Name: Humanisierten Maus-Modell, um bakterielle Infektionen Studieren Targeting der Mikrogefäß (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-01T15:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Erfahren Sie, wie Neisseria meningitidis menschliche Blutgefäße in humanisierten Mäusen infiziert. Diese Methode nutzt Hauttransplantationen, um Infektionsmechanismen und vaskuläre Schäden in vivo zu untersuchen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Die Autoren bedanken sich alle Mitglieder der Dumenil Labor, insbesondere Silke Silva für das kritische Lesen des Manuskripts danken. Die chirurgische Abteilung im Hôpital Européen Georges Pompidou (HEGP), Dr. David Maladry. Michael Hivelin und Dr. Patrick Bruneval, Pathologie-Abteilung an HEGP. Die Tierhaltung in PARCC von Elizabeth Huc geleitet. Diese Arbeit wurde durch die folgenden Zuschuss Agenturen unterstützt: Marie-Curie-Stipendium IEF-Nr. 273.223 (KM), ATIP-Avenir Grant von INSERM, CODDIM Ausrüstung Zuschuss (Region Ile de France), FRM (Fondation pour la recherche médicale) Ausrüstung gewähren, die IBEID Laboratory der Exzellenz-Konsortium, ANR (Agence Nationale pour la Recherche) grant &quot; Bugs-in-flow &quot;. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts.

