Name: Intravitale Videomikroskopie-Messungen des retinalen Blutflusses bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Lernen Sie die Messung des retinalen Blutflusses bei Mäusen mittels intravitaler Videomikroskopie mit fluoreszierenden Mikrosphären. Diese Methode ermöglicht präzise Quantifizierung von Gefäßdurchmessern und Blutgeschwindigkeiten.

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Finanziert durch NIH EY017599 (NRH).

Die Verfahren, die die Verwendung von Tieren beinhalten, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der LSUHSC-S überprüft und genehmigt und gemäß den von den National Institutes of Health festgelegten Kriterien durchgeführt.
1. Herstellung von Perfusionslösungen
<ol>
	<li>Beschallung einer 1 %igen Stammlösung von Mikrosphären mit einem Durchmesser von 1,9 μm.</li>
	<li>Entnehmen Sie ~25-30 x 106 grün fluoreszierende Mikrokügelchen (d. h. ~10 μl der Stammlösung) in eine 300 μl Spritze. Verdünnen Sie die Mikrosphären, indem Sie weitere 240 μl Kochsalzlösung in die Spritze aufziehen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 50-μl-Lösung von 2 x 10 6 Molekulargewicht fluoreszierendem Dextran vor, das in steriler Kochsalzlösung gelöst ist, mit einer injizierten Dosis im Bereich von 3-10 mg/kg. Bewahren Sie das Dextran bis zur Infusion in Alufolie bedeckt auf.</li>
</ol>
2. Tieranästhesie und Gefäßkanülierung
<ol>
	<li>Betäuben Sie das Tier für das chirurgische Einführen von Gefäßkanülen und für die stationäre Positionierung unter einem Mikroskopobjektiv. Es gibt eine große Auswahl an Anästhesieprotokollen mit verschiedenen Vor- und Nachteilen und potenziellen Auswirkungen auf systemische Parameter. Zu den vielen verschiedenen Optionen gehören eine Kombination aus Ketamin (100-150 mg/kg), Xylazin (10 mg/kg) und Acepromazin (2 mg/kg) oder eine Kombination aus Ketamin (50 mg/kg) und Pentobarbital (50 mg/kg). Die beschriebenen Verfahren sind akut und enden mit einer Euthanasie, die durch eine Überdosierung von Pentobarbital (150 mg/kg) induziert wird, gefolgt von einer Thorakotomie; Die Aufnahme eines Analgetikums ist für den terminalen Eingriff nicht erforderlich.</li>
	<li>Halten Sie für den Rest des Versuchs ein Heizkissen unter dem Tier.</li>
	<li>Halten Sie die Augen während des anschließenden chirurgischen Einsetzens von Gefäßkanülen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung feucht.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Gefäßkanüle für nachfolgende Infusionen von fluoreszierenden Tracern vor. Auf die Spitze einer Spritzennadel wird ein 20 cm langer Polyethylenschlauch (z.B. 0,28 mm Innendurchmesser; 0,61 mm Außendurchmesser) gelegt, wobei das scharfe Ende der Nadel zuvor durch Hin- und Herbiegen mit einem Hämostaten abgebrochen wird.</li>
	<li>Füllen Sie eine Spritze und einen Schlauch mit heparinisierter (25 U/ml) Kochsalzlösung.</li>
	<li>Rasieren Sie eine Seite des Unterbauchs und machen Sie einen Schnitt, um die Oberschenkelvene freizulegen.</li>
	<li>Um die Vena femoralis zu kanülieren, binden Sie das Gefäß mit einer 5.0-Naht ab, machen Sie einen teilweisen Schnitt in das Gefäß (etwa die Hälfte des Gefäßdurchmessers) und führen Sie den Schlauch in das Gefäß ein, wobei Sie den Schlauch mit der Naht um den kanülierten Abschnitt befestigen.</li>
</ol>
3. Vorbereitung für die Intravitalmikroskopie
<ol>
	<li>Erweitern Sie die Pupille des Auges mit einem Tropfen 1% Tropicamid-Ophthalmologie, gefolgt von einem Tropfen 2,5% Hypromellose-Ophthalmologie.</li>
	<li>Decken Sie das Auge mit einem 5 mm Glasdeckglas ab.</li>
	<li>Legen Sie das Tier auf eine Plexiglasplatte, die unter dem Mikroskopobjektiv eines aufrechten Mikroskops positioniert wird. Platzieren Sie die chirurgische Gaze strategisch unter dem Kopf, um eine direkte Achse durch das Objektiv zur zentralen Netzhaut und Papille zu ermöglichen.</li>
	<li>Fokussieren Sie durch das Mikroskop auf die Sehscheibe, finden Sie die Scheibe mit einem 4X-Objektiv mit geringer Leistung und verwenden Sie einen Fluoreszeinfilter.</li>
</ol>
4. Infusion von fluoreszierenden Mikrosphären zur Messung von Geschwindigkeiten
<ol>
	<li>Fokussieren Sie mit einem 4X-Objektiv auf die Netzhaut mit der Sehscheibe in der Mitte des Sichtfelds.</li>
	<li>Die fluoreszierende Mikrosphärenlösung wird mit einer Geschwindigkeit von 250 μl/min/kg infundiert.</li>
	<li>Nehmen Sie die sichtbare Netzhaut um die Sehplatte herum mit einer Kamerabelichtungszeit von ~8 ms auf Video auf.</li>
	<li>Beenden Sie die Mikrosphären-Infusion, wenn eine ausreichende Dauer des Videos aufgezeichnet wurde (1-2 Minuten); etwas Mikrosphärenlösung wird wahrscheinlich nicht verwendet.</li>
</ol>
5. Infusion eines fluoreszierenden Plasmamarkers zur Messung von Durchmessern
<ol>
	<li>Fokussieren Sie mit einem 4X-Objektiv auf die Netzhaut mit der Sehscheibe in der Mitte des Sichtfelds.</li>
	<li>Die vorbereitete Lösung von fluoreszierendem Dextran wird während der Videoaufzeichnung als Bolus über ~5 Sekunden in die Oberschenkelvene infundiert. Dieses Video hilft dabei, die Identität der Arteriolen im Vergleich zu den Venolen zu bestimmen, wobei die Arteriolen zuerst perfundiert werden. Führen Sie diesen Schritt mit einer Belichtungszeit der Kamera von ~8 ms aus, obwohl die genaue Belichtungszeit nicht entscheidend ist.</li>
