Humanisierten Maus-Modell, um bakterielle Infektionen Studieren Targeting der Mikrogefäß

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Mechanismen zu untersuchen, durch die die Bakterien, die Meningitis verursachen, menschliche Blutgefäße in vivo infizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst menschliche Haut auf eine immundefiziente Maus transplantiert wird, wodurch menschliche dermale Blutgefäße eingeführt werden. Im zweiten Schritt werden die humanisierten Mäuse mit den Bakterien infiziert.

Die Infektion wird anschließend über einen vorbestimmten Zeitraum fortschreiten gelassen. Im letzten Schritt werden Blut- und Gewebeproben gewonnen, um das Ergebnis der Infektion zu bewerten. Letztendlich kommt eine Kombination aus Histologie, Immunfluoreszenz sowie Blut- und Gewebeanalyse zum Einsatz, um das Fortschreiten der Infektion in den menschlichen Gefäßen zu untersuchen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie Zellkulturanmodellen oder Tierversuchsmodellen besteht darin, dass wir erstmals die typische klinische Pathologie beobachten können, die während dieser Infektionen auftritt. Reinigen Sie die menschliche Hautoberfläche so bald wie möglich nach der Entnahme mit 70 %igem Ethanol und legen Sie sie dann flach auf eine saubere Oberfläche, vorzugsweise unter einer Flusshaube. Verwenden Sie anschließend einen Dermatom mit voreingestellter Dicke, um 200 bis 400 Mikrometer dicke Scheiben von der Hautoberseite abzuschneiden.

Überprüfen Sie die Schnitte auf Integrität und schneiden Sie sie anschließend in zwei mal zwei Zentimeter große Quadrate zurecht. Legen Sie die Quadrate in PBS und reinigen Sie anschließend die rasierte Fläche eines chirurgisch vorbereiteten, anästhesierten sechs bis acht Wochen alten schwer kombiniert immundefizienten beige-Maus mit 70 %igem Ethanol. Nach der Applikation eines Lokalanästhetikums auf die Transplantationsstelle entfernen Sie mit einer gebogenen Schere vorsichtig die oberflächliche Hautschicht der Maus in einem Bereich, der etwas kleiner ist als die Transplantatstücke, wobei Sie darauf achten, die darunterliegende Gefäßversorgung nicht zu stören.

Um eine Austrocknung des Transplantats zu vermeiden, platzieren Sie schnell eine der menschlichen Hautscheiben auf der Transplantatunterlage, wobei die epidermale Seite nach oben zeigen muss. Richten Sie die Kante des Gewebes aus und befestigen Sie es mit Gewebekleber. Passen Sie dann vorsichtig den Rest der menschlichen Haut an die Transplantatunterlage an, indem Sie kleine Mengen Gewebekleber um jede Kante herum auftragen.

Schneiden Sie die menschliche Haut immer passend zur Größe zu, anstatt das Transplantatbett zu vergrößern. Nachdem bestätigt wurde, dass jede Ecke fixiert ist, reinigen Sie die Stelle mit einer Jodlösung und bringen Sie ein Pflaster fest, aber nicht zu straff auf, wobei die Polsterseite über dem Transplantat liegen soll. Achten Sie darauf, dass die Atmung des Tieres nicht beeinträchtigt wird. Befestigen Sie das Pflaster anschließend mit Verbandklebeband und lassen Sie das Tier auf einer warmen Unterlage wieder zu sich kommen. Sobald das Tier wach ist, bringen Sie es in seinen Käfig zurück, bis die bakterielle Injektion eine Übernachtkultur auf einer Platte erneut in eine Flüssigkultur überführt.

Am Morgen der Infektion, wenn die Bakterien die gewünschte Konzentration erreicht haben, verdünnen Sie die Zellen auf einen mal 10 hoch 7 Kolonie-bildende Einheiten pro Milliliter. Danach überprüfen Sie nach der Anästhesie die Sedierung der engrafteten Mäuse durch Zehenquetschung und stellen die Tiere auf eine Wärmematte.

Tragen Sie Augensalbe auf die Augen des Tieres auf und injizieren Sie dann jedes Maus intraperitoneal mit acht Milligramm humanem Transfer in Salzlösung. Schneiden Sie anschließend bei jedem Tier die Schwanzspitze ab und verteilen Sie einen kleinen Tropfen Blut vom Schwanz auf einer Agarplatte, um zu bestätigen, dass das Blut vor der Infektion steril ist.

Injizieren Sie anschließend 100 µL der Bakterienkultur intravenös mittels retroorbitärer Injektion. Nach einigen Minuten schneiden Sie erneut das Ende des Schwanzes ab und streichen diese Blutprobe ebenfalls auf frische Agarplatten aus. Um die Anzahl der koloniebildenden Einheiten im Blut unmittelbar nach der Infektion zu bestimmen, verschließen Sie den Schwanz mit Gewebeleim und verdünnen anschließend das bakterielle Inokulum, das Sie auf Agarplatten mit den entsprechenden Antibiotika ausplattieren.

Um die Anzahl der koloniebildenden Einheiten des Inokulums sechs Stunden nach der Infektion zu bestimmen, entnehmen Sie erneut eine kleine Menge Blut aus den Schwänzen der Mäuse und verdünnen sowie impfen Sie die Blutstropfen wie zuvor gezeigt ab, um die koloniebildenden Einheiten nach sechs Stunden zu ermitteln. Inkubieren Sie anschließend alle Platten über Nacht bei 37 °C in 5 % Kohlendioxid, um die koloniebildenden Einheiten in den Organen zu bestimmen. Zählung der Einheiten bei den infizierten Tieren.

