Zellbasierter Durchflusszytometrie-Assay zur Messung der zytotoxischen Aktivität

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die zytotoxische Aktivität antigenspezifischer CD8-T-Zellen mithilfe eines zellbasierten Durchflusszytometrie-Assays zu messen. Zunächst werden Effektor-CD8-T-Zellen sechs Tage lang in Gegenwart des Peptids der Wahl expandiert. Im zweiten Schritt werden Ziel-CD4-T-Zellen mit dem Peptid der Wahl beladen und anschließend mit unbehandelten CD4-TT-Zellen gemischt. Anschließend werden die Effektor-CD8-T-Zellen und die Ziel-CD4-T-Zellen für sechs Stunden bei verschiedenen Effektor-zu-Target-Verhältnissen gemeinsam kultiviert.

Im letzten Schritt werden das Abtöten der Peptid-beladenen Ziel-CD4-T-Zellen und die Anzahl der Effektor-CD8-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Letztendlich kann die intrinsische Abtötungskapazität der antigenspezifischen CD8-T-Zellen in lytischen Einheiten ausgedrückt berechnet werden. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens, des sogenannten Oxy-Matter-like-Aro-Freisetzungstests, bestehen darin, dass autologe primäre Zielzellen anstelle immortalisierter Zelllinien und der eigentlichen Zielzelle verwendet werden.

Damit lassen sich die Anzahl der Effektorzellen auf Einzelzell-Ebene quantifizieren. Zu Beginn wird nun eine wissenschaftliche Mitarbeiterin in meinem Labor die Vorgehensweise zur Isolierung der CD8-positiven Effektorzellen demonstrieren. Beginnen Sie damit, autologe, kryokonservierte PBMCs in einem Wasserbad bei 37 °C aufzutauen und waschen Sie die Zellen anschließend in bis zu 50 mL komplettem Medium.

Nach der Zellzählung die PBMCs in komplettem Medium auf eine Konzentration von 5 Millionen Zellen pro Milliliter verdünnen und anschließend IL-2 sowie das gewünschte Peptid der Kultur hinzufügen. Danach je ein Milliliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Loch-Platte geben. Nach dreitägiger Kultur die Hälfte des Überstandes durch frisches komplettes Medium ersetzen. Nach sechstägiger Kultur die Zellen mit einer Mehrkanalpipette in ein steriles Reservoir überführen, anschließend zählen und waschen.

Suspendieren Sie das Pellet in einem Trennpuffer bei 50 Millionen Zellen pro Milliliter und inkubieren Sie die PBMCs in einem 14-Milliliter-Rundbodentestgefäß mit einem menschlichen CD8-positiven T-Zell-Anreicherungs-Cocktail bei 50 Mikroliter pro Milliliter Zellen bei Raumtemperatur. Nach 10 Minuten inkubieren Sie die Zellen weitere fünf Minuten mit magnetischen Partikeln, die mit anti-CD8-IgG konjugiert sind, bei 150 Mikroliter pro Milliliter. Anschließend ergänzen Sie die Zellsuspension mit zusätzlichem Trennpuffer auf insgesamt sieben Milliliter. Stellen Sie das Gefäß nach fünf Minuten in den Trennmagneten; mit dem Gefäß weiterhin im Magneten gießen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Konustestgefäß. Färben Sie danach einen kleinen Aliquot der Zellen mit Antikörpern gegen CD3 und CD8 in PBS, der mit 2 % FBS ergänzt ist, 30 Minuten bei vier Grad Celsius.

Überprüfen Sie, ob die Reinheit der Zellen mittels Durchflusszytometrie 95 % CD8-positiv oder höher beträgt. Geben Sie nun 225 Mikroliter komplettes Medium in fünf Schraubkappengefäße und verdünnen Sie die Zellen seriell von 1:2 bis 1:32. Um die CD4-positiven Zielzellen zu isolieren, beginnen Sie mit dem Auftauen autologer, kryokonservierter PBMCs in einem Wasserbad bei 37 °C.

Überführen Sie die aufgetauten Zellen in ein 50-Milliliter-Konischglas, das 10 Milliliter Medium enthält. Anreicherung von CD4-exprimierenden T-Zellen durch magnetische Partikelseparation, wie gerade demonstriert, wobei eine Reinheit von 95 % oder höher an CD4-positiven T-Zellen mittels Durchflusszytometrie bestätigt wird. Nach der Zellzählung teilen Sie die Zellen auf zwei 15-Milliliter-Konischgläser auf und waschen Sie diese anschließend in warmer PBS; resuspendieren Sie die Pellets in PBS mit einer Dichte von 20 Millionen Zellen pro Milliliter.

Nachdem sichergestellt wurde, dass die Zellen vor Licht geschützt sind, färben Sie eine Hälfte der CD4-positiven T-Zellen mit einer frisch zubereiteten CFSE-Arbeitslösung in hoher Konzentration auf eine Endkonzentration von 0,2 Millimolar und die andere Hälfte in einer frisch zubereiteten CFSE-Arbeitslösung in niedriger Konzentration auf eine Endkonzentration von 0,04 Millimolar für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2. Am Ende der Färbezeit zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren die Pellets in einem Milliliter warmer kompletter Kulturmedien, um die Markierungsreaktion zu stoppen. Stimulieren Sie die CFSE-niedrigen CD4-positiven T-Zellen mit einer Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter des gewünschten Peptids in kompletten Kulturmedien für 45 Minuten im Zellkulturinkubator.