	<li>Wechseln Sie zu einem 10-fachen Objektiv und einer Belichtungszeit von 20-40 ms, um eine verbesserte Auflösung für das Video jeder der 4-7 Arteriolen und 4-7 Venolen in der oberflächlichen Netzhaut zu erzielen. Fokussieren Sie jeweils auf etwa einen Quadranten der sichtbaren Netzhaut (und nehmen Sie sie auf Video auf), wobei sich die Mitte der Sehscheibe in einer Ecke des Sichtfelds befindet. Es sollte versucht werden, die Zeit, in der das Mikroskoplicht das Gewebe beleuchtet, zu minimieren, um die Möglichkeit einer licht-/farbstoffinduzierten Phototoxizität zu verringern17.</li>
</ol>
6. Videoanalyse
<ol>
	<li>Kalibrieren Sie das Videosystem mit Hilfe einer Mikrometerskala für eine Umrechnung von μm/Pixel.</li>
	<li>Mit einer Bildbearbeitungssoftware können Sie das aufgenommene Video wiedergeben.</li>
	<li>Anhand des Videos der Bolusinfusion von fluoreszierendem Dextran können Sie Arteriolen von Venolen unterscheiden.</li>
	<li>Messen Sie für jede der 4-7 Arteriolen und 4-7 Venolen, die mit dem 10X-Objektiv aufgezeichnet wurden, die mit fluoreszierendem Dextran gefüllten Durchmesser, wobei Sie durchschnittlich 5 Messungen des Durchmessers pro Gefäß entlang der sichtbaren Länge durchführen.</li>
	<li>Messen Sie für jede der gleichen Arteriolen und Venolen die Streifenlänge der fluoreszierenden Mikrosphären mit 10 aufeinanderfolgenden Mikrosphärenstreifen in jedem Gefäß, um eine Selektionsverzerrung zu vermeiden. Teilen Sie die Streifenlängen durch die Belichtungszeit, um die Mikrosphärengeschwindigkeit zu berechnen, z. B. 160 μm/8 ms = 20 μm/ms = 2 cm/sec. Durchschnittlich die 10 Geschwindigkeiten pro Schiff.</li>
	<li>Berechnen Sie den Volumenstrom für jedes Gefäß mit der folgenden Gleichung: Durchfluss = mittlere Geschwindigkeit × π × Durchmesser2/4.</li>
	<li>Summieren Sie die arteriolären Flussraten und getrennt die venulären Flussraten, um den gesamten retinalen Blutfluss zu erhalten.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Fortune, B., Cull, G., McElwain, K. M., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspheres+method+for+ocular+blood+flow+measurement+in+rats%3A+size+and+dose+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Microspheres method for ocular blood flow measurement in rats: size and dose optimization.</a> Exp. Eye Res. 84, 108-117 (2007).</li>
<li>Wang, L., Grant, C., Fortune, B., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+and+choroidal+vasoreactivity+to+altered+PaCO2+in+rat+measured+with+a+modified+microsphere+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal and choroidal vasoreactivity to altered PaCO2 in rat measured with a modified microsphere technique.</a> Exp. Eye Res. 86, 908-913 (2008).</li>
<li>Pouliot, M., Hetu, S., Lahjouji, K., Couture, R., Vaucher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+retinal+blood+flow+by+kinin+B%281%29+receptor+in+Streptozotocin-diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of retinal blood flow by kinin B(1) receptor in Streptozotocin-diabetic rats.</a> Exp. Eye Res. 92, 482-489 (2011).</li>
<li>Pouliot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+regional+measurement+of+retinal+blood+flow+in+rats+using+N-isopropyl-p-%5B14C%5D-iodoamphetamine+%28%5B14C%5D-IMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative and regional measurement of retinal blood flow in rats using N-isopropyl-p-[14C]-iodoamphetamine ([14C]-IMP).</a> Exp. Eye Res. 89, 960-966 (2009).</li>
<li>Zhi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+and+quantitative+imaging+of+retinal+blood+flow+in+rats+with+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Volumetric and quantitative imaging of retinal blood flow in rats with optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 2, 579-591 (2011).</li>
<li>Zhi, Z., Cepurna, W. O., Johnson, E. C., Morrison, J. C., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+intraocular+pressure+on+changes+of+blood+flow+in+the+retina%2C+choroid%2C+and+optic+nerve+head+in+rats+investigated+by+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Impact of intraocular pressure on changes of blood flow in the retina, choroid, and optic nerve head in rats investigated by optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 3, 2220-2233 (2012).</li>
<li>Li, G., De La Garza, B., Shih, Y. Y., Muir, E. R., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+blood-flow+MRI+of+retinitis+pigmentosa+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Layer-specific blood-flow MRI of retinitis pigmentosa in RCS rats.</a> Exp. Eye Res. 101, 90-96 (2012).</li>
<li>Muir, E. R., Renteria, R. C., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ocular+blood+flow+as+an+early+indicator+of+diabetic+retinopathy+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Reduced ocular blood flow as an early indicator of diabetic retinopathy in a mouse model of diabetes.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 6488-6494 (2012).</li>
<li>Wright, W. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+attenuates+early+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel attenuates early streptozotocin-induced constriction of arterioles in the mouse retina.</a> Exp. Eye Res. 86, 528-536 (2008).</li>
