Rapid-Synthese und Screening von Chemisch aktivierte Transkriptionsfaktoren mit GFP-basierte Reporter

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, genetisch kodierbare, induzierbare künstliche Transkriptionsfaktoren oder ATFs mit gewünschter Spezifität herzustellen, zu testen und zu validieren. Dies wird zunächst erreicht, indem der ATF über eine einfache Hefetransformation erzeugt wird, bei der das Einbringen eines PCR-Produkts einer DNA-Bindedomäne zu einer in Leserichtung fusionierten Verbindung mit einem humanen Östrogenrezeptor und VP16 führt. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, ein GFP-Reportergebendes Plasmid für den ATF zu erzeugen, indem die Bindungsstellen im Plasmid PMN8 durch an den Transkriptionsfaktor gerichtete Sequenzen ersetzt werden.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Fähigkeit der ATFs, den GFP-Reporter zu aktivieren, zu testen und gleichzeitig deren Auswirkung auf die Hefe-Physiologie durch Messung der Wachstumsrate zu bewerten. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, den validierten a TF zu verwenden, um ein natives genomisches Zielgen bedingt zu exprimieren. Letztendlich kann jedes gewünschte Zielgen bedingt aktiviert werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Galactose-vermittelten Induktion der Genexpression liegt darin, dass eine selektive Induktion unter unterschiedlichen Nährstoff- und physiologischen Bedingungen ohne pleiotrope Effekte erreicht werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Hefebiologie zu beantworten, indem gewünschte Genprodukte schnell und reversibel eingeführt werden, wodurch die Untersuchung von Funktionsgewinn und Funktionsverlust ermöglicht wird. Beginnen Sie damit, mittels eines hochfidelitären Polymerase das DNA-Bindungsdomänen- oder DVD-Gen von Interesse per PCR zu amplifizieren.

Transformieren Sie mehr als ein Mikrogramm des gereinigten PCR-Produkts mittels der Lithiumacetat-Methode in Hefe. Nach der Transformation zentrifugieren Sie die Zellen für 15 Sekunden mit maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge, entfernen das Transformationsgemisch und resuspendieren die Zellen in etwa 200 Mikrolitern sterilen Wassers, bevor sie auf Hefeextrakt-Pepton-Dextrose- oder YPD-Medium ausgestrichen werden. Am nächsten Tag übertragen Sie mittels Replikaplatte von YPD auf fünf Platten mit 5-Fluoroesigsäure.

Nach einem Wachstum von zwei bis vier Tagen rereifen Sie mindestens fünf bis 10 Kolonien auf YPD erneut. Führen Sie anschließend eine Kolonien-PCR mit den im Textprotokoll angegebenen Primern durch und sequenzieren Sie, um die Integration zu verifizieren. Verdünnen Sie die gewünschten Oligos des Bindungsbereichs auf äquimolare Konzentrationen.

Phosphorylieren Sie die Bindungsregion unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase und anschließend einem Neo-Thermocycler gemäß den Reaktionsbedingungen im Textprotokoll. Danach verdauen Sie etwa ein bis zwei Mikrogramm PMN8 mit NotI-HF und XbaI eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius Gel.

Reinigen Sie das Bandskelett und verdünnen Sie das gereinigte Bandskelett auf 10 Nanogramm pro Mikroliter. Verdünnen Sie anschließend die phosphorylierte doppelsträngige Bindungsstelle auf die fünffache molare Konzentration des Bandskeletts pro Mikroliter. Fügen Sie mithilfe von T4-DNA-Ligase die Bindungsstellen bei Raumtemperatur 30 Minuten lang in das geschnittene Bandskelett ein.

Führen Sie die Transformation durch, indem Sie die Hälfte der Ligationsreaktion zu 50 Mikroliter standardmäßiger chemisch kompetenter E. coli-Zellen hinzufügen und dem im Textprotokoll aufgeführten Verfahren folgen. Nach der Wiederherstellung der Zellen fügen Sie 100 bis 200 Mikroliter der Zellen pro Luria-Bertani- oder LB-Platte mit Ampicillin hinzu und inkubieren über Nacht. Am nächsten Tag züchten Sie die E. coli in flüssigem LB mit Ampicillin auf und isolieren die Plasmid-DNA gemäß der Beschreibung im Textprotokoll.

Danach das neue Reportergekonid aus Ligationskolonien sequenzieren. Schließlich das neue Reportergekonid mittels Lithiumacetat-Transformation in den A TF enthaltenden E-Stamm transformieren. Beginnen Sie damit, einen TF- und Reporter-enthaltenden Stamm über Nacht in fünf Millilitern synthetischem komplettem Medium ohne Uracil anzuziehen.

Bereiten Sie neun 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben vor und geben Sie jeweils 25 Milliliter SC minus URA hinzu. Bereiten Sie anschließend sieben der Kolben mit unterschiedlichen Verdünnungen von Beta-Estradiol vor, wie im textlichen Protokoll angegeben, durch zehnfache serielle Verdünnung eines 25-Millimolar-Beta-Estradiol-Grundansatzes. Geben Sie 125 Mikroliter der Übernachtkulturen zu diesen sieben Kolben. Für die beiden verbleibenden Kolben verwenden Sie einen konstitutiven GFP-produzierenden Stamm und einen Stamm ohne GFP. Diese werden zur Kalibrierung des Durchflusszytometers benötigt.

