Imaging Cell Membrane Verletzung und subzellulärer Prozesse in der Reparatur beteiligt

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Wirkung der gewünschten Behandlungen auf die Reparatur verletzter Zellen zu beobachten und die subzellulären Prozesse zu untersuchen, die bei der Reparatur verletzter Zellen helfen. Dies wird erreicht, indem Zellen in Gegenwart von Fluoreszenzfarbstoffen verletzt werden, die intakte Zellmembranen nicht durchdringen können, um die Kinetik und Fähigkeit verletzter Zellen zu beurteilen, das Eindringen dieser Farbstoffe zu verhindern. In einem zweiten Schritt überwachen wir das Auftreten intrazellulärer Proteine an der verletzten Zellmembran, was die Fähigkeit eines zellulären Kompartiments von Interesse identifiziert, durch Fusion mit der verletzten Zellmembran an der Reparatur teilzunehmen.

Als nächstes überwachen wir die Fusion der interessierenden zellulären Kompartimente mit der verletzten Zellmembran, um die Kinetik der Verletzung zu überwachen. Durch die getriggerte Fusion dieses Kompartiments werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass die Reparatur der Zellmembranverletzung mit der lysosomalen Exozytose verbunden ist, basierend auf einem erhöhten Auftreten des Lysosomen-assoziierten Membranproteins, eines an der verletzten Zelloberfläche und einer Live-Bildgebung der Sekretion des lysosomalen Inhalts durch verletzte Zellen. Diese Methoden können helfen, wichtige Fragen bei der Zellverletzung und -reparatur zu beantworten.

Mit diesen lässt sich zum Beispiel bestimmen, welche Proteine und zellulären Kompartimente auf fokale Verletzungen an der Zellmembran reagieren und dann deren Kinetik der Reaktion bewerten. Das Verfahren wird von Aurelia D, vier, und hamma stra, zwei der Postdoktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Um die verletzten Zellen, die heilen, und diejenigen, die nicht heilen, getrennt zu markieren.

Aussaat der Zellen auf sterilen Deckgläsern für die drei Versuchsbedingungen. Kultivieren Sie die Zellen, bis sie eine Konfluenz von mehr als 50 % erreichen, und waschen Sie dann C eins und C zwei zweimal mit CIM bei 37 Grad Celsius. C3 mit PBS bei 37 Grad Celsius waschen.

Übertragen Sie dann die Deckgläser auf Silikon-O-Ringe. Geben Sie 100 Mikroliter vorwärmte Fitzy-Dextran-Lösung in einen geeigneten Puffer. Verletzen Sie die Plasmamembran an C 1 und C3, indem Sie bei Raumtemperatur 40 Milligramm Glasperlen über den Deckglas geben und den Deckel manuell kippen.

Rutscht sechs- bis achtmal in einem Winkel von 30 Grad hin und her für leichte Verletzungen. Stellen Sie sicher, dass die Glasperlen gleichmäßig verteilt sind, um wiederholte Verletzungen zu minimieren und die Reproduzierbarkeit der Verletzung zwischen den Proben zu verbessern. Führen Sie gleichzeitig die Glasperlenverletzung der verschiedenen zu vergleichenden Proben durch, wodurch ein weiteres Rollen der Kügelchen vermieden wird.

Übertragen Sie alle Deckgläser in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator bei Umgebungs-CO2 und lassen Sie die Reparatur fünf Minuten lang laufen, ohne dass die Kügelchen rollen. Entfernen Sie die Glasperlen und das Fitzy-Dextran durch Waschen mit Puffer oder PBS. Setzen Sie nun die Deckgläser wieder auf den O-Ring und fügen Sie 100 Mikroliter vorwarmes Lysin hinzu.

Fixierbare Trissy-Dextran-Lösung: Inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius bei Umgebungs-CO2. Waschen Sie die Bezugsbezüge zweimal mit vorwärmtem CIM und fixieren Sie sie nach zwei PBS-Wäschen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 %PFA. Inkubieren Sie die Probe zwei Minuten lang in Hersch-Farbstoff und montieren Sie die Probe nach zwei PBS-Wäschen mit Eindeckmedium auf einen Objektträger.