<li>Lee, S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losartan+and+ozagrel+reverse+retinal+arteriolar+constriction+in+non-obese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Losartan and ozagrel reverse retinal arteriolar constriction in non-obese diabetic mice.</a> Microcirculation. 15, 379-387 (2008).</li>
<li>Wright, W. S., Messina, J. E., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+diabetes-induced+retinal+vasoconstriction+by+a+thromboxane+receptor+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of diabetes-induced retinal vasoconstriction by a thromboxane receptor antagonist.</a> Exp. Eye Res. 88, 106-112 (2009).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+streptozotocin-induced+microvascular+changes+in+the+mouse+retina+with+the+endothelin+receptor+A+antagonist+atrasentan%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of streptozotocin-induced microvascular changes in the mouse retina with the endothelin receptor A antagonist atrasentan.</a> Exp. Eye Res. 91, 670-675 (2010).</li>
<li>Yadav, A. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tempol+on+diabetes-induced+decreases+in+retinal+blood+flow+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of tempol on diabetes-induced decreases in retinal blood flow in the mouse.</a> Curr. Eye Res. 36, 456-461 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+20-HETE+attenuates+diabetes-induced+decreases+in+retinal+hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of 20-HETE attenuates diabetes-induced decreases in retinal hemodynamics.</a> Exp. Eye Res. 93, 108-113 (2011).</li>
<li>Wright, W. S., Yadav, A. S., McElhatten, R. M., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+blood+flow+abnormalities+following+six+months+of+hyperglycemia+in+the+Ins2%28Akita%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal blood flow abnormalities following six months of hyperglycemia in the Ins2(Akita) mouse.</a> Exp. Eye Res. 98, 9-15 (2012).</li>
<li>Lee, S., Morgan, G. A., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+reverses+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel reverses streptozotocin-induced constriction of arterioles in rat retina.</a> Microvasc. Res. 76, 217-223 (2008).</li>
<li>Rumbaut, R. E., Sial, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phototoxicity+of+fluorescent+dye-labeled+albumin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Differential phototoxicity of fluorescent dye-labeled albumin conjugates.</a> Microcirculation. 6, 205-213 (1999).</li>
<li>Tadayoni, R., Paques, M., Gaudric, A., Vicaut, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+and+leukocyte+dynamics+in+the+retinal+capillaries+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte and leukocyte dynamics in the retinal capillaries of diabetic mice.</a> Exp. Eye Res. 77, 497-504 (2003).</li>
<li>Walsh, M. K., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+fluorescence+imaging+of+individual+retinal+ganglion+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse fluorescence imaging of individual retinal ganglion cells in mice.</a> J. Neurosci. Methods. 169, 214-221 (2008).</li>
<li>Shahidi, M., Wanek, J., Blair, N. P., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+mapping+of+chorioretinal+vascular+oxygen+tension+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional mapping of chorioretinal vascular oxygen tension in the rat.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 820-825 (2009).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rat.</a> Vis. Res. 19, 569-588 (1979).</li>
<li>Remtulla, S., Hallett, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+mouse%2C+and+comparisons+with+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the mouse, and comparisons with the rat.</a> Vis. Res. 25, 21-31 (1985).</li>
<li>Schmucker, C., Schaeffel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biometry+in+the+mouse+eye+with+low+coherence+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo biometry in the mouse eye with low coherence interferometry.</a> Vis. Res. 44, 2445-2456 (2004).</li>
<li>Mulivor, A. W., Lipowsky, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-+and+ischemia-induced+shedding+of+venular+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation- and ischemia-induced shedding of venular glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1672-1680 (2004).</li>
<li>Harris, N. R., Whatley, J. R., Carter, P. R., Specian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venular+constriction+of+submucosal+arterioles+induced+by+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Venular constriction of submucosal arterioles induced by dextran sodium sulfate.</a> Inflamm. Bowel Dis. 11, 806-813 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Technik der intravitalen Videomikroskopie kann nicht nur auf Mäuse, sondern auch auf Ratten angewendet werden. Dieses Protokoll stützt sich nur auf einige Annahmen, ist aber auf die Anwendung unter Narkose und mit Pupillenerweiterung, wie wir sie beschrieben haben, beschränkt. Die anderen Annahmen und Einschränkungen lauten wie folgt:
1. Annahme eines minimalen optischen Vergrößerungsfehlers, der sich aus der Brechungsnatur des Auges ergibt. Wie von anderen18-20</sup...

