Isolierung und funktionelle Charakterisierung der Menschen ventrikuläre Kardiomyozyten von Fresh Chirurgische Proben

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, lebensfähige Kardiomyozyten aus menschlichen ventrikulären Gewebeproben mit Erkrankung zu isolieren und deren funktionelle Veränderungen zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst frische ventrikuläre Proben rasch gesammelt und in eiskalter kardioplegischer Lösung zerkleinert werden, um eine übermäßige Gewebezerstörung und Zellschädigung zu vermeiden. Der zweite Schritt besteht darin, die Myokardstücke schrittweise mithilfe einer speziell angefertigten Verdauungsvorrichtung und enzymatischen Lösungen zu verdauen.

Über sechs Zyklen hinweg wird die Zellpuffer enthaltende Fraktion in jedem Zyklus in einem Reagenzglas gesammelt und mit einer Zellkonservierungslösung verdünnt. Im letzten Schritt werden die Zellen aus den sechs Reagenzgläsern in einem geringeren Volumen einer standardmäßigen physiologischen Lösung mit normalen Kalziumkonzentrationen resuspendiert, um die funktionelle Charakterisierung durchzuführen. Abschließend erfolgt die Patch-Clamp-Aufzeichnung von Aktionspotentialen und gleichzeitige Beurteilung des interzellulären Kalziums mittels fluoreszierender Farbstoffe, um die Veränderungen der Aktionspotentiale, der Aktionspotentiaudauer sowie des intrazellulären Kalziumzyklus in Kardiomyozyten von Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie aufzuzeigen.

Der Hauptvorteil von DYS unique gegenüber einer 16-Methode, wie der Standard-Chunk-Ausscheidungsmethode, besteht darin, dass wir in Verbindung mit einer Enzymlösung ein speziell angefertigtes Verdauungsgerät verwenden, das dank seiner Silikonabstreifer eine gemeinsame Dissoziation variabler Zellen ermöglicht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Kardiologie zu beantworten, beispielsweise wie die bekannte molekulare und strukturelle Umbildung im Zusammenhang mit Herzerkrankungen in Veränderungen einzelner Kardiomyozyten zum Ausdruck kommt, die mit unserer Methode analysiert und durch gezielte Arzneistoffe beeinflusst werden können. Die Implikationen dieser Technik reichen somit bis zur Therapie genetischer Herzerkrankungen wie der hypertrophen Kardiomyopathie.

Tatsächlich kann diese Methode verwendet werden, um neuartige neuropathische Ansätze an ventrikulären Kardiomyozyten von Patienten mit hypertrophen oder ischämischen Herzerkrankungen zu testen, die sich einer Herzoperation unterzogen haben. Wir hatten die Idee zu dieser Methode erstmals, als wir die Analogie zwischen menschlichen Arterienpräparaten und ventrikulären Biopsien verglichen, die während einer Herzoperation gewonnen wurden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie 40 Milliliter Kardioplegelösung in ein 50-Milliliter-Gefäß geben und diese auf Eis lagern, um den schnellen Transport des Präparats vom Operationssaal zum Zellisolationslabor sicherzustellen. Überführen Sie das Präparat rasch in den Laborbereich und beginnen Sie die Verarbeitung des Präparats innerhalb von 10 Minuten nach der Präparatentnahme.

Nächste kollektive ventrikuläre Myokardprobe aus dem Operationssaal unmittelbar nach der Exzision entnehmen. Mit eiskaltem CP-Lösung waschen und in einem Röhrchen aufbewahren, wobei die Probe in eiskaltem CP-Puffer gehalten wird. Die endokardiale fibröse Schicht anschließend vorsichtig mit feiner Schere entfernen.

Schneiden Sie das Myokardgewebe in zwei bis drei Millimeter lange kleine Stücke, wobei die Gesamtmenge des ventrikulären Myokardgewebes pro Isolierung zwischen 100 Milligramm und einem Gramm liegen sollte. Nachdem die Gewebestücke in die Schabkammer des Verdauungsgeräts überführt wurden, tauschen Sie das CP-Puffer im Kammer mit kaltem, calciumfreiem Dissoziationspuffer aus. Anschließend stellen Sie das Verdauungsgerät in ein thermostatisches Bad.

Stellen Sie das Bad auf 37,5 Grad Celsius ein und schalten Sie es ein. Schalten Sie anschließend den Motor der Verdauungsvorrichtung ein und stellen Sie die Rotationsgeschwindigkeit auf eine Umdrehung pro Sekunde ein. Führen Sie drei Waschzyklen mit DB durch und wechseln Sie die Lösung in der Kammer alle acht Minuten mit sauerstoffgesättigtem, sauberem DB bei 37 Grad Celsius.

