Name: Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren Chlamydia Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Chlamydia-Inklusionsdynamik in lebenden Zellen mit fluoreszierenden Proteinen visualisieren und quantifizieren. Diese Methode ermöglicht Echtzeitanalyse der Infektionsbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken Ian Clarke und P. Scott Hefty für die Plasmide pGFP-SW2 bzw. pASK-GFP-mKate2-L2. Wir danken Paul Miller für die technische Unterstützung und Richard Stephens für weitere Ressourcen. Diese Arbeit wurde durch das NIH Grant AI095603 (KH) finanziert.

1. Erzeugung von Leuchtstoff-Wirtszelllinien <ol><li> Tag 1. Platte 293T-Zellen (oder andere retrovirale Verpackungslinie) auf 6-Well-Platten mit 2 × 10 6 Zellen / Vertiefung, zu sein ~ 75% konfluent am nächsten Tag. Falls gewünscht, um die Platte zwei Vertiefungen für jede Retrovirus verwendet werden. </li><li> Tag 2. Saugen Sie Zellen und 2 ml frisches Wachstumsmedium (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-Glutamin). Transfektion von Zellen mit 5-8 &amp; mgr; g jedes der retroviralen Vektor (enthaltend GFP) und Verpackungsvektor (z. B. pVSVg) unter Verwendung von Lipofectamine 2000 oder einem ähnlichen Reagenz, und nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Inkubieren Zellen mit DNA für 4-6 Stunden in einem 37 ° C CO 2 -Inkubator und anschließend Ersetzen Medium mit 1 ml Wachstumsmedium. </li><li> Inkubieren Zellen für 48 Stunden in 37 ° C CO 2 -Inkubator. </li><li> Tag 3. Platte Zielzellen (z. B. HeLa) auf Platten mit 6 Vertiefungen bei einer Dichte von etwa 10 5 Zellen / Vertiefung sein ~ 50% konfluentnächster Tag. Stellen Sie sicher, positive Transfektion in 293T-Zellen durch die Überwachung GFP-Fluoreszenz auf einem inversen Mikroskop. </li><li> Tag 4. Sammeln Retrovirus enthaltende Überstände abgehoben 293T-Zellen mit einer Pipette und Den Überstand durch ein 0,45 um-Celluloseacetat-Spritzenfilter. </li><li> Entfernen Sie Medium aus HeLa-Zellen und 0,5 ml Wachstumsmedium, das 16 ug / ml Polybren. Hinzufügen ~ 0,5 ml filtriert Retrovirus an Zellen tropfenweise und inkubieren Zellen in einem 37 ° C CO 2 Inkubator für 24 Stunden. Speichern alle verbleibenden Retrovirus (dh aus dem Bohrloch zu duplizieren) bei 4 ° C. </li><li> Tag 5. Wenn zwei Vertiefungen wurden vorgenommen, um zusätzliche Retrovirus, wiederholen Sie Schritt 1.7 zu erzeugen, die in Reihe mit den übrigen retrovirale Partikel zu infizieren. </li><li> Tag 6. Passage transfizierten HeLa-Zellen 1: 1 in einem 10 cm Schale, die Auswahl-Antibiotika (zB 500 ug / ml Neomycin). </li><li> Warten Sie ausreichend Zeit für die transduzierten Zellen in Anwesenheit von Selektions antibio wieder wachsenTiC, wonach Zellen können durch Standard-Techniken mit einer geringeren Konzentration an Selektionsantibiotikum vermehrt werden (z. B. 200 ug / ml Neomycin). Anmerkung: Die Zellen können auch klonal für optimale Helligkeit zu dieser Zeit ausgewählt werden, wenn nötig. </li></ol> 2. Erzeugung von GFP-exprimierenden Chlamydia trachomatis <ol><li> Vorbereitung 2x CaCl 2-Puffer (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM CaCl 2) und 4SP Puffer (0,4 M Saccharose, 16 mM Na 2 HPO 4). </li><li> Tag 1. Tauen Sie gefrorenes C. trachomatis Lager auf Eis und sofort zu verdünnen 10 ul Bakterien in 50 ul 2x CaCl2 Puffer. In 3 ug Plasmid-DNA (z. B. pASK-GFP-mKate2-L2), gut mischen und Inkubation für 30 min bei 25 ° C. </li><li> Während dieser Stufe herzustellen Wirtszellen durch Trypsinierung eine T-75-Kolben McCoys-Zellen in einem Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 50 xg für 5 min und den Überstand verwerfen. Resuspend Zellpellet in geeigneten Volumen 1x CaCl2 Puffer zu einer Endkonzentration von 4 x 10 7 Zellen / ml zu ergeben. </li><li> Nach der 30 min Inkubation (aus Stufe 2.2) wird mit 100 &amp; mgr; l an Transformationsgemisch Rohr (Gesamtvolumen 200 ul) hergestellt McCoy-Zellen und Inkubation weitere 20 min bei 25 ° C. Zugabe von 100 ul dieser transformierten Zellgemisches auf eine einzelne Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen und Überlagerung mit 2 ml Wachstumsmedium. Inkubieren bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator für 2 Tage. </li><li> Tag 3. Lyse McCoy Zellen mit C infiziert trachomatis durch Ersatz-Medium mit 1 ml dH 2 O und Kratzen Zellen mit einem gebogenen 1.000 ul Pipettenspitze. 1 ml 4SP Puffer und übergeben Suspension durch eine 27,5 G-Nadel ~ 5 mal für eine effiziente Zelllyse und Freisetzung von C. trachomatis. </li><li> Übertragungs 2 ml des Zellysats, die C. trachomatis in eine T-75-Kolben mit einer konfluenten Monolayer von frisch plattierten McCoy Zellen; 8 ml DMEM (ohne FBS) und Inkubation für 2 Stunden bei 25 ° C bis C ermöglichen trachomatis, sich an Zellen zu haften. </li><li> Saugen Sie Zellen und fügen Sie frisches Wachstumsmedium mit 10 U / ml Penicillin G und 1 ug / ml Cycloheximid ergänzt. Kolben für 48 h Inkubieren bei 37 ° C CO 2 -Inkubator. </li><li> Tag 4. Stellen Sie sicher, durch Lichtmikroskopie, die Zellen infiziert und Einschlüsse enthalten anomale Chlamydia. Identifizieren Einschlüsse so hell Vakuolen auf einer Standard-Lichtmikroskop, und anomale Chlamydia Körper als ringartige Objekte innerhalb Einschlüsse, die größer als 2 &amp; mgr; m Durchmesser. </li><li> Tag 5. Lyse Kultur durch Ersatz-Medium mit 2 ml dH 2 O und kratzen Zellen in einer Suspension. 