Als nächstes bilden Sie die Zellen mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop aus der C-2-Probe ab. Bestimmen Sie die Intensität der roten und grünen Färbung im Hintergrund. Verwenden Sie dann diesen Wert, um den Schwellenwert für den roten und grünen Kanal für alle Samples festzulegen.

Bewerten Sie die Gesamtzahl der grün markierten Zellen. Bewerten Sie auch Zellen, die in den Stichproben C 1 und C3 rot oder sowohl rot als auch grün sind. Zählen Sie nun über 100 grün verletzte Zellen für jeden Zustand und drücken Sie den Anteil der Zellen, die sich nicht reparieren konnten, als Prozentsatz aller verletzten Zellen aus.

Waschen Sie die auf über 50% Confluence angewachsenen Zellen mit vorgewarntem CIM und montieren Sie das Deckglas in CIM mit FM-Farbstoff. In einer Halterung im oberen Inkubator der Bühne wird sie bei 37 Grad Celsius gehalten. Wählen Sie eine Region der Zellmembran mit optimaler Leistung, die eine konsistente, aber nicht tödliche Schädigung ermöglicht.

Bestrahlen Sie die Probe dazu weniger als 10 Millisekunden lang mit dem gepulsten Laser. Dämpfen Sie die Laserleistung über die Software auf 40 bis 50 % der Spitzenleistung, um alle zwei bis 10 Sekunden Bilder in Epi, Fluoreszenz und Hellfeld zu überwachen, zu reparieren und zu erfassen, beginnend vor der Verletzung und drei bis fünf Minuten nach der Verletzung. Um die Kinetik der Reparatur zu quantifizieren, messen Sie die zelluläre FM-Farbstofffluoreszenz.

Berechnen Sie die Intensitätsänderung im Verlauf der Bildgebung. Mittelwerten Sie die Daten für mehr als 10 Zellen in jeder Bedingung und stellen Sie sie entweder als gemittelten Wert oder als Wert für einzelne Zellen dar. Waschen Sie die Deckgläser von C eins und C zwei.

Kulturpräparate mit CIM bei 37 Grad Celsius und Waschen von C3 mit PBS bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie dann die Proben auf Silikon-O-Ringe. Fügen Sie 100 Mikroliter vorwarmes Lysin fixierbares Trissy Dextran hinzu.

Verletzen Sie die Plasmamembran an C 1 und C3, wie oben gezeigt. Dann wird ein weiteres Rollen der Perlen vermieden. Übertragen Sie alle Deckgläser in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator bei Umgebungs-CO2 und lassen Sie die Reparatur fünf Minuten lang laufen.

Um nun die Glasperlen und Trixie Dextran zu entfernen, waschen Sie den Bezug in kaltem Wachstumsmedium, um sicherzustellen, dass die Glasperlen nicht auf den Zellen rollen. Spülen Sie die Deckgläser zweimal mit kaltem Wachstumsmedium ab und geben Sie sie auf die O-Ringe auf C eins und C3. Geben Sie 100 Mikroliter Anti-US-Lampe 1-Antikörper in kaltes vollständiges Wachstumsmedium und fügen Sie das kalte vollständige Wachstumsmedium C zwei hinzu, um die Antikörperbindung zu ermöglichen. Inkubieren Sie die Deckgläser nach drei Wäschen mit kaltem CIM 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Alle Deckgläser mit 4%PFA für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Anschließend dreimal mit CIM spülen. Als nächstes inkubieren Sie alle Deckgläser in 100 Mikrolitern einer Blockierungslösung für 15 Minuten, gefolgt von 100 Mikrolitern Ofor, 4 88 Anti-Ratten-Antikörper für 15 Minuten.

Waschen Sie zweimal mit PBS und inkubieren Sie nach zwei PBS-Wäschen zwei Minuten lang bei Raumtemperatur in ihrem Fleck. Montieren Sie die Proben auf einen Objektträger und bilden Sie sie dann mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop mit Bildern von zwei Zellen ab. Bestimmen Sie die unspezifische Hintergrundfärbung in den roten und grünen Kanälen.