Danach bereiten Sie den Enzympuffer eins vor, indem Sie 250 Einheiten pro Milliliter Kollagenase Typ fünf und vier Einheiten pro Milliliter Protease Typ 24 zur DB-Lösung hinzufügen. Bereiten Sie anschließend den Enzympuffer zwei vor, indem Sie 250 Einheiten pro Milliliter Kollagenase hinzufügen.

Geben Sie fünf Milliliter der DB-Lösung zu EB eins, das mit Sauerstoff angereichert wurde, und erwärmen Sie es auf 37 Grad Celsius. Führen Sie anschließend zwei Zyklen mit je zwölf Minuten Verdauung im rotierenden Verdauungsgerät mit drei Milliliter 100 % sauerstoffangereichertem EB eins bei 37 Grad Celsius durch. Entfernen Sie die Lösung nach jedem Zyklus durch Pipettenaspiration und entsorgen Sie sie.

Bereiten Sie anschließend sechs 15-Milliliter-Röhrchen zur Zellensammlung und 80 Milliliter einer vier Grad Celsius kalten, künstlich gebrauten Lösung zur Ausschaltung der Puffer-Oxygenierung von EB zwei vor und erwärmen Sie diese auf 37 Grad Celsius. Führen Sie danach einen ersten 15-minütigen Verdauungszyklus mit drei Milliliter 100 % oxygeniertem EB zwei bei 37 Grad Celsius durch. Nach dem Verdauungszyklus sammeln Sie die Lösung, die die ersten assoziierten Myozyten enthält, in einem 15-Milliliter-Röhrchen und verdünnen die Zellsuspension mit 12 Milliliter kalter KB-Lösung.

Bewahren Sie die Röhrchen flach bei Raumtemperatur auf, führen Sie fünf weitere 12-minütige Verdauungszyklen mit je drei Milliliter EB zwei bei 37 Grad Celsius durch und sammeln Sie jeweils die myocytenhaltige Pufferlösung in einem 15-Milliliter-Konusröhrchen. Verdünnen Sie die jeweils gesammelten drei Milliliter Pufferlösung zusätzlich mit 12 Milliliter KB-Lösung pro Zyklus. Bewahren Sie am Ende die sechs zellhaltigen Röhrchen bei Raumtemperatur auf.

In diesem Schritt fügen Sie ein Milligramm pro Milliliter Rinderserumalbumin zu 20 Milliliter kalziumfreiem Tyro-Puffer hinzu. Danach filtrieren Sie die Lösung und zentrifugieren die sechs konischen Röhrchen mit Myozyten bei 100 ×g für fünf Minuten. Um die Myozyten zum Absatz zu bringen, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in jedem Röhrchen mit einer variablen Menge an BSA-haltigem TB bei Raumtemperatur.

Erhöhen Sie schrittweise die Kalziumkonzentration im Puffer der Zelle, indem Sie im ersten und zweiten Schritt kleine Mengen einer 100 Millimolar pro Liter Kalziumchloridlösung hinzufügen. Die Kalziumkonzentration wird jeweils auf 50 Mikromolar pro Liter und 100 Mikromolar pro Liter angehoben. Die folgenden Kalziumzugabeschritte werden alle fünf Minuten durchgeführt, wobei die Konzentration in jedem Schritt um 100 Mikromolar pro Liter erhöht wird, bis eine Endkonzentration von 0,9 Millimolar pro Liter erreicht ist.

Um die Ausbeute des Isolationsverfahrens zu beurteilen, überführen Sie 0,5 Milliliter der myocytenhaltigen Lösung in die Glasbodenkammer eines Mikroskops. Bewerten Sie 15 Mikroskopfelder bei 10× Objektivvergrößerung und berechnen Sie den Prozentsatz gesunder Myozyten, wie stabförmige Zellen mit klaren Streifungen und ohne signifikante Einschlüsse. Die erwartete Ausbeute sollte etwa 20 % betragen, um die funktionelle Beurteilung menschlicher Kardiomyozyten einschließlich simultaner Ableitungen von Aktionspotentialen und intrazellulären Kalziumflüssen zu demonstrieren.

Bereiten Sie zunächst die Pipettenlösung für Patch-Clamp-Experimente in der perforierten Patch-Konfiguration vor. Geben Sie dann 1,8 Millimolar Calciumchlorid zu calciumfreiem tb hinzu. Verwenden Sie die Lösung zur Überleitung von Kardiomyozyten während Patch-Clamp-Fluoreszenz-Experimenten.

Überführen Sie anschließend ein Milliliter der Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und geben Sie 10 µmol/L Flu Fort und 10 µL Power Load hinzu. Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten bei Raumtemperatur in horizontaler Position. Danach stellen Sie das Röhrchen vertikal auf und lassen die Zellen fünf Minuten lang absinken.

Anschießend pipettieren Sie den Überstand ab und resuspendieren das Zellpellet in kalziumhaltigem Puffer. Übertragen Sie 0,25 Milliliter der Zellsuspension in eine kleine, temperaturgesteuerte Aufzeichnungskammer, die am Mikroskop befestigt ist. Spülen Sie das System durch Gravitation mit einem beheizten Mikroperfusionsystem bei einer Flussrate von 0,3 Millilitern pro Minute bei 37 Grad Celsius.