2 ml 4SP Puffer und übergeben Suspension durch eine 27,5 G-Nadel ~ 5 mal. </li><li> Verwenden Sie 2 ml Zelllysat, einen frischen Monoschicht von McCoy-Zellen in einem gut in einer 6-Well-Platte zu infizieren. Zellen mit Lysat Inkubieren für 2 Stunden bei 25 ° C, absaugen und fügen Sie frisches WachstumsMedium, das Penicillin G und Cycloheximid. </li><li> Inkubieren Zellen in einem 37 ° C CO 2 -Inkubator für 3-5 Tage in Abhängigkeit von dem allgemeinen Gesundheitszustand der Zellen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,9-2,10 einmal oder mehrmals, falls erforderlich, Passagieren Kulturen an die frische Wells in einer 6-Well-Platte, bis die normalen Suche Einschlüsse (ohne anomale Stellen) entstanden. Zu dieser Zeit verwenden einen invertierten Fluoreszenzmikroskop, um zu überprüfen, dass C. trachomatis auszudrücken mKate2 (rot). </li><li> Scale-up infizierten Kulturen zur Erzeugung von hohem Titer Chlamydienvorräte, beispielsweise durch Ernten Chlamydia Anten aus infizierten McCoy oder HeLa-Zellen in T-150 Kolben gezüchtet. </li></ol> 3. Infektion von Zellen mit Chlamydia <ol><li> Platte GFP-HeLa-Zellen auf Wunsch Kulturgefäß, zum Beispiel Glasbodenschalen oder Kammer-Objektträgern für die hochauflösende Bildgebung, oder 24-Well-Platten für IFU Entschlossenheit und Multiwell-Screening. </li><li> Auftauen frozen Röhrchen mit C. trachomatis, C. muridarum, oder C. pneumoniae auf Eis und verdünnter in HBSS auf gewünschte Multiplizität der Infektion (MOI), beispielsweise MOI = 1. </li><li> Führen entweder statisch oder Zentrifugation gestützten Infektionen bezogen auf die Chlamydia-Stamm, der verwendet wird. <ol><li> Bei Infektionen mit C. trachomatis LGV Serovar L2 oder C. muridarum waschen GFP-HeLa-Zellen mit HBSS und Inkubation mit verdünntem Bakterien für 2 h bei 25 ° C. Absaugen und waschen Sie die Zellen mit HBSS, und inkubieren Zellen in Wachstumsmedium in 37 ° C CO 2 Inkubator. </li><li> Bei Infektionen mit C. trachomatis Serovar D oder C pneumoniae, waschen GFP-HeLa-Zellen mit HBSS und fügen verdünnt Bakterien-Zellen. Zeigen Multiwellplatte oder Glasbodenschale (vom Band in einer Multiwellplatte Deckel gesichert) in einer Multiwellplatte Inhaber einer Schwingbecherrotor Anlage in einer Tischzentrifuge. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 900 g bei 25 ° C für 1 Stunde. </li&gt; <li> Entfernen Kulturgefäße aus der Zentrifuge und in eine 37 ° C CO 2 Inkubator für 1 Stunde. </li><li> Saugen Sie Zellen in einer Biosicherheitswerkbank, waschen Sie die Zellen zweimal mit HBSS, und fügen Sie frisches Wachstumsmedium. Ortszellen in einem 37 ° C CO 2 -Inkubator. </li></ol></li></ol> 4. Live Cell Visualisierung von Chlamydia Einschlüsse <ol><li> Entfernen Chlamydia infiziert GFP-HeLa-Zellen, die aus CO 2 Inkubator und mit RPMI ersetzen Medium ohne Phenolrot + 5% FBS. </li><li> Berg Zellen auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop (Nikon Eclipse-Ti-E oder ähnliches) mit einem 20-fach oder höher Öl-Objektiv. </li><li> Verwenden von Imaging-Software (Volocity 6 oder ähnliches), konzentrieren sich auf und identifizieren Chlamydia infiziert GFP-HeLa-Zellen: grüne Zellen, die große schwarze Löcher (Chlamydia Einschlüsse). </li><li> Markieren Sie die xyz Positionen der Regionen, die Chlamydia infizierten Zellen von Interesse unter Verwendung von Imaging-Software (Volocity 6 oder ähnliches). Führen Sie dies durch manuelles &quot;Hinzufügen von Punkten&quot;, während in der XY-Bühne Ansichtsmodus. Auf diese Weise werden XYZ-Koordinaten für jeden markierten Stelle gespeichert. </li><li> Im Dialogfeld Acquisition, zu konfigurieren Software auf grün (GFP, HeLa Cytosol) und rot (mKate2, C. trachomatis) Kanälen und mit einer Rate von neuen Bildern pro Kanal alle 5 min zu erwerben. </li><li> Erwerben Sie die Bildsequenz mit der Übernahme-Protokoll oben eingegeben, indem Sie auf die &quot;Aufnahme / Aufnahme&quot; Taste. </li></ol> 5. Quantifizierung von Inclusion Wachstumsparameter in lebenden Zellen <ol><li> Zu gewünschten Zeitpunkten nach der Infektion (z. B. 24, 48 hpi) entfernen Chlamydia infiziert GFP-HeLa-Zellen von Inkubator und montieren auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop. Hinweis: A-20X oder 40X Klimaziel mit einer hohen NA ist am besten geeignet für 24-Well-Platten und ein 40X Öl-Objektiv ist für Kammer-Objektträgern empfohlen. Wachsen Zellen auf beiden Substrat für dieses assay. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf Mittelebenen von Zellen, in denen Einschlüsse sind bei ihrer maximalen Durchmesser und liefern gestochen scharfe Kanten. </li><li> Erwerben Sie Bilder für viele Bereiche in jeder Vertiefung (mindestens 10 pro Loch); Brunnen stellen typischerweise Wiederholungen oder experimentelle Variablen. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Einschlüsse von Hand, mit dem Auge (Einschlüsse sind schwarz Fächer in GFP-HeLa-Zellen) oder verwenden Imaging-Software-Algorithmen, um automatisch zu identifizieren und zu zählen Einschlüsse. <ol><li> Finden GFP-HeLa-Zellen durch Fluoreszenzintensität (Befehl &#39;Objekte zu finden &quot;) und stellen Fluoreszenzschwellenintensität basierend auf relativen Intensitäten der Zellen. </li><li> Filter selektierten Objekte mit Größe Richtlinien halten diese nur größer als 5 &amp; mgr; m 2. Dies ist &#39;Bevölkerung 1&#39;. </li><li> Übernehmen &quot;Löcher füllen in Objects &#39;Befehl mit&quot; Bevölkerung 1&#39; als Eingang. Dieser Schritt erzeugt &quot;Bevölkerung 2 &#39;. </li><li> Subtract &quot;Bevölkerung 1&quot; von &quot;population 2 &#39;positiv geprägt Chlamydia Einschlüsse, bezeichnet als Ertrag &quot;Bevölkerung 3&#39;. </li><li> Bewerben Größe Filter auf (&#39;Filter Bevölkerung&#39; Kommando) &quot;Bevölkerung 3 &#39;, zum Beispiel halten Objekte größer als 25 &amp; mgr; m 2 für Einschlüsse in Zellen, die für 24 Stunden oder mehr infiziert. Für Frühinfektion Zeiten, wie vor 18 Stunden, stellen Größe Filter auf Objekte größer als 4 &amp; mgr; m 2 zu halten, da diese Einschlüsse sind viel kleiner. Größe Filterergebnisse in einer Population von als &quot;Einschlüsse&quot; bezeichneten Objekte. </li><li> Berechnen Sie quantitative Daten aus Bildern, zum Beispiel Einbeziehung Nummer, Aufnahme Größe und Einbindung Umfang, mit Imaging-Software. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+infections%3A+progress+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis infections: progress and problems.</a> The Journal of Infectious Diseases. 179, Suppl 2. S380-S383 (1999).</li>
<li>Schachter, J. Infection and disease epidemiology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchachter%2C+J+%22Chlamydia%3A+Intracellular+Biology%2C+Pathogenesis%2C+and+Immunity%22">Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity</a>. Stephens, R. S. , ASM Press. 139-169 (1999).</li>
<li>Campbell, L. A., Kuo, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+pneumoniae--an+infectious+risk+factor+for+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Chlamydia pneumoniae--an infectious risk factor for atherosclerosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).</li>
<li>Darville, T., Hiltke, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+genital+tract+disease+due+to+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis.</a> The Journal of Infectious Diseases. 201, Suppl 2. S114-S125 (2010).</li>
<li>Hackstadt, T. Cell biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHackstadt%2C+T+%22Chlamydia%3A+Intracellular+Biology%2C+Pathogenesis%2C+and+Immunity%22">Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity</a>. Stephens, R. S. , ASM Press. 101-138 (1999).</li>
<li>Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis%3A+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector).</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258(2011).</li>
<li>Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Chlamydia+trachomatis-infected+cells%3A+directed+trafficking+of+Golgi-derived+sphingolipids+to+the+chlamydial+inclusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).</li>
<li>Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labelling+of+intracellular+bacteria+in+living+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).</li>
<li>Hybiske, K., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+host+cell+exit+by+the+intracellular+bacterium+Chlamydia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).</li>
<li>Heinzen, R. A., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chlamydia+trachomatis+parasitophorous+vacuolar+membrane+is+not+passively+permeable+to+low-molecular-weight+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds.</a> Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).</li>
<li>Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+expression+in+Chlamydia+trachomatis+using+the+tet+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system.</a> PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).</li>
<li>Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+recruitment+to+the+Chlamydia+inclusion+is+spatiotemporally+regulated+by+a+mechanism+that+requires+host+and+bacterial+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors.</a> PLoS One. 7 (10), e46949(2012).</li>
<li>Agaisse, H., Derré, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+trachomatis+cloning+vector+and+the+generation+of+C.+trachomatis+strains+expressing+fluorescent+proteins+under+the+control+of+a+C.+trachomatis+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter.</a> PLoS One. 8 (2), e57090(2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Hier beschreiben wir die experimentelle Strategie zur Erzeugung von Fluoreszenz-Wirtszellen für die Echtzeit-Visualisierung und Analyse von Chlamydia Einschlüsse. Diese Vakuole Visualisierung Ansatz eröffnet die leistungsfähige Möglichkeit, im Laufe der Zeit zu beleuchten, zu verfolgen und quantitativen Messung der dynamischen Eigenschaften von Chlamydieneinschlüsse in Populationen von Zellen oder in Einzelzellen. Chlamydia Einschlüsse in fluoreszierendem Protein markierte Zellen sind auffallend gut de...