1. Risiken und Berechtigungen <ol><li> Lokale Ethik-Kommissionen müssen alle Tier Protokolle genehmigen. Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien von den Französisch und europäischen Vorschriften für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Décrets 87-848, 2001-464, 2001-486 und 2001-131 und etablierte durchgeführt EU-Richtlinie 2010/63/UE) und von der lokalen Ethikkommission Comité d&#39;en matière d&#39;Ethique Expérimentation Animale, Universite Paris Descartes, Paris, Frankreich zugelassen. No: CEEA34.GD.002.11. </li><li> Für die menschliche Haut, geschrieben wurde, informierte Patient Zustimmung erhalten und alle Verfahren wurden durchgeführt, nach Französisch nationalen Richtlinien und durch die lokale Ethikkommission, Comité d&#39;Bewertung Ethique de l&#39;INSERM IRB 00003888 00005881 FWA, Paris, Frankreich Stellungnahme zugelassen: 11-048 . </li><li> N. meningitidis ist ein potenziell schädlichen menschlichen Krankheitserreger und alle notwendigen Vorsichtsmaßnahmen bei der Handhabung der orga genommen werdennismus. Zu diesen Vorsichtsmaßnahmen gehören die Impfung und Arbeiten unter Biosafety Level 2 Bedingungen. </li></ol> 2. Skin Graft <ol><li> Sammeln der menschlichen Haut so nah wie möglich Pfropfen. Die Mehrheit der Haut in dieser Arbeit kommt von Schönheitsoperationen, die die Bauchbereich. Andere Quellen, wie Brust-, Bein-und sogar Fläche mit Erfolg verwendet worden. </li><li> Bereiten Sie die Probe menschlichen Haut durch die Reinigung der Hautoberfläche mit 70% EtOH und es flach liegend auf einem gut gereinigten Oberfläche, vorzugsweise unter einem Fluss Kapuze. </li><li> Schneiden 200-400 um Scheiben von der Spitze der Haut mit einem Dermatom mit vorgegebenen Dicke. </li><li> Überprüfen Sie die Haut Scheiben für Integrität und schneiden sie in 2 cm x 2 cm große Quadrate, dann in PBS (ohne zweiwertigen Kationen), wenn sie sofort oder bei 4 ° C in DMEM Pfropfen mit 10% Serum für die kurzfristige Lagerung (3-12 h ). </li><li> Betäuben 6-8 Wochen alten SCID.bg Mäuse (etwa 20 g) mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) injeCTED ip </li><li> Sobald die Mäuse narkotisiert werden, überprüfen Sie die Schmerzreaktion durch Ausführen einer Zehe Prise, ein Standardverfahren zur Gründung Schmerzreflex. Gel auf die Augen, um ein Austrocknen zu verhindern Hornhaut und rasieren die linke Seite des Tieres hinter der Schulter, wo das Implantat platziert wird. Halten Sie die Maus warm an einem Heizkissen während des gesamten Verfahrens. </li><li> Nach prepping Maus für Chirurgie, reinigen Sie die rasierte Fläche mit 70% EtOH. </li><li> Anwenden lokaler Betäubung topisch auf die Transplantationsstelle (Tronothane) und bereiten die Transplantationsstelle durch vorsichtiges Entfernen der Oberflächenschicht der Haut von Mäusen mit einem Paar von gebogenen Schere. Achten Sie darauf, um die zugrunde liegende Gefäßsystem zu stören. </li><li> Haut in einem Bereich ein wenig kleiner als der Bereich der menschlichen Haut Scheibe zu entfernen. </li><li> Haut entfernen Scheibe von PBS (oder DMEM) und legen über Transplantatbett, Sicherstellung der epidermalen Seite nach oben zeigt. 2,8-2,10 Schritte sollten so schnell wie möglich durchgeführt werden, wodurch das Transplantat Bett nicht austrocknet. </li><li> Richten Sie eine Eckeoder Kante und fix mit Gewebekleber. Den Rest der Haut vorsichtig Scheibe passen, um das Transplantat Bett, indem kleine Mengen von Gewebekleber an den Rändern. Immer trimmen die menschliche Haut zu Größe eher als machen das Transplantat Bett größer. </li><li> Die Haut Ziehen Sie nicht zu fest auf das Transplantatbett, wie die Maus Haut ist sehr flexibel. </li><li> Stellen Sie sicher, dass das Transplantat wird mit Gewebekleber in jeder Ecke befestigt. </li><li> Reinigen Sie den Bereich mit einer Jod-Lösung. </li><li> Tragen Sie eine Band-Aid mit dem Polsterbereich über dem Transplantat. Stellen Sie sicher, dass die Band-Aid ist fest, aber nicht zu eng, und dass das Tier die Atmung nicht beeinträchtigt wird. </li><li> Befestigen Sie das Band-Aid mit Dressing Band. </li><li> Lassen Sie das Tier auf einer warmen Oberfläche zu erholen. </li><li> Einmal wach, bringen Sie das Tier in seinen Käfig. Tiere untergebracht sind 2-3 pro Käfig. </li><li> Überprüfen Sie regelmäßig Mäuse während der Wiederherstellung auf Anzeichen von Schmerzen oder Leiden. 10-14 Tage nach der Transplantation, entfernen Sie das Band-Aid, darauf achten, daß das Transplantat zu stören. Nach unserer Erfahrung ist die postoperative Schmerz minimal. Dennoch Tiere sollten jeden Tag vor allem in den Tagen nach der Operation überwacht werden. Kriterien für die Schmerzen oder Leiden sind die folgenden. <ul><li> Gewichtsverlust über 10% </li><li> Erscheinungsbild, Pelz, Bucklige Position, die Augen </li><li> Erhöhte Atmung oder Herzfrequenz </li><li> Verminderte oder ungewöhnliche Bewegungen. </li><li> Anstieg der Körpertemperatur </li><li> Wurden Anzeichen von Schmerzen festgestellt werden paracetamole oral verabreicht (300 mg / kg, alle 4 h). Humane Endpunkte werden streng auf, wenn die Schmerzen länger haften. </li></ul></li><li> Wenn das Transplantat trocken aussieht Babyöl gelten alle 2-3 Tage, um die Haut geschmeidig zu halten. </li><li> Das Transplantat ist bereit für Experimente 21 Tage nach Transplantats. </li></ol> 3. Infektion <ol><li> Der Tag vor der Infektion, bereiten Bakterienstamm durch Ausstreichen auf GCB-Agar-Platten mit entsprechenden Antibiotika. Wachsen über Nacht bei 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Bakterienpräparat <ol&gt; <li> Reinoculate Bakterien in 5 ml menschliches Endothel SFM-Medium mit 10% Serum bis zu einer OD 600 von 0,05. </li><li> Inkubiere unter Schütteln für 2 h im Brutschrank (37 ° C in 5% CO 2) mit losem Deckel, bis eine Bakteriendichte von ungefähr 0,1 OD 600. </li><li> Zentrifugieren Sie die Bakterien für 3 min 15.000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Überstand entfernen und Resuspension in PBS, dann wieder zentrifugiert. </li><li> Wiederholen Sie den Waschschritt (2.2.4-2.2.5) zweimal. </li><li> Resuspendieren Bakterienpellet in PBS. </li><li> Messen OD 600. </li><li> Einen Kultur entweder OD 600 0,1 (10 8 CFU / ml) oder OD 600 1,0 (10 9 CFU / ml). Von diesem bekannten Konzentration verdünnen bis 10 7 CFU / ml. Versuchen Sie, Bakterien so nah an Einspritzzeit wie möglich vorzubereiten. </li></ol></li><li> Mäuse <ol><li> Wiegen Mäusen. </li><li> Mäuse anästhesiert mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) injiziert ip </li><li> Einmal eingeschlafen, cTeufel, dass die Schmerzreaktion ist von einem Zehen Prise fehlt, halten die Mäuse warm mit einem Heizkissen und legte Augensalbe auf, um das Trocknen zu verhindern. </li><li> Geben Sie jedem Maus 8 mg Humantransferrin, in Kochsalzlösung oder PBS, ip injiziert </li><li> Nehmen Sie einen kleinen Tropfen Blut aus dem Schwanz und verteilt auf einer Agar-Platte, um zu überprüfen Blut ist steril vor der Infektion. </li><li> Injizieren von 100 &amp;mgr; l 10 7 CFU / ml Bakterienkultur (10 6 CFU gesamt) intravenös über die retroorbitale oder Schwanzvene. Messungen der CFU genommen 5 Minuten nach der Injektion sind konsistent, unabhängig von der Injektionsstelle. </li><li> Nach ein paar Minuten, schnipp das hintere Ende und breitete Blutprobe auf Agar-Platten mit entsprechenden Antibiotika mit einer 10-fachen Verdünnung, um den Blut CFU etablieren unmittelbar nach der Infektion. </li><li> Verschließen Sie den Schwanz mit Gewebekleber. </li><li> Nach der Injektion verdünnt das Bakterieninokulum und verteilt auf Agar-Platten mit entsprechenden Antibiotika zu CFU etablieren. </li><li> Lassen Sie den Mäusenauf einem Heizkissen erholen, bis sie nach oben und bewegt sich </li><li> Nach 6 Stunden nach der Infektion ziehen Sie eine kleine Menge Blut aus dem Schwanz, verdünnen und Platte CFU bei 6 h zu etablieren. </li><li> Alle Agar-Platten bei 37 ° C in 5% CO 2 über Nacht. </li></ol></li></ol> 4. Sacrifice <ol><li> Bei dem gewählten Zeitpunkt der Infektion, Mäuse anästhesiert mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) injiziert ip </li><li> Einmal eingeschlafen, halten Sie die Maus warm mit einem Heizkissen. </li><li> Wenn der Schmerz-Reflex hat (toe-Pinch) gegangen, schnipp Ende des Schwanzes und ziehen Blut. </li><li> Verbreiten Sie Blut auf Agar-Platten mit entsprechenden Antibiotika; 5 ul direkte und 10 ul 1:10 Verdünnung zu CFU etablieren. </li><li> Sacrifice der Maus durch Genickbruch. </li><li> Nachdem dabei die Maus nach allen relevanten institutionellen und ethischen Richtlinien, bestätigen Tod durch Mangel an Herzschlag. Machen Sie eine Mittellinienschnitt, durch Brustkorb geschnitten und einen Einschnitt in der mündlichent. </li><li> Sammeln Sie so viel Blut wie möglich aus dem Herz / Brustraum und in einem sterilen Röhrchen. </li><li> Organen (z. B. Leber, Milz, Gehirn) zu entfernen, in einen sterilen Platte. </li><li> Entfernen Sie die Hauttransplantation und einen Teil der Haut von Mäusen in den sterilen Teller. </li><li> Entsorgen Sie die Maus Körper. </li><li> Nachdem das gesammelte Blut wurde für 15 min gerinnen, es Zentrifuge 15 min bei 3.000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Entfernen von Plasma aus Blut und bei -80 ° C für spätere Analysen, zB zur Erkennung von Zytokin-ELISA oder FACS-basierten Methoden. </li></ol> 5. Orgel CFU Grafen <ol><li> Wiegen Homogenisieren Röhrchen mit 500 ul PBS jeweils vor der Einnahme von Biopsie-Proben. </li><li> Nehmen Sie 4 mm Biopsieproben aus jedem Gewebe mit einer sterilen Biopsie Punch. </li><li> Platz in Biopsien vorgewogen Homogenisieren Röhrchen mit 500 ul PBS. Homogenisieren Hautproben mit 2-mm-Perlen, verwenden kleinere Perlen für andere Organe. </li><li> Legen Sie die restlichen tFragen in 4% Paraformaldehyd (PFA) und bei 4 ° C für die Mikroskopie (siehe unten). </li><li> Wiegen Homogenisieren Röhrchen mit den Biopsien Biopsie Gewichtes (für die spätere Berechnung der KBE / mg Gewebe). </li><li> Proben homogenisieren. <ol><li> Homogenisieren Leber, Milz und Gehirn, bei 6.000 rpm für 30 sek. </li><li> Homogenisieren Hautproben bei 6.000 rpm für 30 sec und bei Bedarf wiederholen. </li></ol></li><li> Verbreiten Verdünnungen von jedem Homogenisieren Rohr auf Agarplatten und über Nacht wachsen bei 37 ° C in 5% CO 2 bis Organ Keimzahlen herzustellen. </li></ol> 6. Histologie / Immunhistochemie <ol><li> Fixierung <ol><li> Fix die Gewebe in 4% PFA über Nacht bei 4 ° C Die Fixierung Schritt kann mehr sein, wenn die Speicherung über längere Zeiträume legen die Gewebe in 0,25% PFA. </li><li> Spülen Sie die Gewebe in PBS und dann in 20% Saccharose-Lösung legen und zurück auf 4 ° C über Nacht oder bis der Gewebe in der Lösung versenkt. </li><li> In PBS waschen Gewebe, auf Größe geschnitten und in Oktober-Lösung (entweder in Form eines Gewebes oder einer Grundplatte geklebt). </li><li> Frieren schnell die Gewebe auf einer Petrischale schwimmend in flüssigem Stickstoff. </li><li> Nach dem Einfrieren setzen die Gewebe auf Trockeneis vor der Übertragung auf -80 ° C für die Lagerung. </li></ol></li><li> Slicing <ol><li> Gewebe entfernen von -80 ° C übergeführt und bei -20 ° C in einem Kryostaten äquilibrieren. </li><li> Scheibengewebe mit einer Dicke von etwa 10-15 um und setzen auf beschichtete Objektträger-Mikroskopie. </li><li> Speicher gleitet bei -20 ° C, bis sie benötigt. </li></ol></li><li> Die Färbung <ol><li> Lassen Sie Folien auf Raumtemperatur kommen. </li><li> Zeichnen Sie rund um die Scheibe auf der Folie mit einem hydrophoben Stift. Warten Sie 5-10 min. </li><li> Rehydrate / Wasch Scheibe in PBS für 5 min, zweimal wiederholen. </li><li> Permeabilisieren Scheibe in 0,1% Triton in PBS für 10 min. </li><li> In PBS 2-3x Waschen für 5 min. </li><li> Blockieren in PBS0,1% Triton 1% BSA für zwischen 10-60 Minuten, je nach den Antikörper oder Flecken verwendet werden. </li><li> Entfernen Blockierungspuffer und fügen primäre Antikörper verdünnt in Blockpuffer erforderlich. Inkubieren bestimmte Zeit. (Oft 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C). </li><li> In PBS 2-3x Waschen für 5 min. </li><li> Bewerben sekundären Antikörper gegebenenfalls in bock Puffer verdünnt; DAPI wird typischerweise in diesem Schritt enthalten. Inkubieren bestimmten Zeit, oft 1-2 Stunden Raumtemperatur in der Dunkelheit. </li><li> In PBS 2-3x Waschen für 5 min. </li><li> Berg in Fade Schutz Montage Medien mit einem Deckglas und Dichtung mit Nagellack. </li><li> Bild gefärbten Objektträger sofort oder bei 4 ° C </li><li> Führen Bildgebung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskopie oder mit Filter / angemessen Fluorophore verwendeten Laser eingestellt. </li></ol></li><li> Histologie <ol><li> Die Objektträger verwendet für die Histologie auf Raumtemperatur kommen. </li><li> Stain Folien mit sotandard Hämatoxylin / Eosin-Färbung Protokoll. <ol><li> Legen Sie die Folien in der Folienträger. </li><li> Bringen Sie mit den Objektträgern zwischen den Lösungen in der folgenden Reihenfolge: </li><li> 2 Sek. in fließendem Leitungswasser. </li><li> 3 min in Hämatoxylinlösung gefiltert. </li><li> 10 Sek. in fließendem Wasser. </li><li> 10 Sek. in destilliertes Wasser. </li><li> 10 sec in 100% Ethanol. </li><li> 2 sec in Eosin gefiltert. </li><li> 10 Sek. in fließendem Wasser. </li><li> 10 sec in Ethanol 100% </li><li> 2 min in Xylol x 3 (Bad I, II, III). </li><li> Übertragen Sie sofort und fügen einige Tropfen Leim Fixierung auf jedes Rutschen, Platz Deckglas auf, entfernen Sie Luftblasen, trocknen lassen für ein paar Stunden. </li><li> Bild gleitet unter einem Standard-Weißlicht-Mikroskop. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Davis, C. E., Arnold, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+meningococcal+endotoxin+in+Meningococcal+purpura%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Role of meningococcal endotoxin in Meningococcal purpura.</a> J. Exp. Med. 140, 159-171 (1974).</li>
<li>Mairey, E., et al. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMairey%2C+E+%22J.+Exp.+Med%22">J. Exp. Med</a>. 203, 1939-1950 (2006).</li>
<li>Brandtzaeg, P., van Deuren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+and+pathogenesis+of+meningococcal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Classification and pathogenesis of meningococcal infections.</a> Methods Mol. Biol. 799, 21-35 (2012).</li>
<li>Guarner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+diagnosis+of+human+meningococcal+disease+using+immunohistochemical+and+PCR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays.</a> Am. J. Clin. Pathol. 122, 754-764 (2004).</li>
<li>Hill, W. R., Kinney, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutaneous+lesions+in+acute+meningococcemia%3B+a+clinical+and+pathologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">The cutaneous lesions in acute meningococcemia; a clinical and pathologic study.</a> J. Am. Med. Assoc. 134, 513-518 (1947).</li>
<li>Capecchi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+NadA+is+a+new+invasin+which+promotes+bacterial+adhesion+to+and+penetration+into+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis NadA is a new invasin which promotes bacterial adhesion to and penetration into human epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 55, 687-698 (2005).</li>
<li>Merz, A. J., Enns, C. A., So, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+pili+of+pathogenic+Neisseriae+elicit+cortical+plaque+formation+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Type IV pili of pathogenic Neisseriae elicit cortical plaque formation in epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 32, 1316-1332 (1999).</li>
<li>Morand, P. C., Tattevin, P., Eugene, E., Beretti, J. L., Nassif, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adhesive+property+of+the+type+IV+pilus-associated+component+PilC1+of+pathogenic+Neisseria+is+supported+by+the+conformational+structure+of+the+N-terminal+part+of+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The adhesive property of the type IV pilus-associated component PilC1 of pathogenic Neisseria is supported by the conformational structure of the N-terminal part of the molecule.</a> Mol. Microbiol. 40, 846-856 (2001).</li>
<li>Taha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+induces+the+expression+of+the+TNF-alpha+gene+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis induces the expression of the TNF-alpha gene in endothelial cells.</a> Cytokine. 12, 21-25 (2000).</li>
<li>Kirchner, M., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PilC+adhesin+of+the+Neisseria+type+IV+pilus-binding+specificities+and+new+insights+into+the+nature+of+the+host+cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The PilC adhesin of the Neisseria type IV pilus-binding specificities and new insights into the nature of the host cell receptor.</a> Mol. Microbiol. 56, 945-957 (2005).</li>
<li>Mikaty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, (2009).</li>
<li>Johansson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD46+in+meningococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CD46 in meningococcal disease.</a> Science. 301, 373-375 (2003).</li>
<li>Kirchner, M., Heuer, D., Meyer, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD46-independent+binding+of+Neisserial+type+IV+pili+and+the+major+pilus+adhesin%2C+PilC%2C+to+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">CD46-independent binding of Neisserial type IV pili and the major pilus adhesin, PilC, to human epithelial cells.</a> Infect. Immun. 73, 3072-3082 (2005).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+iron+piracy+by+pathogenic+Neisseria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria.</a> Nature. 483, 53-58 (2012).</li>
<li>Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptors+for+transferrin+in+pathogenic+bacteria+are+specific+for+the+host%27s+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Receptors for transferrin in pathogenic bacteria are specific for the host's protein.</a> Can. J. Microbiol. 36, 145-147 (1990).</li>
<li>Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+utilising+human+transferrin+to+study+protection+against+Neisseria+meningitidis+serogroup+B+induced+by+outer+membrane+vesicle+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 26, 75-82 (1999).</li>
<li>Zarantonelli, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+expressing+human+transferrin+as+a+model+for+meningococcal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection.</a> Infect. Immun. 75, 5609-5614 (2007).</li>
<li>Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Dumenil, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Neisseria+meningitidis+to+dermal+vessels+leads+to+local+vascular+damage+and+purpura+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
<li>Murray, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T-cell-mediated+destruction+of+allogeneic+dermal+microvessels+in+a+severe+combined+immunodeficient+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human T-cell-mediated destruction of allogeneic dermal microvessels in a severe combined immunodeficient mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 9146-9150 (1994).</li>
<li>Nassif, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+of+pilin+regulates+adhesion+of+Neisseria+meningitidis+to+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation of pilin regulates adhesion of Neisseria meningitidis to human epithelial cells.</a> Mol. Microbiol. 8, 719-725 (1993).</li>
<li>Geoffroy, M. C., Floquet, S., Metais, A., Nassif, X., Pelicic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+the+meningococcus+genome+by+gene+disruption%3A+resistance+to+complement-mediated+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of the meningococcus genome by gene disruption: resistance to complement-mediated lysis.</a> Genome Res. 13, 391-398 (2003).</li>
<li>Ho, M., Hickey, M. J., Murray, A. G., Andonegui, G., Kubes, P. Visualization of Plasmodium falciparum-endothelium interactions in human microvasculature: mimicry of leukocyte recruitment. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHo%2C+M+%22J.+Exp.+Med%22">J. Exp. Med</a>. 192, 1205-1211 (2000).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Tiermodelle sind für bakterielle Pathogenese Forschung von entscheidender Bedeutung. Es ist unmöglich, vollständig zu imitieren die in vivo-Umgebung, in der Zellkultur und es zeichnet sich ab, daß Wirt-Pathogen-Wechselwirkung wird durch viele dynamische Faktoren beeinflusst. Der menschliche Anwendbarkeit einiger klinisch wichtige Pathogene, wie N. meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes und Salmonella typhi ist die Verwendung von in-vivo-Modelle für diese Infektionen beschränkt. Allerdings, wie wir beginnen zu verstehen, welche Infektionsschritte werden in der Spezifität beteiligt, humanisierte Modelle entwickelt. Das hier beschriebene Protokoll ist ein Beweis dafür mit der Einführung des menschlichen Mikrogefäßen in Mäuse, was eine umfangreiche in vivo-Infektion mit N. meningitidis, was zu Gefäßschäden und gelegentlich die Entwicklung der Purpura Hautausschläge. Mit diesem ModellWir waren in der Lage zu bestimmen, dass die Klebeeigenschaften der TFP in Gefäßbesiedlung in vivo unter Verwendung von bakteriellen Mutanten und dass die Gefäßschäden in Abwesenheit der Adhäsion beteiligt 18 reduziert. Bisher haben die zirkulierende bakterielle Produkte in diesem Schaden in Verbindung gebracht, aber unsere Ergebnisse legen nahe, eine entscheidende Rolle für die lokale Adhäsion und Gefäß Kolonisation. Dies eröffnet neue Möglichkeiten für die Entwicklung neuer Behandlungsziele. Wenn Adhäsion von pathogenen Bakterien könnten pharmazeutisch blockiert werden es möglicherweise verhindern, könnte die Entwicklung von Hautläsionen und führen zu besseren Ergebnissen für die Meningokokken-Überlebenden in Bezug auf Gewebe Nekrose, Debridement und Amputationen. Die Arbeit hat auch die Komplexität der Infektion und die Beteiligung der Immunantwort und Gerinnungskaskade. Wir identifizierten humanen Zytokin-Signalisierung im Serum infizierter Mäuse trotz der relativ geringen Menge an menschlicher Endothel 18 vorhanden.Dies zeigte eine signifikante Reaktion Cytokin, zusammen mit der Infiltration von Mausimmunzellpopulationen in der Umgebung. Tiermodelle können natürlich nie vollständig menschlichen Krankheit zu replizieren und alle Ergebnisse erhielt von ihnen müssen in diesem Sinne angesehen werden. Zum Beispiel in diesem Modell das Blut und die zirkulierenden Zellen von Maus Herkunft, und wir können nicht ausschließen, dass sie unterschiedlich auf den menschlichen Zellen zu verhalten. Ein Vorteil davon jedoch, wie in unserer jüngsten Veröffentlichung 18 gezeigt, ist die Fähigkeit, Signal die aus menschlichen Endothel aus, dass der umlaufMausZellen zu differenzieren. Die immun Hintergrund der in diesem Modell verwendeten Mäuse würde auch für die allogene Übertragung von menschlichen Immunzellpopulationen zu ermöglichen, um eine weitere &#39;Humanisierung&#39; Aspekt. Die immun Hintergrund der Mäuse können jedoch Maske eine Rolle für die NK-, T-oder B-Zellen, die alle fehlen in diesem Modell oder defekt. Die relativ Short Zeitrahmen (24 h) in diesem Modell verwendet, betrifft vor allem die angeborene Reaktion, aber für längerfristige Infektionen und die Entwicklung der Immunität andere Optionen benötigen, erkundet zu werden. Die Haut ist ein wichtiger Infektionsstelle für N. meningitidis, aber mit einer relativ kleinen Menge an menschlichem Gefäße bedeutet auch, dass eine Extrapolation der Daten zu einer systemischen Infektion, die zahlreiche Organe ist schwierig. Während dieses Modell ermöglicht die Untersuchung von Haut Läsion Entwicklung, sind wichtige Schritte von Meningokokken-Infektion, wie Epithel-und Blut-Hirn-Überfahrt nicht inbegriffen. Die Weiterentwicklung dieser humanisierten Modellen benötigt wird, um diese anderen Aspekte der Infektion zu adressieren. Dennoch ist dieses Modell bietet ein großes Potenzial für zahlreiche Menschen spezifischen Krankheitserregern, insbesondere solcher, die auf die Blutgefäße.

