Name: Imaging Cell Membrane Verletzung und subzellulärer Prozesse in der Reparatur beteiligt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-24T20:45:00.000+00:00
Duration: 16 min 44 s
Description: Lernen Sie die Bildgebung von Zellmembranverletzungen und subzellulären Reparaturprozessen mit fluoreszierenden Farbstoffen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung lysosomaler Exozytose und Proteintrafficking bei der Membranreparatur.

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Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants AR055686 und AR060836 und Postdoc-Stipendium an n. Chr. von Französisch Gesellschaft für Muskeldystrophie (AFM) unterstützt. Die zelluläre Bildgebung Anlage in dieser Studie verwendet wird, von der National Institutes of Health Grants HD040677 unterstützt.

1. Imaging Cell Membrane Repair Mit Schütt (Glasperlenspiel) Verwundung Dieses Protokoll erlaubt separat Kennzeichnung der verletzten Zellen und solche, die nicht heilen. Die Quantifizierung dieser Populationen von Zellen erfordert die Verwendung von drei Bedingungen: 1. Test (C1) - Die Zellen können in Gegenwart von Ca 2 +, 2 zu reparieren. Kontrolle 1 (keine Schädigung C2) - Die Zellen werden in Gegenwart von Ca 2 + 3 inkubiert, aber nicht verletzt, und. Control 2 (keine Reparatur C3) - Zellen werden in Abwesenheit von Ca 2 + zu reparieren. <ol><li> Zellen wachsen auf&gt; 50% Konfluenz auf drei sterile Deckgläser und waschen C1 und C2 zweimal mit CIM bei 37 ° C und C3 mit PBS bei 37 ° C und Transferdeck auf Silikon-O-Ringe. </li><li> 100 l vorgewärmten FITC-Dextran-Lösung in CIM auf C1 und C2 oder C3 in PBS auf. </li><li> Verletzen Plasmamembran auf C1 und C3 von sanften 40 mg Glasperlen über das Deckglas bei Raumtemperatur durch manuelles Kippen zurück und Deckgläser6-8 mal her in einem Winkel von 30 °. Hinweis: Für leichte Verletzungen, sicherzustellen, dass die Glasperlen sind gleichmäßig verteilt, so wiederholen Verletzungen zu minimieren. Um die Reproduzierbarkeit der Verletzung zwischen den Proben zu verbessern, gleichzeitig nehmen die Glasperlen Verletzungen der verschiedenen Proben verglichen werden. </li><li> Vermeidung von weiteren Rollen der Perlen, übertragen alle Deckgläser auf einem 37 ° C-Inkubator bei Umgebungs CO 2 und damit die Reparatur für 5 min gehen. </li><li> Ohne dass die Kugeln rollen, entfernen Sie die Glasperlen und FITC-Dextran durch Waschen mit CIM (C1 und C2) oder PBS (C3) bei 37 ° C </li><li> Platz Deckgläser wieder auf den O-Ring und 100 l vorgewärmten Lysin fixierbar TRITC-Dextran-Lösung in CIM auf C1 und C2 oder C3 in PBS auf. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C für 5 min bei Umgebungs CO 2. </li><li> Zweimal waschen Deckgläser mit vorgewärmten CIM setzen und mit 4% PFA für 10 min bei RT. </li><li> Zweimal waschen mit PBS und Inkubation für 2 min bei RT in Hoechst-Farbstoff. </li><li> Wash samples zweimal mit PBS, montieren auf einem Objektträger mit Montage Medien-und Bildzellen mit Hilfe eines Epifluoreszenzmikroskop. </li><li> Verwenden C2-Zellen aus, um den Hintergrund rote und grüne Farbintensität bestimmen und diesen Wert auf Schwellen die roten und grünen Kanäle für alle Proben (C1-C3). </li><li> Ergebnis Gesamtzahl der Zellen, die sind a) Grün (verletzt und repariert) und b) rot oder beide rot und grün (verletzt, aber nicht zu reparieren) in C1 und C3 Proben. </li><li> Zahl&gt; 100 Greens Zellen für jede Bedingung und drücken die Fraktion von Zellen, die als Prozent der Zellen verletzt (grün und rot) zu reparieren fehlgeschlagen. </li></ol> 2. Live-Imaging der Kinetik der Zellmembran Reparatur Nach Laser-Verletzung <ol><li> Waschen der Zellen mit vorgewärmtem CIM und dann das Deckglas in CIM mit FM-Farbstoff. </li><li> Legen Sie das Deckglas in einer Halterung in der Phase Top Inkubator bei 37 ° C gehalten </li><li> Wähle einen 1-2 mm 2 Bereich der Zellmembran, und bestrahlen &lt;, 10 ms mit dem gepulsten Laser. Dämpfen die Laserleistung durch die Software, um 40-50% der Spitzenleistung. Optimale Leistung ermöglicht die konsistente, aber nicht tödliche Verletzungen und dies muss durch Versuch und Irrtum für jedes einzelne Instrument und Zelllinie verwendet bestimmt werden. </li><li> Um Reparatur-, Bild-in Epi-Fluoreszenz-und Hell überwachen alle 10 sec, beginnend vor Verletzungen und weiterhin für 3-5 