Name: Rapid-Synthese und Screening von Chemisch aktivierte Transkriptionsfaktoren mit GFP-basierte Reporter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-26T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Lernen Sie die Konstruktion und Validierung chemisch induzierbarer künstlicher Transkriptionsfaktoren in Hefe mittels GFP-Reporter und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die bedingte Genexpression unter verschiedenen physiologischen Bedingungen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

RSM erkennt Finanzierung von der NSF Graduate Research Fellowship. MBN erkennt Finanzierung aus einer Lewis-Sigler Fellowship und die Stiftungs Geschenk von Peter Lewis. DB bestätigt, Mittel aus dem NIH (GM046406) des National Institute of General Medical Sciences Center for Quantitative Biology (GM071508). Wir erkennen Christina DeCoste für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie Experimenten.

Figur 2 eine schematische Darstellung des Protokoll-Abschnitte 1-3. 1. Erstellung von ATFs <ol><li> Erstellen Primer für die PCR Amplifikation von DNA-bindenden Domäne von Interesse. Homologie zu der ACT1-Promotor und Hormon-Rezeptor (wie in den 3 und 4 beschrieben) wird durch PCR zugegeben, um eine korrekte Rekombination in dem Stamm yMN15 erleichtern. </li><li> PCR verstärken DBD von Interesse mit einem High-Fidelity-Polymerase. </li><li> Transformieren&gt; 1 ug gereinigte PCR-Produkt in Hefe unter Verwendung der Lithiumacetat-Methode 13. </li><li> Nach der Transformation, Spin-Zellen bei Höchstgeschwindigkeit für 15 Sekunden in Mikro und entfernen Transformationsmischung. </li><li> Resuspendieren in ~ 200 ul sterilem Wasser und Platte auf YPD. </li><li> Am nächsten Tag, Replik Platte von YPD auf 5-FOA-Platten (5-FOA-Platten werden wie in der Cold Spring Harbor Hefe-Handbuch beschrieben ist) 13. </li><li> Lassen Wachstum für 2-4 days und restreak mindestens 5-10 Kolonien auf YPD. Durchführen einer Kolonie-PCR unter Verwendung der Primer in Tabelle 1 und die Sequenz für die Eingliederung zu überprüfen. </li></ol> 2. Erstellung von ATF Plasmid Reporter <ol><li> Bestimmen Sie die Bindungsstelle des ATF (am ehesten von der Literatur kommen). </li><li> Um die gewünschte Bindungsregion Oligos (oder Ultramers, falls erforderlich). Bestellen Sie als Ober-und Unter Stränge mit der richtigen Überhängen für NotI und XbaI, wie in Tabelle 2 dargestellt. </li><li> Verdünnen Oligos äquimolaren Konzentrationen (100 &amp;mgr; M). </li><li> Phosphorylierung mit T4 Polynukleotid-Kinase und dann Glühen in einem Thermocycler. Die Reaktionsbedingungen sind in Tabelle 3. </li><li> Verdau ~ 1-2 &amp;mgr; g pMN8 mit NotI und XbaI-HF für 1 h bei 37 ° C (Reaktionsbedingungen in Tabelle 4). </li><li> Gel reinigt das Rückgrat Band. </li><li> Verdünnen Sie die gereinigten Backbone bis 10 ng / ul. </li><li> Verdünnen Sie die Doppelstrang-, PhosphorylATED Bindungsstelle, um die Stoffmengenkonzentration von Backbone pro ul 5x. </li><li> Verwendung von T4-DNA-Ligase zu ligieren, die Bindungsstellen in den verdauten Rückgrat bei Raumtemperatur für 30 min (Tabelle 5). </li><li> Für die Transformation, fügen die Hälfte der Ligationsreaktion zu 50 ul von Standard-, chemisch kompetente Escherichia coli, wie XL1-Blue oder DH5-Alpha. </li><li> Hitzeschock-Zellen, die für 45 Sekunden in einem 42 ° C Wasserbad und legen Sie dann auf Eis für 2 min. </li><li> In 900 ul SOC-Medium der Transformation Reaktion. </li><li> Wachsen bei 37 ° C für 1 h auf einer Walzentrommel. </li><li> Verbreiten 100-200 Zellen pro ul LB + AMP (100 ug / ml) Platte und Inkubation über Nacht. </li><li> Grow up E. coli in LB + AMP Flüssigkeit und Ernte Plasmid-DNA. Sequence überprüfen neuen Reporter-Plasmid von Kolonien Ligation unter