Meningokokken-Sepsis ist eine häufig tödlich Blut geboren Infektion, die durch den bakteriellen Erreger Neisseria meningitidis verursacht. Meningokokken-Sepsis-Patienten oft mit Petechien oder Purpura auf ihrer Haut, die zuvor mit Gefäßzerstörung durch zirkulierende Bakterien und bakterielle Produkte 1 verursacht in Verbindung gebracht wurde Gegenwart. Hautbiopsien von Patienten zeigen klinische Bakterien mit Mikrogefäßen verbunden sind, oft füllt die Gefäße 2. Abgesehen von den Bakterien, ausgedehnten Thrombose, Gerinnung, Staus und Gefäß Leck in den Regionen Purpura 3-5 gesehen. Diese Gefäßschäden können zu ausgedehnten Nekrosen der Haut und der umgebenden Gewebe führen, was Debridement und sogar Amputation in Meningokokken-Überlebenden. Zu verstehen, wie diese Infektion verursacht Gefäßschäden ist wichtig, Prävention und Behandlungsstrategien zu optimieren. Der Großteil der Forschung auf Meningokokken-Sepsis wurde in vitro durchgeführt ammenschlichen Zelllinien aufgrund der Spezifität des menschlichen N. meningitidis. Viele Aspekte der Infektion wurden in vitro einschließlich bakterieller Adhäsion, Wirtszellantwort sowie Cytokinantwort 6-9 untersucht. Typ-IV-Pili (TFP) haben als Haupt Haftung für Organelle N. in Verbindung gebracht meningitidis sowohl Epithel-und Endothel-Zellen 10. Es wurde auch gefunden, daß die Haftung von N. gezeigten meningitidis an Wirtszellen ist Schubspannung abhängig und wird daher angenommen, um den Blutfluss Raten in der Mikrogefäß 11 bezogen werden. Dies legt nahe, die dynamischen Belastungen die Bakterien stellen in vivo sind entscheidend für die Pathogenese. Es ist jedoch sehr schwierig, die Mikroumgebung der kleinen Gefäße in vitro-Modell. Die Haftung Rezeptor für Neisseria TFP noch unbekannt und somit Knock-in Strategien zur bakteriellen Adhäsion in einem Tiermodell zu erzielen kann zu diesem Zeitpunkt nicht in Betracht gezogen werden. CD46 wurde vorgeschlagen, sein TFP-Rezeptor und transgenen Tieren produziert wurden als Maus-Modelle handeln. Allerdings bedeutet Infektion bei diesen Tieren nicht um umfangreiche Infektionen führen oder die Entwicklung 12,13 Ausschlag. Andere Tiermodelle, die für die Bakteriämie Aspekt der Neisseria-Infektion beschrieben wurden, berücksichtigen die bakterielle Vorliebe für menschliches Transferrin als Eisenquelle 14,15. Entweder Ergänzung menschliches Transferrin oder von einem Transgen zu einer erhöhten Bakterienlast im Blut über einen längeren Zeitraum zum Ausdruck, aber dieses Modell zeigt keine bakterielle Adhäsion oder Hautausschlag Entwicklung 16,17. In diesem Protokoll beschreiben wir einen humanisierten Mausmodell, in dem die menschliche Haut, einschließlich der dermalen Mikrogefäß, auf immungeschwächten Mäusen 18,19 transplantiert. Dies führt zu Funktions menschlichen Gefäße, mit der Maus Zirkulation durchblutet. In Kombination mit humanem Transferrin Ergänzung, diese modell letzteres mindestens zwei der menschlichen spezifische Aspekte N. meningitidis, dh menschlichen Endothel-und Humantransferrin, in einer in vivo Umgebung. N. meningitidis eingeführt intravenös in diesem Modell haften spezifisch für das menschliche Endothel Herstellung einer Pathologie, die ähnlich zu dem, was in der klinischen Patienten, einschließlich Gefäßschäden und Purpura Entwicklungs 18 angegeben ist.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>31885-023</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin 500</td><td>Virbac Frankreich</td><td></td><td>Lot-Nr. VAL4243</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer Healthcare</td><td>AMM N&deg; FR/8146715 2/1980</td><td>Los-Nr. KPO809S</td></tr><tr><td>Optigel&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Europhta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lacrigel&nbsp;</td><td>Medizinische Autorisierung&eacute;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tronothane</td><td>Lisa Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC Agar Base</td><td>Conda</td><td>1106</td><td></td></tr><tr><td>Humanendothel SFM Medien</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>11111</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>P A A</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3309</td><td></td></tr><tr><td>UEA Lektin - Rhodamin</td><td>Vector Labs</td><td>RL-1062</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>nüchternes Handdermatom</td><td>Humeca BV, Holland</td><td>4.SB01</td><td></td></tr><tr><td>Tierhaltung</td><td>Innovive</td><td>M-BTM-C8</td><td></td></tr><tr><td>Biopsiestempel (4 mm)</td><td>Dominic Dutscher</td><td>30737</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Prep Lysing Matrix M Tubes</td><td>MP Bio</td><td>116923050</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyzer Green Beads</td><td>Roche</td><td>3358941001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyzer</td><td>Roche</td><td>3358976001</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Eindeckmedien</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>Tissue Glue</td></tr><tr><td>OCT tissue tek</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