min nach der Verletzung. Hinweis: Für keine Reparatursteuer, wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.4 mit die Zellen verletzt in PBS mit FM-Farbstoff. </li><li> Um die Kinetik der Reparatur zu quantifizieren, messen zellulären Fluoreszenz-Farbstoff FM und zeichnen Sie die Änderung in der Intensität (ΔF/F0) im Verlauf der Bildgebung. Diese Daten sollten über 10 Zellen in jeder Bedingung gemittelt und aufgetragen als gemittelte Wert oder einzelne Zelle, wie gebraucht. </li></ol> 3. Bulk-Imaging (Glasperlenspiel) Verletzung Induced Lysosomal Exocytosis Die Proben sind folgende Zellen&gt; 50% gewachsenZusammenfluss: 1. Test (C1) - Die Zellen können in Gegenwart von Ca 2 +, 2 zu reparieren. Control 1 (C2; Keine Verletzung) - Cells weder verletzt noch mit primärem Antikörper inkubiert und drei. Control 2 (C3; keine Reparatur) - Cells erlaubt, in Abwesenheit von Ca 2 + zu reparieren. <ol><li> Waschdeckgläser C1 und C2 zweimal mit CIM bei 37 ° C und C3 mit PBS bei 37 ° C und übertragen sie auf Silikon-O-Ringe. </li><li> 100 ul vorgewärmtes Lysin fixierbar TRITC-Dextran in CIM auf C1 und C2 und C3 in PBS auf. </li><li> Verletzen Plasmamembran auf C1 und C3, wie in Schritt 1.3. </li><li> Vermeidung von weiteren Rollen der Perlen, übertragen alle Deckgläser auf einem 37 ° C-Inkubator bei Umgebungs CO 2 und damit die Reparatur für 5 min gehen. </li><li> Entfernen Sie die Glasperlen und TRITC-Dextran durch Waschen der Deckgläser in kaltem Wachstumsmedium, wodurch ebenfalls keine Rollen der Glasperlen auf den Zellen. </li><li> Zweimal mit kaltem Wachstumsmedium Spülen Sie die Deckgläser und Transfer zu den O-Ringen. </li><li> C1 und C3, 100 l Ratte anti-Maus-Antikörper, der in kalten LAMP1 komplette Wachstumsmedien und die kalte, komplett Wachstumsmedien bis C2. </li><li> Antikörperbindung zu ermöglichen, Inkubieren Deckgläser für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Dreimal Waschen Sie die Deckgläser mit kaltem CIM und reparieren alle Deckgläser mit 4% PFA für 10 min bei RT und dann spülen 3x mit CIM. </li><li> Alle Deck inkubieren in 100 ul Blockierungslösung für 15 min bei RT </li><li> Alle Deck inkubieren in 100 &amp;mgr; l Alexa Fluor 488 anti-Ratten-Antikörper für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Zweimal waschen mit PBS und Inkubation für 2 min bei RT in Hoechst. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, montieren auf einem Objektträger mit Montage Medien und Bild mit Epifluoreszenzmikroskop. </li><li> Mit Bildern von C2-Zellen, bestimmen die unspezifische Hintergrundfärbung in rot (TRITC-Dextran) und Grün (Alexa Fluor 488-Antikörper)-Kanäle und nutzen diese Hintergrundfärbung Werte Schwelle die roten und grünen Kanäle für alle Proben (C1-C3). &lt;/ Li&gt; <li> Verwenden Sie die&gt; 100 rot markierten Zellen von C1 und C3, die Intensität der Färbung LAMP1 (grün) in verletzten Zellen zu messen. Für eine erfolgreiche Experiment der LAMP1 Färbung in Zellen von C3 deutlich niedriger als in den Zellen von C1 sein. </li></ol> 4. Live-Imaging von Cell Membrane Verletzung ausgelöst Subcellular Handel <ol><li> Fluoreszenz beschriften die Raum von Interesse durch Transfektion geeigneter Reporter (zB CD63-GFP für Lysosomen 8) oder mit Fluoreszenzfarbstoffen 9. </li><li> Für die Markierung mit Fluoreszenzfarbstoff Lysosomen, Inkubation Zellen zu 50% Konfluenz in Wachstumsmedium, das FITC-Dextran gewachsen </li><li> Ermöglichen Dextran für 2 Stunden endocytosiert im CO 2-Inkubator (oder mehr als ausreichend endosomalen Markierung mit Dextran von der Zellinie von Interesse erforderlich) werden. </li><li> Waschen der Zellen mit vorgewärmtem Wachstumsmedium und Inkubieren darin für 2 Stunden in einem CO 2-Inkubator, damit alleendozytosiert Dextran in den Lysosomen ansammeln. </li><li> Vor Bildgebung, spülen Sie die Deckglas in vorgewärmten CIM und montieren in einem Deckglas Halter auf der Bühne oben Brutschrank bei 37 ° C </li><li> Führen Sie Weitfeld (für die Bewegung in der gesamten Zelle) oder TIRF (Bewegung an der Zelloberfläche und Exozytose) Bildgebung - Zellen, die FITC-Dextran nicht überfüllt sind markiert Lysosomen sind ideal für die Abbildung der Bewegung und Exozytose einzelner Lysosomen. </li><li> Ausrichten der TIRF Laser für die Bild Mikroskop: Verwenden 60X oder 100X-Objektiv mit&gt; 1,45 NA. Stellen Sie den Winkel für die einfallenden Laserstrahl mit TIRF des Herstellers Ansatz. </li><li> Verletzen die Zellmembran durch Bestrahlen einer kleinen (1-2 mm 2) Region &lt;100 ms, mit dem gepulsten Laser bei 40-50% Dämpfung. </li><li> Um die Reaktion zu überwachen, um Verletzungen Lysosom, Bildzellen für mindestens 2 min lang bei 4-6 Zell Bilder / sec abhängig von der Dynamik der Exozytose in den Zellen von Interesse. </li></ol>

