Isolierung und funktionelle Charakterisierung der Menschen ventrikuläre Kardiomyozyten von Fresh Chirurgische Proben

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, lebensfähige Kardiomyozyten aus menschlichen ventrikulären Proben zu isolieren und ihre funktionellen Veränderungen zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem frische ventrikuläre Proben zunächst schnell in eiskalter kardioplegischer Lösung gesammelt und zerkleinert werden, um einen übermäßigen Gewebeabbau und Zellschäden zu vermeiden. Der zweite Schritt besteht darin, einen schrittweisen Verdau der Myokardbrocken mit einem speziell angefertigten Verdauungsgerät und enzymatischen Lösungen durchzuführen.

In sechs Zyklen wird die zellhaltige Puffer bei jedem Zyklus in einem Röhrchen gesammelt und mit einer Zellkonservierungslösung verdünnt. Der letzte Schritt besteht darin, die in den sechs Röhrchen enthaltenen Zellen in einem geringeren Volumen einer physiologischen Standardlösung mit normalen Kalziumkonzentrationen zu resuspendieren, um die funktionelle Charakterisierung durchzuführen. Letztendlich wird die Patch-Clamp-Aufzeichnung von Aktionspotentialen und die gleichzeitige Bewertung von interzellulärem Kalzium mit Fluoreszenzfarbstoffen verwendet, um die Veränderungen der Wirkung, der potentiellen Dauer und des intrazellulären Kalziumzyklus in Kardiomyozyten von Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie zu zeigen.

Der Hauptvorteil von DYS einzigartig gegenüber einer 16-Methode, wie der Standardmethode der Chunk-Dejection, besteht darin, dass wir in einer Assoziation mit einer Enzymlösung ein speziell angefertigtes Aufschlussgerät verwenden, das dank seiner Silikonkratzer eine gemeinsame Deassoziation variabler Zyten ermöglicht. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Kardiologie zu beantworten, z. B. wie sich der bekannte molekulare und strukturelle Umbau im Zusammenhang mit Herzerkrankungen in Veränderungen einzelner Kardiomyozyten widerspiegelt, die mit unserer Methode analysiert und mit spezifischen Medikamenten gezielt behandelt werden können. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich also auch auf die Therapie genetischer Herzerkrankungen wie der hypertrophen Kardiomyopathie.

Tatsächlich kann diese Methode verwendet werden, um neuartige neuropathische Ansätze an ventrikulären Kardiomyozyten von Patienten mit hypertrophen oder ischämischen Herzerkrankungen zu testen, die sich einer Herzoperation unterzogen haben. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir die Analogie zwischen menschlichen Arterienproben und ventrikulären Biopsien verglichen, die während einer Herzoperation gewonnen wurden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie 40 Milliliter kardioplegische Lösung in ein 50-Milliliter-Röhrchen gießen und für den Probentransport vom Operationssaal zum Zellisolationslabor in Eis lagern, die Probe schnell in den Laborbereich bringen und innerhalb von 10 Minuten nach der Probenentnahme mit der Probenverarbeitung beginnen.

Nächste kollektive ventrikuläre Myokardprobe aus dem Operationssaal unmittelbar nach der Exzision. Waschen Sie es mit eiskalter CP-Lösung und lagern Sie es im Röhrchen, während Sie die Probe in eiskaltem CP-Puffer aufbewahren. Entfernen Sie anschließend vorsichtig mit einer feinen Schere die endokardiale fibrotische Schicht.

Schneiden Sie das Myokardgewebe in zwei bis drei Millimeter lange kleine Stücke mit einer Gesamtmenge an ventrikulärem Myokard zwischen 100 Milligramm und einem Gramm für jede Isolierung. Nachdem die Brocken in die Schabekammer des Aufschlussgeräts überführt wurden, wird der CP-Puffer in der Kammer durch kalten kalziumfreien Dissoziationspuffer ersetzt. Stellen Sie dann das Aufschlussgerät in ein Thermostatbad.

Stellen Sie die Badewanne auf 37,5 Grad Celsius ein und schalten Sie sie ein. Schalten Sie anschließend den Motor des Aufschlussgeräts ein und stellen Sie die Drehzahl auf eine Umdrehung pro Sekunde ein. Führen Sie drei Waschzyklen mit DB durch und wechseln Sie die Lösung in der Kammer mit 37 Grad Celsius sauerstoffgesättigter sauberer DB alle acht Minuten.

Bereiten Sie danach den ersten Enzympuffer vor, indem Sie 250 Einheiten pro Milliliter Kollagenase Typ fünf und vier Einheiten pro Milliliter Protease hinzufügen. Geben Sie 24 in die DB-Lösung ein. Bereiten Sie dann den zweiten Enzympuffer vor, indem Sie 250 Einheiten Kollagenase pro Milliliter hinzufügen.