Die Netzhaut ist eines der stoffwechselaktivsten Gewebe im Körper und benötigt daher eine großzügige Blutversorgung. Zwei getrennte Zirkulationen erfüllen diesen Anspruch: die Aderhautzirkulation für den äußeren Teil der Netzhaut und die Netzhautzirkulation für den inneren Teil der Netzhaut. Untersuchungen der retinalen Perfusion sind unerlässlich, um die pathologischen Mechanismen und Folgen der diabetischen Retinopathie, der sauerstoffinduzierten Retinopathie, des retinalen Arterien- oder Venenverschlusses und des Schlaganfalls zu verstehen. Zur Quantifizierung des retinalen Blutflusses wurden mehrere Methoden eingesetzt, wobei jede Technik ihre Vor- und Nachteile, Einschränkungen und Annahmen hat. Zu diesen Techniken gehören die Infusion von Mikrosphären mit einem Durchmesser von 7-8 μm, die sich in präkapillären Arteriolen einnisten1,2, die quantitative Autoradiographie3,4, die optische Mikroangiopathie-optische Kohärenztomographie5,6, die Magnetresonanztomographie7,8 und die intravitale Videomikroskopie9-16. Zu den Vorteilen des letzteren gehören die direkte Live-Visualisierung von Netzhautgefäßen und -strömungen, die Abhängigkeit von nur wenigen geringfügigen Annahmen und die Erschwinglichkeit für Labore, die über ein Fluoreszenzmikroskop mit angeschlossener Videokamera verfügen. In früheren Studien der Intravital-Videomikroskopie9-16 wurde fluoreszierendes Dextran als Plasmamarker verwendet, und fluoreszenzmarkierte rote Blutkörperchen (von einem Spendertier) wurden als Geschwindigkeitsmarker verwendet. Im aktuellen Protokoll werden fluoreszenzmarkierte Mikrosphären mit einem Durchmesser von 1,9 μm anstelle von roten Blutkörperchen zur Messung der Geschwindigkeit verwendet, wobei diese Änderung die Notwendigkeit eines Blutzellspenders zunichte macht.