humanisierten maus-modell, um bakterielle infektionen studieren targeting der mikrogefäß

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis verursacht eine schwere, oft tödliche Sepsis, wenn es den menschlichen Blutkreislauf gelangt. Die Infektion führt zu umfangreichen Schäden der Blutgefäße, was zu Gefäß Leck, der Entwicklung von Purpura Hautausschläge und eventuelle Gewebe Nekrose. Untersuchung der Pathogenese dieser Infektion wurde zuvor durch das menschliche Spezifität der Bakterien, die in-vivo-Modellen erschwert beschränkt. In diesem Protokoll beschreiben wir einen humanisierten Modell für diese Infektion in der die menschliche Haut, Hautmikrogefäße enthält, wird auf immungeschwächten Mäusen gepfropft. Diese Gefäße anastomosieren mit der Maus Zirkulation unter Wahrung ihrer menschlichen Eigenschaften. Einmal in diesem Modell, N. eingeführt meningitidis haften ausschließlich die menschlichen Gefäße, was zu umfangreichen Gefäßschäden, Entzündungen und in einigen Fällen die Entwicklung der Purpura. Dieses Protokoll beschreibt die Transplantation, Infektion und Auswertungsschritte dieses Modells in der context von N. meningitidis-Infektion. Die Technik kann zu zahlreichen Menschen spezifische Krankheitserreger, die in den Blutstrom zu infizieren angewendet werden.