Geben Sie Typ fünf in die DB-Lösung ein, um EB eins mit Sauerstoff zu versorgen und auf bis zu 37 Grad Celsius zu erwärmen. Führen Sie dann zwei 12-minütige Aufschlusszyklen im rotierenden Aufschlussgerät mit drei Millilitern 100 % sauerstoffhaltigem EB durch, einen bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie die Lösung durch Pipettenaspiration und verwerfen Sie sie nach jedem Zyklus.

Bereiten Sie als Nächstes sechs 15-Milliliter-Röhrchen für die Zellentnahme und 80 Milliliter Craft-Brew-Lösung mit vier Grad Celsius vor, um die Puffer zu umgehen, sauerstoffisieren Sie EB zwei und arbeiten Sie es auf 37 Grad Celsius auf. Führen Sie anschließend einen ersten 15-minütigen Verdauungszyklus mit drei Millilitern 100 % sauerstoffhaltigem EB zwei bei 37 Grad Celsius durch. Nach dem Verdauungszyklus die Lösung, die die ersten assoziierten Myozyten enthält, in einem 15-Milliliter-Röhrchen auffangen und die Zellsuspension mit 12 Millilitern kalter KB-Lösung verdünnen.

Lagern Sie das Röhrchen flach bei Raumtemperatur, führen Sie fünf weitere 12-minütige Verdauungszyklen mit drei Millilitern EB zwei bei 37 Grad Celsius durch und sammeln Sie den Myozyten-haltigen Puffer bei jedem Zyklus in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Denken Sie daran, den drei Milliliter gesammelten Puffer bei jedem Zyklus mit 12 Millilitern KB-Lösung zu verdünnen. Lagern Sie zum Schluss die sechs Zellen mit den Röhrchen bei Raumtemperatur.

In diesem Schritt fügen Sie ein Milligramm pro Milliliter Rinderserumalbumin zu 20 Millilitern kalziumfreiem Tyropuffer hinzu. Filtrieren Sie dann die Lösung, zentrifugieren Sie dann die sechs Myozyten mit konischen Röhrchen bei 100 Käse für fünf Minuten. Um die Myozyten zur Absetzung zu zwingen, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in jedem Röhrchen mit einer variablen Menge BSA, die TB bei Raumtemperatur enthält.

Erhöhen Sie allmählich die Kalziumkonzentration in der Zelle, die den Puffer enthält, indem Sie im ersten und zweiten Schritt kleine OTTs von 100 Millimolar pro Liter Calciumchloridlösung hinzufügen. Die Kalziumkonzentration wird auf 50 Mikromolaren pro Liter bzw. 100 Mikromolaren pro Liter erhöht. Die folgenden Schritte der Kalziumzugabe werden alle fünf Minuten durchgeführt, und die Konzentration wird bei jedem Schritt um 100 Mikromolar pro Liter auf eine Endkonzentration von 0,9 Millimolar pro Liter erhöht.

Um die Ausbeute des Isolationsverfahrens zu beurteilen, werden 0,5 Milliliter Myozyten-haltige Lösung in die Glasbodenkammer eines Mikroskops übertragen. Bewerten Sie 15 Mikroskopfelder bei 10-facher Objektivvergrößerung und berechnen Sie den Prozentsatz gesunder Myozyten, wie z. B. der stäbchenförmigen Zellen mit deutlichen Streifen und ohne signifikante Einschlüsse. Die erwartete Ausbeute sollte bei etwa 20 % liegen, um die funktionelle Bewertung der menschlichen Kardiomyozyten zu demonstrieren, einschließlich gleichzeitiger Aufzeichnungen von Aktionspotentialen und intrazellulären Kalziumflüssen.

Bereiten Sie zunächst die Pipettenlösung für Patch-Clamp-Experimente in perforierter Patch-Konfiguration vor. Fügen Sie dann 1,8 Millimolar Calciumchlorid zu calciumfreier Tuberkulose hinzu. Verwenden Sie die Lösung für die Superfusion von Kardiomyozyten während Patch-Clamp-Fluoreszenzexperimenten.

Übertragen Sie als Nächstes einen Milliliter Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 10 Mikromolar pro Liter Grippefort und 10 Mikroliter Power Load hinzu. Das Konzentrat wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und in horizontaler Position eingestellt. Stellen Sie anschließend das Röhrchen in eine vertikale Position und lassen Sie die Zellen fünf Minuten lang ruhen.

Pipettieren Sie dann den Überstand heraus und resuspendieren Sie das Zellpellet in Calcium, das TB enthält. Übertragen Sie den Punkt 25 Milliliter Zellsuspension in eine kleine, temperaturgesteuerte, am Mikroskop montierte Aufnahmekammer. Super fusioniert durch die Schwerkraft mit einem beheizten Mikro-Fuer-System mit einer Durchflussrate von 0,3 Millilitern pro Minute bei 37 Grad Celsius.