<table><tbody><tr><td>Fluoreszierende Mikrosphären</td><td>Bangs Laboratories</td><td>FS04F/10584 (grün)</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszierende Dextran-Molekularsonden mit hohem Molekulargewicht</td><td></td><td>D-7137 (grün); D-7139 (rot)</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopsystem</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN + Aufsätze</td><td></td></tr><tr><td>4X Objektiv</td><td>Nikon</td><td>Plan Fluor 4X</td><td>numerische Apertur 0,13; Arbeitsabstand 17,2 mm</td></tr><tr><td>10X Objektiv</td><td>Nikon</td><td>Plan 10X</td><td>numerische Apertur 0,25; Arbeitsabstand 10,5 mm</td></tr><tr><td>Tropicamid ophthalmische Lösung</td><td>Bausch Lomb</td><td>1% Tropicamid</td><td></td></tr><tr><td>Hypromellose ophthalmologische Lösung</td><td>HUB Pharmaceuticals</td><td>2,5 % Goniovisc</td><td></td></tr><tr><td>Bildverarbeitungssoftware</td><td>University of California San Francisco Vale Lab</td><td>Micro-Manager</td><td></td></tr><tr><td>Digitale Videokamera für die Mikroskopie</td><td>Photometrie</td><td>CoolSnap ES</td><td>1392 x 1040 Pixel Auflösung; Pixelgröße 6,45 x 6,45 &mu; m</td></tr></tbody></table>

