Name: Multilayer-Halterung für Langzeit-Licht-Mikroskopie Blatt der Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Langzeit-Lichtmikroskopie von Zebrafisch-Embryonen mit FEP-Röhrchen und Methylcellulose. Diese Technik ermöglicht ungestörte Entwicklungsbeobachtungen über mehrere Tage.

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Wir danken der Max-Planck-Gesellschaft, das Human Frontier Science Program (HFSP) und der Boehringer Ingelheim Fonds für die Finanzierung und Unterstützung.

1. Materialaufbereitung <ol><li> Herstellung von Rohren FEP <ol><li> Reinigen Sie die FEP-Schlauch (2A) durch Spülen Flüssigkeiten (in den folgenden Schritten angegeben) durch das Rohr und mit einer Spritze mit einem stumpfen Ende Kanüle (2B) befestigt Anmerkung 1:.. Benutzen Sie Handschuhe während des gesamten Verfahrens Anmerkung 2: Wir empfehlen Schneiden Sie den Schlauch in Stücken von ca. 1 m in der Länge und die Reinigung dieser parallel. <ol><li> Zuerst spülen Sie das Rohr mit 1 M NaOH wiederholt. Dann übertragen die Röhre in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 0,5 M NaOH gefüllt und ultrasonicate es für 10 min. </li><li> Übertragen Sie die Polymerschlauch zu einem kleinen Becken mit ddH 2 O. Spülen Sie das Rohr zunächst mit ddH2O und dann mit 70% EtOH. </li><li> Die FEP-Schlauch Anschließend Transfer in ein frisches Zentrifugenröhrchen mit 70% EtOH. Wieder ultrasonicate dieses Zentrifugenröhrchen für 10 min. </li></ol></li><li> Schneiden Sie den Schlauch gereinigt FEP in Stückevon ca. 3 cm (eine typische Länge für den Einsatz in Montage-und Zebrafisch-Bildgebung) und richten Sie sie gegebenenfalls. Bewahren Sie die Rohre gereinigt FEP in ein frisches 50 ml-Zentrifugenröhrchen mit ddH2O (2C) gefüllt. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Tricaine Stammlösung <ol><li> Bereiten 0,4% Tricaine Stammlösung durch Lösen von 400 mg Tricaine (MS-222) in 97,9 ml ddH 2 O. Nachdem das Pulver vollständig gelöst hat, den pH auf 7,0 unter Verwendung von 2,1 ml 1 M Tris (pH 9,0). Schützen Sie die Lösung aus Licht. Speicher Aliquots bei -20 ° C. </li></ol></li><li> Herstellung von 3% Methylcellulose <ol><li> Vorbereitung 3% Methylcellulose-Lösung für die Innenbeschichtung der Rohre FEP, wie unten beschrieben. Heizen Sie E3 11 in einer Glasflasche auf ca. 60-70 ° C und fügen Sie die entsprechende Menge an Methylcellulose-Pulver. Fügen Sie einen Rührstab und rühren bei 4 ° C Sobald die Lösung auf unter 30 ° C abgekühlt, fügen Tricaine Lösung auf einen endgültigen concentration von 100 mg / L. Halten Sie das Rühren bei 4 ° C über Nacht. </li></ol></li><li> Zubereitung von 1,5% und 0,1% Agarose in E3 <ol><li> Man löst die entsprechende Menge an niedrig schmelzender Agarose-Pulver in einem definierten Volumen von E3 in einem Glaskolben. Erhitzen Sie die Mischung in eine Mikrowelle und schütteln Sie sie einmal in eine Weile, bis die Agarose-Lösung homogen erscheint, ohne verbleibenden Kristalle. </li><li> Bereiten 1 ml Aliquots von 0,1% igen Lösung in 1,5 ml Reaktionsgefäße. Die Aliquots bei 4 ° C gelagert werden </li><li> Verwenden Sie die 1,5%-Lösung zur Beschichtung eines Kunststoff-Petrischale. Die Dicke der Schicht sollte ca. Agarose sein. 2 mm. Nachdem die Agarose verfestigt wird, hinzuzufügen E3 Medium auf der Oberseite der Schicht, um sie vor dem Austrocknen zu verhindern. Die beschichtete Schale kann bei 4 ° C gelagert werden </li></ol></li><li> Vorbereitung der Zebrafisch <ol><li> Halten Zebrafisch (Danio rerio) Erwachsene und Embryonen bei 28,5 ° C und mit ihnen umgehen nach den etablierten Protokollen 11,12. </li><li> Richten Sie männliche und weibliche Fische am Nachmittag und trennen Sie diese durch einen Teiler. Am nächsten Morgen entfernen Sie die Trennlinie, um die Paarung der Fische Timeout. </li><li> Sammeln Sie die Embryonen in einer Schale mit E3 gefüllt und untersuchen sie mit einem Stereomikroskop. </li><li> Bei 24 hpf (oder der Entwicklungsphase Ihres Interesses), wählen Sie die Zebrafisch-Embryo für die Fluoreszenz-Ausdruck und übertragen die positive auf eine neue Schale mit frischen E3. </li><li> Sorgfältig dechorionate die Embryonen mit zwei scharfen Pinzette (Abb. 2D und 2E). Verwenden Sie die erste Zange zu greifen und halten Sie die Chorion und die zweite Zange, um es aufzureißen und abziehen Anmerkung 1:. Führen Sie diesen Schritt mit Hilfe eines Stereomikroskops. </li></ol></li></ol> 2. Multilayer-Montage <ol><li> Beschichten des FEP-Rohrs <ol><li> Bringen Sie ein stumpfes Ende eine Kanüle in eine Spritze. Legen Sie die Kanüle vorsichtig für etwa 3 mm in das eine Ende eines gereinigt und geschnitten Stück. FEP-Schlauch (2F und 2G) Hinweis 1: Handschuhe und vermeiden Sie jegliche Biegen oder Zusammendrücken des Rohres. </li><li> Tauchen Sie das freie Ende des FEP-Schlauch in 3% Methylcellulose und füllen Sie den Schlauch mit der Lösung. </li><li> Langsam den Methylcellulose, indem Sie auf der Spritze. Entsorgen Sie die Lösung. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2 und 2.1.3 mit E3 Hinweis 1:. Die beschichteten Rohre für die Montage sofort verwendet werden müssen. </li></ol></li><li> Übertragen der Zebrafisch zu der Agarose <ol><li> Aufheizen eines Aliquots von 0,1% Agarose auf 70 ° C in einem Heizblock. Vortex das Reaktionsrohr kurz und übertragen sie auf eine auf 38 ° C (2H) gesetzt Wärmeblock. </li><li> Nehmen Sie die Reaktionsröhrchen aus dem Wärmeblock und abkühlen lassen kurz. Hinzufügen Tricaine bis zu einer Endkonzentration von 133 bis 200 mg / L und Wirbel wieder (Fig. 2I). </li><li> Wählen Sie eine der dechorionated Zebrafischembryonen und transfe. r sie in das Reaktionsrohr mit dem vorgewärmten 0,1% Agarose mit einem Glas-Pasteur-Pipette (Abb. 2J und 2K) Hinweis 1: Versuchen Sie, so wenig wie möglich zusätzliche E3 übertragen. </li></ol></li><li> Montage des Zebrafisch <ol><li> Nehmen Sie den Embryo mit der Spritze befestigt FEP-Schlauch (2L). . Das Rohr sollte vollständig mit 0,1% Agarose gefüllt werden, wobei der Embryo nahe an einem Ende der Röhre und mit dem Kopf in Richtung der Öffnung des Rohres Hinweis 1: Stellen Sie sicher, dass Sie vor der Aufnahme die Fische nehmen einige Agarose. Hinweis 2: Ziehen Sie ganz sanft auf die Spritze, um Blasen zu vermeiden Hinweis 3:. Halten Sie das Rohr in einer horizontalen Ausrichtung, um ein Auslaufen der Inhalte (Bilder 2M und 2N) zu vermeiden. </li></ol></li><li> Stecken Sie den Schlauch <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"src = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot; /&gt; 2. Multilayer-Halterung für Zebrafisch-Embryonen. A) Fluorierte Ethylen-Propylen (FEP) Röhren auf einer Kabeltrommel vor der Zubereitung. B) Eine Spritze mit einem stumpfen Ende Kanüle befestigt. C) Ein gereinigt und geschnitten FEP-Schlauch. D, E) Dechorionation von 24 hpf Zebrafisch-Embryonen. F) die Röhre in das stumpfe Ende Kanüle. G) Die Spritze mit Kanüle und Schlauch befestigt. H) Eine Teilmenge von 0,1% Agarose in einem Reaktionsgefäß während der Übertragung auf einen Wärmeblock. I) Vortexen des geschmolzenen Agarose. J) Aufnahme eines dechorionated Embryos unter Verwendung einer Glaspipette. K) Übertragung des Embryos in die geschmolzene Agarose. L) Einlass des Embryos mit Umgebung Agarose in die FEP-Röhre. M, N) Der Zebrafisch-Embryos im Inneren des FEP-Rohrs . <strong&gt; O) Schneiden Sie den Schlauch zwischen Probe und Kanüle. P) Stecken Sie den Schlauch durch die Verwendung eines Agarose-beschichteten Gericht. Q) Der Embryo innerhalb der gesteckten Röhre. R) Die endgültige Probenvorbereitung in einem Metallhalter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um größeres Bild zu betrachten.</a> <ol><li> Verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Schlauch aus der Kanüle (Abbildung 2 O) geschnitten. </li><li> Langsam kleben Sie das Ende des Rohres den Fisch durch die gesamte Schicht von 1,5% Agarose in der Kunststoffschale, um das Rohr (Abbildung 2P)-Stecker enthält Anmerkung 1:. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen und versuchen, einen geraden Stecker Oberfläche zu erhalten, indem die . Rohr exakt senkrecht zur Oberfläche Agarose Hinweis 2: Drehen Sie den Schlauch schwach, um einen schönen Stecker zu erhalten. </li><li> Halten Sie die Probe montiert in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß mit E3, um das Trocknen zu vermeiden. Die Probe now bereit, abgebildet werden. Vor Bildgebung, zu überprüfen, ob der Fisch sitzt rechts oben auf dem Stecker (2Q Zahlen und 2R). Achten Sie darauf, auch Tricaine auf das Medium innerhalb des Abbildungskammer bei der gleichen Konzentration wie in der Montage Medium hinzufügen. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Erweiterte Mikroskopietechniken wie Lichtblatt Mikroskopie ermöglichen heute Bilddaten mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung im Laufe von mehreren Tagen aufnehmen, aber auch verlangen Probe Montagetechniken zu verbessern. Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll von Mehrschicht Halterung für Lichtmikroskopie Blatt der Zebrafisch-Entwicklung. Das Verfahren ist einfach zu implementieren und wir sie verwenden in unserem Labor auf einer täglichen Basis. Die FEP-Schläuche Schlüsselkomponenten unserer Strategie sind Röhren Montage der Polymer Fluorierte Ethylen-Propylen (FEP) vorgenommen. Wir entschieden uns, FEP vor allem wegen seiner Brechungsindex von 1.338, die ähnlich wie Wasser und daher ideal für die Lichtmikroskopie Blatt mit Wasser-Tauchziele und Probe erfordern wässrigen Medien geeignet ist, zu verwenden. Die Röhrchen mit 0,8 mm Innendurchmesser und 0,4 mm Wandstärke passen die Zebrafisch-Entwicklung sehr gut, kann mit typischen Probenhalter für 1,6 mm geeignet verwendet werdenKapillaren und sind unsere erste Wahl für die Montage vorgestellt Methode. Wir testeten sie gründlich in unserem selbstgebauten Setups sowie im Handelssystem &quot;Lichtschicht Z.1&quot; von Carl Zeiss Mikroskopie und festgestellt, dass FEP Rohre bieten langfristige Stabilität, haben nur minimale Auswirkungen auf die optische Leistung und sind nicht fluoreszierenden 10. Sie sind jedoch nicht für Anwendungen mit Proben, die einen unterschiedlichen Brechungsindex, z. B. gelöscht Probe erfordern. Rohre und Folien aus FEP sind in einer Vielzahl von Durchmessern und Dicken erhältlich. Darüber hinaus können FEP bei 260 ° C aufgeschmolzen werden und bietet praktisch unbegrenzte Möglichkeiten für maßgeschneiderte Probe Halterungen so. Die Polymerrohre sind in der Regel nicht steril geliefert werden, weshalb das Reinigungsprotokoll umfasst mehrere Schritte, um beste optische Qualität sicherzustellen. Die Beschichtung mit Methylcellulose sichergestellt, daß kein Teil der wachsenden Zebrafischembryo klebt auf das Polymer. Die Entscheidung für 0,1% Agarose basiert auf umfangreichen Tests der Wachstumsrate und Unbeweglichkeit in verschiedenen Konzentrationen von Agarose und Methylcellulose 10 basiert. Agarose-Konzentrationen über 0,1% zeigten bereits einen starken Einfluss auf die Wachstumsrate von 24 hpf Zebrafisch. Zusätzlich verwenden wir niedrige Dosen der betäubende Droge Tricaine. Tricaine Blöcke Aktionspotentiale, hemmt dadurch die Signalübertragung zwischen Gehirn und Muskeln und Muskelkontraktionen 16 unterdrückt. Eine Konzentration von 133 bis 200 mg / l gewährleistet eine ausreichende Immobilisierung von Zebrafisch zwischen 24-72 hpf. Allerdings Tricaine und andere Medikamente, die wir getestet Anästhesie zeigen dosisabhängige Nebenwirkungen wie Herz Ödeme. Zusätzlich wird die erforderliche Dosis von Tricaine variiert mit dem Entwicklungsstadium des Embryos. Wir empfehlen daher die Verringerung der Tricaine Konzentration auf die für die Entwicklungsstufen, die abgebildet werden, benötigten Menge. Um beste Performan gewährleistence und verhindern die Bildung