Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren Chlamydia Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wachstumsdynamik des Chlamydieneinschlusses in lebenden Zellen sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst fluoreszierende Wirtszellen erzeugt werden, die ein fluoreszierendes Protein wie GFP stabil in ihrem Zytoplasma exprimieren. Als nächstes werden die Wirtszellen mit Chlamydien infiziert und inkubieren gelassen.

Anschließend werden die infizierten Zellen durch Live-Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Schließlich werden die Einschlussmerkmale von Chlamydien durch mikroskopische Analysesoftware quantifiziert. Schließlich wird die Live-Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um Chlamydieneinschlüsse innerhalb der Wirtszelle sichtbar zu machen und biologische Parameter von Einschlüssen für quantitative Ergebnisse zu messen. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der antikörperbasierten Zählung bestehen darin, dass diese Reverse-Imaging-Strategie an lebenden Zellen und auch in Zusammenarbeit mit anderen Fluoreszenzmarkierungen verwendet werden kann, um die Einschlussdynamik aller Chlamydienarten zu quantifizieren.

Darüber hinaus beleuchtet dieser Ansatz im Gegensatz zu routinemäßigen Methoden, die Bakterien in Zellen markieren, die Einschlussmembran in lebenden Zellen und kann so wichtige dynamische Eigenschaften dieses Erreger-haltigen Kompartiments aufdecken. Nach der Erzeugung fluoreszierender Hela-Zellen tauen GFP-Hela-Zellen gemäß der Textprotokollplatte auf einem gewünschten Kulturgefäß, wie z. B. Glasbodenschalen für hochauflösende Bildgebung 4 24-Well-Platten für die IFU-Bestimmung und Multi-Well-Screening, ein gefrorenes Röhrchen auf, das Crich cotus oder einen anderen gewünschten Chlamydienstamm enthält, auf Eis und verdünnen sie in HBSS auf die gewünschte Infektionsvielfalt. Um eine statische Infektion mit Crich Cotus durchzuführen, aspiriert LGV zero VL two das Medium aus den Vertiefungen und verwendet HBSS, um die GFP-Helazellen zu waschen.

Verdünnte Bakterien in die Vertiefungen geben und zwei Stunden bei 25 Grad Celsius inkubieren, die Zellen aspirieren und mit HBSS waschen. Nach Zugabe von Wachstumsmedium werden die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator inkubiert, um eine zentrifugationsgestützte Infektion mit Crich zum Serovar D oder einem anderen Chlamydienstamm durchzuführen. Verwenden Sie HBSS, um die GFP-Helazellen zu waschen und den Zellen verdünnte Bakterien hinzuzufügen.

Stellen Sie dann die Schale mit den infizierten Zellen in einen Multi-Well-Plattenhalter eines schwingenden Schaufelrotors in einer Tischzentrifuge. Zentrifugieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 900 mal G und 25 Grad Celsius. Stellen Sie dann die Kulturgefäße für eine Stunde in einen 37 Grad Celsius heißen Kohlendioxid-Inkubator in eine Biosicherheitswerkstatt, aspirieren Sie die Zellen, waschen Sie sie zweimal mit HBSS und fügen Sie Wachstumsmedium hinzu.

Inkubieren Sie die Schale der infizierten Zellen bei 37 Grad Celsius. Um Chlamydieneinschlüsse sichtbar zu machen, entfernen Sie Chlamydien-infizierte GFP-Helazellen aus dem Kohlendioxid-Inkubator und verwenden Sie RPMI ohne Phenolrot und 5%FBS. Um das Medium auszutauschen, stellen Sie die Schale oder Multi-Well-Platte auf ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit einem 20-fachen oder höheren Ölobjektiv. Identifizieren Sie mit Hilfe von Bildgebungssoftware Chlamydien-infizierte GFP-Hela-Zellen, die als grüne Zellen erscheinen, die große Schwarze Löcher enthalten.

Konfigurieren Sie die Software im Dialogfeld "Erfassungseinrichtung" so, dass der grüne Kanal und alle anderen Kanäle, die dem Beispiel hinzugefügt wurden, erfasst werden. Verwenden Sie die Aufnahme-Schrägstrich-Aufnahmetaste, um das Bild zu den gewünschten Zeiten aufzunehmen. Nach der Infektion. Nehmen Sie Chlamydien-infizierte GFP-Helazellen aus dem Inkubator und stellen Sie die Schale auf ein Inverter-Fluoreszenzmikroskop.