Nach der Inkubation waschen Sie sowohl die CFSC-high- als auch die CFSC-low-T-Zellpopulationen. Zweimal mit unvollständigem Medium und resuspendieren Sie beide Zellsuspensionen in 200.000 Zellen pro Milliliter in jeweils unvollständigem Medium. Mischen Sie anschließend die beiden Zielpopulationen im Verhältnis 1:1 (CFSE high zu CFSE low).

Geben Sie nun 100 Mikroliter der gemischten Ziel-CD4-positiven T-Zellen in jede Vertiefung einer Rundboden-96-Loch-Platte und impfen Sie jeweils ein Mikroliter der CD8-positiven T-Zell-Suspension im Duplikat an, um ein Endvolumen von 200 Mikrolitern pro Vertiefung zu erreichen. Messen Sie die basale Apoptose, indem Sie drei Vertiefungen nur mit Zielzellen beimpfen, und inkubieren Sie die Kokultur anschließend sechs Stunden im Zellkultur-Inkubator. Nach Beendigung der Inkubation überführen Sie die Zellen in eine VBO-96-Loch-Platte und färben jede Vertiefung 15 Minuten lang mit PE-konjugierten Peptid-MHC-Tetrameren.

Im Zellkultur-Inkubator die Zellen mit PBS, der mit 2 % FBS ergänzt wurde, waschen und anschließend nach dem Waschen 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln färben. Danach die Pellets erneut in 100 Mikrolitern 2 % Formaldehyd in PBS resuspendieren und die Zellen per Durchflusszytometrie analysieren. Nach der Kokultur werden die Zellen analysiert und wie in diesen Punktdiagrammen gezeigt, entsprechend gefiltert.

Das Verhältnis von lebensfähigen CFSE-hoch- zu CFSE-niedrig-Zielzellen, unbehandelt oder mit Peptid beladen, wird anhand eines kleinen Forward- zu Side-Scatter-Gates analysiert. Lebende Zellen werden als lebend/abgestorben-negativ und CD4-positive T-Zellen dargestellt und hinsichtlich CFSE ausgewertet, um das Verhältnis von CFSE-niedrig- zu CFSE-hoch-Zellen zu bestimmen. Anschließend wird ein größeres Forward- zu Side-Scatter-Gate definiert, um die Gesamtanzahl der entweder toten oder lebenden Effektor- und Zielzellen zu ermitteln. Nach der sechsstündigen Inkubation werden CD8-positive, Tetramer-positive T-Zellen sowie CFSE-niedrig-, CD4-positive T-Zellen dargestellt, um das Verhältnis von Effektor- zu Zielzellen zu analysieren.

Die Gesamtanzahl der Effektor-CD8-positiven T-Zellen wird anschließend bestimmt, indem man auf die CD8-positiven, Tetramer-positiven Zellen gated. Die Gesamtanzahl der Zielzellen wird bestimmt, indem man auf die CD4-positiven T-Zellen, CFSE-niedrige sowie lebende und tote Zellen gated. Das Zielverhältnis von CFSE-niedrigen zu CFSE-hohen Zellen beträgt eins zu eins.

Wenn die CD4-positiven Zielzellen in Abwesenheit von Effektorzellen kultiviert werden, nimmt dieses Verhältnis drastisch ab. Wenn die CFSE-schwach positiven Pulszellen mit der gesamten CD8-positiven T-Zellpopulation, die antigenspezifische CD8-positive Effektor-T-Zellen enthält, inkubiert werden.

Wenn das Verhältnis abnimmt, beginnen die CFSE-low-CD4-positiven Puls-Zielzellen, lebend-tot-positiv zu werden. Eine Verdünnung der Effektorzellen führt daher zu einer Wiederherstellung des CFSE-Verhältnisses und letztlich zu einer Wiederherstellung der Anzahl an vitalen peptidbeladenen CFSE-low-CD4-positiven Ziel-T-Zellen. Der Prozentsatz der spezifischen Lyse kann anschließend als Funktion des Effektor-zu-Ziel-Verhältnisses in logarithmischer Skalierung dargestellt werden. Wie in der Grafik gezeigt, wird aus der Darstellung eine lineare Regression berechnet, und die Gleichung der Trendlinie wird verwendet, um die lytischen Einheiten zu berechnen.

Dies ist die Anzahl an CD8-positiven Effektor-T-Zellen, die erforderlich sind, um 30 % von einer Million Ziel-CD4-positiven T-Zellen zu eliminieren, um die intrinsische zytolytische Kapazität der antigenspezifischen CD8-positiven T-Zellen zu bestimmen und die Ergebnisse zwischen Spendern zu vergleichen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Durchflusszytometrie verwendet wird, um die zytotoxische Aktivität antigenspezifischer CD-T-Zellen zu messen. Diese Technik kann außerdem leicht für Ihren eigenen F-Zelltyp angepasst werden.