von toxischen Nebenprodukten sollte frisch zubereitet oder aufgetaut Tricaine Stammlösung verwendet werden, vor Licht geschützt und nicht über 30 ° C erhitzt Die Einbettung in FEP Rohre ermöglicht auch eine einfache Änderung der Montagemedium für die spezifischen Bedürfnisse zu berücksichtigen. Für Zeitraffer-Bildgebung des Herzens, empfehlen wir die Verwendung von 3% Methylcellulose und 100 mg / L Tricaine anstelle von 0,1% Agarose und 200 mg / L für die Montage. Methylcellulose ist viskoser als 0,1% Agarose wodurch höhere Immobilität auf eigene und weniger Tricaine muss verwendet werden, um eine Begrenzung des Embryos zu gewährleisten. Tricaine empfindlich auf Temperaturen über 30 ° C und kann auch durch das Medium in der Belichtungskammer verdünnt werden, was zu einer verringerten Leistung und mögliche Zucken des Embryos. Stellen Sie daher sicher, dass Sie Tricaine auch in der Abbildungsmedium, in dem die Probe eingetaucht montiert zu verwenden. Wenn Ihre Experimente erfordern die Verwendung von höherenTemperaturen empfehlen wir den Austausch des Mediums in der Abbildungskammer entweder ständig unter Verwendung einer Perfusionssystem oder manuell mit einem Rohr und einer Spritze zwischen zwei Zeitpunkten. Kritische Schritte Die kritischen Schritte im Prozess der Montage sind die Probenaufnahme der Probe in das Rohr und das Einführen des Agarose-Stopfen. Die Einlass definiert die Anfangsposition des Embryos, die umständlich nachträglich ändern ist. Mehrere Proben sollten zu montieren sein und die Montagequalität sollte mit einem Stereomikroskop beobachtet werden. Wenn die Probe Orientierung nicht zufriedenstellend ist, die Änderung der Geschwindigkeit von der Erstellung der Probe und die Vermeidung von Folgebewegungen der Kolben kann helfen, wie dies oft verdreht den Embryo. Die 1,5%-Agarose-Stopfen erforderlich ist, um eine Leckage des 0,1%-igen Agarose vermeiden. Die Oberfläche des Stopfens im Inneren des Rohres sollte flach auf den Probenorientierung während der Entwicklung nicht zu beeinflussen. Um eine gute Surf erreichenace, unterschiedliche Dicken der Schichten Agarose müssen getestet werden und das Rohr muss in der Agarose normal zu der Oberfläche gebracht werden. Drehen der Röhre ein wenig und ziehen den Schlauch heraus sorgfältig frei den Stecker aus der Schüssel. Die Qualität der Befestigung sollte mit einem Stereomikroskop geprüft werden vor der Bilderzeugung. Multiview-Bild Ein großer Vorteil der Lichtbogen-Mikroskopie ist Multiview-Bildgebung, die Fähigkeit, um die Probe zu drehen, zu erwerben z-Stapel aus verschiedenen Blickwinkeln und in der Folge zu registrieren und verschmelzen sie. Eine etablierte Methode, um die z-Stacks im 3D-Raum zu registrieren ist Wulst-basierte Registrierung unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen die Probe umgebenden als Treuhänder 17 Marker. Dieses Verfahren beruht jedoch auf einem festen Einbettungsmedium, wie 1,5% Agarose und scheint daher mit der mehrschichtige Montage hier vorge unvereinbar. Aber mehrere alternative Lösungen zu arbeiten, je nach Anwendung. Erstens kann die fluoreszierende Kügelchenin der Agarose-Stecker, der in das Sichtfeld während der Erfassung werden muss aufgenommen werden. Zweitens können die Tischpositionen vor den eigentlichen Versuche unter Verwendung eines 1,5% Agarose-Säule, die mit fluoreszierenden Kügelchen kalibriert werden. Drittens können alternative Marker, wie Fluoreszenz Kerne verwendet, um die Position der Z-Stapel relativ zueinander zu identifizieren. Verdunstung Typische Lichtschnittmikroskopie Setups einen offenen Probenkammer, die unvermeidlich führt zur Verdampfung des Mediums. Da das Medium ist essentiell für das Überleben der Probe, um die Verdampfung des Montagemedium zu beschränken und für die richtige Brechungsindex zwischen der Optik und der Probe, empfehlen wir unter einer oder mehreren der folgenden Maßnahmen, um Verdunstung zu verhindern. Erstens kann das Medium in der Kammer ständig ein Perfusionssystem ausgetauscht werden. Zweitens kann das Medium manuell nachgefüllt werden. Drittens kann die Kammer mit einem Deckel oder einer flexiblen Folie abgedeckt werden. <pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; Sauerstoffversorgung Das Polymer FEP wurde entwickelt, um eine große Vielzahl von Chemikalien zu widerstehen und ist daher robust, chemisch inert und undurchlässig für Gas. Im Fall von mehrschichtigen Montage Sauerstoff kann nur durch die Agarose-Stopfen und dem Agarose-Luft-Grenzfläche zu durchdringen, aber es bleibt zu zeigen, wenn die Sauerstoffzufuhr in mehrschichtigen Montage ist erheblich niedriger im Vergleich zu den Einbau in 1,5% Agarose-Polymer ohne Stützrohr. Da die Montage in 1,5% Agarose kann nur für etwa zwei Stunden verwendet werden, bevor der Zebrafisch Morphologie mehrschichtigen Montage betroffen sein scheint, die überlegene Gesamtlösung für die Langzeitabbildungs ​​sein. Abbilden früheren Entwicklungsstufen Multilayer-Montage ist nun unsere Standard-Einbettungstechnik für Zeitraffer-Mikroskopie von Lichtbogen Zebrafisch älter als 24 hpf zu werden. Außer, dass wir auch die Polymerrohren für die Bildgebung von früher Embryonen zu verwenden. Die Embryos bleiben in ihrer Chorion und in einer FEP-Röhre mit einem Innendurchmesser von 1 mm angeordnet und mit E3 gefüllt. Der Zebrafisch kann frei innerhalb des Chorion entwickelt und kann immer noch gut mit Hilfe von Licht-Mikroskopie Blatt abgebildet werden. Ausblick Die vorgestellte Mehrschichtprobe Montage entfesselt das volle Potential der Lichtblatt-Mikroskopie für Echtzeit-Entwicklungsbiologie mit Zebrafisch. Es kann leicht für andere Mikroskopietechniken wie optischen Projektionstomographie (OPT) und andere Organismen angenommen werden. Wir glauben, dass die Standard-Größe FEP Schläuche sind nur die ersten Schritte in Richtung Probe Montagetechniken für die spezifischen Bedürfnisse zugeschnitten sind.

