Humanisierten Maus-Modell, um bakterielle Infektionen Studieren Targeting der Mikrogefäß

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Mechanismen zu untersuchen, mit denen das Bakterium neer Meningitis menschliche Blutgefäße in vivo infiziert. Dies wird erreicht, indem zunächst menschliche Haut auf eine immundefiziente Maus transplantiert wird, wodurch menschliche dermale Blutgefäße eingeführt werden. Im zweiten Schritt werden die humanisierten Mäuse mit den Bakterien infiziert.

Die Infektion wird dann für einen bestimmten Zeitraum fortgesetzt. Im letzten Schritt werden Blut- und Gewebeproben entnommen, um den Ausgang der Infektion zu bewerten. Letztendlich wird eine Kombination aus Histologie, Immunfluoreszenz sowie Blut- und Gewebeanalyse verwendet, um das Fortschreiten der Infektion in den menschlichen Gefäßen zu untersuchen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie Zellkulturmodellen oder Tiermodellen besteht darin, dass wir zum ersten Mal die typische klinische Pathologie beobachten können, die bei diesen Infektionen stattfindet. Reinigen Sie die menschliche Hautoberfläche so bald wie möglich nach der Entnahme mit 70 % Ethanol und legen Sie sie dann flach auf eine gut gereinigte Oberfläche, vorzugsweise unter einer Strömungshaube. Verwenden Sie anschließend ein Dermatom mit einer voreingestellten Dicke, um 200 bis 400 Mikrometer große Scheiben von der Oberseite der Haut abzuschneiden.

Überprüfen Sie die Scheiben auf Unversehrtheit und schneiden Sie sie dann weiter in zwei mal zwei Zentimeter große Quadrate ab. Legen Sie die Quadrate in PBS und reinigen Sie dann den rasierten Bereich einer chirurgisch vorbereiteten sechs bis acht Wochen alten, schwer immundefizienten beigen Maus mit 70% Ethanol. Entfernen Sie nach dem Auftragen eines Lokalanästhetikums auf die Transplantatstelle mit einer gebogenen Schere vorsichtig die oberflächliche Schicht der Maushaut in einem Bereich, der etwas kleiner als die Transplantatstücke ist, und achten Sie darauf, das darunter liegende Gefäßsystem nicht zu stören.

Um ein Austrocknen des Transplantats zu vermeiden, legen Sie einen der menschlichen Hautscheiben über das Transplantatbett und stellen Sie sicher, dass die epidermale Seite nach oben zeigt. Richten Sie den Rand des Taschentuchs aus und fixieren Sie es mit Gewebekleber. Passen Sie dann vorsichtig den Rest der menschlichen Haut an das Transplantatbett an und geben Sie kleine Mengen Gewebekleber um jede Kante.

Schneiden Sie die menschliche Haut immer auf die richtige Größe zu, anstatt das Transplantatbett zu vergrößern. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass jede Ecke fixiert ist, reinigen Sie den Bereich mit einer Jodlösung und legen Sie ein Pflaster fest, aber nicht fest mit der Kissenseite über das Transplantat, wobei Sie darauf achten, dass die Atmung des Tieres nicht beeinträchtigt wird, befestigen Sie dann das Pflaster mit Verbandsband und lassen Sie das Tier sich auf einer warmen Oberfläche erholen. Sobald das Tier wach ist, bringen Sie es bis zur bakteriellen Injektion in seinen Käfig zurück, inokulieren Sie eine Plattenkultur über Nacht in eine Flüssigkultur.

Am Morgen der Infektion, wenn die Bakterien die gewünschte Konzentration erreichen, verdünnen Sie die Zellen auf eins mal 10 bis sieben koloniebildende Einheiten pro Milliliter. Bestätigen Sie dann nach der Anästhesie die Sedierung der transplantierten Mäuse durch die Zehe. Kneifen Sie die Tiere und legen Sie sie auf ein Heizkissen.

Tragen Sie Augensalbe auf die Augen des Tieres auf und dann ip. Injizieren Sie jeder Maus acht Milligramm menschlichen Transfer in Kochsalzlösung. Schneiden Sie dann für jedes Tier die Spitze des Schwanzes ab und verteilen Sie einen kleinen Tropfen Blut aus dem Schwanz auf eine Agarplatte, um zu bestätigen, dass das Blut vor der Infektion steril ist.

Injizieren Sie dann 100 Mikroliter der Bakterienkultur intravenös per retroorbitaler Injektion. Schneiden Sie nach einigen Minuten das Ende des Schwanzes wieder ab und verteilen Sie diese Blutprobe ebenfalls auf frischen Agarplatten. Um die blutkoloniebildenden Einheiten unmittelbar nach der Infektion zu etablieren, versiegeln Sie den Schwanz mit Gewebekleber und verdünnen Sie dann das bakterielle Inokulum und verteilen Sie es mit den entsprechenden Antibiotika auf Agarplatten.

Um die koloniebildenden Einheiten des Inokulums sechs Stunden nach der Infektion zu etablieren, entnehmen Sie jedem der Mäuseschwänze eine weitere kleine Menge Blut und verdünnen und plattieren Sie dann die Blutstropfen, wie gerade gezeigt, um die koloniebildenden Einheiten nach sechs Stunden zu etablieren. Inkubieren Sie dann alle Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid, um die Bildung einer Organkolonie durchzuführen. Stückzahlen der infizierten Tiere.