<ol><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li>
<li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li>
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<li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li>
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<li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li>
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<li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+events+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Zellmembranschäden in vivo auftritt, aufgrund einer Vielzahl von physiologischen Belastungen und verschiedene experimentelle Ansätze wurden entwickelt, um diese zu imitieren. Dazu gehören verletzen Zellmembran von adhärenten Zellen durch Abschaben sie von der Schale oder durch Passagieren durch eine enge Bohrung Spritze 9,10. Nach solchen Verletzungen heilen die Zellen in Suspension und nicht an die extrazelluläre Matrix eingehalten, wie sie normalerweise in dem Gewebe zu tun. Wieder andere, wie die ...

Zellmembran hält die Integrität der Zellen durch eine Barriere zwischen der Zelle und der extrazellulären Umgebung. Eine chemische, elektrische oder mechanische Reiz, die die normalen physiologischen Schwelle sowie das Vorhandensein von eindringenden Krankheitserregern überschreitet kann jedes Ergebnis zu Verletzungen der Zellmembran und lösen eine anschließende zelluläre Reaktion auf diese Verletzung zu reparieren. Um diese Verletzungen der Zellmembran überleben Zellen besitzen einen effizienten Mechanismus zur Reparatur. Dieser Mechanismus ist calciumabhängig und erfordert intrazellulären Transports von Proteinen, wie Annexine und MG53 ua sowie subzellulären Kompartimenten, wie Endosomen, Lysosomen, Golgi abgeleiteten Vesikeln und Mitochondrien der verletzten Zellmembran 1-7. Allerdings bleibt die Details der Abfolge der molekularen und subzellulärer Ereignisse bei der Reparatur beschädigter Zellmembran beteiligt kaum verstanden. Reparatur Antwort Zelle kann in Ohr getrennt werdenly und späte Antworten. Frühe Reaktionen, die innerhalb von Sekunden bis Minuten-Zeitskala auftreten, sind bei der Bestimmung der Natur der verspäteten Antworten, die zu erfolgreichen Zellreparatur oder Zelltod enorm wichtig. Endpunkt-Assays auf Basis von Groß biochemische und zelluläre Analyse haben dazu beigetragen, die Einbeziehung der molekularen und zellulären Prozesse in Reparatur. Aber aufgrund der Heterogenität und die Schnelligkeit der zellulären Reparatur Antwort, Endpunkt-Assays nicht den kinetischen und räumlichen Details der Abfolge der Ereignisse, die zu reparieren ist. Ansätze, die gesteuert Verletzung Zellmembran ermöglichen und die Überwachung der Zellmembran assoziierten Reparatur und subzellulären Reaktionen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ideal für solche Untersuchungen geeignet sind. Hier solcher Ansätze wurden vorgestellt. Zwei der Protokolle beschreiben Ansätze, um die Echtzeit-Kinetik der Zellmembran Reparatur und die subzelluläre Antworten mit der Reparatur-Prozess in lebenden Zellen assoziiert folgende Laser inj überwachenUry. Als Ergänzung zu diesen Live-Cell-Imaging-basierte Assays haben Endpunkt-Assays auch beschrieben, dass eine Bevölkerung basierte Maßnahme zur Überwachung der Reparatur von einzelnen Zellen und der damit verbundenen subzellulärer Antworten zu liefern. Um ihren Nutzen zeigen diese Ansätze wurden verwendet, um Menschenhandel und Exozytose von Lysosomen zu überwachen als Reaktion auf Verletzungen der Zellmembran.