Schütteln Sie den Kolben bei 200 U/min und 30 Grad Celsius für 12 bis 18 Stunden. Entnehmen Sie anschließend 500 Mikroliter jeder Kultur und zentrifugieren Sie diese in separaten 1,7-Milliliter-Einwegröhrchen. Nach dem Absaugen des Überstandes waschen Sie das Zellpellet einmal mit Durchflusszytometriebuffer und resuspendieren die Zellen anschließend in einem Milliliter desselben Puffers.

Fügen Sie anschließend ein Milliliter Durchflusszytometrie-Puffer zu neun Falcon-2 hinzu. Geben Sie die resuspendierten Zellen zu den Puffer enthaltenden Falcon-Röhrchen, um ein Endvolumen von zwei Millilitern zu erreichen. Führen Sie abschließend die Durchflusszytometrie durch.

Verwenden Sie Vorwärtsstreuung und Seitwärtsstreuung, um Hefezellen zu identifizieren. Stellen Sie die Durchflussrate auf etwa 3000 Zellen pro Sekunde ein. Messen Sie die GFP über den 50-Kanal und verfahren Sie wie im Textprotokoll beschrieben: Streichen Sie aus gefrorenen Stämmen sowohl einen Stamm mit als auch einen Stamm ohne A TF auf YPD aus. Nach zwei Tagen Wachstum impfen Sie separate Kulturröhrchen, die fünf Milliliter flüssiges YPD enthalten, mit jeweils einem Stamm an und kultivieren diese über Nacht bei 30 Grad Celsius.

Führen Sie zehnfache serielle Verdünnungen einer 0,25 mmolaren Beta-Estradiol-Standardlösung bis zu einer 10.000-fachen Verdünnung in 100 % Ethanol durch. Geben Sie 40 Mikroliter jeder Übernachtkultur zu 10 Milliliter flüssigem YPD. Geben Sie für jeden Stamm 96 Mikroliter der verdünnten Zellen in 18 Vertiefungen einer 96-Loch-Platte.

Fügen Sie dann vier Mikroliter Beta-Estradiol zu den Zellen hinzu. Ein wesentlicher Punkt ist sicherzustellen, dass jedes Loch die gleiche Gesamtmenge an Ethanol enthält. Führen Sie eine dreifache Wiederholung mit drei Löchern pro Stamm durch, wobei nur Ethanol enthalten ist.

Stamproben bedecken die 96-Well-Platte mit einer gasdurchlässigen Membran. Überwachen Sie das Wachstum bei einer optischen Dichte von 600 Nanometern in einem Plattenreader. Quantifizieren Sie die Wachstumsraten mit einer beliebigen Anzahl von Methoden, beispielsweise durch Ermittlung der maximalen Steigung.

Nach der Herstellung des Plasmids gemäß der schriftlichen PCR-Anleitung amplifizieren Sie die canMX-Promotorkassette. Transformieren Sie das PCR-Produkt mittels der Lithiumacetat-Methode in einen ATF-exprimierenden Stamm, plattieren Sie die transformierten Zellen auf YPD und führen Sie am folgenden Tag eine Replikaplatte auf YPD plus G418-Antibiotikum durch. Bestätigen Sie abschließend die korrekte Insertion des Promotors unter Verwendung eines Vorwärtsprimers und eines Rückwärtsprimers, der innerhalb des Gens lokalisiert ist, dessen Promotor ersetzt wurde.

Das endgültige PCR-Produkt ist etwa 1,2 KB groß. Dargestellt ist hier die Induktion von GFP durch drei verschiedene aTF-Promotor-Paare: Z4-EV, Z3-EV bzw. GEV über die Zeit hinweg in Reaktion auf ein Mikromolar Beta-Estradiol. Beachten Sie die Zunahme der GFP-Produktion als Antwort auf die aTFs, die nicht-yeast-spezifische DNA-Bindedomänen enthalten. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass diese Faktoren in dem Hefe-Genom eine Einzelgen-Spezifität erreichen.

Die alleinige GEV-Induktion führt zur Aktivierung oder Repression von Hunderten von Genen, während Z drei EV und Z vier EV lediglich die Expression eines Zielgens aktivieren, das stromabwärts eines synthetischen Promotors mit geeigneten Bindungsstellen positioniert ist. Hier wird die Induktion von GFP durch Z drei EV in Reaktion auf null Nanomolar Beta-Estradiol sowie ein Mikromolar Beta-Estradiol nach 18 Stunden Induktion gezeigt. Die Fluoreszenz wurde zudem aus Zellen ohne GFP gemessen, um die straffe Regulation des Z drei EV-Systems zu veranschaulichen. Die Fähigkeit von Z drei EV, GFP über einen Bereich an Beta-Estradiol-Konzentrationen hinweg zu induzieren, ist hier dargestellt.

Die mittlere Fluoreszenz der Verteilungen zeigt, dass die Beziehung zwischen Induktorkonzentration und Expressionsausgabe graduell ist, mit einem Hill-Koeffizienten von etwa eins, was auf eine unabhängige Bindung von Z drei EV hinweist. Mit dieser Methode könnten weitere Verfahren wie Genexpressions-Mikroarrays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie die veränderte Expression eines einzelnen Gens genomweite Expressionsmuster beeinflusst. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man künstliche Transkriptionsfaktoren konstruiert, testet und deren Wirksamkeit validiert. Diese künstlichen Transkriptionsfaktoren steuern bedingt die Expression von Genen, die downstream geeigneter DNA-Zielsequenzen positioniert sind.