Beginnen Sie damit, bei jeder euthanasierten Maus einen Mittellinienschnitt zu machen. Schneiden Sie dann für jedes Tier die Rippe durch und machen Sie einen Schnitt im Herzen. Verwenden Sie eine sterile Spritze, um so viel Blut wie möglich aus der Herz- und Brusthöhle zu entnehmen, und geben Sie es für jede Probe in einzelne sterile Röhrchen ab.

Entfernen Sie anschließend die interessierenden Organe und übertragen Sie dann die Hauttransplantate und die zugehörigen Abschnitte der Maushaut auf eine sterile Platte pro Tier. Lassen Sie das gesammelte Blut 15 Minuten lang gerinnen und schleudern Sie es dann nach unten. Anschließend entnehmen Sie das Plasma aus dem Blut und lagern es bei minus 80 Grad Celsius für die spätere Analyse.

Wiegen Sie anschließend Homogenisierröhrchen mit jeweils 500 Mikrolitern PBS. Und dann verwenden Sie einen sterilen Biopsiestanzer, um vier Millimeter Biopsieproben von jedem präparierten Gewebe zu entnehmen. Legen Sie die Biopsien einzeln in die Homogenisierungsröhrchen, wobei sich in jedem Röhrchen eine zwei Millimeter große Kugel befindet, die eine Hautprobe enthält.

Lagern Sie das restliche Gewebe in 4%para-Formaldehyd bei vier Grad Celsius für die Mikroskopie und wiegen Sie die Homogenisierröhrchen, um das Biopsiegewicht zu bestimmen. Homogenisieren Sie dann die Proben 30 Sekunden lang bei 6.000 U/min und wiederholen Sie die Hauthomogenisierung, bis das Homogenat kackig ist. Zum Schluss verteilen Sie die Zellschlämme aus jedem Röhrchen auf frische Agarplatten und züchten die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid.

Um die Organkolonie-bildende Einheit zu ermitteln, zählen diese repräsentativen Ergebnisse. Ein GFP-positiver Stamm der N-Meningitis. Es wurde die Serogruppe C verwendet.

Blutbilder zeigten, dass fünf Minuten nach der intravenösen Injektion von einer mal 10 in die sechs koloniebildenden Einheiten von Bakterien durchschnittlich 1,5 mal 10 bis fünf koloniebildende Einheiten pro Milliliter im Blut zirkulierten. Nach sechs Stunden betragen die Zählungen durchschnittlich 4,8 mal 10 bis zur vierten koloniebildenden Einheit pro Milliliter nach 24 Stunden. Die durchschnittlichen Zählungen betrugen 2,4 mal 10 bis zur vierten koloniebildenden Einheiten pro Milliliter.

Aber in dieser Gruppe von 10 Mäusen hatten fünf keine nachweisbaren zirkulierenden Bakterien, während die anderen fünf relativ hohe Zahlen aufwiesen. Diese Balken in diesen Diagrammen zeigen die Medianwerte für jede Gruppe von KBE-Zahlen, die aus der Haut entnommen wurden. Proben zeigen, dass die Mehrheit der Mäuse beträchtliche Zählungen in der menschlichen Haut aufweist, durchschnittlich 2,1 mal 10 bis zur vierten KBE pro Milligramm Gewebe nach sechs Stunden und 4,4 mal 10 bis zur zweiten KBE pro Milligramm Gewebe nach 24 Stunden.

Die kontralateralen Hautproben der Maus wiesen nach 24 Stunden keine Keimzahlen und nach sechs Stunden nur eine sehr niedrige Anzahl auf, was die starke Präferenz für die Endmeningitis gegenüber den menschlichen Gefäßen im transplantierten Gewebe zeigt. Im Allgemeinen waren die Keimzahlen in den anderen untersuchten Organen sehr niedrig bis nicht nachweisbar, obwohl zwei Tiere Zahlen zeigten, die mit einer hohen Anzahl zirkulierender Bakterien korrelieren könnten. Dieses Modell kann auch verwendet werden, um die Rolle von Virulenzfaktoren in vivo zu bestimmen.

Zum Beispiel wurden in diesem Experiment Bakterienstämme ohne funktionelle Typ-4-Pille I verwendet: Mäuse, die mit diesen mutierten Stämmen infiziert waren, zeigten keine bakterielle Adhäsion in den menschlichen Hauttransplantaten, was die entscheidende Rolle der Typ-4-Pille I bei der Adhäsion in vivo bestätigt. In diesen konfokalen Bildern einer Hauttransplantation sind zwei Stunden nach der Infektion menschliche Gefäße zu sehen, die mit Lektin UEA-konjugiertem Romin gefärbt sind. Der epidermale Hautrand der Haut ist klar erkennbar und die infektiöse GFP-positive und Meningitis ist in den gesamten Gefäßen deutlich zu beobachten.

Dieses mit H und E gefärbte menschliche Hauttransplantat weist Entzündungen und Gefäßlecks auf, ebenso wie die Thrombose, die sich auf Gefäße nahe der epidermalen Hautgrenze konzentriert. 24 Stunden nach der Infektion führten bei etwa 30% der Infektionen bakterielle Adhäsionen in der Haut zur Entwicklung einer makroskopisch nachweisbaren Purpura. Die Entwicklung dieser Technik ebnet also den Weg für Forscher, die an der Erforschung und Interaktion zwischen Krankheitserregern beteiligt sind, um die Mechanismen von Krankheiten im Zusammenhang mit menschlichen Gefäßen zu untersuchen.