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H1387</td><td>Zur Aufbereitung von CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7,4)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP410</td><td>Zur Aufbereitung von CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7,4)</td></tr><tr><td>FITC Dextran (Lysin fixierbar)</td><td>Invitrogen</td><td>D1820</td><td>2 mg/ml in CIM oder PBS</td></tr><tr><td>Glasperlen</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Dextran (Lysin fixierbar)</td><td>Invitrogen</td><td>D1818</td><td>2 mg/ml in CIM oder PBS</td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4% in PBS</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1/10 000 in PBS</td></tr><tr><td>FM Farbstoff</td><td>Invitrogen</td><td>T3163</td><td>1 &micro; g/&micro; l in CIM oder PBS</td></tr><tr><td>FITC Dextran</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>2 mg/ml im Wachstumsmedium</td></tr><tr><td>LAMP1&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-19992</td><td>1/300 in Wachstumsmedium</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Huhn Anti-Ratte IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21470</td><td>1/500 in Blockierlösung</td></tr><tr><td>Eindeckmittel</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Fisher</td><td>12-545-86</td><td></td></tr><tr><td>Glasboden Petridum</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Silikon O-Ring</td><td>Bellco</td><td>1943-33315</td><td></td></tr><tr><td>Deckglashalter</td><td>Bellco</td><td>1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR</td><td>12001-566</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>MP1400-500H</td><td>Verwendet für Wachstumsmedium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td></tr><tr><td>Penicillin/Sreptomycin</td><td>VWR</td><td>12001-350</td><td>Verwendet für Wachstumsmedium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td></tr><tr><td>Hühnerserum</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td>5% Hühnerserum in CIM wird zur Blockierung der Lösung während der Immunfärbung</td></tr><tr><td>verwendet PBS (Ca2+ und Mg2+ frei)</td><td>VWR</td><td>12001-664</td><td></td></tr><tr><td>Epifluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus America, PA</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>TIRF Illuminator&nbsp;</td><td>Olympus America, PA</td><td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td><td></td></tr><tr><td>Epifluoreszenzbeleuchtung</td><td>Sutter Instruments, Novato CA</td><td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Photometrics, Tucson, AZ</td><td>Evolve 512 EMCCD&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bilderfassungs- und Analysesoftware</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Slidebook 5</td><td></td></tr><tr><td>Gepulster Laser</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td><td>Ablate (3iL13)</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator auf der Bühne</td><td>Tokaihit, Japan</td><td>INUBG2ASFP-ZILCS</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging cell membrane verletzung und subzellulärer prozesse in der reparatur beteiligt

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

Die Fähigkeit von verletzten Zellen zu heilen ist eine grundlegende zelluläre Prozess, aber zellulären und molekularen Mechanismen der Heilung verletzten Zellen beteiligt sind kaum verstanden. Hier Assays werden beschrieben, die Fähigkeit und die Kinetik der Heilung von kultivierten Zellen folgenden lokalisierten Verletzungen zu überwachen. Das erste Protokoll beschreibt einen Endpunkt basierten Ansatz, um gleichzeitig zu beurteilen Zellmembran Reparaturfähigkeit von Hunderten von Zellen. Das zweite Protokoll beschreibt ein Echtzeit-Bild Ansatz, um die Kinetik der Zellmembran Reparatur in einzelnen Zellen folgenden lokalisierten Verletzungen mit einem gepulsten Laser zu überwachen. Wie Heilung verletzten Zellen beinhaltet Handel von spezifischen Proteinen subzellulärer Kompartimente und an den Ort der Verletzung, das dritte Protokoll beschreibt die Verwendung von oben Endpunkt Ansatz für eine solche Veranstaltung Handel (lysosomale Exozytose) in Hunderten von Zellen verletzt bewerten und gleichzeitig die letzte Protokoll beschreibt die Verwendung von gepulstem Laser Verletzungen zusammen mit TIRF microsKopie an die Dynamik der einzelnen subzellulären in verletzten Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu überwachen. Während die Protokolle beschreiben die Verwendung dieser Ansätze, um die Verbindung zwischen Zellmembran Reparatur und lysosomale Exozytose in kultivierten Muskelzellen zu studieren, können sie als solche für andere adhärenten Kulturzelle und subzellulären Kompartiment der Wahl angewendet.

