ T-Zellen in vollem RPMI. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt zwei Wäschen. Resuspendieren Sie in einer Konzentration von je 2 x 105 Zellen/ml in vollständiger RPMI.</li>
	<li>Mischen Sie die beiden Zielpopulationen im Verhältnis 1:1 (CFSE-Hoch:CFSE-Niedrig) (siehe Abbildung 1 unteres Bild).</li>
</ol>
3. Kokultur
<ol>
	<li>Aus jeder Verdünnung von CD8+ T-Zellen werden 100 μl in doppelter Ausführung auf eine 96-Well-Platte mit rundem Boden ausgedünnt.</li>
	<li>Fügen Sie die gemischten CD4+ T-Zielzellen (100 μl) zu jeder Verdünnung der Effektorzellen hinzu, um ein Endvolumen von 200 μl zu erhalten.</li>
	<li>Um die basale Apoptose zu messen, säen Sie 3 Vertiefungen nur mit Zielzellen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Kokultur für 6 Stunden in 5 % CO2 -Atmosphäre bei 37 °C.</li>
</ol>
4. Färbung und Erfassung in der Durchflusszytometrie
<ol>
	<li>Die Zellen werden auf eine 96-Well-Platte mit V-Boden umgefüllt und 15 Minuten lang in 5 % CO2 -Atmosphäre bei 37 °C mit PE-konjugierten pMHC-Tetrameren gefärbt</li>.
	<li>1x PBS-2% FBS einwaschen und die Zellen mit Far Red LIVE/DEAD fixierbaren toten Zellen, αCD3-Alexa700, αCD8-Percp, αCD4-Brilliant Violet 650 für 30 min bei 4 °C einfärben, lichtgeschützt.</li>
	<li>Zellen einmal mit 1x PBS-2% FBS waschen und in 100 μl mit 2% Formaldehyd in 1x PBS resuspendieren.</li>
	<li>Erfassen Sie Zellen mit einem Durchflusszytometer.</li>
</ol>

<ol><li>Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).</li>
<li>Betts, M. R., Harari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+function+of+protective+T+cell+immune+responses+in+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+HIV+AIDS%22%5BJournal%5D)">Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV.</a> Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).</li>
<li>Roder, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+immunodeficiency+disorder+in+humans+involving+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells.</a> Nature. 284, 553-555 (1980).</li>
<li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J. Immunol. 171, 27-31 (2003).</li>
<li>Byers, A. M., Kemball, C. C., Moser, J. M., Lukacher, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+rapid+in+vivo+CTL+activity+by+polyoma+virus-specific+effector+and+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: rapid in vivo CTL activity by polyoma virus-specific effector and memory CD8+ T cells.</a> J. Immunol. 171, 17-21 (2003).</li>
<li>Devevre, E., Romero, P., Mahnke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LiveCount+Assay%3A+concomitant+measurement+of+cytolytic+activity+and+phenotypic+characterisation+of+CD8%28%2B%29+T-cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">LiveCount Assay: concomitant measurement of cytolytic activity and phenotypic characterisation of CD8(+) T-cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 311, 31-46 (2006).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li>
<li>Mbitikon-Kobo, F. M., Bonneville, M., Sekaly, R. P., Trautmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+measurement+of+the+cytotoxic+capacity+of+human+primary+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo measurement of the cytotoxic capacity of human primary antigen-specific CD8 T cells.</a> J. Immunol. Methods. 375, 252-257 (2012).</li>
<li>Bryant, J., Day, R., Whiteside, T. L., Herberman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+lytic+units+for+the+expression+of+cell-mediated+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Calculation of lytic units for the expression of cell-mediated cytotoxicity.</a> J. Immunol. Methods. 146, 91-103 (1992).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%28%2B%29+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8(+) T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+metabolic%2C+functional%2C+and+cytolytic+differences+characterize+HIV-specific+CD8+T+cells+in+primary+and+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Profound metabolic, functional, and cytolytic differences characterize HIV-specific CD8 T cells in primary and chronic HIV infection.</a> Blood. 120, 3466-3477 (2012).</li>
<li>Hildemann, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Efficiency+of+Antiviral+CD4%28%2B%29+Killer+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High Efficiency of Antiviral CD4(+) Killer T Cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Der hier beschriebene Assay ermöglicht die Quantifizierung der Hauptfunktion von CD8+ T-Zellen: der zytolytischen Aktivität. Die genaue Messung dieser Funktion ist bei der Charakterisierung der Effektorfunktionen von CD8+ T-Zellen von größter Bedeutung, da frühere Studien über eine Diskordanz zwischen dieser Funktion und der Zytokinsekretion von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen berichteten10,11. Aufgrund der kurzen Inkubationszeit in der Kokultur (6 Stunden) und der Verwendung autologer Zielzellen ist die Rat...

