Minimal Invasive Gründung von murinen orthotopen Blasen Xenografts

Die etablierte Technik, um primäre invasive orthotopen Blasenkrebs Xenografts impfen erfordert Laparotomie und Mobilisierung der Blase. Dieses Verfahren verursacht eine signifikante Morbidität auf Mäuse, ist technisch anspruchsvoll und zeitaufwendig. Wir haben deshalb eine hohe Präzision, die perkutane Ansatz verwendet Ultraschallkontrolle.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, orthotope Blasenkrebs-Xenotransplantate schnell, präzise und minimalinvasiv zu erstellen. Dies wird erreicht, indem zunächst die jeweilige Tumorzelllinie erweitert und die Tumorzellen in Matrigel suspendiert werden. Als nächstes wird das Tier auf die Bildgebungsplattform montiert und die Blase mit Ultraschall sichtbar gemacht.

Anschließend werden die Schleimhaut- und Muskelschichten in der Blase mit einer Kochsalzinjektion getrennt. Schließlich wird die Tumorzell-Matrigel-Suspension in diesen künstlich geschaffenen Raum injiziert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die durch Ultraschallbildgebung und Biolumineszenz ein Tumorwachstum zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden, wie z. B. der Laparotomie zur Inokulation von primären Xenotransplantaten, besteht darin, dass dieser Ansatz schnell, präzise und minimalinvasiv ist. Die Implikationen dieser Techniken erstrecken sich auf die Diagnose und Therapie von Blasenkrebs, da Auto-Xenotransplantate der Goldstandard für die präklinische Erforschung neuartiger Behandlungen sind. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Injektionsschritte ziemlich schwer zu erlernen sind und das Wasser sehr dünnflüssig ist.

Igor Mosca hat einen wissenschaftlichen Mitarbeiter und Wolfgang Yeager einen Postdoktoranden. Beide sind Urologen, nachdem sie die Identität der jeweiligen menschlichen Blasenkrebszelllinien bestätigt haben. Verwenden Sie für diese Studie durch DNA-Fingerprinting ein lentivirales Konstrukt, das das Glühwürmchen-Luziferase-Gen für die Biolumineszenz-Wachstumsanalyse von Xenotransplantat-Tumoren trägt, um die Zelllinien zu transfizieren.

Wenn Sie bereit sind, mit dem Verfahren zu beginnen, tauen Sie auf und verwenden Sie DMEM mit 10 % FBS, um die vorhandenen Zelllinien zu erweitern, und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2. Um eine Zellsuspension für die Injektion nach dem Auftauen vorzubereiten, Matrigel und Halten auf Eis Trypsin-Augen, 70% Konfluenzzellen und verwenden Sie normales Wachstumsmedium zum Suspendieren, zählen Sie dann die Zellen und drehen Sie die Suspension fünf Minuten lang bei 200 mal G. Nach Entfernen des Überstands wird die entsprechende Menge gleicher Volumina D-M-E-M-F-B-S und MATRIGEL zugegeben, um die gewünschte Zellkonzentration für die Injektion eines Volumens von 40 Mikrolitern pro Tier zu erreichen.

Gut mischen und Luftblasen aus flachem, starrem Kunststoff vermeiden. Schneiden Sie einen Blasenstabilisator ab, inspizieren Sie das Armband sorgfältig und entfernen Sie alle scharfen Kanten, bevor Sie es auf die Mäuse auftragen. Nach der Betäubung weiblicher Mäuse mit 3% Isofluran in Sauerstoff und der Durchführung eines Zehenkneifens.

Um eine ausreichende Sedierung zu gewährleisten, montieren Sie das Tier auf den Heiztisch der Kleintier-Bildgebungsplattform und überwachen Sie kontinuierlich seine Vitalparameter mit einem Gummiband. Fixieren Sie die unteren Gliedmaßen und verwenden Sie 0,5 % Chlorhexidingluconat, um den Bauch zu desinfizieren, bevor Sie die Haut mit einem sterilen Wattestäbchen abwischen. Als nächstes immobilisieren Sie die Blase mit dem Blasenstabilisierungsband, um ein Ausweichen der Blase während der intramuralen Injektion zu vermeiden.