Um die komplexen Ereignisse und Interaktionen während der Embryogenese zu verstehen, ist die Forschung in der Entwicklungsbiologie mehr und mehr Bewegung von Mikroskopie von einzelnen Zellen und Organe in vivo Bildgebung von ganzen Organismen. Traditionelle Mikroskopie-Techniken in der Regel nicht die räumliche und zeitliche Auflösung, um eine schnelle Ereignisse über einen längeren Zeitraum verfolgen und bieten oft dazu führen, Bleichen oder phototoxische Effekte in der Probe ein. Wir und andere gefunden, Lichtbogen-Mikroskopie (Abbildung 1), um die ideale Technik für die in-vivo-Bildgebung der Zebrafisch-4.2 sein. Die Beleuchtung der Probe mit einer dünnen Schicht von Laserlicht, die orthogonal zur Erkennung Achse, bietet eine schnelle optische Schnitte mit hoher räumlicher Auflösung sowie Foto-Toxizität minimiert 5. Zugleich wird durch diese einzigartige optische Anordnung herkömmlichen Probenbefestigungstechniken unter Verwendung von Petrischalen oder Kulturkammern sind nicht geeignet. In einer typischen LichtBlatt Mikroskop drei translatorischen Motoren und Motordreh Halten der Probe, so dass sie präzise positioniert werden kann, gedreht und aus einer beliebigen Richtung betrachtet wird. In den letzten Proben für die Lichtmikroskopie Blatt oft in 2.1% Agarose in einer Glaskapillare 6,7 eingebettet. In diesem Fall wird die erstarrte Agarose Zylinder mit der eingebetteten Probe wird aus der Glaskapillare in die Probenkammer mit wasserartigen Mediums zur Bildgebung gefüllt extrudiert. Agarose hat einen Brechungsindex nahe Wasser und ist daher für die in vivo Mikroskopie Lichtblatt, die Wasser-korrigierten Belichtungs-und Detektionsoptik erleichtert geeignet. Die Probe wird in der starren Agarose beschränkt und kann auch für eine kurze Zeit abgebildet werden, aber morphogenetische Veränderungen und Wachstum des Embryos stark beeinträchtigt, wenn die Abbildung für mehrere Stunden 7,8. Obwohl Lösungen für andere Anwendungen entwickelt worden, 9, die nicht-invasive Langzeit Zeitraffer-Zebrafisch<html> Bildpotential der Lichtmikroskopie Blatt kann mit dem herkömmlichen 1,5% Agarose-Einbettung nicht ausgenutzt werden. Wir haben deshalb eine neue Strategie für die Montage in vivo Mikroskopie Lichtblatt der Zebrafisch-Embryonen 10. Die Probe wird in 0,1% Agarose mit 200 mg / L Tricaine in einem Rohr des optisch klare Polymer fluorierten Ethylen-Propylen-(FEP) montiert. Der eingebettete Embryo entwickelt normalerweise aufgrund der niedrigen Viskosität des Mediums. Zur gleichen Zeit, beschränkt die FEP-Röhre des Mediums und der Probe für die Dauer des Experiments. Hier bieten wir ein ausführliches Protokoll der neuen Montagetechnik und Darstellung von Daten reflektieren ihre Vorteile gegenüber dem herkömmlichen Protokoll. Wir zeigen, dass unsere Verfahren Zebrabärblingentwicklung kontinuierlich mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung über einen Zeitraum von mehr als zwei Tage abgebildet werden. 5in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Das Prinzip der Lichtbogen-Mikroskopie. Ein Zebrafisch in einem Rohr von fluorierten Ethylen-Propylen (FEP) vorgenommen montiert übersetzt werden kann und durch die Brennebene des Detektionsobjektiv gedreht. Eine dünne Schicht von Laserlicht (Lichtbogen) wird durch die Beleuchtung Ziel in die Fokusebene des Detektionsobjektiv projiziert und beleuchtet nur eine dünne optische Schnitt der Probe. Das emittierte Fluoreszenzsignal wird von der Detektionsobjektiv gesammelt und auf einem Kamera-Chip aufgezeichnet.

