Minimal Invasive Gründung von murinen orthotopen Blasen Xenografts

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, orthotope xenotransplantierte Harnblasenkarzinome schnell, präzise und minimalinvasiv zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst die spezifische Tumorzelllinie vermehrt und die Tumorzellen in Matrigel suspendiert werden. Anschließend wird das Tier auf der Bildgebungsplattform positioniert und die Harnblase mittels Ultraschall visualisiert.

Anschließend werden die Schleimhaut- und Muskelschichten der Harnblase durch eine Kochsalzlösungsinjektion voneinander getrennt. Schließlich wird die Suspension von Tumorzellen in Matrigel in diesen künstlich geschaffenen Raum injiziert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die das Tumorwachstum mittels Ultraschallbildgebung und Biolumineszenz zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden, wie beispielsweise der Verwendung einer Laparotomie zur Inokulation primärer Xenotransplantate, liegt darin, dass dieser Ansatz schnell, präzise und minimalinvasiv ist. Die Bedeutung dieser Techniken erstreckt sich auf die Diagnose und Therapie von Blasenkrebs, da autochthone Xenotransplantate den Goldstandard für präklinische Studien neuartiger Behandlungen darstellen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Injektionsschritte sehr schwierig zu erlernen sind und die Wand der Harnblase äußerst dünn ist. Die Demonstration dieses Verfahrens wird daher von großem Nutzen sein.

Igor Mosca hat einen wissenschaftlichen Assistenten und Wolfgang Yeager, einen Postdoktoranden. Beide sind Urologen. Nach Bestätigung der Identität der jeweiligen humanen Harnblasenkarzinom-Zelllinien für diese Studie mittels DNA-Fingerprinting, verwenden Sie einen lentiviralen Konstrukt, der das Firefly-Luciferase-Gen für die Biolumineszenz-Wachstumsanalyse von Xenotransplantat-Tumoren trägt, um die Zelllinien zu transfizieren.

Wenn Sie bereit sind, das Verfahren zu beginnen, tauen Sie die Zellen auf und verwenden Sie DMEM mit 10 % FBS, um die vorhandenen Zelllinien zu vermehren, und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2. Um nach dem Auftauen eine Zellsuspension für die Injektion vorzubereiten, setzen Sie Matrigel ein, bewahren Sie Trypsin-Augen auf Eis auf, verwenden Sie Zellen mit 70 % Konfluenz und suspendieren Sie diese in normalem Wachstumsmedium. Zählen Sie anschließend die Zellen und zentrifugieren Sie die Suspension fünf Minuten lang mit 200 × g. Nach dem Entfernen des Überstandes geben Sie die entsprechende Menge an gleichen Volumina von D-M-E-M-F-B-S und MATRIGEL hinzu, um die gewünschte Zellkonzentration zu erreichen, um je Tier ein Volumen von 40 Mikrolitern zu injizieren.

Gut mischen und vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen aus jedem flachen, starren Kunststoffmaterial. Schneiden Sie einen Blasenstabilisator vorsichtig zu und prüfen Sie den Riemen auf scharfe Kanten, die vor der Anwendung an den Mäusen entfernt werden müssen. Nach der Anästhesie von weiblichen Mäusen mit 3 % Isofluran in Sauerstoff und Durchführung eines Zehenquetschtests.

Um eine ausreichende Sedierung sicherzustellen, befestigen Sie das Tier auf dem beheizten Untersuchungstisch der Kleintier-Bildgebungsplattform und überwachen Sie kontinuierlich die Vitalfunktionen mit einem Gummiband. Fixieren Sie die Hintergliedmaßen und desinfizieren Sie den Bauchbereich mit 0,5 % Chlorhexidin digluconat, bevor Sie die Haut mit einem sterilen Wattestäbchen abwischen. Anschließend immobilisieren Sie die Harnblase mithilfe des Harnblasenfixiergurts, um eine Verschiebung während der intramuralen Injektion zu verhindern.

Dann sterilisiertes Ultraschallgel auf den Unterbauch auftragen. Den Ultraschallkopf langsam auf die Haut aufsetzen und die Blase auf dem Ultraschallbild sichtbar machen. Falls die Blase leer ist, 50 Mikroliter warmes PBS über einen transurethralen 24-Gauge-Angiokatheter verwenden, um die Blase zu füllen und die Wandschichten der Blase voneinander zu trennen.