Verwendung des Primers 5&#39;-GTACCTTATATTGAATTTTC-3 &#39;. </li><li> Trans neuen Reporter-Plasmid in ATF-haltigen Hefe strain von Abschnitt 1 mit Lithium-Acetat-Transformation. </li></ol> 3. Quantifizierung der Wirkung von ATF Induktion über Gene Expression Mit GFP-Reporter Vorbereitung der Proben: <ol><li> Machen Sie 25 mM β-Estradiol-Lager (10 ml Ethanol + 0,0681 g β-Estradiol). Im Kühlschrank. </li><li> Wachsen ATF +-Stamm Reporter haltige über Nacht in 5 ml SC-URA. </li><li> Erhalten neun 250 ml-Schüttelkolben und 25 ml SC-URA zu jedem. </li><li> In 0 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 uM oder 10 uM β-Estradiol. Dies geschieht am einfachsten, indem Sie das 10-fache serielle Verdünnungen der 25 mM β-Estradiol Lager getan. Für eine endgültige Konzentration von 10 uM β-Estradiol, fügen Sie 10 ul der 25 mM β-Estradiol Lager zu 25 ml SC-URA. </li><li> In 125 ul der Übernachtkulturen in Kolben (1:200 Verdünnung). </li><li> Für die restlichen zwei Fläschchen, impfen mit einem konstitutiven GFP Herstellung Strain und ein Stamm fehlt GFP. Diese werden für die Kalibrierung des Durchflusszytometers benötigt. </li><li> Schütteln bei 200 rpm bei 30 ° C für 12-18 Stunden. Hinweis: Die optimale Inkubationszeit wird durch die Identifizierung, wenn GFP-Induktion nicht mehr ändert nach Zugabe von β-Östradiol bestimmt. </li><li> Nehmen Sie 500 ul jeder Kultur und Spin-down in separaten 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Saugen SC-URA. </li><li> Einmal in 1 ml PBS + 0,1% Tween-20 waschen und absaugen. </li><li> 1 ml PBS + 0,1% Tween-20 und resuspendieren. </li><li> 1 ml PBS + 0,1% Tween-20 Falcon-Röhrchen. </li><li> Hinzufügen der resuspendierten Zellen auf 5-ml-Röhrchen (Endvolumen = 2 ml) (mit 4 ° C für mehrere Tage gelagert werden.) </li><li> Optional: beschallen Zellen leicht, um etwaige Trennung verklumpte Zellen. Durchflusszytometrie-Analyse: Überblick: Die Fluoreszenz von 10.000-100.000 Zellen wird in der Regel pro Probe analysiert. Die Daten können entweder in FlowJo oder mit benutzerdefinierten Skripten in MATLAB oder verarbeitet werdenR. Achten Sie darauf, um die Spannung des GFP-Kanal-Kalibrierung mit GFP-positiven und negativen Kontrollen. Sobald die FCS-Dateien exportiert werden, ein Skript, wie in Abbildung 6 zusammen mit den Funktions fca_readfcs ( <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/9608-fcs-data-reader</a> können) verwendet, um das zu verarbeiten Daten. </li><li> Führen Durchflusszytometrie. <ol><li> Verwenden Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC), Hefe-Zellen zu identifizieren. </li><li> Die Durchflussrate auf ~ 3.000 Zellen / sec. </li><li> Messen GFP (FITC Kanal). </li><li> Sobald die Daten erhoben werden, zu exportieren. FCS-Dateien </li></ol></li><li> Legen MATLAB. </li><li> Verschieben Sie die. FCS-Dateien fcs_readfcs.m und ein Skript ähnlich dem aus Abbildung 6 in den gleichen Ordner. </li><li> Ändern Sie die aktuelle Arbeitsverzeichnis in den Ordner mit den Daten und Skripte. </li><li> Führen Sie das Skript aus Abbildung 6 (Hinweis: DieLegende wurde manuell eingegeben werden, um zu produzieren, was in Abbildung 7 zu sehen). </li></ol> 4. Quantifizierung der Wirkung von ATF Induktion auf das Zellwachstum <ol><li> Von gefrorenen Aktien, Streifen sowohl (1) ein ATF-haltigen Stamm und (2) ein ATF-Stamm fehlt (wie yMN15) auf separate YPD-Platten. </li><li> Nach 2 Tagen Wachstum inokulieren separaten Kulturröhrchen, enthaltend 5 ml YPD-Flüssig mit jedem Stamm und über Nacht wachsen bei 30 ° C </li><li> Führen Sie 10-fach serielle Verdünnungen einer 0,25 mM β-Estradiol-Stammlösung bis zu 10.000-fach (0,025 uM β-Estradiol) in 100% Ethanol. </li><li> In 40 ul-Nacht-Kulturen zu 10 ml YPD-Flüssigkeit (1-250 Verdünnung). </li><li> Für