Keimzahlen Der N. meningitidis-Stamm in dieser repräsentativen Ergebnisse verwendet, ist N. meningitidis 8013 Klon 12, eine Serogruppe C klinischen Isolat, Ausdruck einer Klasse-I-SB pilin, Opa -, OPC -, PilC1 + / + 20 PilC2. Der Stamm war so konstruiert, dass das grün fluoreszierende Protein (GFP) von einer chromosomalen Insertion 18 auszudrücken. Bakterienkolonie-Bildungseinheit Zählwerte durch Zählung der Anzahl der Kolonien auf den Agarplatten und Berechnen entweder CFU / ml Blut oder CFU / mg Gewebe aus den bekannten Volumina plattiert etabliert. Blutbild zeigte, dass 5 Minuten nach iv Injektion von 10 6 CFU Bakterien war ein Durchschnitt von 1,5 × 10 5 CFU / ml im Blut zirkuliert (Fig. 1A). Nach 6 Stunden die Zählungen im Durchschnitt 4,8 x 10 4 KBE / ml. Nach 24 Stunden waren die durchschnittlichen zählt 2,4 x 10 4 KBE / ml, aber in dieser Gruppe von 10 Mäusen, 5 hattekeine nachweisbaren zirkulierenden Bakterien, während die anderen 5 relativ hohe Zählungen (Fig. 1A). Keimzahlen von den Hautproben genommen zeigen die Mehrzahl der Mäuse mit erheblichen Zählungen in der menschlichen Haut, durchschnittlich 2,1 x 10 4 KbE / mg Gewebe in 6 h ​​und 4,4 × 10 2 KBE / mg Gewebe in 24 h (Fig. 1B) . Die kontralateralen Maus Hautproben zeigten keine Bakterienzahl bei 24 Stunden und nur einer sehr geringen Anzahl an 6 Stunden, was die starke Präferenz für N. meningitidis zu den menschlichen Gefäße in der transplantierten Haut (Abbildung 1B). Im Allgemeinen waren die Bakterienzahl in den anderen Organen abgetastet, obwohl 2 Tiere zeigen Zählungen, die eine Kontamination durch das Blut zugeschrieben werden können, wie sie mit hoher Umlaufbakterienzahlen (Abbildung 1C) korreliert tat ​​sehr niedrig nicht nachweisbar. Das Modell kann auch verwendet werden, um die Rolle von Virulenzfaktoren in vivo zu bestimmen, beispielsweise der Typ IV pili. Bakterienstämme mit definierten Mutationen im Gen PILD 21, was zu einem Stamm fehlt TFP sowie die pilC1-Gen 8, ohne die vorgeschlagene Tfp &quot;Adhäsin&quot; wurden in das Modell eingeführt. Diese Mutationen ergaben keine bakterielle Adhäsion im menschlichen Hauttransplantat und bestätigt die entscheidende Rolle spielen TFP Adhäsion in vivo (Fig. 1D). Immunhistochemie / Histologie In diesen Experimenten verwendeten wir N. meningitidis-Stämme, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren, um Fluoreszenzdetektion ohne sekundäre Färbung zu ermöglichen. Menschliche Gefäße wurden mit einem Marker für menschliche Endothel gefärbt, entweder CD31 (PECAM-1) oder das Lectin Ulex Europaeus Agglutinin (UEA) 18,22. Der UEA wurde Rhodamin konjugiert wodurch ein Färbungsschritt (Fig. 2A-C). Zellkerne können zu färbened mit DAPI zur Identifizierung Gewebestrukturen (Fig. 2A-B). Histologie wurde unter Verwendung eines Standard-Hämatoxylin / Eosin-Färbung. Die epidermalen / dermalen Grenze der Haut war deutlich erkennbar. Entzündungen, Thrombose und Gefäßleck wurden auf Schiffe in der Nähe dieser Grenze 24 Stunden nach der Infektion (Abbildung 2D) konzentriert. Thrombose war in mehreren kleinen Hautgefäße, die oft von Staus und Entzündungen einher sichtbar. Austritt von roten Blutkörperchen aus in das Gewebe sehen konnte, was auf eine weit reichende Gefäßschäden. Die Histopathologie der transplantierten Haut in nicht-infizierten Mäusen normal erschien ohne Entzündung zu unterscheiden 18. In etwa 30% der Infektionen bakteriellen Adhäsion in der Haut führt zur Entwicklung von makroskopisch nachweisbare Purpura (Fig. 2E und 2F). <img alt="Figur 1" fo:content-width=<html> &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg&quot; /&gt; Fig. 1 ist. CFU zählt. (A) Bakterienkeimzahlen pro ml Blut in 5 min, 6 h und 24 h nach Infektion. (B) Bakterielle CFU zählt von Hautproben Vergleich der menschlichen Haut (HS) und Maus-Haut (MS) sowohl bei 6 Stunden und 24 Stunden nach der Infektion. (C) Bakterienkeimzahl von anderen Organen aufgenommen 24 Stunden nach der Infektion. (D) Vergleich der Bakterienkeimzahlen aus Mensch und Maus Hautproben bei 24 Stunden nach der Infektion von Mäusen, die mit dem Wildtyp infizierten N. genommen meningitidis 2C43 Fleck (WT), einen Stamm mit einer Mutation in dem Gen PILD (PILD) oder einem Stamm mit einer Mutation in der pilC1-Gens (pilC1). Alle Diagramme werden als Rohdaten mit Median gezeigt. Abbildung von 18 Melican et al. Modifiziert&quot;_blank&quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2.jpg" /> 2. Mikroskopie. (A) Projektion eines konfokalen Stapel, die einen menschlichen Mikrogefäß mit Lektin UEA (rot) in der Nähe der Haut (d) der Epidermis (e) Grenze gefärbt. Der Behälter wird mit infizierten N. meningitidis (grün) 2 h nach der Infektion. (B) Eine optische Scheibe und eine Scheibe Projektion (C) zeigt N. meningitidis Mikrokolonien (grün)-Infektion eine menschliche Gefäß (UEA - rot) in einer Hauttransplantation 2 Stunden nach der Infektion. (D) Hämatoxylin / Eosin-Färbung von menschlichen Hauttransplantation für 24 Stunden mit N. infiziert meningitidis. Der epidermale (e), ist dermalen (d) Grenze deutlich sichtbar und ausgedehnten Thrombose und Staus von microvessels (Pfeile) in der Dermis zu sehen. Entzündung und einige Vascular Leak (Pfeilspitze) kann auch identifiziert werden. (E) Die menschliche Haut Transplantat vor der Infektion. (F) Das gleiche Hauttransplantation als (E) 24 h nach Infektion mit N. meningitidis, die Purpura Regionen (Pfeile). 2B, 2D, 2E, 2F und werden von Melican et al. modifizierten 18 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

Neisseria meningitidis ist ein Menschen bestimmten Erreger infiziert, die Blutgefäße. In diesem Protokoll menschlichen Mikrogefäße werden durch Pfropfen von der menschlichen Haut auf immungeschwächten Mäusen in eine Maus vorgestellt. Bakterien haften umfassend für die menschlichen Gefäße, was zu Gefäßschäden und die Entwicklung der Purpura typischerweise in menschlichen Fälle beobachtet.

Humanisierten Maus-Modell, um bakterielle Infektionen Studieren Targeting der Mikrogefäß