Die zytolytische Aktivität ist die Hauptfunktion von CD8+ T-Zellen, wird aber immer noch selten gemessen, da die zu diesem Zweck verwendeten Assays umständlich sind und schwer zu standardisieren sind. Die genaue Messung dieser Funktion ist bei der Charakterisierung der Effektorfunktionen von CD8+ T-Zellen von größter Bedeutung, da bisher keine zuverlässigen Prädiktoren für eine wirksame zellvermittelte Zytotoxizität beschrieben wurden1,2. In dieser Arbeit schlagen wir einen neuen funktionellen Assay vor, um die zytotoxische Aktivität von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen auf CD4+ T-Zielzellen zu messen. Es wurden mehrere Ansätze entwickelt, um Alternativen zum Goldstandard, dem Chrom-Release-Assay, anzubieten. Wir stellen hier einen zellbasierten Assay vor, der den gesamten Prozess der Tötung aufzeigt, während er den Tod lebender Zielzellen misst. Diese Methode wurde aus Protokollen von durchflusszytometrischen zytotoxischen Assays in vivo bei Mäusen4,5 und in vitro beim Menschenabgeleitet 6. In diesem Protokoll werden die antigenspezifischen CD8+ T-Zellen, die in der gesamten CD8+ T-Zellpopulation enthalten sind, als Effektorzellen und autologe CD4+ T-Zellen als Zielzellen verwendet. Die interessierenden Effektor-CD8+-T-Zellen werden unter Verwendung von MHCI/Peptid-Tetrameren7 gezählt. Der Tod der Zielzellen wird durch das Verhältnis zwischen peptidbeladenen und ungeladenen CD4+ T-Zellen berechnet. Wir haben bereits gezeigt, dass diese Methode reproduzierbar, sensitiv und spezifisch ist und nicht von der Anzahl der Effektorzellen innerhalb der gesamten CD8+ T-Zellpopulation abhängt8. Durch Aufzählung sowohl der Anzahl der Effektor- als auch der Zielzellen im Kokultur-Assay kann die intrinsische Kapazität von CD8+ T-Zellen zur Abtötung von Zielzellen berechnet und in lytischen Einheitenausgedrückt werden 9.

<table><tbody><tr><td>EasySep Humanes CD4+ T-Zell-Anreicherungskit</td><td>Stammzelle</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Humanes CD8+ T-Zell-Anreicherungskit</td><td>Stammzelle</td><td>19053</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Zellproliferationskit - Für Durchflusszytometrie</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Far Red LIVE/DEAD fixierbare tote Zellen</td><td>Invitrogen</td><td>L10120</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 Maus Anti-Human CD3</td><td>BD</td><td></td><td></td>557943</tr><tr><td>Brilliant Violet 650 Anti-Human-CD4-Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>317435</td><td></td></tr><tr><td>PerCP Anti-Human-CD8-Antikörper</td><td>Biolegend 344707</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium 1x</td><td>VWR</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 100x Lösung</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum - Gold, hitzeinaktiviertes</td><td>PAA</td><td>A15-252</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten; Behandelt; U-Boden; mit</td><td>Deckel BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>25 ml steriles Polystyrol, einzeln verpackte Reservoire</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-U-Boden, sterile 2 ml Deep-Well-Platten</td><td>Thermo Scientific</td><td>275743</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-2 (v126), Forschungsqualität</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-096</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep Puffer, Trennpuffer</td><td>Stammzelle</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>15 ml konisches Polypropylen-Röhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Rundbodenröhrchen, Polypropylen</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>The Big Easy EasySep Magnet</td><td>Stammzelle</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>VWR</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>96-Well; V-Bodenplatte mit Deckel</td><td>Fisher</td><td>12-565-481</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehydlösung, ACS-Reagenz, 37 Gew.-% in H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikroröhrchen mit Schraubverschluss, konisch</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td></td></tr></tbody></table>