jeden Stamm, füge 96 &amp;mgr; l der verdünnten Zellen auf 18 Wells einer 96-Well-Platte. </li><li> Hinzufügen von 4 ul β-Östradiol zu den Zellen. Ein wesentlicher Punkt ist, um sicherzustellen, dass jeder auch die gleiche Menge an Gesamt-Ethanol. (Alternativ kann ein mo<html> re konzentrierte Stamm von β-Estradiol verwendet werden und anschließend auf den Punkt verdünnt die Wirkung von Ethanol auf Wachstum ist nicht messbar). </li><li> Führen Sie in dreifacher Ausfertigung. Drei der Vertiefungen für jeden Stamm sollte Ethanol nur steuert. </li><li> Decken Sie die 96-Well-Platte in gasdurchlässige Membran. </li><li> Überwachung Wachstum (OD 600) in Plattenlesegerät. </li><li> Quantifizierung der Wachstumsraten mit einer beliebigen Anzahl von Standardmethoden wie das Finden der maximalen Steigung. Hinweis: Wir haben gute Erfolge mit der Open-Source-Software-Paket Grofit 14, die in der R-Programmierumgebung läuft hatte Es ist erwähnenswert, dass, während die Wachstumsraten von 96-Well-Plattentests berechnet, verglichen mit (25 ml Kulturen)-Fläschchen schütteln. sind nicht unbedingt die gleichen (aufgrund beiden Unterschiede in der Physiologie und in der Instrumentierung), haben wir beobachtet, dass die relativen Wachstumsraten sind ähnlich (obwohl dies nicht immer der Fall sein). </li></ol>tle &quot;&gt; 5. erstellen Inducible Genomic Allele <ol><li> Erhalten pMN10, noncentromeric ein Plasmid mit der ATF-responsive Promotor aus pMN8 zu KanMX (in der entgegengesetzten Orientierung) fusioniert. </li><li> Beschränkung verdauen die Vektor-Rückgrat und Gel-Extrakt, wie in Abschnitt 2. </li><li> Glühen, phosphoryliert und Ligats Oligos, die geeignete Bindungsstellen, wie in Abschnitt 2 beschrieben. </li><li> Sequenz zu überprüfen. Dieses Plasmid wird nun als DNA-Vorlage für die Erstellung der induzierbaren Allel zu dienen. </li><li> Erhalten Sie die Hefestamm die entsprechende ATF von Interesse exprimieren. </li><li> PCR verstärken die KanMX-Promoter Kassette (~ 2 kb) unter Verwendung der Primer aus Tabelle 6. </li><li> Transformieren Sie das PCR-Produkt in die ATF-exprimierenden Stamm unter Verwendung der Lithium-Acetat-Methode. </li><li> Platte auf YPD-und Replika Platte auf YPD + G418 am folgenden Tag. </li><li> Bestätigen geeignete Insertion des Promotors unter Verwendung des Vorwärts-Primers (5&#39;-CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT-3 &#39;) und einen Rückwärtsprimer internen the Gen, dessen Promotor ersetzt wurde. Der Reverse-Primer ist typischerweise entworfen, um zwischen 200-300 bp stromabwärts des ersten ATG 15 sein. Das endgültige PCR-Produkt wird ~ 1,2 kb. </li></ol>

<ol><li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+gene+expression+perturbation+systems+with+rapid%2C+tunable%2C+single-gene+specificity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+res%22%5BJournal%5D)">Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast.</a> Nucleic acids res. 41, e57(2013).</li>
<li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+cell%22%5BJournal%5D)">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Biol. cell. 22, 4447-4459 (2011).</li>
<li>Louvion, J. F., Havaux-Copf, B., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+GAL4-VP16+to+a+steroid-binding+domain+provides+a+tool+for+gratuitous+induction+of+galactose-responsive+genes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Fusion of GAL4-VP16 to a steroid-binding domain provides a tool for gratuitous induction of galactose-responsive genes in yeast.</a> Gene. 131, 129-134 (1993).</li>