Für Single-Cell-Imaging hier beschriebenen Protokolle sind, die Fähigkeit und die Kinetik der Zellmembran Reparatur (Protokolle 1 und 2) und die subzelluläre Handel und Fusion von Lysosomen während der Reparatur zu überwachen (Protokolle 3 und 4). Protokoll 1 zeigt eine Groß Assay, der die Kennzeichnung aller verletzten Zellen und der Identifizierung von verletzten Zellen, die zur Reparatur fehlgeschlagen ermöglicht. Die Ergebnisse in Abbildung 1 zeigen, dass, während die un...

Der Prozess der Heilung verletzten Zellen beinhaltet Handel spezifischer Proteine ​​und subzellulären Kompartimenten an der Stelle der Zellmembran Verletzung. Dieses Protokoll beschreibt Assays, um diese Prozesse zu überwachen.

Imaging Cell Membrane Verletzung und subzellulärer Prozesse in der Reparatur beteiligt

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Wirkung bestimmter Behandlungen auf die Reparatur verletzter Zellen zu beobachten und die subzellulären Prozesse zu untersuchen, die zur Reparatur verletzter Zellen beitragen. Dies wird erreicht, indem Zellen in Gegenwart fluoreszierender Farbstoffe verletzt werden, die intakte Zellmembranen nicht durchdringen können, um die Kinetik und Fähigkeit verletzter Zellen zu bewerten, den Eintritt dieser Farbstoffe zu verhindern. Als zweiten Schritt überwachen wir das Auftreten intrazellulärer Proteine an der verletzten Zellmembran, was die Fähigkeit eines bestimmten zellulären Kompartiments identifiziert, an der Reparatur durch Fusion mit der verletzten Zellmembran mitzuwirken.Danach überwachen wir die Fusion zellulärer Kompartimente von Interesse mit der verletzten Zellmembran, um die Kinetik der Verletzung zu verfolgen. Die ausgelöste Fusion dieses Kompartiments führt zu Ergebnissen, die zeigen, dass die Reparatur einer Zellmembranverletzung mit einer lysosomalen Exozytose assoziiert ist, basierend auf der vermehrten Anwesenheit des lysosomassoziierten Membranproteins 1 an der verletzten Zelloberfläche sowie Live-Bildgebung der Sekretion lysosomaler Inhalte durch verletzte Zellen. Diese Methoden können helfen, wichtige Fragen im Bereich der Zellverletzung und -reparatur zu beantworten.Zum Beispiel können diese verwendet werden, um zu bestimmen, welche Proteine und zellulären Kompartimente auf fokale Schädigungen der Zellmembran reagieren, und anschließend die Kinetik dieser Reaktion zu bewerten. Die Demonstration des Verfahrens übernehmen Aurelia D vier und hamma stra zwei, Postdoktorandinnen aus meinem Labor. Um die verletzten Zellen, die heilen, und jene, die nicht heilen, separat zu markieren.Säen Sie die Zellen auf sterilen Deckgläsern für die drei Versuchsbedingungen aus. Kultivieren Sie die Zellen, bis sie eine Konfluenz von mehr als 50 % erreichen, anschließend waschen Sie C1 und C2 zweimal mit CIM bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie C3 mit PBS bei 37 Grad Celsius. Überführen Sie dann die Deckgläser auf Silikon-O-Ringe. Geben Sie 100 Mikroliter vorgewärmte Dextran-Lösung in geeignetem Puffer hinzu. Verletzen Sie die Plasmamembran an C1 und C3, indem Sie 40 Milligramm Glaskügelchen über das Deckglas bei Raumtemperatur geben und das Deckglas manuell kippen.Bewegen Sie den Applikator sechs bis acht Mal im Winkel von 30 Grad hin und her, um eine leichte Verletzung zu erzeugen. Stellen Sie sicher, dass die Glasperlen gleichmäßig verteilt sind, um Wiederholungsverletzungen zu minimieren und die Reproduzierbarkeit der Verletzung zwischen den Proben zu verbessern. Führen Sie die Glasperlenverletzung an den verschiedenen zu vergleichenden Proben gleichzeitig durch, um ein weiteres Rollen der Perlen zu vermeiden.