Multilayer-Halterung für Langzeit-Licht-Mikroskopie Blatt der Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen Zebrafisch-Embryo für eine langfristige in vivo Lichtblattmikroskopie vorzubereiten. Dazu wird zunächst ein Fluor-Ethylen-Propylen- oder FEP-Röhrchen gereinigt und mit Methylcellulose beschichtet. Anschließend wird ein Zebrafisch-Embryo der gewünschten Art beschichtet.

Anschließend wird das Embryo zuerst in geschmolzenes Agarose und dann in die beschichtete FEP-Röhre überführt. Abschließend wird das untere Ende der Röhre mit einem Aros-Stopfen verschlossen und die Orientierung des montierten Embryos sorgfältig überprüft. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die ungestörte Entwicklung von Zebrafisch-Embryonen über mehrere Tage mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mittels In-vivo-Lichtblattmikroskopie zeigen.

Nun, der Hauptvorteil gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass wir Super-Fischembryonen nun über mehrere Tage hinweg beobachten können, anstatt nur über wenige Stunden. Diese Methode kann wertvolle Einblicke in die langfristige Embryogenese des Zebrafisches mithilfe der Lichtblattmikroskopie liefern. Sie kann außerdem auf andere kleine Organismen wie kleine marine Organismen angewendet werden.

Es kann auch mit anderen Mikroskopietechniken wie der optischen Projektionstomographie, der Weitfeldmikroskopie oder der konfokalen Mikroskopie verwendet werden. Personen, die neu in dieser Methode sind, könnten Schwierigkeiten haben, da das Protokoll zeitraubende Schritte beinhaltet und die Beurteilung der endgültigen Position des Embryos etwas Erfahrung erfordert. Um einen FEP-Schlauch vorzubereiten, reinigen Sie ihn zunächst, indem Sie ihn mehrfach mit einmolarer Natronlauge durchspülen. Anschließend überführen Sie den Schlauch in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das mit 0,5-molarer Natronlauge gefüllt ist, und setzen ihn zehn Minuten lang einer Ultraschallbehandlung aus.

Überführen Sie das Polymerrohr in ein kleines Becken mit destilliertem, deionisiertem Wasser und spülen Sie es durch. Anschließend spülen Sie es mit 70 % Ethanol durch, bevor Sie es in ein frisches Zentrifugenröhrchen überführen. Mit Ethanol ultras.

Sonifizieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang, bevor Sie es in ein kleines Becken mit destilliertem, deionisiertem Wasser überführen und erneut spülen. Schneiden Sie das saubere FEB-Röhrchen in drei Zentimeter lange Stücke und richten Sie sie gegebenenfalls gerade. Lagern Sie die gereinigten Röhrchen in einem frischen 50-Milliliter-Röhrchen, das mit destilliertem, deionisiertem Wasser gefüllt ist.

Stellen Sie eine Stammlösung von Trica her. 3 % Methylcellulose und jeweils 1,5 % und 0,1 % Aros gemäß dem Textprotokoll. Schmelzen Sie 1,5 % Agarose und geben Sie sie in eine Petrischale, um eine Schicht mit einer Dicke von etwa zwei Millimetern zu bilden.

Sammeln Sie Zebrafischembryonen im gewünschten Entwicklungsstadium, die das gewählte Fluoreszenzgen positiv exprimieren, und überführen Sie sie unter einem Stereomikroskop in eine frische Schale mit E3. Verwenden Sie zwei scharfe Pinzetten, um die Embryonen vorsichtig zu entchorionieren, indem Sie mit einer Pinzette die Chorionhülle festhalten und mit der zweiten Pinzette diese aufreißen und abziehen, um eine mehrschichtige Montage durchzuführen. Mit Handschuhen an den Händen befestigen Sie eine stumpfe Kanüle an einer Spritze.

Setzen Sie die Kanüle vorsichtig etwa drei Millimeter in ein Ende eines gereinigten Stückes FEP-Schlauches ein. Tauchen Sie danach das freie Ende des FEP-Schlauches in 3% Methylcellulose und füllen Sie den Schlauch mit der Lösung. Drücken Sie anschließend langsam auf die Spritze, um die Methylcellulose mit E drei Medium freizusetzen, und wiederholen Sie die Eintauch- und Ausstoßschritte.

Unterdessen in einem Wärmeblock ein Aliquot von 0,1 % Aros auf 70 Grad Celsius erwärmen. Das Reaktionsgefäß kurz vortexen, bevor es in einen auf 38 Grad Celsius eingestellten Wärmeblock überführt wird. Nach der Erhitzung das Gefäß kurz abkühlen lassen und Trica auf eine Endkonzentration von 133 bis 200 Milligramm pro Liter hinzufügen und vortexen.

Erneut unter Verwendung einer Glas-Pasteurpipette überführen Sie ein beschichtetes Embryo in das Reaktionsröhrchen mit dem vorgewärmten Aros, wobei möglichst wenig E3 übertragen werden sollte. Mit dem FEP-Röhrchen und der befestigten Spritze nehmen Sie zunächst eine kleine Menge Aros auf, bevor Sie das Embryo aufnehmen, und füllen das Röhrchen vollständig mit Aros.

Der Embryo sollte an einem der beiden Enden der Röhre positioniert werden, wobei der Kopf zur Öffnung zeigt. Um ein Auslaufen des Inhalts zu vermeiden, halten Sie die Röhre in horizontaler Position, um sie zu verschließen. Schneiden Sie den Embryo mit einer Rasierklinge von der Kanüle ab.

Dann halten Sie das Röhrchen senkrecht und führen Sie dessen Ende langsam vollständig durch die Schicht mit 1,5 % Aros, wobei Sie es leicht drehen. Um Austrocknung zu vermeiden, bewahren Sie das präparierte Objekt in einem 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen auf, das mit E3-Medium gefüllt ist, bevor Sie es abbilden. Stellen Sie sicher, dass der Fisch innerhalb des FEP-Röhrchens gerade positioniert ist und sein Kopf direkt auf dem Stopfen für die Bildaufnahme liegt.

Fügen Sie Trica dem Medium in der Bildgebungskammer hinzu. Dargestellt ist ein transgener Zebrafischembryo vom Typ K-G-R-L-G-F-P einen Tag nach der Befruchtung, der über einen Zeitraum von zwei Tagen beobachtet wurde, um die Entwicklung des Gefäßsystems zu verfolgen.

Der Zebrafisch ist durch das Einbettungsmedium nicht eingeschränkt und kann sich normal entwickeln. Beispielsweise hebt er den Kopf. Der Schwanz streckt sich aus, und die Gefäßaussprossung erfolgt ungehindert.

Diese Technik kann innerhalb von 10 Minuten durchgeführt werden, sofern sie korrekt ausgeführt wird und sämtliches Material leicht verfügbar ist. Denken Sie daran, alle wesentlichen Schritte ohne Verzögerung durchzuführen. Halten Sie alle Lösungen sauber, da Verunreinigungen die endgültige Bildqualität beeinträchtigen können.