zellbasierter durchflusszytometrie-assay zur messung der zytotoxischen aktivität

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Die zytolytische Aktivität von CD8+ T-Zellen wird selten untersucht. Wir beschreiben hier einen neuen zellbasierten Assay zur Messung der Fähigkeit von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen, CD4+ T-Zellen abzutöten, die mit ihrem verwandten Peptid beladen sind. Die Ziel-CD4+ T-Zellen werden in zwei Populationen unterteilt, die mit zwei unterschiedlichen CFSE-Konzentrationen markiert sind. Eine Population wird mit dem interessierenden Peptid gepulst (CFSE-niedrig), während die andere nicht gepulst wird (CFSE-hoch). Gepulste und ungepulste CD4+ T-Zellen werden im gleichen Verhältnis gemischt und mit einer zunehmenden Anzahl von gereinigten CD8+ T-Zellen inkubiert. Die spezifische Abtötung von autologen CD4+ T-Zellen wird mittels Durchflusszytometrie nach Kokultur mit CD8+ T-Zellen analysiert, die den antigenspezifischen Effektor CD8+ T-Zellen enthalten, der durch Peptid/MHCI-Tetramer-Färbung nachgewiesen wurde. Die spezifische Lyse von CD4+ T-Zielzellen, gemessen bei unterschiedlichen Effektor- und Zielverhältnissen, ermöglicht die Berechnung von lytischen Einheiten, LU30/106 Zellen. Dieser einfache und unkomplizierte Assay ermöglicht die genaue Messung der intrinsischen Kapazität von CD8+ T-Zellen zur Abtötung von CD4+ T-Zielzellen.

Das Schema in Abbildung 1 fasst den Assay zusammen. Reine CD8+ T-Zellen (Effektorzellen) wurden in 450 µl vollständigem RPMI resuspendiert, und serielle Verdünnungen wurden durchgeführt, indem 225 µl der CD8+ T-Zellen in das nächste Reagenzglas gegeben wurden, das 225 µl Medium enthielt (oberes Panel). Reine CD4+ T-Zellen (Zielzellen) wurden gezählt, in zwei Röhrchen aufgeteilt und mit zwei unterschiedlichen Konzentrationen von CFSE (hoch und niedrig) gemäß der Anleitung gefärbt. CFSE-niedrige CD4+ T-Zel...

Dieses Protokoll beschreibt einen sensitiven, zellbasierten Zytotoxizitätstest. Durch die Aufzählung der Abnahme der Häufigkeit von lebenden CD4+ T-Zielzellen in Gegenwart einer zunehmenden Anzahl von Effektor-CD8+ T-Zellen ermöglicht dieser Assay die direkte Beurteilung der zytolytischen Aktivität von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen.