Überführen Sie alle Deckgläser in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius unter Umgebungsluft mit ambientem CO2 und lassen Sie die Reparatur fünf Minuten lang ablaufen, wobei sich die Kügelchen nicht bewegen dürfen. Entfernen Sie die Glaskügelchen und den Fitzy-Dextran durch Waschen mit Puffer oder PBS. Setzen Sie die Deckgläser nun zurück auf den O-Ring und geben Sie 100 Mikroliter vorgewärmtes Lysin hinzu.Lösung mit fixierbarem Trissy-Dextran. Inkubieren bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten bei ambientem CO2. Die Deckgläser zweimal mit vorgewärmtem CIM waschen und nach zwei PBS-Puffer-Waschungen mit 4 % PFA für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Zwei Minuten in Hirsch-Dye inkubieren und nach zwei PBS-Waschungen die Probe mit Eindeckmedium auf einem Objektträger montieren.Bilden Sie anschließend die Zellen aus der C-zwei-Probe mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop ab. Bestimmen Sie die Hintergrundintensität der roten und grünen Färbung. Verwenden Sie diesen Wert dann, um die roten und grünen Kanäle für alle Proben zu schwellenwertbasiert zu filtern.Zählen Sie die Gesamtanzahl der grünen Zellen. Zählen Sie außerdem Zellen, die rot oder sowohl rot als auch grün sind, in den Proben C1 und C3. Zählen Sie nun über 100 grüne geschädigte Zellen für jede Bedingung und geben Sie den Anteil der Zellen, die die Reparatur nicht abgeschlossen haben, als Prozentwert aller geschädigten Zellen an.Waschen Sie die Zellen, die eine Überkonfluenz von mehr als 50 % erreicht haben, mit vorgewärmtem CIM und montieren Sie den Deckglaser in CIM mit FM-Farbstoff. In einem Halter im auf der Objektbühne befindlichen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius gehalten wird. Wählen Sie einen Bereich der Zellmembran unter Verwendung einer optimalen Leistung, die eine konstante, aber nicht letale Schädigung ermöglicht.Bestrahlen Sie die Probe mit dem gepulsten Laser weniger als 10 Millisekunden, um dies zu erreichen. Dämpfen Sie die Laserleistung über die Software auf 40 bis 50 % der Spitzenleistung, um alle zwei bis zehn Sekunden im Epi-, Fluoreszenz- und Hellfeldmodus zu überwachen, zu reparieren und Bilder aufzunehmen, beginnend vor der Verletzung und fortgesetzt für drei bis fünf Minuten nach der Verletzung. Um die Kinetik der Reparatur zu quantifizieren, messen Sie die zelluläre Fluoreszenz der FM-Färbung.Berechnen Sie die Änderung der Intensität während des Bildgebungsverlaufs. Mitteln Sie die Daten für mehr als 10 Zellen unter jeder Bedingung und tragen Sie diese entweder als gemittelte Werte oder als Einzelzellwerte auf. Spülen Sie die Deckgläser von C eins und C zwei.Kulturgefäßpräparationen mit CIM bei 37 Grad Celsius und Waschen von C3 mit PBS bei 37 Grad Celsius. Danach die Proben auf Silikon-O-Ringe übertragen. 100 Mikroliter vorgewärmtes lysinfixierbares Trissy-Dextran hinzufügen.Beschädigen Sie die Plasmamembran an C1 und C3, wie zuvor gezeigt. Vermeiden Sie danach ein weiteres Rollen der Kügelchen. Überführen Sie alle Deckgläser in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator bei ambientem CO2 und lassen Sie die Reparatur fünf Minuten lang ablaufen.Jetzt, um die Glasperlen und Trixie-Dextran zu entfernen, waschen Sie die Deckgläser in kaltem Wachstumsmedium, wobei darauf zu achten ist, dass die Glasperlen nicht über die Zellen rollen. Spülen Sie die Deckgläser zweimal mit kaltem Wachstumsmedium und überführen Sie sie auf die O-Ringe zu C1 und C3. Geben Sie 100 Mikroliter Ratten-anti-US-Lamp-1-Antikörper in kaltes vollständiges Wachstumsmedium und geben Sie das kalte vollständige Wachstumsmedium zu C2, um die Antikörperbindung zu ermöglichen. Inkubieren Sie die Deckgläser 30 Minuten bei vier Grad Celsius nach dreimaligem Waschen mit kaltem