<table><tbody><tr><td>Röhrchen aus fluoriertem Ethylen-Propylen (FEP)</td><td>Bola</td><td>S 1815-04</td><td>0,8/1,6 mm Innen-/Außendurchmesser, andere Größen verfügbar</td></tr><tr><td>Omnifix-F Solo 1 ml Spritze</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9161406 V</td><td></td></tr><tr><td>Sterican Einmalkanüle, stumpf</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>9180109</td><td>0,8 mm x 22 mm, andere Größen verfügbar, Außendurchmesser der Kanüle muss dem Innendurchmesser des FEP-Röhrchens entsprechen</td></tr><tr><td>50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 M NaOH&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td>als Pulver</td></tr><tr><td>E3 Medium (für Zebrafischembryonen)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Reaktionsgefäß</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, niedrige Geliertemperatur</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>als Pulver</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Greiner</td><td>633180</td><td>Kunststoff, 94 mm x 16 mm</td></tr><tr><td>Tricain</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>Synonyme:&nbsp; Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat, MS-222, TS 222, Tricain-Methansulfonat&nbsp;</td></tr><tr><td>10X/0,3 W Mikroskop Objektiv</td><td>Leica</td><td>HCX APO L</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Kamera</td><td>Andor Technology</td><td>iXon 885 EMCCD</td><td></td></tr></tbody></table>