Zellbasierter Durchflusszytometrie-Assay zur Messung der zytotoxischen Aktivität

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die zytotoxische Aktivität antigenspezifischer CD8-T-Zellen mithilfe eines zellbasierten Durchflusszytometrie-Assays zu messen. Zunächst werden Effektor-CD8-T-Zellen sechs Tage lang in Gegenwart des Peptids der Wahl expandiert. Im zweiten Schritt werden Ziel-CD4-T-Zellen mit dem Peptid der Wahl beladen und anschließend mit unbehandelten CD4-TT-Zellen gemischt. Anschließend werden die Effektor-CD8-T-Zellen und die Ziel-CD4-T-Zellen für sechs Stunden bei verschiedenen Effektor-zu-Target-Verhältnissen gemeinsam kultiviert.Im letzten Schritt werden das Abtöten der Peptid-beladenen Ziel-CD4-T-Zellen und die Anzahl der Effektor-CD8-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Letztendlich kann die intrinsische Abtötungskapazität der antigenspezifischen CD8-T-Zellen in lytischen Einheiten ausgedrückt berechnet werden. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens, des sogenannten Oxy-Matter-like-Aro-Freisetzungstests, bestehen darin, dass autologe primäre Zielzellen anstelle immortalisierter Zelllinien und der eigentlichen Zielzelle verwendet werden.Damit lassen sich die Anzahl der Effektorzellen auf Einzelzell-Ebene quantifizieren. Zu Beginn wird nun eine wissenschaftliche Mitarbeiterin in meinem Labor die Vorgehensweise zur Isolierung der CD8-positiven Effektorzellen demonstrieren. Beginnen Sie damit, autologe, kryokonservierte PBMCs in einem Wasserbad bei 37 °C aufzutauen und waschen Sie die Zellen anschließend in bis zu 50 mL komplettem Medium.Nach der Zellzählung die PBMCs in komplettem Medium auf eine Konzentration von 5 Millionen Zellen pro Milliliter verdünnen und anschließend IL-2 sowie das gewünschte Peptid der Kultur hinzufügen. Danach je ein Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Loch-Platte geben. Nach dreitägiger Kultur die Hälfte des Überstandes durch frisches komplettes Medium ersetzen. Nach sechstägiger Kultur die Zellen mit einer Mehrkanalpipette in ein steriles Reservoir überführen, anschließend zählen und waschen.Suspendieren Sie das Pellet in einem Trennpuffer bei 50 Millionen Zellen pro Milliliter und inkubieren Sie die PBMCs in einem 14-Milliliter-Rundbodentestgefäß mit einem menschlichen CD8-positiven T-Zell-Anreicherungs-Cocktail bei 50 Mikroliter pro Milliliter Zellen bei Raumtemperatur. Nach 10 Minuten inkubieren Sie die Zellen weitere fünf Minuten mit magnetischen Partikeln, die mit anti-CD8-IgG konjugiert sind, bei 150 Mikroliter pro Milliliter. Anschließend ergänzen Sie die Zellsuspension mit zusätzlichem Trennpuffer auf insgesamt sieben Milliliter. Stellen Sie das Gefäß nach fünf Minuten in den Trennmagneten; mit dem Gefäß weiterhin im Magneten gießen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Konustestgefäß. Färben Sie danach einen kleinen Aliquot der Zellen mit Antikörpern gegen CD3 und CD8 in PBS, der mit 2 % FBS ergänzt ist, 30 Minuten bei vier Grad Celsius.Überprüfen Sie, ob die Reinheit der Zellen mittels Durchflusszytometrie 95 % CD8-positiv oder höher beträgt. Geben Sie nun 225 Mikroliter komplettes Medium in fünf Schraubkappengefäße und verdünnen Sie die Zellen seriell von 1:2 bis 1:32. Um die CD4-positiven Zielzellen zu isolieren, beginnen Sie mit dem Auftauen autologer, kryokonservierter PBMCs in einem Wasserbad bei 37 °C.Überführen Sie die aufgetauten Zellen in ein 50-Milliliter-Konischglas, das 10 Milliliter Medium enthält. Anreicherung von CD4-exprimierenden T-Zellen durch magnetische Partikelseparation, wie gerade demonstriert, wobei eine Reinheit von 95 % oder höher an CD4-positiven T-Zellen mittels Durchflusszytometrie bestätigt wird. Nach der Zellzählung teilen Sie die Zellen auf zwei 15-Milliliter-Konischgläser auf und waschen Sie diese anschließend in warmer PBS; resuspendieren Sie die Pellets in PBS mit einer Dichte von 20 Millionen Zellen pro Milliliter.Nachdem sichergestellt wurde, dass die Zellen vor Licht geschützt sind, färben Sie eine Hälfte der CD4-positiven T-Zellen mit einer frisch zubereiteten CFSE-Arbeitslösung in hoher Konzentration auf eine Endkonzentration von 0,2 Millimolar und die andere Hälfte in einer frisch zubereiteten CFSE-Arbeitslösung in niedriger Konzentration auf eine Endkonzentration von 0,04 Millimolar für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2. Am Ende der Färbezeit zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren die Pellets in einem Milliliter warmer kompletter Kulturmedien, um die Markierungsreaktion zu stoppen. Stimulieren Sie die CFSE-niedrigen CD4-positiven T-Zellen mit einer Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter des gewünschten Peptids in kompletten Kulturmedien für 45 Minuten im Zellkulturinkubator. Nach der Inkubation waschen Sie sowohl die CFSC-high- als auch die CFSC-low-T-Zellpopulationen. Zweimal mit unvollständigem Medium und resuspendieren Sie beide Zellsuspensionen in 200.000 Zellen pro Milliliter in jeweils unvollständigem Medium. Mischen Sie anschließend die beiden Zielpopulationen im Verhältnis 1:1 (CFSE high zu CFSE low).Geben Sie nun 100 Mikroliter der gemischten Ziel-CD4-positiven T-Zellen in jede Vertiefung einer Rundboden-96-Loch-Platte und impfen Sie jeweils ein Mikroliter der CD8-positiven T-Zell-Suspension im Duplikat an, um ein Endvolumen von 200 Mikrolitern pro Vertiefung zu erreichen. Messen Sie die basale Apoptose, indem Sie drei Vertiefungen nur mit Zielzellen beimpfen, und inkubieren Sie die Kokultur anschließend sechs Stunden im Zellkultur-Inkubator. Nach Beendigung der Inkubation überführen Sie die Zellen in eine VBO-96-Loch-Platte und färben jede Vertiefung 15 Minuten lang mit PE-konjugierten Peptid-MHC-Tetrameren.Im Zellkultur-Inkubator die Zellen mit PBS, der mit 2 % FBS ergänzt wurde, waschen und anschließend nach dem Waschen 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln färben. Danach die Pellets erneut in 100 Mikrolitern 2 % Formaldehyd in PBS resuspendieren und die Zellen per Durchflusszytometrie analysieren. Nach der Kokultur werden die Zellen analysiert und wie in diesen Punktdiagrammen gezeigt, entsprechend gefiltert.Das Verhältnis von lebensfähigen CFSE-hoch- zu CFSE-niedrig-Zielzellen, unbehandelt oder mit Peptid beladen, wird anhand eines kleinen Forward- zu Side-Scatter-Gates analysiert. Lebende Zellen werden als lebend/abgestorben-negativ und CD4-positive T-Zellen dargestellt und hinsichtlich CFSE ausgewertet, um das Verhältnis von CFSE-niedrig- zu CFSE-hoch-Zellen zu bestimmen. Anschließend wird ein größeres Forward- zu Side-Scatter-Gate definiert, um die Gesamtanzahl der entweder toten oder lebenden Effektor- und Zielzellen zu ermitteln. Nach der sechsstündigen Inkubation werden CD8-positive, Tetramer-positive T-Zellen sowie CFSE-niedrig-, CD4-positive T-Zellen dargestellt, um das Verhältnis von Effektor- zu Zielzellen zu analysieren.Die Gesamtanzahl der Effektor-CD8-positiven T-Zellen wird anschließend bestimmt, indem man auf die CD8-positiven, Tetramer-positiven Zellen gated. Die Gesamtanzahl der Zielzellen wird bestimmt, indem man auf die CD4-positiven T-Zellen, CFSE-niedrige sowie lebende und tote Zellen gated. Das Zielverhältnis von CFSE-niedrigen zu CFSE-hohen Zellen beträgt eins zu eins.Wenn die CD4-positiven Zielzellen in Abwesenheit von Effektorzellen kultiviert werden, nimmt dieses Verhältnis drastisch ab. Wenn die CFSE-schwach positiven Pulszellen mit der gesamten CD8-positiven T-Zellpopulation, die antigenspezifische CD8-positive Effektor-T-Zellen enthält, inkubiert werden.Wenn das Verhältnis abnimmt, beginnen die CFSE-low-CD4-positiven Puls-Zielzellen, lebend-tot-positiv zu werden. Eine Verdünnung der Effektorzellen führt daher zu einer Wiederherstellung des CFSE-Verhältnisses und letztlich zu einer Wiederherstellung der Anzahl an vitalen peptidbeladenen CFSE-low-CD4-positiven Ziel-T-Zellen. Der Prozentsatz der spezifischen Lyse kann anschließend als Funktion des Effektor-zu-Ziel-Verhältnisses in logarithmischer Skalierung dargestellt werden. Wie in der Grafik gezeigt, wird aus der Darstellung eine lineare Regression berechnet, und die Gleichung der Trendlinie wird verwendet, um die lytischen Einheiten zu berechnen.Dies ist die Anzahl an CD8-positiven Effektor-T-Zellen, die erforderlich sind, um 30 % von einer Million Ziel-CD4-positiven T-Zellen zu eliminieren, um die intrinsische zytolytische Kapazität der antigenspezifischen CD8-positiven T-Zellen zu bestimmen und die Ergebnisse zwischen Spendern zu vergleichen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Durchflusszytometrie verwendet wird, um die zytotoxische Aktivität antigenspezifischer CD-T-Zellen zu messen. Diese Technik kann außerdem leicht für Ihren eigenen F-Zelltyp angepasst werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Zellbasiertes Durchflusszytometrie-Assay zur Messung der zytotoxischen Aktivität