CIM.Fixieren Sie alle Deckgläser mit 4 % PFA für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie anschließend dreimal mit CIM. Inkubieren Sie dann alle Deckgläser für 15 Minuten in 100 µL einer Blockierungslösung, gefolgt von 100 µL 488-markiertem Anti-Ratte-Antikörper für 15 Minuten.Zweimal mit PBS waschen und nach zwei PBS-Spülungen zwei Minuten bei Raumtemperatur in Her-Färbung inkubieren. Die Proben auf einem Objektträger montieren und anschließend mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop Bilder von C2-Zellen aufnehmen. Die unspezifische Hintergrundfärbung in den roten und grünen Kanälen bestimmen.Verwenden Sie diese Hintergrundfärbungswerte, um die Schwellenwerte für die roten und grünen Kanäle bei allen Proben festzulegen. Nutzen Sie die über 100 rot markierten Zellen aus C1 und C3, um die Intensität der Lamp-1-Färbung in verletzten Zellen zu messen. Bei einem erfolgreichen Experiment wird die Lamp-1-Färbung in Zellen aus C3 deutlich niedriger sein als in Zellen aus C1. Zur Markierung von Lysosomen mit fluoreszierendem Farbstoff inkubieren Sie die Zellen, die bis zur 50%igen Konfluenz in Wachstumsmedium gezüchtet wurden, in Anwesenheit von FITC-Dextran.Lassen Sie die Dextran-Endozytose zwei Stunden im Zellkultur-Inkubator stattfinden. Waschen Sie die Zellen mit vorgewärmtem Wachstumsmedium und inkubieren Sie sie zwei Stunden in einem CO2-Inkubator, um eine Ansammlung des endozytierten Dextrans im Lysosom vor der Bildaufnahme zu ermöglichen. Spülen Sie den Deckglaser in vorgewärmtem CIM und montieren Sie ihn in CIM auf einem Deckglas-Halter im Inkubator auf dem Mikroskoptisch bei 37 Grad Celsius. Wählen Sie Zellen aus, deren lysosomen, die mit Fitzy-Dextran markiert sind, nicht überfüllt sind, um die Abbildung durchzuführen. Die Bewegung und Exozytose einzelner Lysosomen. Erfassen Sie Weitfeldbilder zur Verfolgung der Lysosomenbewegung im gesamten Zellinneren.Alternativ gewinnen Sie Rasenbilder, um die Bewegung an der Zelloberfläche zu erfassen und deren Exozytose zu überwachen. Verletzen Sie die Zellmembran durch Bestrahlung, wie zuvor gezeigt, um die Reaktion des Lysosoms auf Zellschäden zu überwachen, und nehmen Sie Bilder der Zellen mit vier bis sechs Bildern pro Sekunde für mindestens zwei Minuten oder länger auf, abhängig von der Dynamik der Exozytose in den betreffenden Zellen. Bei diesem Sammelansatz werden alle verletzten Zellen markiert und jene identifiziert, die keine Reparatur zeigen, während die nicht verletzten Zellen unlabeled bleiben.Die Zellen, die durch Glaskugeln in Gegenwart von Fitzy-Dextran verletzt wurden, färben sich grün, wenn die Zellen in Gegenwart von Calcium regenerieren können. Die meisten verletzten Zellen schaffen die Reparatur und werden nicht durch Trissy-Dextran markiert, wenn den Zellen die Regeneration ermöglicht wird. In Abwesenheit von Calcium werden die meisten verletzten Zellen außerdem rot durch Trissy-Dextran markiert.Dieses Experiment bewertet die Kinetik der Zellmembranreparatur, indem der Eintritt von FM-Farbstoff in die Zelle verfolgt wird. Bei Inkubation mit FM-Farbstoff zeigen intakte Zellen kaum bis keine intrazelluläre Anfärbung. Nach einer lokalisierten Laserverletzung der Zellmembran beginnt FM D in die Zelle einzudringen und an innere Membranen zu binden, was einen plötzlichen Anstieg der Fluoreszenz des FM-Farbstoffs verursacht, da die Fähigkeit der Zellmembran, sich nach einer Laserverletzung zu reparieren, von Calcium abhängt.Eine Zelle, die in Gegenwart von Calcium verletzt wird, ist in der Lage, sich zu reparieren, wodurch der Einstrom des FM-Farbstoffs innerhalb einer Minute nach der Verletzung zum Erliegen kommt. Im Gegensatz dazu versagt bei einer Zelle, die