Befestigen Sie zunächst eine 1,0-Milliliter-Spritze, die mit PBS gefüllt ist und an einer 30-Gauge-Nadel mit einer Länge von drei Viertel Zoll angeschlossen ist, in der Spritzenhalterung. Richten Sie die Nadel in Richtung der Haut direkt oberhalb des Schambeins aus. Bringen Sie sie in einem Winkel von 30 bis 45 Grad an und erkennen Sie die Nadel zunächst auf dem Ultraschallbildschirm, bevor Sie langsam die Haut und die Bauchwandmuskulatur durchstechen.

Drehen Sie anschließend die Schräge der Nadel um 180 Grad, sodass sie nach posterior weist, und führen Sie die Nadelspitze in die Blasenwand ein, ohne die Mukosa zu durchdringen. Um einen künstlichen Raum zu schaffen, injizieren Sie langsam 50 µL PBS zwischen die Muscularis und die Mukosa, bevor Sie die Nadel zurückziehen. Um Blasenkrebszellen zu injizieren, befestigen Sie eine zweite 1,0-mL-Spritze, die mit der Krebszell-Matrigel-Suspension gefüllt ist, sowie eine 30-Gauge-Nadel mit einer Länge von drei Viertel Zoll an der Spritzenklemme.

Führen Sie die Nadelspitze in den mit PBS gefüllten Raum. Eben erstellt und injizieren Sie 40 Mikroliter der Suspension in den Raum. Ziehen Sie dann die Nadel zurück, nachdem Sie die Maus von der Bildgebungsplattform demontiert haben.

Halten Sie es in einer warmen und angenehmen Umgebung unter kontinuierlicher Überwachung. Nach Wiedererlangung des Bewusstseins und normaler Fortbewegungsfähigkeit wird das Tier in seinen Heimkäfig zurückgebracht. Die intramurale Injektion von drei verschiedenen Tumorzelllinien wurde bei 50 Tieren unter Ultraschallführung an drei aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt.

Die Inokulation wurde effizient durchgeführt und war mit keinerlei intra- oder postinterventionellen Komplikationen verbunden. Das Tumorwachstum wurde mittels Ultraschallbildgebung und Biolumineszenz überwacht. Am dritten Tag konnte bei allen 50 Tieren mittels Ultraschall ein Tumor im vorderen Blasenbereich nachgewiesen werden, und 98 % der Mäuse zeigten während des Nachbeobachtungszeitraums nach der Inokulation von uc.Three kontinuierliches Tumorwachstum.

Bei einer Maus entwickelte sich eine intraperitoneale Tumorausbreitung, und der Tumor zog sich bei einem zweiten Tier nach Tag sieben zurück. Dies war die erste Gruppe von Mäusen, die mit dieser neuen Technik nach Inokulation von uc.Three infiziert wurden. Luke uc, eine Luke und uc.

13 Luke. Die Mäuse wurden am 24., 28. und 37. Tag jeweils getötet. Xenotransplantierte Tumore wurden entnommen und mittels H- und D-Schnitten untersucht.

Alle Tumoren waren muskelinvasiv, und einige drangen in das periviszerales Fettgewebe ein, jedoch wurde keine Invasion in benachbarte Organe beobachtet. 60 % der Urothelkarzinome, 13 Luke und 20 % der Urothelkarzinome. Drei Luke-Tumortragende Mäuse entwickelten retroperitoneale Lymphknotenmetastasen, die durch H-und-E-Färbung bestätigt wurden.

Einmal beherrscht, kann diese Technik innerhalb von drei Minuten durchgeführt werden. Die Vertrautheit mit der Ultraschallbildgebung ist eine Voraussetzung für die Durchführung dieses Verfahrens. Nachdem Tumoren auf diese Weise inokuliert wurden, ermöglicht der Ultraschall uns nicht nur, das Tumorwachstum über die Zeit zu überwachen, sondern auch die Tumorperfusion mit Mikrobläschen zu untersuchen. Außerdem können wir damit intratumorale Injektionen mit neuartigen experimentellen Wirkstoffen durchführen.