Tragen Sie dann steriles Ultraschallgel auf den Unterbauch auf. Schieben Sie die Ultraschalluntersuchung langsam voran, gehen Sie zur Haut und visualisieren Sie die Blase auf dem Ultraschallbildschirm. Wenn die Blase leer ist, verwenden Sie 50 Mikroliter warmes PBS in einem transurethralen 24-Gauge-Angio-Katheter, um ihn zu füllen, um die Blasenwandschichten zu trennen.

Beginnen Sie damit, eine mit PBS gefüllte 1,0-Milliliter-Spritze an der Spritzenklemme anzubringen, die mit einer 30-Gauge-Dreiviertelzoll-Nadel verbunden ist. Positionieren Sie die Nadel in Richtung Haut knapp über dem Schambein. Erkennen Sie die Nadel in einem Winkel von 30 bis 45 Grad auf dem Ultraschallbildschirm, bevor Sie die Haut- und Bauchwandmuskulatur langsam perforieren.

Drehen Sie dann die Fase der Nadel um 180 Grad, so dass sie nach hinten zeigt, und führen Sie die Spitze der Nadel in die Blasenwand ein, ohne in die Schleimhaut einzudringen. Um dann einen künstlichen Raum zu schaffen, injizieren Sie langsam 50 Mikroliter PBS zwischen die Muskelschicht und die Schleimhaut, bevor Sie die Nadel zurückziehen. Um Blasenkrebszellen zu injizieren, befestigen Sie eine zweite 1,0-Milliliter-Spritze, die mit der Krebszell-Matrigel-Suspension gefüllt ist, und eine 30-Gauge-Dreiviertelzoll-Nadel an der Spritzenklemme.

Führen Sie die Spitze der Nadel in den PBS-gefüllten Raum. Gerade erstellt und injizieren Sie 40 Mikroliter der Suspension in den Raum. Ziehen Sie dann die Nadel zurück, nachdem Sie die Maus von der Bildgebungsplattform demontiert haben.

Bewahren Sie es in einer warmen und komfortablen Umgebung unter ständiger Überwachung auf. Nachdem Sie das Bewusstsein wiedererlangt und normal gehfähig sind, setzen Sie das Tier zurück in seinen Heimatkäfig. Die intramurale Injektion von drei verschiedenen Tumorzelllinien wurde bei 50 Tieren unter Ultraschallkontrolle an drei aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt.

Die Inokulation wurde effizient durchgeführt und war nicht mit intra- oder postinterventionellen Komplikationen verbunden. Die Überwachung des Tumorwachstums erfolgte durch Ultraschallbildgebung und Biolumineszenz. Am dritten Tag konnte bei allen 50 Tieren ein Tumor in der vorderen Blase per Ultraschall nachgewiesen werden, und 98% der Mäuse zeigten während der Nachbeobachtungszeit nach der Inokulation von UC ein konstantes Tumorwachstum. Drei.

Luke, eine Maus, entwickelte eine intraperitoneale Tumorverbreitung und der Tumor involutierte nach dem siebten Tag bei einem zweiten Tier. Dies war die erste Gruppe von Mäusen, die nach der Inokulation von uc mit dieser neuen Technik geimpft wurden. Drei. Luke uc, ein Luke und uc.

13 Lukas. Die Mäuse wurden an den Tagen 24, 28 und 37 getötet. Xenotransplantattumoren wurden entnommen und mittels h- und d-Schnitten untersucht.

Alle Tumoren waren muskelinvasiv und einige infiltrierten in das viszerale Fett, aber es wurde keine Invasion in benachbarte Organe beobachtet. 60% der uc, 13 Luke und 20% der uc. Drei Mäuse mit Luke-Tumor entwickelten retroperitoneale Lymphknotenmetastasen, die durch h- und e-Färbung bestätigt wurden.

Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann sie in drei Minuten ausgeführt werden. Die Vertrautheit mit der Ultraschallbildgebung ist eine Voraussetzung für die Durchführung dieses Verfahrens Nachdem Tumore auf diese Weise geimpft wurden, können wir mit dem Ultraschall nicht nur das Tumorwachstum im Laufe der Zeit überwachen, sondern auch die Tumorperfusion mit Mikrobläschen betrachten. Es ermöglicht uns auch, intratumorale Injektionen mit neuartigen experimentellen Wirkstoffen durchzuführen.