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Mechanismen zu untersuchen, durch die die Bakterien, die Meningitis verursachen, menschliche Blutgefäße in vivo infizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst menschliche Haut auf eine immundefiziente Maus transplantiert wird, wodurch menschliche dermale Blutgefäße eingeführt werden. Im zweiten Schritt werden die humanisierten Mäuse mit den Bakterien infiziert. Die Infektion wird anschließend über einen vorbestimmten Zeitraum fortschreiten gelassen. Im letzten Schritt werden Blut- und Gewebeproben gewonnen, um das Ergebnis der Infektion zu bewerten. Letztendlich kommt eine Kombination aus Histologie, Immunfluoreszenz sowie Blut- und Gewebeanalyse zum Einsatz, um das Fortschreiten der Infektion in den menschlichen Gefäßen zu untersuchen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie Zellkulturanmodellen oder Tierversuchsmodellen besteht darin, dass wir erstmals die typische klinische Pathologie beobachten können, die während dieser Infektionen auftritt. Reinigen Sie die menschliche Hautoberfläche so bald wie möglich nach der Entnahme mit 70 %igem Ethanol und legen Sie sie dann flach auf eine saubere Oberfläche, vorzugsweise unter einer Flusshaube. Verwenden Sie anschließend einen Dermatom mit voreingestellter Dicke, um 200 bis 400 Mikrometer dicke Scheiben von der Hautoberseite abzuschneiden.Überprüfen Sie die Schnitte auf Integrität und schneiden Sie sie anschließend in zwei mal zwei Zentimeter große Quadrate zurecht. Legen Sie die Quadrate in PBS und reinigen Sie anschließend die rasierte Fläche eines chirurgisch vorbereiteten, anästhesierten sechs bis acht Wochen alten schwer kombiniert immundefizienten beige-Maus mit 70 %igem Ethanol. Nach der Applikation eines Lokalanästhetikums auf die Transplantationsstelle entfernen Sie mit einer gebogenen Schere vorsichtig die oberflächliche Hautschicht der Maus in einem Bereich, der etwas kleiner ist als die Transplantatstücke, wobei Sie darauf achten, die darunterliegende Gefäßversorgung nicht zu stören.Um eine Austrocknung des Transplantats zu vermeiden, platzieren Sie schnell eine der menschlichen Hautscheiben auf der Transplantatunterlage, wobei die epidermale Seite nach oben zeigen muss. Richten Sie die Kante des Gewebes aus und befestigen Sie es mit Gewebekleber. Passen Sie dann vorsichtig den Rest der menschlichen Haut an die Transplantatunterlage an, indem Sie kleine Mengen Gewebekleber um jede Kante herum auftragen.Schneiden Sie die menschliche Haut immer passend zur Größe zu, anstatt das Transplantatbett zu vergrößern. Nachdem bestätigt wurde, dass jede Ecke fixiert ist, reinigen Sie die Stelle mit einer Jodlösung und bringen Sie ein Pflaster fest, aber nicht zu straff auf, wobei die Polsterseite über dem Transplantat liegen soll. Achten Sie darauf, dass die Atmung des Tieres nicht beeinträchtigt wird. Befestigen Sie das Pflaster anschließend mit Verbandklebeband und lassen Sie das Tier auf einer warmen Unterlage wieder zu sich kommen. Sobald das Tier wach ist, bringen Sie es in seinen Käfig zurück, bis die bakterielle Injektion eine Übernachtkultur auf einer Platte erneut in eine Flüssigkultur überführt.Am Morgen der Infektion, wenn die Bakterien die gewünschte Konzentration erreicht haben, verdünnen Sie die Zellen auf einen mal 10 hoch 7 Kolonie-bildende Einheiten pro Milliliter. Danach überprüfen Sie nach der Anästhesie die Sedierung der engrafteten Mäuse durch Zehenquetschung und stellen die Tiere auf eine Wärmematte.Tragen Sie Augensalbe auf die Augen des Tieres auf und injizieren Sie dann jedes Maus intraperitoneal mit acht Milligramm humanem Transfer in Salzlösung. Schneiden Sie anschließend bei jedem Tier die Schwanzspitze ab und verteilen Sie einen kleinen Tropfen Blut vom Schwanz auf einer Agarplatte, um zu bestätigen, dass das Blut vor der Infektion steril ist.Injizieren Sie anschließend 100 µL der Bakterienkultur intravenös mittels retroorbitärer Injektion. Nach einigen Minuten schneiden Sie erneut das Ende des Schwanzes ab und streichen diese Blutprobe ebenfalls auf frische Agarplatten aus. Um die Anzahl der koloniebildenden Einheiten im Blut unmittelbar nach der Infektion zu bestimmen, verschließen Sie den Schwanz mit Gewebeleim und verdünnen anschließend das bakterielle Inokulum, das Sie auf Agarplatten mit den entsprechenden Antibiotika ausplattieren.Um die Anzahl der koloniebildenden Einheiten des Inokulums sechs Stunden nach der Infektion zu bestimmen, entnehmen Sie erneut eine kleine Menge Blut aus den Schwänzen der Mäuse und verdünnen sowie impfen Sie die Blutstropfen wie zuvor gezeigt ab, um die koloniebildenden Einheiten nach sechs Stunden zu ermitteln. Inkubieren Sie anschließend alle Platten über Nacht bei 37 °C in 5 % Kohlendioxid, um die koloniebildenden Einheiten in den Organen zu bestimmen. Zählung der Einheiten bei den infizierten Tieren.Beginnen Sie mit einem medianen Schnitt an jeder euthanasierten Maus. Schneiden Sie dann bei jedem Tier durch den Rippenbogen und führen einen Schnitt im Herzen durch. Entnehmen Sie mithilfe einer sterilen Spritze so viel Blut wie möglich aus dem Herzen und der Brusthöhle und geben Sie es in einzelne sterile Röhrchen für jede Probe ab. Entfernen Sie anschließend die gewünschten Organe und überführen Sie die Hauttransplantate zusammen mit den entsprechenden Hautabschnitten der Maus auf eine sterile Platte pro Tier. Lassen Sie das gesammelte Blut 15 Minuten lang gerinnen und zentrifugieren Sie es danach. Entfernen Sie anschließend das Plasma aus dem Blut und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius für spätere Analysen. Als Nächstes Homogenisiergefäße wiegen, die jeweils 500 µL PBS enthalten. Anschließend mit einer sterilen Biopsielösepunze vier Millimeter große Biopsieproben aus jedem präparierten Gewebe entnehmen. Die Biopsien einzeln in die Homogenisiergefäße geben, wobei sich in jedem Gefäß, das eine Hautprobe enthält, eine zwei Millimeter große Kugel befindet.Bewahren Sie die verbleibenden Gewebeproben für die Mikroskopie in 4 % Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius auf und wiegen Sie die Homogenisiergefäße, um das Biopsiegewicht zu bestimmen. Anschließend homogenisieren Sie die Proben bei 6.000 U/min für 30 Sekunden und wiederholen die Haut-Homogenisierung, bis das Homogenat bröcklig ist. Verteilen Sie schließlich die Zellsuspensionen aus jedem Gefäß auf frische Agarplatten und kultivieren Sie die Ansätze über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid.Um die Anzahl der koloniebildenden Einheiten in diesen repräsentativen Ergebnissen zu bestimmen, wurde ein GFP-positiver Stamm von N. meningitidis, Serogruppe C, verwendet.Die Blutuntersuchungen zeigten, dass fünf Minuten nach der intravenösen Injektion von 1 × 10⁶ koloniebildenden Einheiten Bakterien durchschnittlich 1,5 × 10⁵ koloniebildende Einheiten pro Milliliter im Blut zirkulierten. Nach sechs Stunden betrug der Durchschnitt 4,8 × 10⁴ koloniebildende Einheiten pro Milliliter, nach 24 Stunden waren es durchschnittlich 2,4 × 10⁴ koloniebildende Einheiten pro Milliliter.Doch in dieser Gruppe von 10 Mäusen hatten fünf keine nachweisbaren zirkulierenden Bakterien, während die anderen fünf relativ hohe Keimzahlen aufwiesen. Diese Balken in den Diagrammen zeigen die Medianwerte der CFU-Zahlen jeder Gruppe, die aus der Haut gewonnen wurden. Die Proben zeigen, dass die Mehrheit der Mäuse beträchtliche Keimzahlen in der menschlichen Haut aufweist, mit durchschnittlich 2,1 × 10⁴ CFU pro Milligramm Gewebe nach sechs Stunden und 4,4 × 10² CFU pro Milligramm Gewebe nach 24 Stunden.Die kontralateralen Maushautproben zeigten nach 24 Stunden keine bakteriellen Keimzahlen und erst nach sechs Stunden eine sehr geringe Anzahl, was die starke Präferenz für eine Endmeningitis in den menschlichen Gefäßen des transplantierten Gewebes belegt. Im Allgemeinen waren die bakteriellen Keimzahlen in den anderen entnommenen Organen sehr gering bis nicht nachweisbar, obwohl bei zwei Tieren Keimzahlen festgestellt wurden, die möglicherweise mit hohen zirkulierenden Bakterienzahlen korrelieren. Dieses Modell kann ebenfalls verwendet werden, um die Rolle von Virulenzfaktoren in vivo zu bestimmen.Beispielsweise wurden in diesem Experiment bakterielle Stämme verwendet, die über keine funktionellen Typ-Vier-Pilli I verfügten; Mäuse, die mit diesen mutierten Stämmen infiziert wurden, wiesen keine bakterielle Adhärenz in den humanen Hauttransplantaten auf, was die entscheidende Rolle von Typ-Vier-Pilli I bei der Adhärenz in vivo bestätigt. In diesen konfokalen Aufnahmen eines Hauttransplantats zwei Stunden nach der Infektion sind humane Gefäße sichtbar, die mit dem mit Rhodamin konjugierten Lektin UEA angefärbt wurden. Die Grenze zwischen Epidermis und Dermis ist deutlich erkennbar, und die infizierenden, GFP-positive Bakterien sowie Meningokokken sind deutlich in den Gefäßen sichtbar.Diese mit H und E gefärbte humane Hauttransplantatprobe zeigt Entzündungen und vaskuläre Lecks sowie eine auf Gefäße nahe der epidermalen Dermis-Grenze konzentrierte Thrombose. 24 Stunden nach der Infektion führten bei etwa 30 % der Infektionen bakterielle Adhäsionen in der Haut zur Entwicklung makroskopisch erkennbarer Purpura. Die Entwicklung dieser Technik ebnet daher Forschern, die an der Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen beteiligt sind, den Weg, die Krankheitsmechanismen im Kontext menschlicher Gefäße zu erforschen.