multilayer-halterung für langzeit-licht-mikroskopie blatt der zebrafisch

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Lichtbogen-Mikroskopie ist das ideale bildgebendes Verfahren zur Zebrafisch embryonalen Entwicklung zu studieren. Aufgrund des geringen Phototoxizität und Bleichen, ist es besonders für die Langzeit Zeitraffer-Bildgebung über mehrere Stunden bis zu mehreren Tagen geeignet. Es wird jedoch ein entsprechender Proben Montage Strategie benötigt, die sowohl Haft und normale Entwicklung der Probe bietet. Multilayer-Montage ist eine neue Einbettungstechnik mit niedriger Konzentration Agarose in optisch klaren Rohre, überwindet nun diese Einschränkung und entfesselt das volle Potential der Lichtmikroskopie Blatt für Echtzeit-Entwicklungsbiologie.

Multiday Imaging der Zebrafisch-Entwicklung Gefäßsystem Wir verwenden ein dpf Tg (kdrl: GFP) 13 Zebrafisch, um die Vorteile der Mehrschicht-Montage-Strategie für langfristige Lichtblatt-Mikroskopie zeigen. Ziel ist es, die Bildentwicklung des Gefäßsystems im gesamten Zebrafisch über einen Zeitraum von 2 Tagen. Der Zebrafisch Embryo wurde in 0,1% igen Methylcellulose in einer beschichteten Polymerrohr montiert. Hier wird der Zebrafisch nicht von der Montagemedium beschränkt und kann normal entwickeln. Sein Kopf wirft, der Schwanz erstreckt und Gefäß Austrieb erscheint ungehindert (Abbildung 3). <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> 3. Multiday Bildgebung Zebrafisch Gefäßentwicklung. Das Gefäßsystem eines multilayer montiert 1 dpf Tg (kdrl: GFP) 13 Zebrafisch entwickelt ungehindert in einem Lichtblatt-Mikroskop im Laufe der zwei Tage. Ein 488-nm-Laserlichtschnitt der Fluoreszenz angeregt und das Signal wurde mit 10X/0.3 W objektive und eine EM-CCD-Kamera detektiert. Z-Stapel wurden auf vier benachbarten Positionen alle 10 Minuten erfasst und anschließend mit Fiji 15 genäht. Maximum Intensity Projections einer Teilmenge von Zeitpunkten dargestellt. Maßstab:. 500 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> Imaging der frühen Embryogenese Zebrafisch Hier zeigen wir die Fähigkeit von FEP Rohre als Halterung für die Lichtmikroskopie Blatt der frühen Zebrafischembryogenese während des ersten Tages nach der Befruchtung. Die 8 hpf Tg (H2A: GFP) 14 Zebrafischembryo mit seiner intakten Chorion innerhalb eines E3-gefüllte Röhre mit einem i montiertMänner Durchmesser von 1 mm. Dadurch ergibt sich eine leichte Klemmung der Chorion. Alle Entwicklungsprozesse während der Embryogenese sind unabhängig von der Montage und optimal visualisiert mit Hilfe von Licht-Mikroskopie Blatt werden. In diesem Beispiel wir die abzubildende Probe über einen Zeitraum von 12 h (Fig. 4). Typische Formänderungen während der frühen Embryogenese, wie die zunehmende Dehnung des Eigelbs und Verdickung des Gewebes entlang der Mittellinie, würde bei Verwendung der herkömmlichen Montage ohne Chorion in 1,5% igen unterdrückt werden. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> . Abbildung 4 Imaging der frühen Embryogenese Zebrafisch Ein Tg (H2A: GFP). Zebrafisch-14 durchläuft der frühen Embryogenese. Ein 488-nm-Laserlicht Blatt aufgeregt GFP und das Fluoreszenzsignal erkannt wurdemit einem 10X/0.3 W objektiven und einer EMCCD Kamera. Z-Stapel aus zwei Blickwinkeln wurden alle 3 min über einen Zeitraum von 12 Stunden erworben. Normalisierte maximale Intensität Projektionen einer Teilmenge der Zeitraffer gezeigt. Sichtbare Bewegungsunschärfe bei 19 hpf Ergebnisse aus dem Embryo Zucken während der Akquisition, da keine Betäubung verwendet. Maßstab:. 150 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a>

Die Entwicklung von Zebrafisch kann über Tage mit Licht-Mikroskopie Blatt, wenn Embryonen werden in optisch klare Polymerrohren mit niedriger Konzentration Agarose eingebettet folgen.