<li>Littlewood, T. D., Hancock, D. C., Danielian, P. S., Parker, M. G., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+oestrogen+receptor+ligand-binding+domain+as+an+improved+switch+for+the+regulation+of+heterologous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+res%22%5BJournal%5D)">A modified oestrogen receptor ligand-binding domain as an improved switch for the regulation of heterologous proteins.</a> Nucleic acids res. 23, 1686-1690 (1995).</li>
<li>McIsaac, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+Analysis+of+mRNA+Molecules+Using+Fluorescence+In+Situ+Hybridization+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Vis. Exp. (76), e50382(2013).</li>
<li>McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation-based+analysis+and+modeling+of+combinatorial+regulation+in+the+yeast+sulfur+assimilation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+cell%22%5BJournal%5D)">Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway.</a> Mol. Biol. cell. 23, 2993-3007 (2012).</li>
<li>Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., Herrero, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+activator%2Frepressor+dual+system+allows+tight+tetracycline-regulated+gene+expression+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+res%22%5BJournal%5D)">An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast.</a> Nucleic acids res. 26, 942-947 (1998).</li>
<li>Baron, U., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+repressor-based+system+for+regulated+gene+expression+in+eukaryotic+cells%3A+principles+and+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tet repressor-based system for regulated gene expression in eukaryotic cells: principles and advances.</a> Meth. Enzymol. 327, 401-421 (2000).</li>
<li>Kodama, S., Okada, K., Akimoto, K., Inui, H., Ohkawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+aryl+hydrocarbon+receptors+for+bioassay+of+aryl+hydrocarbon+receptor+ligands+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Recombinant aryl hydrocarbon receptors for bioassay of aryl hydrocarbon receptor ligands in transgenic tobacco plants.</a> Plant Biotechnol. J. 7, 119-128 (2009).</li>
<li>Hickman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+regulation+of+sulfur+and+phospholipid+metabolism+reflects+the+importance+of+methylation+in+the+growth+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+cell%22%5BJournal%5D)">Coordinated regulation of sulfur and phospholipid metabolism reflects the importance of methylation in the growth of yeast.</a> Mol. Biol. cell. 22, 4192-4204 (2011).</li>
<li>Taxis, C., Stier, G., Spadaccini, R., Knop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+protein+depletion+by+genetically+controlled+deprotection+of+a+dormant+N-degron%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient protein depletion by genetically controlled deprotection of a dormant N-degron.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 267(2009).</li>
<li>Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auxin-based+degron+system+for+the+rapid+depletion+of+proteins+in+nonplant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells.</a> Nat. methods. 6, 917-922 (2009).</li>
<li>Burke, D. J., Amberg, D. C., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurke%2C+DJ+%22Methods+in+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%22">Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual</a>. , (2005).</li>
<li>Kahm, M., Hasenbrink, G., Lichtenberg-Frate, H., Ludwig, J., Kschischo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((grofit%3A+Fitting+Biological+Growth+Curves+with+R%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Stat.+Softw%22%5BJournal%5D)">grofit: Fitting Biological Growth Curves with R.</a> J. Stat. Softw. 33, 1-21 (2010).</li>
<li>Rozen, S., Skaletsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods Mol. Biol. 132, 365-386 (2000).</li>