Konzentrieren Sie sich auf die mittleren Ebenen der Zellen, wo die Einschlüsse ihren maximalen Durchmesser und ihre maximale Ausbeute erreichen. Gestochen scharfe Kanten erfassen Bilder in mindestens 10 Halbbildern pro Well. Wells stellen in der Regel Replikate oder experimentelle Variablen dar.

Um GFP-Helazellen auf der Registerkarte "Messungen" zu finden, verwenden Sie den Befehl "Objekte suchen" und wählen Sie den grünen Kanal aus. Passen Sie die Schwellenwertintensität basierend auf den relativen Intensitäten der Zellen an. Zählen Sie die Anzahl der Einschlüsse oder schwarzen Kompartimente und GFP-Helazellen manuell mit dem Auge oder verwenden Sie Bildgebungssoftwarealgorithmen, um Einschlüsse automatisch zu identifizieren und zu zählen.

Filtern Sie die ausgewählten Objekte, indem Sie nur die Objekte beibehalten, die größer als fünf Quadratmikrometer sind. Bezeichnen Sie dies als Population eins. Wenden Sie unter Verwendung dieser Füllung den Befehl Löcher in Objekten füllen als Eingabe an, mit der in diesem Schritt die zweite Füllung generiert wird.

Subtrahieren Sie Population eins von Population zwei, um positiv markierte Chlamydien-Einschlüsse zu erhalten, die als Population drei bezeichnet werden. Verwenden Sie den Befehl filter population, um einen Größenfilter auf die dritte Population anzuwenden. Wenn Sie z. B. Objekte mit einem Abstand von mehr als 25 Quadratmikrometern für Einschlüsse in Zellen aufbewahren, die für frühe Infektionszeiten 24 Stunden oder länger infiziert sind, stellen Sie den Größenfilter so ein, dass Objekte größer als vier Quadratmikrometer bleiben.

Da diese Einschlüsse viel kleiner sind, führt der Größenfilter zu einer Auffüllung von Objekten, die als Einschlüsse gekennzeichnet sind. Verwenden Sie die Imaging-Software, um quantitative Daten aus den Bildern zu berechnen, z. B. Einschlusszahl, Einschluss, Größe und Einschluss. Der Umfang bei der Infektion mit Chlamydien-Einschlüssen ist als schwarze Flecken gut sichtbar, und die Wirtszellen oder das fluoreszierende Protein, das Chlamydien in den Wirtszellen exprimiert, und ihre Klarheit kann für die automatisierte Identifizierung in zahlreichen Sichtfeldern und/oder Behandlungen genutzt werden.

Wie in dieser Grafik gezeigt, ist eine wichtige Anwendung die Bestimmung von Chlamydien-Einschluss-bildenden Einheiten in lebenden infizierten Zellen, wodurch Immunfluoreszenzverfahren überflüssig werden, die sowohl zeitaufwändig als auch kostspielig sind. Ein weiteres wichtiges Merkmal dieses bildgebenden Ansatzes ist, dass er problemlos auf jede Chlamydienart oder jeden Chlamydienstamm angewendet werden kann. In diesem Beispiel wurde für jede dieser Spezies und Stämme eine Zeitverlaufsanalyse von GFP-Helazellen durchgeführt, die mit einer von vier Chlamydienarten oder -stämmen infiziert waren.

Die Einschlüsse wurden markiert und analysiert, um ihre durchschnittliche Fläche, Umfangslänge und Anzahl pro Zelle zu den angegebenen Zeiten zu berechnen. Diese Attribute liefern wichtige Informationen über die Biologie von Chlamydien-Einschlüssen, einschließlich der Art und Weise, wie sie mit der Wirtszelle interagieren. Hier ist ein Video von m Kirsch-Hela-Zellen zu sehen, die mit GFPC, Tracom L two, infiziert sind, bestehend aus Zeitrafferbildern, die in Fünf-Minuten-Intervallen für 125 Minuten aufgenommen wurden, beginnend 48 Stunden nach der Infektion.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese Reverse-Imaging-Technik verwenden können, um nicht nur Chlamydieneinschlüsse zu visualisieren, sondern auch die Einschlussdynamik wie den Umfang des Einschlussbereichs und die Anzahl der Einschlüsse pro Zelle zu quantifizieren. Diese Technik ist im Vergleich zu traditionelleren Visualisierungstechniken kostengünstig und funktioniert mit allen Chlamydienarten und -stämmen.