Infektionskrankheiten durch Arten der intrazelluläre Bakterium Chlamydia verursacht entlocken eine große Belastung für die globale Gesundheit, einschließlich sexuell übertragbare Krankheit, entzündliche Erkrankungen des Beckens, Blindheit, Pneumonie und möglicherweise Atherosklerose 1-4. Die Fähigkeit von Chlamydia um mit der Wirtszelle wechselwirken, innerhalb einer Vakuole (genannt die Aufnahme), ist ein kritischer Faktor für die erfolgreiche Infektion von Zellen und dem Host. Die Aufnahme ist eine neuartige pathogenen Fach, die Chlamydien-Wachstum ermöglicht und wird dynamisch über die gesamte 2-3 Tag Entwicklungszyklus von Chlamydia 5 modifiziert. Die obligat intrazelluläre Natur der Chlamydien stellt zahlreiche Herausforderungen für die Forschung, insbesondere für direkt an das Studium der einzigartigen Biologie der Eingliederung. Ein großes Handicap war die Unfähigkeit, entweder intrazellulären Chlamydien oder ihre Aufnahme von Fluoreszenz Ansatz effizient visualisierenes in lebenden Zellen. Eine neue Entdeckung hat endlich enthüllt die Mittel, um GFP-exprimierenden C. generieren trachomatis 6; aber dieses Ergebnis noch nicht auf eine spezifische Markierung der Aufnahme geführt. Einige Techniken zur Markierung von Bakterien und Einschlüsse 7,8 beschrieben worden, aber sie Mängel auf, wie nicht-Spezifität transiency und die Anfälligkeit gegen Ausbleichung leiden. Ein Schlüssel Entdeckung von unserer Arbeitsgruppe gegründet, eine neue Strategie für die Beleuchtung der Aufnahme mit GFP-exprimierenden Wirtszellen 9. Diese Strategie rationell nutzt die intrinsische Undurchlässigkeit der Einschlußmembran bis größer als 520 Da 10 Molekülen. Wenn Zellen entwickelt, um stabil eine bestimmte cytosolische fluoreszierende Protein (zB GFP oder mCherry) zum Ausdruck bringen, sind Chlamydia Einschlüsse mit außergewöhnlicher Klarheit durch ihre vollständigen Ausschluss der Fluoreszenz sichtbar. Diese umgekehrte Imaging-Strategie ermöglicht eine sofortige Visualisierung von Einschlüssen für alle Chlamydia Arten und es kann leicht für die meisten Wirtszellen von Interesse angepasst werden. Als Demonstration der Nützlichkeit wurde dieses Verfahren bisher verwendeten zu offenbaren und zu definieren, die zellulären Austrittswege für Chlamydia spp 9. Hier haben wir weiter zu zeigen, wie dieses Verfahren durchgeführt wird, und kann genutzt werden, um Schlüssel quantitative Daten über die Aufnahme Wachstumsdynamik abgeleitet werden. Darüber hinaus kann sie wirksam für teure Antikörper-basierte Zählverfahren ersetzen und kann in Kombination mit anderen fluoreszierenden Markern, wie mKate2 exprimierenden Chlamydia 11 verwendet werden. Diese leistungsstarke Kombination von Werkzeugen ermöglicht Erforschung der physikalischen Eigenschaften des Chlamydien-Aufnahme-Membran im Inneren lebenden Wirtszellen.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &Mikro; m filter</td><td>Fisher</td><td>09-719D</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Invitrogen</td><td>10131</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 ohne phenolrot</td><td>Cellgro</td><td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G</td><td>Sigma</td><td>13752</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximid</td><td>Sigma</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Glasbodenschalen</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Objektkammern, Lab-Tek II</td><td>Nunc</td><td>154526, 154534</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung fluoreszierende proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren<em&gt; chlamydia</em&gt; vakuole wachstumsdynamik in lebenden zellen