humanized-mouse-model-to-study-bacterial-infections-targeting

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir eine Methode zur menschlichen Nabelschnurblut-derived endothelial Kolonie-bildenden Zellen (ECFCs) und Knochenmark gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in einem Kollagen / Fibronektin Gel eingebettet, subkutan in immundefizienten Mäusen. Liefern Diese Zelle / Gel-Kombination erzeugt eine humane vaskuläre Netzwerk, das mit der Maus Gefäßsystem verbindet.

Bioengineering humane mikrovaskuläre Networks in immundefizienten Mäusen

Quelle: Valentine, M. E. et al., Erzeugung von In-Frame-Gen-Deletionsmutanten in Pseudomonas aeruginosa und Tests auf Virulenzabschwächung in einem einfachen Mausmodell der Infektion. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video demonstriert die Anwendung eines biolumineszenzbasierten Bildgebungsansatzes zur Überwachung bakterieller Infektionen in einem Live-Mausmodell. Sequentielle biolumineszente und Röntgenbildgebung ermöglicht eine Echtzeitvisualisierung und anatomische Lokalisierung der Infektion, die...

Echtzeitbildgebung bakterieller Infektionen in einem Mausmodell mittels Biolumineszenz

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Dieses Video zeigt in vivo Bildgebung, um die Rekrutierungsdynamik von Neutrophilen an einer Infektionsstelle in einer immungeschwächten, transgenen Maus mit GFP-exprimierenden Neutrophilen zu untersuchen. Dabei werden Leuchtbakterien injiziert, um eine Infektion auszulösen. Dies führt zur Rekrutierung von Neutrophilen an der Infektionsstelle, deren Verfolgung durch Bildgebung erfolgt.

Überwachung der Rekrutierungsdynamik von Neutrophilen und der bakteriellen Belastung an der Infektionsstelle in einem Mausmodell

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Generierung eines Mausmodells für Hautwundinfektionen. Bei der Infektion von Mäusen – die so verändert wurden, dass sie ein fluoreszierendes Protein in Neutrophilen exprimieren – mit einem genetisch veränderten biolumineszierenden Staphylococcus aureus – einem pathogenen Bakterium. Die bakterielle Belastung an der Infektionsstelle und die Rekrutierungsdynamik von Neutrophilen können mit Hilfe von Ganztierbildgebung untersucht werden.

Ein Maus-Modell für Hautwundeninfektionen zur Untersuchung der Immunantwort gegen einen bakteriellen Krankheitserreger

Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Tiermodellen erwiesen haben wertvolle Werkzeuge bei der Definition von Wirt und Pathogen-spezifische Mechanismen, die zur Entstehung der chronischen Entzündung beitragen. Hier beschreiben wir ein Mausmodell der oralen Infektion mit dem menschlichen Erreger Porphyromonas gingivalis und Detail Methoden, um das Fortschreiten der Entzündung an lokalen und systemischen Websites zu beurteilen.

Einem Mausmodell für Pathogen-induzierten chronischen Entzündung an lokalen und systemischen Seiten

Um die Interaktion von Bakterien mit den Blutgefäßen unter Scherspannung zu untersuchen, werden eine Strömungskammer und ein in vivo mesenteriales Intravitalmikroskopie-Modell beschrieben, die es ermöglichen, die bakteriellen und Wirtsfaktoren zu entschlüsseln, die zur Gefäßadhäsion beitragen.

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

Während in vitro Studien von Wirt-Erreger-Interaktionen die Charakterisierung spezifischer Immunantworten ermöglichen, sind in vivo Modelle erforderlich, um die Auswirkungen komplexer Reaktionen zu beobachten. Unter Verwendung der Exposition von Candida albicans, gefolgt von einer Pseudomonas aeruginosa-vermittelten Lungeninfektion, etablierten wir ein Mausmodell für mikrobielle Interaktionen, die an der Pathogenität der beatmungsassoziierten Pneumonie beteiligt sind.

Studieren Mikrobielle Gemeinschaften<em&gt; In-vivo-</em&gt;: Ein Modell von Host-vermittelte Interaktion zwischen<em&gt; Candida albicans</em&gt; Und<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In den Atemwegen

Ein Ansatz ist für Echtzeit-Erkennung der angeborenen Immunantwort zu kutanen Verwundung und Staphylococcus Aureus Infektion der Mäuse beschrieben. Durch Vergleich LysM EGFP Mäuse (die fluoreszierenden Neutrophile besitzen) mit einem LysM EGFP immungeschwächte Maus Sorte gekreuzt, wir vorab unser Verständnis der Infektion und der Entwicklung von Ansätzen zur Bekämpfung der Infektion.

Ein Mausmodell zu beurteilen, angeborene Immunantwort auf Staphylococcus Aureus -Infektion

Erfahren Sie, wie Neisseria meningitidis menschliche Blutgefäße in humanisierten Mäusen infiziert. Diese Methode nutzt Hauttransplantationen, um Infektionsmechanismen und vaskuläre Schäden in vivo zu untersuchen.

Humanisierten Maus-Modell, um bakterielle Infektionen Studieren Targeting der Mikrogefäß

Weitere Videos entdecken