<li>Khalil, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+biology+framework+for+programming+eukaryotic+transcription+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions.</a> Cell. 150, 647-658 (2012).</li>
<li>Chockalingam, K., Chen, Z., Katzenellenbogen, J. A., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+specific+receptor-ligand+pairs+for+use+in+the+creation+of+gene+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of specific receptor-ligand pairs for use in the creation of gene switches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5691-5696 (2005).</li>
<li>McLachlan, M. J., Chockalingam, K., Lai, K. C., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+orthogonal+ligand+specificity+in+a+single+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of orthogonal ligand specificity in a single scaffold.</a> Angewandte Chemie. 48, 7783-7786 (2009).</li>
<li>Jorgensen, P., Nishikawa, J. L., Breitkreutz, B. J., Tyers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+pathways+that+couple+cell+growth+and+division+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of pathways that couple cell growth and division in yeast.</a> Science. 297, 395-400 (2002).</li>
<li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol. cell. 21, 319-330 (2006).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+biotechnol%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nat. biotechnol. 20, 1041-1044 (2002).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-inducible+spatiotemporal+control+of+gene+activation+by+customizable+zinc+finger+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 16480-16483 (2012).</li>
<li>Losi, A., Gartner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+chromophores%2C+new+photoactivation+paradigms%2C+trendy+applications%3A+flavins+in+blue+light-sensing+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Old chromophores, new photoactivation paradigms, trendy applications: flavins in blue light-sensing photoreceptors.</a> Photochem. Photobiol. 87, 491-510 (2011).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+deconstruction+of+parkinsonian+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry.</a> Science. 324, 354-359 (2009).</li>
<li>Milias-Argeitis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+feedback+for+in+vivo+regulation+of+a+gene+expression+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+biotechnol%22%5BJournal%5D)">In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit.</a> Nat. biotechnol. 29, 1114-1116 (2011).</li>
</ol>

McIsaac, Noyes und Botstein (mit anderen) sind Teil dieses Systems als Patent Offenlegung eingereicht.

Die hier beschriebenen Hormon-basierte Schalter haben unzählige Anwendungen, von nativen Zellbiologie studieren, um zu testen, ob eine DNA-Bindungsdomäne von Interesse, eine DNA-Sequenz in vivo zielen. Das System hat viele wünschenswerte Eigenschaften, einschließlich einer abgestuften Reaktion auf Induktor, schnelle Action, und strenge Regulierung (dh. Keine messbare Undichtigkeit, siehe Abbildung 7). Es gibt jedoch immer noch Raum für Verbesserung und Erweiterung. Die jüngsten Arbeiten in der synthetischen Biologie hat Multiplex synthetischen Systemen betont und erweitert das Repertoire der gut charakterisierten, programmierbare DNA Teile 16. Independent, bedingter Ausdruck von unterschiedlichen Zielgenen erfordert sowohl mehrere Induktoren und DNA-Bindungsdomänen, die sich überlappenden Spezifität fehlt. Die Verfügbarkeit von Engineered und natürlich vorkommende Rezeptoren bietet eine große Anzahl von Teilen, mit denen neue künstliche Transkriptionsfaktoren zu entwickeln. Der Ausbau derRepertoire von zueinander orthogonalen Schalter wurde stark durch gerichtete Evolution gestützte Ansätze 17,18. Die derzeitigen Bemühungen, den