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

Das obligate intrazelluläre Bakterium Chlamydia stellt eine große Belastung für die globale öffentliche Gesundheit dar. C. trachomatis ist die häufigste bakterielle Ursache für sexuell übertragbare Infektionen und auch die Hauptursache für vermeidbare Blindheit in der Welt. Eine wesentliche Determinante für eine erfolgreiche Infektion von Wirtszellen durch Chlamydien ist die Fähigkeit des Bakteriums, die Signalübertragung der Wirtszelle aus einem neuartigen, vakuolären Kompartiment, dem sogenannten Einschluss, zu manipulieren. Aus dem Einschluss erhalten Chlamydien die Nährstoffe, die für ihr 2-3-tägiges Entwicklungswachstum erforderlich sind, und sie sezernieren zusätzlich eine Reihe von Effektorproteinen auf die zytosolische Fläche der Vakuolenmembran und in das Zytosol des Wirts. Lücken in unserem Verständnis der Biologie der Chlamydien stellen jedoch erhebliche Herausforderungen für die Visualisierung und Analyse dieses intrazellulären Kompartiments dar. Kürzlich wurde eine Reverse-Imaging-Strategie zur Visualisierung des Einschlusses mit Hilfe von GFP-exprimierenden Wirtszellen beschrieben. Dieser Ansatz nutzt die intrinsische Undurchlässigkeit der Einschlussmembran für große Moleküle wie GFP rational aus. In dieser Arbeit beschreiben wir, wie GFP- oder mCherry-exprimierende Wirtszellen für die anschließende Visualisierung von Chlamydieneinschlüssen erzeugt werden. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass diese Methode kostspielige Antikörper-basierte Enumerationsmethoden effektiv ersetzt, zusammen mit anderen fluoreszierenden Markierungen, wie z. B. GFP-exprimierenden Chlamydien, verwendet werden kann und zur Ableitung wichtiger quantitativer Daten über das Wachstum der Einschlussmembran aus einer Reihe von Chlamydien-Spezies und -Stämmen genutzt werden kann.

Säugetierzellen, die cytosolische fluoreszierende Proteine ​​(zB GFP) kann konstruiert werden, um die Beleuchtung des Chlamydiaeinschlüssen einem lebenden, infizierten Zellkulturen zu ermöglichen. Nach Infektion mit Chlamydia, sind Einschlüsse leicht als schwarze Flecken in den Wirtszellen (Abbildung 1) sichtbar. Die Klarheit der fluoreszenz fehlt Einschlüsse für die automatisierte Identifikation der Einschlüsse in zahlreichen Bereichen und / oder den Behandlungen (Fig...

