Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wachstumsdynamik von Chlamydien-Inklusionen in lebenden Zellen sichtbar zu machen und quantitativ zu erfassen. Dies wird erreicht, indem zunächst fluoreszierende Wirtszellen erzeugt werden, die stabil ein fluoreszierendes Protein wie GFP im Zytoplasma exprimieren. Anschließend werden die Wirtszellen mit Chlamydien infiziert und zur Inkubation freigegeben.

Anschließend werden die infizierten Zellen mittels Live-Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Schließlich werden die Merkmale der Chlamydien-Inklusionen durch eine mikroskopische Analyse-Software quantifiziert; letztendlich dient die Live-Fluoreszenzmikroskopie der Visualisierung von Chlamydien-Inklusionen innerhalb der Wirtszelle und der Messung biologischer Parameter der Inklusionen für quantitative Ergebnisse. Die wesentlichen Vorteile dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie der Antikörper-basierten Zählung liegen darin, dass diese umgekehrte Bildgebungsstrategie an lebenden Zellen angewendet werden kann und zudem in Kombination mit anderen fluoreszenten Markierungen zur Quantifizierung der Inklusionsdynamik aller Chlamydien-Spezies eingesetzt werden kann.

Außerdem beleuchtet dieser Ansatz im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, die Bakterien in Zellen markieren, die Inklusionsmembran in lebenden Zellen und kann somit wichtige dynamische Eigenschaften dieses den Erreger enthaltenden Kompartiments aufzeigen. Nachdem fluoreszierende Hela-Zellen erzeugt wurden, entsprechend dem Textprotokoll, die GFP-Hela-Zellen auf einem gewünschten Kulturgefäß, wie z. B. Glasbodenkulturschalen für hochauflösende Bildgebung, 4- oder 24-Well-Platten zur IFU-Bestimmung und Mehrfach-Well-Screening, ausplattieren, eine gefrorene Röhrchenprobe mit Crich Cotus oder einem anderen gewünschten Chlamydien-Stamm auf Eis auftauen und in HBSS auf die gewünschte Multiplizität der Infektion verdünnen. Um eine statische Infektion mit Crich Cotus, LGV serovar L2 (LGV L2), durchzuführen, das Medium aus den Vertiefungen abpipettieren und die GFP-Hela-Zellen mit HBSS waschen.

Gebe verdünnte Bakterien in die Vertiefungen und inkubiere zwei Stunden bei 25 Grad Celsius, saugt die Zellen ab und wasche mit HBSS. Danach füge Wachstumsmedium hinzu und inkubiere die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator, um eine zentrifugationsunterstützte Infektion mit crich zu Serovar D oder einem anderen Chlamydien-Stamm durchzuführen. Wasche die GFP-Hela-Zellen mit HBSS und gebe verdünnte Bakterien zu den Zellen.

Danach die Schale mit infizierten Zellen in einen Multiwell-Plattenhalter eines Schwenkkorbrotors in einer Tischzentrifuge platzieren. Die Zellen eine Stunde lang bei 900 × g und 25 °C zentrifugieren. Anschließend die Kulturgefäße in einem Biosicherheitswerkbank in einen 37 °C warmen Kohlendioxid-Inkubator für eine Stunde stellen, die Zellen absaugen, zweimal mit HBSS waschen und Wachstumsmedium hinzufügen.

Die Schale mit infizierten Zellen bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um Chlamydien-Inklusionen sichtbar zu machen, entfernen Sie die mit Chlamydien infizierten GFP-Hela-Zellen aus dem Kohlendioxid-Inkubator und ersetzen Sie das Medium durch RPMI ohne Phenolrot und mit 5 % FBS. Platzieren Sie die Schale oder die Mehrfach-Well-Platte auf einem umgekehrten Fluoreszenzmikroskop mit einer 20×- oder höheren Öl-Objektivlinse. Identifizieren Sie mithilfe der Bildgebungssoftware GFP-Hela-Zellen, die infiziert sind mit Chlamydien und als grüne Zellen mit großen schwarzen Löchern erscheinen.

Stellen Sie im Dialogfeld zur Erfassungskonfiguration die Software so ein, dass sie den grünen Kanal und alle weiteren im Probenpräparat hinzugefügten Kanäle erfasst. Nutzen Sie die Aufnahme-/Aufzeichnungsschaltfläche, um das Bild zu den gewünschten Zeitpunkten nach der Infektion aufzuzeichnen. Entfernen Sie Chlamydien-infizierte GFP-Hela-Zellen aus dem Inkubator und platzieren Sie die Zellkulturplatte auf einem Invertierten Fluoreszenzmikroskop.