Liganden-Bindungsspezifität von unserer künstlichen Transkriptionsfaktoren umprogrammieren in der Zukunft vorgestellt werden. Bisher wurden die phänotypischen Auswirkungen der Gen-Deletion / Überexpression sind ausführlich in Hefe 19,20 sucht. Es hat sich jedoch nicht einfach ist, die Wirkung der Expression von verschiedenen Phänotypen über einen Bereich von Expressionsniveaus zu studieren. Ein Hauptmerkmal des hier vorgestellten Systems ist die abgestufte Natur (Abbildung 8). Während häufig angenommen, die Beziehung zwischen Genexpression und Phänotypen von Interesse nicht notwendigerweise monoton sein. Künstliche Transkriptionsfaktoren wie Z 3 und Z 4 EV EV wird die Aufgabe der Bestimmung der phänotypischen Reaktion auf Änderungen in der Genexpression einfach machen. Schließlich werden die Protokolle diskutierened in diesem Manuskript sind für technische und Charakterisierung künstliche Transkriptionsfaktoren, die an β-Östradiol reagieren, jedoch eine wichtige Alternative zu chemisch reaktionsDomänen ist die Verwendung von auf Licht reagierenden Domänen (wie die PhyB/Pif3, LOV, und BLUF) deren Aktivitäten sind reversibel, ohne die Kultur Wachstumsmedium 21-23 stören. Lichtsysteme erleichtern räumlich-zeitliche Kontrolle der Genexpression, Protein-Protein-Wechselwirkungen, Ionentransport, und die enzymatische Aktivität, die bereits leistungsfähige 21-26 bewährt haben. Zusammenfassend haben wir Methoden für die schnelle Konstruktion von induzierbarer, künstliche Transkriptionsfaktoren in Hefe dargestellt. Dieses Protokoll stellt eine Vorlage für die Konstruktion in Verbindung mit zugehörigen GFP-Reporter, wie auch Methoden für die Analyse der Daten unter Verwendung von Reporter-Durchflusszytometrie und Testen der Wirkung des ATF-Aktivierung auf Wachstum.

Entwicklung von genetischen Schalter in Hefe ist von großem Interesse, sowohl in der akademischen und industriellen Forschung. Im Idealfall können genetische Schalter verwendet werden, um ein bestimmtes Gen (oder eine Gruppe von Genen) nur aktiviert, wenn der Experimentator wünschen übrig. Eines Gens kodierende Sequenz stromabwärts von einem synthetischen Promotors nicht in Abwesenheit einer induzierenden Moleküls ausgedrückt: auf Induktors zusätzlich das Gen sollte rasch ausgedrückt werden. Es wurde erst kürzlich gezeigt, daß ein solcher Schalter kann in Hefe, wobei in Abwesenheit des Induktors, zeigt der Stamm eine Deletion Phänotyp, jedoch in Gegenwart von Induktor wird die Expression im Verhältnis zu der Ebene der Induktor in allen Zellen aktiviert konstruiert werden, 1,2. Historisch haben bedingten Expressionssysteme in Hefe stark auf nährstoff reaktive DNA-Sequenzen, darunter die MET, FO und GAL-Promotoren (deren Aktivitäten sind empfindlich gegen extrazelluläre Konzentration von Methionin, Phosphat und verlassenGalactose, jeweils). Während Bedingungsausdruck erzielt werden kann, kommt es auf Kosten einer signifikanten pleiotrope Effekte. Hormonrezeptoren, wie dem menschlichen Östrogen-Rezeptoren haben sich als wirksam schaltet in Eukaryonten 3,4 sein. In Abwesenheit des Hormons, kann ein Protein mit einem Hormonrezeptor fusioniert im Cytoplasma, wo sie mit dem Hsp90-Chaperon-Komplex interagiert, sequestriert werden. Bei der Bindung der entsprechenden Liganden der Rezeptor eine Konformationsänderung, wodurch es zu der Hsp90-Chaperon-Komplex freigesetzt werden und enthüllt ein Kernlokalisationssignal. Um die Lokalisation Dynamik einer bestimmten Hormonrezeptor-enthaltendes Protein beobachten wir eine C-terminale Fusion Gal4dbd.ER.VP16 (GEV, einem synthetischen Transkriptionsfaktor, der die Gal4p DNA-Bindungsdomäne, die Ligandenbindungsdomäne des humanen Östrogenrezeptor geschaffen und VP16) mit GFP 2. Kernlokalisierungs wurde innerhalb von 8 min nach