Ein auf lebenden Zellen basierendes Verfahren zur Beleuchtung von zellulären Vakuolen (Einschlüssen), die Chlamydien enthalten, wird beschrieben. Diese Strategie ermöglicht eine schnelle, automatisierte Bestimmung der Infektiosität von Chlamydien in Proben und kann zur quantitativen Untersuchung der Wachstumsdynamik des Einschlusses verwendet werden.

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wachstumsdynamik von Chlamydien-Inklusionen in lebenden Zellen sichtbar zu machen und quantitativ zu erfassen. Dies wird erreicht, indem zunächst fluoreszierende Wirtszellen erzeugt werden, die stabil ein fluoreszierendes Protein wie GFP im Zytoplasma exprimieren. Anschließend werden die Wirtszellen mit Chlamydien infiziert und zur Inkubation freigegeben. Anschließend werden die infizierten Zellen mittels Live-Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Schließlich werden die Merkmale der Chlamydien-Inklusionen durch eine mikroskopische Analyse-Software quantifiziert; letztendlich dient die Live-Fluoreszenzmikroskopie der Visualisierung von Chlamydien-Inklusionen innerhalb der Wirtszelle und der Messung biologischer Parameter der Inklusionen für quantitative Ergebnisse. Die wesentlichen Vorteile dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie der Antikörper-basierten Zählung liegen darin, dass diese umgekehrte Bildgebungsstrategie an lebenden Zellen angewendet werden kann und zudem in Kombination mit anderen fluoreszenten Markierungen zur Quantifizierung der Inklusionsdynamik aller Chlamydien-Spezies eingesetzt werden kann.Außerdem beleuchtet dieser Ansatz im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, die Bakterien in Zellen markieren, die Inklusionsmembran in lebenden Zellen und kann somit wichtige dynamische Eigenschaften dieses den Erreger enthaltenden Kompartiments aufzeigen. Nachdem fluoreszierende Hela-Zellen erzeugt wurden, entsprechend dem Textprotokoll, die GFP-Hela-Zellen auf einem gewünschten Kulturgefäß, wie z. B. Glasbodenkulturschalen für hochauflösende Bildgebung, 4- oder 24-Well-Platten zur IFU-Bestimmung und Mehrfach-Well-Screening, ausplattieren, eine gefrorene Röhrchenprobe mit Crich Cotus oder einem anderen gewünschten Chlamydien-Stamm auf Eis auftauen und in HBSS auf die gewünschte Multiplizität der Infektion verdünnen. Um eine statische Infektion mit Crich Cotus, LGV serovar L2 (LGV L2), durchzuführen, das Medium aus den Vertiefungen abpipettieren und die GFP-Hela-Zellen mit HBSS waschen.Gebe verdünnte Bakterien in die Vertiefungen und inkubiere zwei Stunden bei 25 Grad Celsius, saugt die Zellen ab und wasche mit HBSS. Danach füge Wachstumsmedium hinzu und inkubiere die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator, um eine zentrifugationsunterstützte Infektion mit crich zu Serovar D oder einem anderen Chlamydien-Stamm durchzuführen. Wasche die GFP-Hela-Zellen mit HBSS und gebe verdünnte Bakterien zu den Zellen.Danach die Schale mit infizierten Zellen in einen Multiwell-Plattenhalter eines Schwenkkorbrotors in einer Tischzentrifuge platzieren. Die Zellen eine Stunde lang bei 900 × g und 25 °C zentrifugieren. Anschließend die Kulturgefäße in einem Biosicherheitswerkbank in einen 37 °C warmen Kohlendioxid-Inkubator für eine Stunde stellen, die Zellen absaugen, zweimal mit HBSS waschen und Wachstumsmedium hinzufügen.Die Schale mit infizierten Zellen bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um Chlamydien-Inklusionen sichtbar zu machen, entfernen Sie die mit Chlamydien infizierten GFP-Hela-Zellen aus dem Kohlendioxid-Inkubator und ersetzen Sie das Medium durch RPMI ohne Phenolrot und mit 5 % FBS. Platzieren Sie die Schale oder die Mehrfach-Well-Platte auf einem umgekehrten Fluoreszenzmikroskop mit einer 20×- oder höheren Öl-Objektivlinse. Identifizieren Sie mithilfe der Bildgebungssoftware GFP-Hela-Zellen, die infiziert sind mit Chlamydien und als grüne Zellen mit großen schwarzen Löchern erscheinen.Stellen Sie im Dialogfeld zur Erfassungskonfiguration die Software so ein, dass sie den grünen Kanal und alle weiteren im Probenpräparat hinzugefügten Kanäle erfasst. Nutzen Sie die Aufnahme-/Aufzeichnungsschaltfläche, um das Bild zu den gewünschten Zeitpunkten nach der Infektion aufzuzeichnen. Entfernen Sie Chlamydien-infizierte GFP-Hela-Zellen