Verwenden Sie diese Werte für die Hintergrundfärbung, um den Schwellenwert für den Rot- und Grünkanal für alle Proben festzulegen. Verwenden Sie die über 100 rot markierten Zellen von C 1 und C3, um die Intensität der Färbung von Lampe eins in verletzten Zellen zu messen. In einem erfolgreichen Experiment wird die Lampe eins, die Zellen aus C3 färbt, signifikant niedriger sein als in Zellen aus C eins zur Markierung von Lysosomen mit Fluoreszenzfarbstoff inkubieren die Zellen, die zu 50% Konfluenz in Wachstumsmedien gewachsen sind, die fitzy dextran enthalten.

Lassen Sie das Dextran zwei Stunden lang im Zellkultur-Inkubator endozytieren. Waschen Sie die Zellen mit vorwärmtem Wachstumsmedium und inkubieren Sie darin zwei Stunden lang in einem CO2-Inkubator, damit sich das gesamte Endozytose-Dextran vor der Bildgebung im Lysosom ansammeln kann. Spülen Sie den Eindeckbezug in Prewarm CIM aus und montieren Sie ihn in CIM auf einen Eindeckglashalter auf dem Inkubator der Bühnenoberseite bei 37 Grad Celsius.

Wählen Sie für die Bildgebung nach Zellen aus, die keine überfüllten, mit Fitzy-Dextran markierten Lysosomen aufweisen. Die Bewegung und Exozytose einzelner Lysosomen. Erfassen Sie Weitwinkelbilder für die Bewegung des Lysosoms in der Zelle.

Nehmen Sie abwechselnd Rasenbilder für die Bewegung an der Zelloberfläche und zur Überwachung ihrer Exozytose auf. Verletzen Sie die Zellmembran durch Bestrahlung, wie zuvor gezeigt, um die Reaktion von Lysosomen auf Zellverletzungsbildzellen bei vier bis sechs Bildern pro Sekunde für mindestens zwei Minuten oder länger zu überwachen, abhängig von der Dynamik der Exozytose in den interessierenden Zellen. In diesem Bulk-Assay werden alle verletzten Zellen markiert und diejenigen, die sich nicht reparieren konnten, identifiziert, während die unverletzten Zellen unmarkiert bleiben.

Die Zellen, die durch Glasperlen in Gegenwart von Fitzy-Dextran verletzt werden, werden grün markiert, wenn die Zellen in Gegenwart von Kalzium reparieren können. Die meisten der verletzten Zellen schaffen es, sich zu reparieren und werden nicht durch Trissy-Dextran markiert, wenn die Zellen sich reparieren können. In Abwesenheit von Kalzium werden die meisten verletzten Zellen auch durch das trissy Dextran rot markiert.

Dieses Experiment untersucht die Kinetik der Zellmembranreparatur, indem es den Eintritt von FM-Farbstoff in die Zelle überwacht. Bei der Inkubation in FM-Zellen zeigen intakte Zellen wenig bis gar keine intrazelluläre Färbung. Nach einer lokalisierten Laserverletzung der Zellmembran beginnt FM D, in die Zelle einzudringen und Endomembranen zu binden, was zu einem plötzlichen Anstieg der FM-Farbstofffluoreszenz führt, da die Fähigkeit der Zellmembran, nach einer Laserverletzung zu reparieren, von Kalzium abhängt.

Eine Zelle, die in Gegenwart von Kalzium verletzt wird, ist in der Lage, sich zu reparieren, was dazu führt, dass der Eintritt des FM-Farbstoffs innerhalb einer Minute nach der Verletzung aufhört. Im Gegenteil, eine Zelle, die sich in Abwesenheit von Kalzium reparieren lässt, kann nicht repariert werden, was zu einem kontinuierlichen Farbstoffeintritt und damit zu einem kontinuierlichen Anstieg der FM d-Fluoreszenz auch vier Minuten nach der Verletzung führt. So führt die Reparatur der Zellmembran zu einem Plateau der FM-Farbstofffärbung.