Beginnen Sie mit einem medianen Schnitt an jeder euthanasierten Maus. Schneiden Sie dann bei jedem Tier durch den Rippenbogen und führen einen Schnitt im Herzen durch. Entnehmen Sie mithilfe einer sterilen Spritze so viel Blut wie möglich aus dem Herzen und der Brusthöhle und geben Sie es in einzelne sterile Röhrchen für jede Probe ab.

Entfernen Sie anschließend die gewünschten Organe und überführen Sie die Hauttransplantate zusammen mit den entsprechenden Hautabschnitten der Maus auf eine sterile Platte pro Tier. Lassen Sie das gesammelte Blut 15 Minuten lang gerinnen und zentrifugieren Sie es danach. Entfernen Sie anschließend das Plasma aus dem Blut und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius für spätere Analysen.

Als Nächstes Homogenisiergefäße wiegen, die jeweils 500 µL PBS enthalten. Anschließend mit einer sterilen Biopsielösepunze vier Millimeter große Biopsieproben aus jedem präparierten Gewebe entnehmen. Die Biopsien einzeln in die Homogenisiergefäße geben, wobei sich in jedem Gefäß, das eine Hautprobe enthält, eine zwei Millimeter große Kugel befindet.

Bewahren Sie die verbleibenden Gewebeproben für die Mikroskopie in 4 % Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius auf und wiegen Sie die Homogenisiergefäße, um das Biopsiegewicht zu bestimmen. Anschließend homogenisieren Sie die Proben bei 6.000 U/min für 30 Sekunden und wiederholen die Haut-Homogenisierung, bis das Homogenat bröcklig ist. Verteilen Sie schließlich die Zellsuspensionen aus jedem Gefäß auf frische Agarplatten und kultivieren Sie die Ansätze über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid.

Um die Anzahl der koloniebildenden Einheiten in diesen repräsentativen Ergebnissen zu bestimmen, wurde ein GFP-positiver Stamm von N. meningitidis, Serogruppe C, verwendet.

Die Blutuntersuchungen zeigten, dass fünf Minuten nach der intravenösen Injektion von 1 × 10⁶ koloniebildenden Einheiten Bakterien durchschnittlich 1,5 × 10⁵ koloniebildende Einheiten pro Milliliter im Blut zirkulierten. Nach sechs Stunden betrug der Durchschnitt 4,8 × 10⁴ koloniebildende Einheiten pro Milliliter, nach 24 Stunden waren es durchschnittlich 2,4 × 10⁴ koloniebildende Einheiten pro Milliliter.

Doch in dieser Gruppe von 10 Mäusen hatten fünf keine nachweisbaren zirkulierenden Bakterien, während die anderen fünf relativ hohe Keimzahlen aufwiesen. Diese Balken in den Diagrammen zeigen die Medianwerte der CFU-Zahlen jeder Gruppe, die aus der Haut gewonnen wurden. Die Proben zeigen, dass die Mehrheit der Mäuse beträchtliche Keimzahlen in der menschlichen Haut aufweist, mit durchschnittlich 2,1 × 10⁴ CFU pro Milligramm Gewebe nach sechs Stunden und 4,4 × 10² CFU pro Milligramm Gewebe nach 24 Stunden.

Die kontralateralen Maushautproben zeigten nach 24 Stunden keine bakteriellen Keimzahlen und erst nach sechs Stunden eine sehr geringe Anzahl, was die starke Präferenz für eine Endmeningitis in den menschlichen Gefäßen des transplantierten Gewebes belegt. Im Allgemeinen waren die bakteriellen Keimzahlen in den anderen entnommenen Organen sehr gering bis nicht nachweisbar, obwohl bei zwei Tieren Keimzahlen festgestellt wurden, die möglicherweise mit hohen zirkulierenden Bakterienzahlen korrelieren. Dieses Modell kann ebenfalls verwendet werden, um die Rolle von Virulenzfaktoren in vivo zu bestimmen.

Beispielsweise wurden in diesem Experiment bakterielle Stämme verwendet, die über keine funktionellen Typ-Vier-Pilli I verfügten; Mäuse, die mit diesen mutierten Stämmen infiziert wurden, wiesen keine bakterielle Adhärenz in den humanen Hauttransplantaten auf, was die entscheidende Rolle von Typ-Vier-Pilli I bei der Adhärenz in vivo bestätigt. In diesen konfokalen Aufnahmen eines Hauttransplantats zwei Stunden nach der Infektion sind humane Gefäße sichtbar, die mit dem mit Rhodamin konjugierten Lektin UEA angefärbt wurden. Die Grenze zwischen Epidermis und Dermis ist deutlich erkennbar, und die infizierenden, GFP-positive Bakterien sowie Meningokokken sind deutlich in den Gefäßen sichtbar.

Diese mit H und E gefärbte humane Hauttransplantatprobe zeigt Entzündungen und vaskuläre Lecks sowie eine auf Gefäße nahe der epidermalen Dermis-Grenze konzentrierte Thrombose. 24 Stunden nach der Infektion führten bei etwa 30 % der Infektionen bakterielle Adhäsionen in der Haut zur Entwicklung makroskopisch erkennbarer Purpura. Die Entwicklung dieser Technik ebnet daher Forschern, die an der Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen beteiligt sind, den Weg, die Krankheitsmechanismen im Kontext menschlicher Gefäße zu erforschen.