intravitale videomikroskopie-messungen des retinalen blutflusses bei mäusen

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Veränderungen des Blutflusses der Netzhaut können zu Augenerkrankungen und Sehstörungen beitragen oder eine Folge davon sein. Daher kann die Quantifizierung der veränderten Perfusion die Erforschung der Mechanismen von Netzhauterkrankungen unterstützen. Die Intravital-Videomikroskopie von fluoreszierenden Tracern kann zur Messung von Gefäßdurchmessern und Blutstromgeschwindigkeiten des retinalen Gefäßsystems verwendet werden, insbesondere der Arteriolen, die von der zentralen Netzhautarterie abzweigen, und der Venolen, die in die zentrale Netzhautvene führen. Die Blutflussraten können aus den Durchmessern und Geschwindigkeiten berechnet werden, wobei die Summe des arteriolären Flusses und des separat venulären Flusses berechnet wird, wodurch Werte für den gesamten retinalen Blutfluss geliefert werden. Dieser Artikel und das zugehörige Video beschreiben die Methoden zur Anwendung dieser Technik an Mäusen, die 1) die Vorbereitung des Auges für die intravitale Mikroskopie des anästhesierten Tieres, 2) die intravenöse Infusion von fluoreszierenden Mikrosphären zur Messung der Blutbahngeschwindigkeit, 3) die intravenöse Infusion eines fluoreszierenden Dextrans mit hohem Molekulargewicht zur Unterstützung der mikroskopischen Visualisierung des retinalen Mikrogefäßsystems, 4) die Verwendung einer digitalen Mikroskopkamera, um Videos der perfundierten Netzhaut zu erhalten, und 5) die Verwendung von Bildverarbeitungssoftware zur Analyse des Videos. Die gleichen Techniken können zur Messung der retinalen Blutflussraten bei Ratten verwendet werden.

Abbildung 1 zeigt Einzelbilder eines Videos aus einem Experiment, wobei die Panels A–D und F–I Fluoreszenz-Mikrokugel-Streifen darstellen, die mit einem 4X&#160;Objektiv und einer Belichtungszeit von 8 ms aufgenommen wurden (sowie einer Binning-Einstellung von 2&nbsp;×&#160;2 Pixeln zur Verringerung der Videodateigröße). Abbildung 1E zeigt die Orientierung der Netzhautgefäße in den anderen Panels der Abbildung. Nicht jedes Videobild enthält einen scharf abgebildeten fluoreszierenden Stre...

Intravitalmikroskopie kann bei Tieren verwendet werden, um retinale Gefäßdurchmesser, Blutbahngeschwindigkeiten und den gesamten retinalen Blutfluss sichtbar zu machen und zu messen.

Intravitale Videomikroskopie-Messungen des retinalen Blutflusses bei Mäusen

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den retinalen Blutfluss bei Mäusen zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst fluoreszierende Mikrosphären durch die kanülierte Oberschenkelvene einer anästhesierten Maus infundiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Mikrosphären, die durch die Netzhautgefäße der Maus fließen, auf Video aufzuzeichnen.Als nächstes infundieren Sie fluoreszierendes Dextran durch die Oberschenkelvene und nehmen ein Video auf, während es durch die Netzhautgefäße fließt. Der letzte Schritt besteht darin, die Geschwindigkeiten der Mikrosphären und die Gefäßdurchmesser aus den aufgenommenen Videos zu messen, um den retinalen Blutfluss zu berechnen. Ein Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, den Blutfluss der Netzhaut mit einem Standard-Fluoreszenzmikroskop genau zu messen.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Netzhaut zu beantworten, wie zum Beispiel, inwiefern Veränderungen des Blutflusses zur diabetischen Retinopathie beitragen. Obwohl wir diese Technik in der Netzhaut einer Maus demonstrieren werden. Die allgemeine Methode kann in anderen Geweben und auch bei Ratten angewendet werden.Beschallen Sie eine 1%ige St

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

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Dieser Artikel berichtet über eine detaillierte Methode zur dynamischen Messung und Quantifizierung der Blutflussgeschwindigkeit in einzelnen Blutgefäßen des Lebergefäßsystems der Maus unter Verwendung der intravitalen mikroskopischen Bildgebung in Kombination mit einer spezifischen Methodik zur Bildaufnahme und -analyse.