Während ein Mangel an Zellmembranreparatur zu einem kontinuierlichen Farbstoffeintrag führt, der kein Plateau erreicht. Der Ansatz der Bulk-Glasperlenverletzung kann verwendet werden, um die Translokation von Vesikeln und Proteinen auf der Zelloberfläche als Reaktion auf eine Verletzung zu überwachen. Hier werden die Zellen in Gegenwart von trissy Dextran verletzt.

Während also die unverletzten Zellen nicht rot markiert sind, sind alle verletzten Zellen rot markiert. Beachten Sie, dass unverletzte Zellen, die nicht mit Primärantikörpern behandelt wurden, eine Hintergrundmarkierung für die Zelloberflächenlampe eins aufweisen. Wenn Zellen jedoch verletzt werden und in Gegenwart von Kalzium heilen können, durchlaufen Lysosomen eine Exozytose und daher kommt es zu einer erhöhten Lamp-One-Färbung auf der Oberfläche der verletzten Zellen.

Diese Zunahme der Markierung der Zelloberflächenlampe ist bei Zellen, die in Abwesenheit von Kalzium heilen dürfen, viel geringer. Dies dient sowohl der Quantifizierung der Anzahl der Zellen mit einer Färbung mit hoher Zelloberflächenlampe, als auch der Messung des Füllstands der Zelloberflächenlampe. Eins. Die Färbung einzelner verletzter Zellen liefert Messungen für die Fähigkeit der Zelle, eine durch Verletzungen ausgelöste lysosomale Exozytose zu erleiden.

Dieses Experiment überwacht direkt die Kinetik, die Art und den Ort der individuellen Lysosomenfusion. Als Reaktion auf eine Verletzung der Zellmembran werden die Zellen durch den gepulsten Laser verletzt und die Lysosomen der Zelloberfläche werden durch Turf-Imaging abgebildet, was die Überwachung der durch Verletzungen ausgelösten Exozytose von Lysosomen in einzelnen Zellen ermöglicht. Diese Abbildung zeigt eine Zelle, die durch Phasenkontrastbildgebung im linken Feld und durch Rasenmikroskopie im mittleren Feld sichtbar gemacht wird.

Das rechte Feld zeigt das Rasenbild derselben Zelle 105 Sekunden nach der Verletzung. Hier wird die durch Verletzungen ausgelöste Rekrutierung eines Lysosoms an die Zellmembran gezeigt, gefolgt von einer Exozytose. Dieses Lysosom ist vor der Verletzung auf dem Rasenbild nicht sichtbar, aber nach der Verletzung erreicht das Lysosom die Zellmembran und wird nachweisbar.

Je näher sich das Vesikel der Zellmembran nähert, desto besser wird es durch die Rasenbeleuchtung angeregt, wodurch die Fluoreszenz des lysosomalen Fitsy-Dex-Strangs den Maximalwert erreicht. Wenn sich der Fusionsguss öffnet, bewirkt dies eine Neutralisation des lysosomalen pH-Werts und damit eine Dequenchierung der fitzy DExT-Strangfluoreszenz. Anschließend wird der DExT-Strang aus dem Vesikel nach außen entladen, wodurch sich die ZI-Fluoreszenz lateral ausbreitet und die Vesikelfluoreszenz allmählich abnimmt, wodurch verschiedene durch Verletzungen ausgelöste Reaktionen der Lysosomen gemessen werden können.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Fähigkeit von Zellen zur Reparatur von großen fokalen Verletzungen überwachen und subzelluläre Kompartimente und Proteine überwachen können, die auf den Reparaturprozess reagieren und ihn unterstützen. Weitere Experimente mit unterschiedlichen Tag-Vital-Markierungen, Kompartimenten oder Proteinen von können durchgeführt werden, um die Reaktion auf Verletzungen und die Beteiligung an der Reparatur von IND-Zellen zu überwachen.