Bereiten Sie mit einem Mikropipettenabzieher Patch-Clamp-Pipetten mit einem Spitzendurchmesser von drei bis fünf Mikrometern und einem Widerstand von drei bis 4,5 Megaohm vor, wenn sie mit ps gefüllt sind. Geben Sie danach Amphotericin B zu PS in einer Menge von 250 Mikrogramm pro Milliliter hinzu und verwenden Sie es zum Befüllen der Elektroden, dann montieren Sie die Elektrode auf dem Pipettenhalter. Wählen Sie als Nächstes die ronförmige Zelle mit deutlichen Streifen und ohne Einschlüsse aus.

Formen Sie die Giga-Dichtung und warten Sie fünf bis 10 Minuten, bis der Zugangswiderstand unter 20 Ohm fällt. Anschließend werden Aktionspotentiale im Strom-Clamp-Modus mit kurzen Impulsen bei unterschiedlichen Stimulationsfrequenzen ausgelöst. Schalten Sie während der Aufnahmephase die Hellfeldbeleuchtung bei 492 Nanometern ein und detektieren Sie die Fluoreszenz bei 505 bis 520 Nanometern.

Erfassen Sie dann die Fluoreszenz- und Membranpotentialsignale. Diese Abbildung zeigt die Veränderungen der Aktionspotentiale in ventrikulären Kardiomyozyten aus den HCM-Proben. Hier sind die repräsentativen überlagerten Aktionspotentiale, die bei 0,2 Hertz, 0,5 Hertz und einem Hertz von einem Kontrollmyozyten und einem HCM-Myozyten hervorgerufen wurden.

Die überlagerten Aktionspotentiale bei 0,5 Hertz von einem Kontrollmyozyten. In Abwesenheit und Anwesenheit von 10 bis sieben molaren Isoproterenol ist hier die repräsentative Spur des Membranpotentials eines Kardiomyozyten von einem HCM-Patienten dargestellt, der früh nach Depolarisationen mehrere spontane Depolarisationen aufwies. Die Abbildung zeigt die Veränderungen des transienten Kalziums in ventrikulären Kardiomyozyten aus den HCM-Proben.

Hier sind die repräsentativen überlagerten Calciumtransienten, die während der Stimulation bei 0,2 Hertz über die Patch-Pipette in einem Kontrollmyozyten und einer HCM-Zelle hervorgerufen wurden. Die Kinetik von Kalziumtransienten in HCM und Kontrollkardiomyozyten zu unterschiedlichen Zeiten wird gezeigt, und hier sind die repräsentativen langen Spuren, die intrazelluläres Kalzium während der Stimulation bei drei verschiedenen Frequenzen zeigen, was das erhöhte diastolische Kalzium bei hohen Stimulationsraten in den HCM-Myozyten hervorhebt. Diese Abbildung zeigt die zusätzlichen experimentellen Anwendungen mit humanen ventrikulären Myozyten.

Die repräsentativen überlagerten Spuren, die den Calciumstrom vom L-Typ zeigen, der bei unterschiedlichen Membranspannungen aufgezeichnet wurde, sind links dargestellt, und die durchschnittliche Spitzendichte des Calciumstroms vom L-Typ von 18 Zellen, die aus HCM-Proben bei unterschiedlichen Membranspannungen isoliert wurden, ist rechts dargestellt, und hier ist die intrazelluläre Calciumspur dargestellt, die von einem ventrikulären Myozyten während der Stimulation des elektrischen Feldes bei einem Hertz aufgezeichnet wurde. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, den Eingriff kurz nach der Entnahme der Probe aus dem Operationssaal zu beginnen, um sicherzustellen, dass Sie nach diesem Verfahren menschliche ventrikuläre Kardiomyozyten isolieren. Andere Methoden wie die konfokale Mikroskopie des Lebensstils oder die Immunchemie können durchgeführt werden, und dies wird entscheidend sein, um grundlegende Fragen zu beantworten, wie z.B. wie die subzelluläre Lokalisation von Membranstrukturen und Kalziumfreisetzungseinheiten bei Herzerkrankungen nach ihrer Entwicklung gebremst wird.

Diese Technik ebnete in der zellulären Kardiologie den Weg, um die funktionellen Anomalien in ventrikulären Kardiomyozyten zu untersuchen und den potenziellen Nutzen neuartiger Therapieoptionen zu testen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man lebensfähige einzelne Kardiomyozyten aus menschlichen Proben isoliert und wie man die Zellfunktion unter verschiedenen Bedingungen charakterisiert.