Präparieren Sie mit einem Mikropipettenzuggerät Patch-Clamp-Pipetten mit einem Spitzen­durchmesser von drei bis fünf Mikrometern und einem Widerstand von drei bis 4,5 Megaohm, wenn sie mit PS gefüllt sind. Danach geben Sie Amphotericin B in eine Konzentration von 250 Mikrogramm pro Milliliter zu PS und füllen damit die Elektroden; anschließend montieren Sie die Elektrode in den Pipettenhalter. Wählen Sie danach eine rundenförmige Zelle mit deutlichen Streifenmustern und ohne Einschlüsse aus.

Bilden Sie die Giga-Dichtung und warten Sie fünf bis zehn Minuten, bis der Zugangswiderstand unter 20 Ohm fällt. Leiten Sie anschließend in der Strom-Klemm-Modus Aktionspotentiale mittels kurzer Pulse bei unterschiedlichen Reizfrequenzen ein. Aktivieren Sie während der Aufnahmephase die Hellfeldbeleuchtung bei 492 Nanometern und detektieren Sie die Fluor-fort-Fluoreszenz im Bereich von 505 bis 520 Nanometern.

Danach werden die Fluoreszenz- und Membranpotentialsignale aufgezeichnet. Diese Abbildung zeigt die Veränderungen der Aktionspotentiale in ventrikulären Kardiomyozyten aus HCM-Proben. Dargestellt sind repräsentative übereinandergelegte Aktionspotentiale, die bei 0,2 Hertz, 0,5 Hertz und einem Hertz von einem Kontroll-Myozyten und einem HCM-Myozyten ausgelöst wurden.

Die überlagerten Aktionspotenziale bei 0,5 Hertz von einem Kontroll-Myozyten. Dargestellt sind die Aufzeichnungen in Abwesenheit und in Gegenwart von 10⁻⁷ molarem Isoprotrenol, sowie hier die repräsentative Spur des Membranpotenzials eines Kardiomyozyten von einem HCM-Patienten, der mehrere spontane Depolarisationen, sogenannte frühe Nachdepolarisationen, zeigte. Die Abbildung zeigt die Veränderungen des Kalziumtransienten in ventrikulären Kardiomyozyten aus HCM-Proben.

Hier sind die repräsentativen überlagerten Kalziumtransienten, die während der Stimulation mit 0,2 Hertz über die Patch-Pipette in einer Kontroll-Myozyte und einer HCM-Zelle hervorgerufen wurden. Die Kinetik der Kalziumtransienten in HCM- und Kontroll-Kardiomyozyten zu verschiedenen Zeitpunkten ist dargestellt, und hier sind die repräsentativen Langzeitverläufe, die das intrazelluläre Kalzium während der Stimulation mit drei unterschiedlichen Frequenzen zeigen, wodurch das erhöhte diastolische Kalzium bei hohen Stimulationsraten in der HCM-Myozyte verdeutlicht wird. Diese Abbildung zeigt zusätzliche experimentelle Anwendungen unter Verwendung menschlicher ventrikulärer Myozyten.

Die repräsentativen überlagerten Spuren, die den L-Typ-Calciumstrom bei verschiedenen Membranpotentialen zeigen, sind links dargestellt, und die durchschnittliche Peakdichte des L-Typ-Calciumstroms aus 18 Zellen, die aus HCM-Proben bei unterschiedlichen Membranpotentialen isoliert wurden, ist rechts dargestellt. Hier gezeigt ist außerdem die intrazelluläre Calciumspur, die von einem ventrikulären Kardiomyozyten während elektrischer Feldstimulation bei einem Hertz aufgezeichnet wurde. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Verfahren kurz nach der Entnahme der Probe aus dem Operationssaal zu beginnen, um frische Zellen für die Isolierung menschlicher ventrikulärer Kardiomyozyten sicherzustellen. Weitere Methoden wie konfokale Laser-Lebendmikroskopie oder Immunchemie können durchgeführt werden, was entscheidend sein wird, um grundlegende Fragen zu beantworten, beispielsweise, wie die subzelluläre Lokalisation von Membranstrukturen und Calciumfreisetzungseinheiten bei Herzerkrankungen verändert ist, nachdem sie entwickelt wurden.

Diese Technik hat in der zellulären Kardiologie den Weg geebnet, funktionelle Anomalien in ventrikulären Kardiomyozyten zu untersuchen und die potenzielle Wirksamkeit neuartiger therapeutischer Ansätze zu testen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie lebensfähige einzelne Kardiomyozyten aus menschlichem Gewebe isoliert werden können und wie die Zellfunktion unter verschiedenen Bedingungen charakterisiert wird.