aus dem Inkubator und platzieren Sie die Zellkulturplatte auf einem Invertierten Fluoreszenzmikroskop.Konzentrieren Sie sich auf die mittleren Ebenen der Zellen, in denen Einschlüsse ihren maximalen Durchmesser und Ertrag erreichen. Machen Sie Aufnahmen mit scharfen Kanten in mindestens 10 Feldern pro Vertiefung. Vertiefungen stellen typischerweise technische oder experimentelle Wiederholungen beziehungsweise Versuchsvariablen dar.Um die GFP-Hela-Zellen unter dem Reiter „Measurements“ zu finden, verwenden Sie den Befehl „Objekte finden“ und wählen den grünen Kanal aus. Passen Sie die Schwellenintensität basierend auf den relativen Intensitäten der Zellen an. Zählen Sie die Anzahl der Einschlüsse oder schwarzen Kompartimente und der GFP-Hela-Zellen manuell mit dem Auge oder verwenden Sie Algorithmen der Bildverarbeitungssoftware, um Einschlüsse automatisch zu identifizieren und zu zählen. Filtern Sie die ausgewählten Objekte, indem Sie nur jene beibehalten, die größer als fünf Quadratmikrometer sind. Bezeichnen Sie dies als Population eins. Wenden Sie auf dieser Population den Befehl zum Füllen von Löchern in Objekten an, wobei dieser Schritt als Eingabe Population zwei erzeugt.Subtrahieren Sie Population eins von Population zwei, um positiv markierte Chlamydien-Inklusionen zu erhalten, die als Population drei bezeichnet werden. Verwenden Sie den Befehl „Population filtern“, um einen Größenfilter auf Population drei anzuwenden. Behalten Sie beispielsweise bei Inklusionen in Zellen, die 24 Stunden oder länger infiziert waren, Objekte größer als 25 Quadratmikrometer bei frühen Infektionszeitpunkten; setzen Sie den Größenfilter so, dass Objekte größer als vier Quadratmikrometer beibehalten werden.Da diese Einschlüsse viel kleiner sind, führt der Größenfilter zu einer Population von Objekten, die als Einschlüsse bezeichnet werden. Verwenden Sie die Bildgebungssoftware, um quantitative Daten aus den Bildern zu berechnen, wie beispielsweise die Anzahl der Einschlüsse, die Größe der Einschlüsse und den Umfang der Einschlüsse. Nach einer Infektion mit Chlamydien sind Einschlüsse leicht als schwarze Punkte sichtbar, ebenso wie die Wirtszellen oder das fluoreszierende Protein exprimierende Chlamydien innerhalb der Wirtszellen, und ihre Klarheit kann zur automatisierten Identifizierung über zahlreiche Bildfelder und/oder Behandlungen hinweg genutzt werden.Wie in diesem Diagramm gezeigt, besteht eine wichtige Anwendung in der Bestimmung von Chlamydien-Inklusionsbildenden Einheiten in lebenden infizierten Zellen, wodurch aufwendige und kostspielige Immunfluoreszenzverfahren entfallen. Ein weiteres zentrales Merkmal dieses bildgebenden Ansatzes ist, dass er problemlos auf jede Chlamydien-Art oder -Stamm anwendbar ist. In diesem Beispiel wurde für jede dieser Arten und Stämme eine Zeitreihenanalyse von GFP-markierten Hela-Zellen durchgeführt, die mit einer von vier Chlamydien-Arten oder -Stämmen infiziert waren.Inklusionen wurden markiert und analysiert, um ihre durchschnittliche Fläche, Umfangslänge und Anzahl pro Zelle zu den angegebenen Zeitpunkten zu berechnen. Diese Merkmale liefern wichtige Informationen über die Biologie chlamydialer Inklusionen, einschließlich ihrer Wechselwirkungen mit der Wirtszelle. Gezeigt ist hier ein Video von mCherry-Hela-Zellen, die mit GFPC, Tracom L zwei infiziert wurden, bestehend aus Zeitrafferaufnahmen in Fünf-Minuten-Abständen über einen Zeitraum von 125 Minuten, beginnend 48 Stunden nach der Infektion.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese umgekehrte Bildgebungstechnik verwenden können, um nicht nur chlamydiale Inklusionen sichtbar zu machen, sondern auch deren Dynamik zu quantifizieren, beispielsweise die Fläche und den Umfang der Inklusionen sowie die Anzahl der Inklusionen pro Zelle. Diese Technik ist kostengünstiger im Vergleich zu traditionelleren Visualisierungsmethoden und funktioniert mit allen Chlamydien-Arten und -Stämmen.

using-fluorescent-proteins-to-visualize-quantitate-chlamydia-vacuole

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier zeigen wir die Protokolle für die Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie an lebenden Bakterienzellen, damit funktionale molekulare Komplexe detektiert werden, verfolgt und quantifiziert.