Multilayer-Halterung für Langzeit-Licht-Mikroskopie Blatt der Zebrafisch

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen Zebrafisch-Embryo für eine langfristige in vivo Lichtblattmikroskopie vorzubereiten. Dazu wird zunächst ein Fluor-Ethylen-Propylen- oder FEP-Röhrchen gereinigt und mit Methylcellulose beschichtet. Anschließend wird ein Zebrafisch-Embryo der gewünschten Art beschichtet.Anschließend wird das Embryo zuerst in geschmolzenes Agarose und dann in die beschichtete FEP-Röhre überführt. Abschließend wird das untere Ende der Röhre mit einem Aros-Stopfen verschlossen und die Orientierung des montierten Embryos sorgfältig überprüft. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die ungestörte Entwicklung von Zebrafisch-Embryonen über mehrere Tage mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mittels In-vivo-Lichtblattmikroskopie zeigen.Nun, der Hauptvorteil gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass wir Super-Fischembryonen nun über mehrere Tage hinweg beobachten können, anstatt nur über wenige Stunden. Diese Methode kann wertvolle Einblicke in die langfristige Embryogenese des Zebrafisches mithilfe der Lichtblattmikroskopie liefern. Sie kann außerdem auf andere kleine Organismen wie kleine marine Organismen angewendet werden.Es kann auch mit anderen Mikroskopietechniken wie der optischen Projektionstomographie, der Weitfeldmikroskopie oder der konfokalen Mikroskopie verwendet werden. Personen, die neu in dieser Methode sind, könnten Schwierigkeiten haben, da das Protokoll zeitraubende Schritte beinhaltet und die Beurteilung der endgültigen Position des Embryos etwas Erfahrung erfordert. Um einen FEP-Schlauch vorzubereiten, reinigen Sie ihn zunächst, indem Sie ihn mehrfach mit einmolarer Natronlauge durchspülen. Anschließend überführen Sie den Schlauch in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das mit 0,5-molarer Natronlauge gefüllt ist, und setzen ihn zehn Minuten lang einer Ultraschallbehandlung aus.Überführen Sie das Polymerrohr in ein kleines Becken mit destilliertem, deionisiertem Wasser und spülen Sie es durch. Anschließend spülen Sie es mit 70 % Ethanol durch, bevor Sie es in ein frisches Zentrifugenröhrchen überführen. Mit Ethanol ultras.Sonifizieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang, bevor Sie es in ein kleines Becken mit destilliertem, deionisiertem Wasser überführen und erneut spülen. Schneiden Sie das saubere FEB-Röhrchen in drei Zentimeter lange Stücke und richten Sie sie gegebenenfalls gerade. Lagern Sie die gereinigten Röhrchen in einem frischen 50-Milliliter-Röhrchen, das mit destilliertem, deionisiertem Wasser gefüllt ist.Stellen Sie eine Stammlösung von Trica her. 3 % Methylcellulose und jeweils 1,5 % und 0,1 % Aros gemäß dem Textprotokoll. Schmelzen Sie 1,5 % Agarose und geben Sie sie in eine Petrischale, um eine Schicht mit einer Dicke von etwa zwei Millimetern zu bilden.Sammeln Sie Zebrafischembryonen im gewünschten Entwicklungsstadium, die das gewählte Fluoreszenzgen positiv exprimieren, und überführen Sie sie unter einem Stereomikroskop in eine frische Schale mit E3. Verwenden Sie zwei scharfe Pinzetten, um die Embryonen vorsichtig zu entchorionieren, indem Sie mit einer Pinzette die Chorionhülle festhalten und mit der zweiten Pinzette diese aufreißen und abziehen, um eine mehrschichtige Montage durchzuführen. Mit Handschuhen an den Händen befestigen Sie eine stumpfe Kanüle an einer Spritze.Setzen Sie die Kanüle vorsichtig etwa drei Millimeter in ein Ende eines gereinigten Stückes FEP-Schlauches ein. Tauchen Sie danach das freie Ende des FEP-Schlauches in 3% Methylcellulose und füllen Sie den Schlauch mit der Lösung. Drücken Sie anschließend langsam auf die Spritze, um die Methylcellulose mit E drei Medium freizusetzen, und wiederholen Sie die Eintauch- und Ausstoßschritte.Unterdessen in einem Wärmeblock ein Aliquot von 0,1 % Aros auf 70 Grad Celsius erwärmen. Das Reaktionsgefäß kurz vortexen, bevor es in einen auf 38 Grad Celsius eingestellten Wärmeblock überführt wird. Nach der Erhitzung das Gefäß kurz abkühlen lassen und Trica auf eine Endkonzentration von 133 bis 200 Milligramm pro Liter hinzufügen und vortexen.Erneut unter Verwendung einer Glas-Pasteurpipette überführen Sie ein beschichtetes Embryo in das Reaktionsröhrchen mit dem vorgewärmten Aros, wobei möglichst wenig E3 übertragen werden sollte. Mit dem FEP-Röhrchen und der befestigten Spritze nehmen Sie zunächst eine kleine Menge Aros auf, bevor Sie das Embryo aufnehmen, und füllen das Röhrchen vollständig mit Aros.Der Embryo sollte an einem der beiden Enden der Röhre positioniert werden, wobei der Kopf zur Öffnung zeigt. Um ein Auslaufen des Inhalts zu vermeiden, halten Sie die Röhre in horizontaler Position, um sie zu verschließen. Schneiden Sie den Embryo mit einer Rasierklinge von der Kanüle ab.Dann halten Sie das Röhrchen senkrecht und führen Sie dessen Ende langsam vollständig durch die Schicht mit 1,5 % Aros, wobei Sie es leicht drehen. Um Austrocknung zu vermeiden, bewahren Sie das präparierte Objekt in einem 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen auf, das mit E3-Medium gefüllt ist, bevor Sie es abbilden. Stellen Sie sicher, dass der Fisch innerhalb des FEP-Röhrchens gerade positioniert ist und sein Kopf direkt auf dem Stopfen für die Bildaufnahme liegt.Fügen Sie Trica dem Medium in der Bildgebungskammer hinzu. Dargestellt ist ein transgener Zebrafischembryo vom Typ K-G-R-L-G-F-P einen Tag nach der Befruchtung, der über einen Zeitraum von zwei Tagen beobachtet wurde, um die Entwicklung des Gefäßsystems zu verfolgen.Der Zebrafisch ist durch das Einbettungsmedium nicht eingeschränkt und kann sich normal entwickeln. Beispielsweise hebt er den Kopf. Der Schwanz streckt sich aus, und die Gefäßaussprossung erfolgt ungehindert.Diese Technik kann innerhalb von 10 Minuten durchgeführt werden, sofern sie korrekt ausgeführt wird und sämtliches Material leicht verfügbar ist. Denken Sie daran, alle wesentlichen Schritte ohne Verzögerung durchzuführen. Halten Sie alle Lösungen sauber, da Verunreinigungen die endgültige Bildqualität beeinträchtigen können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel beschreibt die Probenvorbereitung für die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie. Es demonstriert auch eine Methode zur Montage lebender Zebrafischembryonen für die Langzeitbildgebung, die die Aufnahme von langen Zeitrafferfilmen von lebenden Embryonen unter nahezu physiologischen Bedingungen ermöglicht.