Intravitalmikroskopie Imaging der Leber nach<em&gt; Leishmania</em&gt; Infection: Eine Bewertung von Leber Hämodynamik

Die Live-Zell-Bildgebung der markierten Blutzellen im Augenkreis kann Informationen über Entzündungen und Ischämie bei diabetischer Retinopathie und altersbedingter Makuladegeneration liefern. Ein Protokoll zur Etikettierung von Blutzellen und Bild der markierten Zellen in der Netzhautzirkulation ist beschrieben.

Fluoreszenzfarbstoff-Markierung von Erythrozyten und Leukozyten zum Studieren der Flußdynamik bei der Maus-Retinal-Zirkulation

Viele Vision-bedrohlichen okuläre Erkrankungen gehen einher mit dysfunktionalen retinalen mikrogefäßen. Daher ist die Messung der retinalen arteriola Antworten wichtig, die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für Maus retinalen arteriola Isolation und Vorbereitung zur Bewertung der Auswirkungen von vasoaktive Substanzen auf vaskuläre Durchmesser.

Vorbereitende Schritte für die Messung der Reaktivität in Maus retinalen Arteriolen Ex Vivo

Ein offener Gefäßfensteransatz mit fluoreszierenden Tracern bietet eine ausreichende Auflösung für die Messung des Cochlea-Blutflusses (CoBF). Die Methode erleichtert die Untersuchung struktureller und funktioneller Veränderungen von CoBF bei Mäusen unter normalen und pathologischen Bedingungen.

Messung des restrischen Blutflusses in Maus-Cochlea mittels offenem Gefäßfenster und intravitaler Fluoreszenzmikroskopie

In-vivo-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Biologie in Gesundheit und Krankheit. Dieses Protokoll beschreibt die transpupille Bildgebung der Netzhaut der Maus mit einem Standard-Zwei-Photonen-Mikroskop. Es zeigt auch verschiedene In-vivoimaging-Methoden, um mehrere zelluläre Kohorten der Netzhaut fluoreszierend zu markieren.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Herstellung und Immunfluoreszenzfärbung von Netzhaut-Flachhalterungen und Analysen von Mäusen. Auch die Verwendung der Fluoresceinfundusangiographie (FFA) bei Mäusewelpen und die Bildverarbeitung werden ausführlich beschrieben.

Überwachung des dynamischen Wachstums von Netzhautgefäßen im sauerstoffinduzierten Retinopathie-Mausmodell

Dieser Artikel beschreibt einen gut etablierten und reproduzierbaren Lektin-Färbungsassay für die gesamten Netzhautpräparate und die Protokolle, die für die quantitative Messung von Gefäßparametern erforderlich sind, die bei proliferativen und nicht-proliferativen Retinopathien häufig verändert sind.

Quantifizierung vaskulärer Parameter in der gesamten Netzhaut von Mäusen mit nicht-proliferativen und proliferativen Retinopathien

Hier stellen wir drei Datenanalyseprotokolle für Fluorescein-Angiographie (FA) und optische Kohärenztomographie (OCT) Bilder in der Studie der Netzhautvenenokklusion (RVO) vor.

Im lebenden Organismus Gefäßverletzungsanzeigen in der Netzhaut der Maus zur Förderung der Reproduzierbarkeit

Das retinale Gefäßsystem der Maus ist besonders interessant, um die Mechanismen der Gefäßmusterbildung zu verstehen. Dieses Protokoll misst automatisch den Durchmesser von Netzhautgefäßen der Maus aus fluoreszierenden Angiographie-Fundusbildern in einem festen Abstand zur Sehscheibe.

Messung des retinalen Gefäßdurchmessers aus Fluoreszenzangiographie-Bildern der Maus

Lernen Sie die Messung des retinalen Blutflusses bei Mäusen mittels intravitaler Videomikroskopie mit fluoreszierenden Mikrosphären. Diese Methode ermöglicht präzise Quantifizierung von Gefäßdurchmessern und Blutgeschwindigkeiten.

Intravitale Videomikroskopie-Messungen des retinalen Blutflusses bei Mäusen

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