in Abwesenheit von Calcium reparieren soll, die Reparatur, was zu einem kontinuierlichen Farbstoffeinstrom und folglich zu einem anhaltenden Anstieg der FM-d-Farbstoff-Fluoreszenz auch noch vier Minuten nach der Verletzung führt. Somit führt die Reparatur der Zellmembran zu einer Plateaubildung der FM-Farbstoff-Anfärbung.Während das Fehlen einer Zellmembranreparatur zu einem kontinuierlichen Farbstoffeintritt führt, der kein Plateau erreicht. Der groben Glassphären-basierte Verletzungsansatz kann verwendet werden, um die Translokation von Vesikeln und Proteinen an die Zelloberfläche als Reaktion auf eine Verletzung zu überwachen. Hierbei werden die Zellen in Gegenwart von Trissy-Dextran verletzt.Daher werden die nicht verletzten Zellen nicht rot markiert, während alle verletzten Zellen rot markiert sind. Beachten Sie, dass nicht verletzte Zellen, die nicht mit primärem Antikörper behandelt wurden, eine Hintergrundfärbung für das Zelloberflächenprotein Lamp-1 aufweisen. Wenn jedoch Zellen verletzt werden und unter Anwesenheit von Calcium heilen dürfen, durchlaufen Lysosomen eine Exocytose, wodurch die Färbung von Lamp-1 auf der Oberfläche der verletzten Zellen verstärkt wird.Diese Zunahme der LAMP1-Markierung an der Zelloberfläche ist deutlich geringer in Zellen, die in Abwesenheit von Calcium heilen dürfen. Sowohl die Quantifizierung der Anzahl von Zellen mit intensiver LAMP1-Färbung an der Zelloberfläche als auch die Messung des Ausmaßes der LAMP1-Färbung an individuellen verletzten Zellen liefern daher Maße für die Fähigkeit der Zelle, eine verletzungsbedingte lysosomale Exozytose durchzuführen.Dieses Experiment überwacht direkt die Kinetik, Art und Lokalisation einzelner Lysosomenfusionen. Als Reaktion auf eine Zellmembranschädigung werden die Zellen durch einen gepulsten Laser verletzt, und die an der Zelloberfläche befindlichen Lysosomen werden mittels TURF-Bildgebung abgebildet, wodurch die verletzungsbedingte Exozytose von Lysosomen in einzelnen Zellen verfolgt werden kann. Diese Abbildung zeigt eine Zelle, die im linken Panel durch Phasenkontrastbildgebung und im mittleren Panel durch TURF-Mikroskopie dargestellt ist.Im rechten Panel ist das Turf-Bild derselben Zelle 105 Sekunden nach der Verletzung zu sehen. Hier zeigt sich, dass die Verletzung die Rekrutierung eines Lysosoms an die Zellmembran ausgelöst hat, gefolgt von Exocytose. Dieses Lysosom ist im Turf-Bild vor der Verletzung nicht sichtbar, nach der Verletzung jedoch erreicht es die Zellmembran und wird detektierbar.Wenn sich das Vesikel der Zellmembran nähert, wird es durch die Flächenbeleuchtung stärker angeregt, wodurch die Fluoreszenz des lysosomalen Fitsy-Dex-Strangs ihren Maximalwert erreicht. Wenn sich der Fusionsschlitz öffnet, führt dies zur Neutralisation des lysosomalen pH-Werts und damit zur Dequenchung der Fitzy-DExT-Strang-Fluoreszenz. Anschließend wird der DExT-Strang aus dem Vesikel nach außen abgegeben, wodurch sich die ZI-Fluoreszenz lateral ausbreitet und die Vesikel-Fluoreszenz allmählich abnimmt. Verschiedene, durch Verletzungen ausgelöste Reaktionen der Lysosomen können so gemessen werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Fähigkeit von Zellen überwacht, sich von großen fokalen Verletzungen zu reparieren, sowie subzelluläre Kompartimente und Proteine, die auf die Verletzung reagieren und bei der Reparatur helfen. Weitere Experimente unter Verwendung verschiedener Vitalfarbstoffe, Kompartimente oder Proteine können durchgeführt werden, um die Reaktion auf die Verletzung und die Beteiligung an der Reparatur von IND-Zellen zu überwachen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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