Probenvorbereitung für die Lichtblattmikroskopie: Einbetten lebender Zebrafischembryonen für die Langzeitbildgebung

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Montage lebender Zebrafischembryonen für Langzeitbildgebung. Diese Methode ist kostengünstig und einfach durchzuführen mit normalen Mikroskopischalen mit Glasboden für die Bildgebung am inversen Mikroskop. Die Einbettung erfolgt in Schichten von Agarose in unterschiedlichen Konzentrationen.

Layered Agar Mounting: Vorbereitung lebender Zebrafischembryonen für die Langzeitbildgebung mit einem inversen Mikroskop

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erfassung der Dynamik der Regeneration von Schwanzflossen von Zebrafischlarven auf einer Ganzgewebeskala mit Hilfe von Hellfeld-basierter Stereomikroskopie. Diese Technik ermöglicht es, die Regenerationsdynamik mit einer Einzelzellauflösung zu erfassen. Diese Methodik kann an jedes Stereomikroskop angepasst werden, das mit einer CCD-Kamera und einer Zeitraffer-Software ausgestattet ist.

Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie ist ein hervorragendes Werkzeug für die Abbildung der Embryonalentwicklung. Es ermöglicht die Aufnahme von langen Zeitrafferfilmen von lebenden Embryonen unter nahezu physiologischen Bedingungen. Wir demonstrieren seine Anwendung für die Bildgebung der Entwicklung von Zebrafischaugen über weite räumliche und zeitliche Skalen und stellen eine Pipeline für die Fusion und Dekonvolution von Multiview-Datensätzen vor.

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Hier präsentieren wir eine vielseitige Einbettungsmethode, die die Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung der hinteren Körperentwicklung von lebenden Zebrafischembryonen ermöglicht, ohne die normale Entwicklung zu stören.

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Montage zerbrechlicher Zebrafischembryonen für eine längere konfokale Zeitraffermikroskopie. Diese kostengünstige Methode ist einfach mit normalen Glasbodenmikroskopie-Geschirr für die Bildgebung auf jedem invertierten Mikroskop durchzuführen. Die Montage erfolgt in Agaroseschichten in unterschiedlichen Konzentrationen.

Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen

Wir beschreiben optimierte Werkzeuge zur Untersuchung des Zebrafischherzens in vivo mit Lichtblattfluoreszenzmikroskopie. Insbesondere schlagen wir helle kardiale transgene Linien vor und präsentieren neue sanfte Einbettungs- und Immobilisierungstechniken, die Entwicklungs- und Herzfehler vermeiden. Eine mögliche Datenerfassungs- und Analysepipeline, die an die kardiale Bildgebung angepasst ist, ist ebenfalls vorhanden.

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Eine Probenvorbereitungsstrategie für die Abbildung früher Zebrafischembryonen in einem intakten Chorion mit einem Lichtblattmikroskop wird beschrieben. Es analysiert die verschiedenen Orientierungen, die Embryonen innerhalb des Chorions in den 70% Epibolie- und Knospenstadien annehmen, und beschreibt bildgebende Strategien, um mit Hilfe des Lichtblattsystems eine zelluläre Auflösung im gesamten Embryo zu erzielen.

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In diesem Bericht schlagen wir eine neue Anwendung von lichthärtenden Dentalharze für Montagesockel von Elektroden oder Mikrodialysesonden in chronischen Experimenten. Dieses Material ermöglicht die direkte Anbindung an die Schädeldecke.

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Multilayer-Halterung für Langzeit-Licht-Mikroskopie Blatt der Zebrafisch

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