Dieses Video demonstriert eine in vitro Technik, um die zytotoxische Fähigkeit von Zytokin-induzierten Killerzellen (CIK) gegen Krebszellen zu messen. Bei der Co-Kultivierung von Zielkrebszellen mit CIK-Zellen werden die toten Krebszellen mit einem fluoreszierenden Viabilitätsfarbstoff identifiziert und mittels Durchflusszytometrie quantifiziert, um die zytotoxische Wirkung von CIK-Zellen abzuschätzen.

Ein In-vitro-Assay zur Untersuchung der zytotoxischen Fähigkeit von Zytokin-induzierten Killerzellen

Dieses Video zeigt die lytische Aktivität natürlicher Killerzellen gegen fluoreszenzgefärbte Zielzellen. Die Methode ermöglicht die Messung der NK-Zell-induzierten Zytotoxizität durch Färbung toter Zellen und Verwendung eines Durchflusszytometers zur Quantifizierung lebender und toter Zielzellen.

Natürlicher Killerzell-vermittelter Zytotoxizitätsassay Probenvorbereitung für die durchflusszytometrische Analyse

Dieses Video zeigt einen Apoptose-Assay in Krebszellen, der durch voraktivierte Effektor-T-Zellen induziert wurde. Durch die Co-Kultivierung dieser Zellen mit Krebszellen, die mit fluoreszierenden Zellkernen markiert sind, wird ein Caspase-spaltbares fluorogenes Substrat hinzugefügt. Apoptotische Krebszellen zeigen in ihren Zellkernen eine andere Farbe, was zu einer dualen Fluoreszenz führt. Diese duale Fluoreszenz ist ein Hinweis darauf, dass Krebszellen eine Apoptose durchlaufen.

Ein in vitro Assay zur Untersuchung der Zytotoxizität von präaktivierten CD8+ T-Zellen gegen Krebszellen

Wir beschreiben ein Single-Cell-Assay mit hohem Durchsatz, die Zytotoxizität von T-Zellen zu messen, wenn mit Tumor Zielzellen inkubiert. Dieses Verfahren verwendet eine dichte, elastomeren Anordnung von Sub-Nanoliter-Wells (~ 100.000 Wells / Array) räumlich zu begrenzen, die T-Zellen und Zielzellen in definierten Verhältnissen und mit Fluoreszenzmikroskopie gekoppelt Effektor-Target Konjugation und anschließender Apoptose überwachen.

Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen

Das Vollblut Zytotoxizitätsassay (WCA) ist ein Zytotoxizitätstest durch Einbau Hochdurchsatz-Zellpositionierungstechnologie mit Fluoreszenzmikroskopie und automatisierte Bildverarbeitung entwickelt. Hier beschreiben wir, wie Lymphom-Zellen mit einem anti-CD20-Antikörper behandelt werden können, in Echtzeit in menschlichem Vollblut zur quantitativen Analyse bereitzustellen zelluläre Zytotoxizität untersucht werden.

Echtzeit-Zytotoxizitätsassays in menschlichem Vollblut

Eine einfache und zuverlässige Methode wird hier beschrieben eine Reihe von NK-Zellfunktionen wie Degranulierung, Zytokin und Chemokin-Produktion in verschiedenen NK-Zelluntergruppen zu analysieren.

Durchflusszytometrie-basierte Assay zur Überwachung von NK-Zell-Funktionen

Diese Arbeit beschreibt einen fortgeschrittenen Arbeitsablauf zur genauen und schnellen Bestimmung der NK-Zellzahl (Natural Killer) und der Zytotoxizität von NK-Zellen in menschlichen Blutproben.

Durchflusszytometrische Analyse von natürlichen Killerzellen lytische Aktivität in menschlichem Vollblut

Eine Flow Cytometry basierende Methode quantitativ bestimmen die zytotoxische Aktivität des menschlichen natürliche Killerzellen wird hier angezeigt.

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von Doppelemulsionströpfchen, die eine T-Zelle und eine Krebszielzelle verkapseln, um die Zellabtötung auf Einzelzellebene zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die duale Quantifizierung sowohl zytotoxischer Moleküle als auch der Apoptose der Zielzellen innerhalb einer großen Population von T-Zellen.

Tröpfchenbasierter Zytotoxizitätsassay zur Beurteilung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf Einzelzellebene

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten in-vitro. Arbeitsablauf für die konsistente Messung der natürlichen, chimerischen Antigenrezeptor-vermittelten und antikörperabhängigen Zytotoxizität menschlicher natürlicher Killerzellen mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie.

Quantifizierung der NK-Zell-Zytotoxizität, verstärkt durch chimerische Antigenrezeptoren und therapeutische Antikörper mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie

Lernen Sie einen zellbasierten Durchflusszytometrie-Assay zur Messung der zytotoxischen Aktivität antigen-spezifischer CD8+ T-Zellen gegen CD4+ Zielzellen. Diese Methode ermöglicht die präzise Quantifizierung lyrischer Einheiten.

Zellbasierter Durchflusszytometrie-Assay zur Messung der zytotoxischen Aktivität

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