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Quelle: Chetrit, D., et al. Anwendung von Live-Zell-Bildgebung und Kryo-Elektronen-Tomographie zur Auflösung raumzeitlicher Merkmale des Sekretionssystems Legionella pneumophila dot/icm. J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video demonstriert die Herstellung und Bildgebung fluoreszierend markierter pathogener Bakterien. Agarose-Pads werden zunächst vorbereitet und in einem klebrigen Rahmen positioniert. Eine Suspension von genetisch veränderten Bakterien, die ein fluoreszierendes Protein exprimieren,...

Probenvorbereitung und Bildgebung fluoreszenzmarkierter Bakterien

Wir beschreiben die bildgebenden Verfahren verwenden wir, um die Verteilung und Mobilität der transfizierten fluoreszierenden Proteinen in das endoplasmatische Retikulum (ER) mittels des konfokalen Abbildung von lebenden Zellen resident untersuchen. Wir haben auch ultrastrukturell analysieren die Wirkung ihrer Expression auf die Architektur dieser subzellulären Kompartiment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

Studien von Biomolekülen in vivo sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Funktion in einem biologischen Kontext. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, die es ermöglicht, fluoreszierende Biomoleküle, wie DNA oder Proteine, in lebende Mikroorganismen zu internalisieren. Die Analyse von in vivo-Daten, die durch Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, wird ebenfalls vorgestellt und diskutiert.

Internalisierung und Beobachtung von Fluoreszenz Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen durch Elektroporation

Eine genaue Quantifizierung vesikulärer Transportereignisse liefert oft wichtige Einblicke in die Rolle bestimmter Proteine und die Auswirkungen von Mutationen. In diesem Artikel werden Methoden zur Verwendung von superekliptikem pHluorin, einer pH-sensitiven GFP-Variante, als Werkzeug zur Quantifizierung endozytärer Ereignisse in lebenden Zellen mittels quantitativer Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie vorgestellt.

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Verständnis der Funktion der wesentlichen Prozesse in Bakterien ist eine Herausforderung. Fluoreszenz-Mikroskopie mit zielgruppenspezifischer Farbstoffe kann wichtige Einblicke in mikrobiellen Zelle Wachstum und Zellzyklus Fortschreiten geben. Hier wird Agrobacterium Tumefaciens als ein Modell-Bakterium verwendet, um Methoden für das live Cell Imaging zur Charakterisierung der wesentlichen Prozesse zu markieren.

Live Cell Fluoreszenzmikroskopie um wesentliche Vorgänge während der mikrobiellen Zellwachstum beobachten

Dieser Artikel enthält eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Untersuchung der subzellulären Lokalisierungsdynamik von Proteinen und zur Überwachung morphologischer Veränderungen mithilfe der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie in Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus.

Live-Cell Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung subzellulärer Proteinlokalisierung und Zellmorphologie Veränderungen in Bakterien

Vitale Fluoreszenzfarbstoffe sind wesentliche Werkzeuge für livezellbildende Analysen in der modernen Pilzzellbiologie. Dieses Papier beschreibt die Anwendung etablierter und weniger bekannter Fluoreszenzfarbstoffe zur Verfolgung der Plasmamembrandynamik, Endo-/Exozytose und Zellwandmorphogenese in fadenförmigen Pilzen.

Anwendung von Membran- und Zellwandselektiven Fluoreszenzfarbstoffen für die Live-Zell-Bildgebung von filamentösen Pilzen

Die Bildgebung von Bakterienzellen ist ein aufkommendem systembiologischen Ansatz, der sich auf die Definition statischer und dynamischer Prozesse konzentriert, die die Funktion großer makromolekularer Maschinen diktieren. Hier wird die Integration von quantitativer Live-Zell-Bildgebung und Kryo-Elektronentomographie verwendet, um Legionella pneumophila Typ IV Sekretionssystemarchitektur und -funktionen zu untersuchen.

Anwendung von Live Cell Imaging und Cryo-Electron Tomography zur Auflösung der raumzeitlichen Merkmale des Legionella pneumophila Dot/Icm Sekretionssystems

Dieses Protokoll verwendet fluoreszierende Promotor-Reporter, Live-Zell-Mikroskopie und individuelle Inklusionsextraktion in einem gerichteten vorwärts genetischen Ansatz, um Entwicklungsmutanten von Chlamydia trachomatiszu identifizieren und zu isolieren.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

Erfahren Sie, wie Sie Chlamydia-Inklusionsdynamik in lebenden Zellen mit fluoreszierenden Proteinen visualisieren und quantifizieren. Diese Methode ermöglicht Echtzeitanalyse der Infektionsbiologie.

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren Chlamydia Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen (Video) | JoVE Journal

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren

Weitere Videos entdecken