Konzentrieren Sie sich auf die mittleren Ebenen der Zellen, in denen Einschlüsse ihren maximalen Durchmesser und Ertrag erreichen. Machen Sie Aufnahmen mit scharfen Kanten in mindestens 10 Feldern pro Vertiefung. Vertiefungen stellen typischerweise technische oder experimentelle Wiederholungen beziehungsweise Versuchsvariablen dar.

Um die GFP-Hela-Zellen unter dem Reiter „Measurements“ zu finden, verwenden Sie den Befehl „Objekte finden“ und wählen den grünen Kanal aus. Passen Sie die Schwellenintensität basierend auf den relativen Intensitäten der Zellen an. Zählen Sie die Anzahl der Einschlüsse oder schwarzen Kompartimente und der GFP-Hela-Zellen manuell mit dem Auge oder verwenden Sie Algorithmen der Bildverarbeitungssoftware, um Einschlüsse automatisch zu identifizieren und zu zählen.

Filtern Sie die ausgewählten Objekte, indem Sie nur jene beibehalten, die größer als fünf Quadratmikrometer sind. Bezeichnen Sie dies als Population eins. Wenden Sie auf dieser Population den Befehl zum Füllen von Löchern in Objekten an, wobei dieser Schritt als Eingabe Population zwei erzeugt.

Subtrahieren Sie Population eins von Population zwei, um positiv markierte Chlamydien-Inklusionen zu erhalten, die als Population drei bezeichnet werden. Verwenden Sie den Befehl „Population filtern“, um einen Größenfilter auf Population drei anzuwenden. Behalten Sie beispielsweise bei Inklusionen in Zellen, die 24 Stunden oder länger infiziert waren, Objekte größer als 25 Quadratmikrometer bei frühen Infektionszeitpunkten; setzen Sie den Größenfilter so, dass Objekte größer als vier Quadratmikrometer beibehalten werden.

Da diese Einschlüsse viel kleiner sind, führt der Größenfilter zu einer Population von Objekten, die als Einschlüsse bezeichnet werden. Verwenden Sie die Bildgebungssoftware, um quantitative Daten aus den Bildern zu berechnen, wie beispielsweise die Anzahl der Einschlüsse, die Größe der Einschlüsse und den Umfang der Einschlüsse. Nach einer Infektion mit Chlamydien sind Einschlüsse leicht als schwarze Punkte sichtbar, ebenso wie die Wirtszellen oder das fluoreszierende Protein exprimierende Chlamydien innerhalb der Wirtszellen, und ihre Klarheit kann zur automatisierten Identifizierung über zahlreiche Bildfelder und/oder Behandlungen hinweg genutzt werden.

Wie in diesem Diagramm gezeigt, besteht eine wichtige Anwendung in der Bestimmung von Chlamydien-Inklusionsbildenden Einheiten in lebenden infizierten Zellen, wodurch aufwendige und kostspielige Immunfluoreszenzverfahren entfallen. Ein weiteres zentrales Merkmal dieses bildgebenden Ansatzes ist, dass er problemlos auf jede Chlamydien-Art oder -Stamm anwendbar ist. In diesem Beispiel wurde für jede dieser Arten und Stämme eine Zeitreihenanalyse von GFP-markierten Hela-Zellen durchgeführt, die mit einer von vier Chlamydien-Arten oder -Stämmen infiziert waren.

Inklusionen wurden markiert und analysiert, um ihre durchschnittliche Fläche, Umfangslänge und Anzahl pro Zelle zu den angegebenen Zeitpunkten zu berechnen. Diese Merkmale liefern wichtige Informationen über die Biologie chlamydialer Inklusionen, einschließlich ihrer Wechselwirkungen mit der Wirtszelle. Gezeigt ist hier ein Video von mCherry-Hela-Zellen, die mit GFPC, Tracom L zwei infiziert wurden, bestehend aus Zeitrafferaufnahmen in Fünf-Minuten-Abständen über einen Zeitraum von 125 Minuten, beginnend 48 Stunden nach der Infektion.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese umgekehrte Bildgebungstechnik verwenden können, um nicht nur chlamydiale Inklusionen sichtbar zu machen, sondern auch deren Dynamik zu quantifizieren, beispielsweise die Fläche und den Umfang der Inklusionen sowie die Anzahl der Inklusionen pro Zelle. Diese Technik ist kostengünstiger im Vergleich zu traditionelleren Visualisierungsmethoden und funktioniert mit allen Chlamydien-Arten und -Stämmen.