der Zugabe von beobachtetensättigenden Mengen der Induktor ß-Östradiol, zu dem Wildtyp-Hefe ist völlig inert. Bis zu diesem Zeitpunkt die Mehrheit der Zellen deutlich sichtbar aktiv Stellen für Transkriptions GEV Zielgene (über Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung untersucht) sowie ausgereifte mRNAs 2,5. GEV Zielgene in Ausdruck&gt; 2-fach innerhalb von 2,5 min 2,6 (gemessen mit Microarrays) erhöht, was zeigt, dass es &lt;2,5 min für die chimären Aktivator in den Zellkern transloziert, binden DNA und aktivieren Transkription. Während mehrere andere Online-Schalter sind in der Hefe, die verschiedene kleine Moleküle oder Medikamente (einschließlich der klassischen Doxycyclin-basierte Switches von Escherichia coli 7,8 und ein Indigo-basierte Schalter 9 von Arabidopsis thaliana), keiner hat die Geschwindigkeit erreicht, nutzen angewandt wurde, Spezifität oder Dichtheit der Regelung durch die Hormon-basierten Switches ausgestellt. Es ist erwähnenswert tHut schnelle off-Schalter sind auch in Hefe entwickelt, und in der Regel durch Fusion eines Gens auf eine Protease oder Ubiquitin-Ligase-Zielsequenz 2,10,11,12 arbeiten. Die Fähigkeit, schnell zu entfernen eines Zielproteins aus der Zelle erleichtert die Untersuchung essentieller Gene sowie Gene, die anfällig für genetische Ausblendung bei 10 gelöscht. Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren sind für den Aufbau und Charakterisierung von synthetischen on-Schalter in Hefe. Zuerst wird gezeigt, wie schnell erzeugen genomisch integriert Fusionsproteine ​​bestehend aus einer DNA-bindenden Domäne von Interesse, die Ligandenbindungsdomäne des humanen Östrogen-Rezeptor und VP16 (DBD-EV). Nach unserem Protokoll, wird das Fusionsprotein aus einem ACT1 Promotors exprimiert. Wir zeigen dann, wie man einen verwandten Reporter-Plasmid für die ATF erstellen und testen Sie die Funktionalität mit der Durchflusszytometrie. Obwohl wir uns vorstellen, wobei diese Reporter-Plasmide mit neuen ATFs (Abbildung 1) verwendet, so kann be als Reporter für eine native Transkriptionsaktivator als gut. Schließlich Einzelheiten zum Testen der Wirkung der ATF-Aktivierung auf das Zellwachstum in 96-Well-Platten und zum Engineering induzierbaren genomischen Allele sind vorgesehen.

<table><tbody><tr><td>Name des Reagenzes</td><td></td><td>Firmenkatalognummer</td><td>Kommentare&nbsp;</td></tr><tr><td>Erweitern High Fidelity PCR System</td><td>Roche</td><td>11 732 650 001</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Kompetent E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>18258-012</td><td></td></tr><tr><td>Estradiol</td><td>Tocris Biosciences</td><td>2824</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynukleotidkinase</td><td>NEB</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-23</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>clonNAT</td><td>Jena Bioscience</td><td>AB-102L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D15-500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Pepton</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>BD Biosciences</td><td>210929</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Life Technologies</td><td>11811-031</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumacetat-Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6883</td><td></td></tr><tr><td>Lachsspermien-DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide pMN8 und pMN10; Hefestamm yMN15</td><td>Noyes oder Botstein Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Bouillon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3397</td><td></td></tr><tr><td>AUSRÜSTUNG:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSRII Durchfluss-Cyometer &nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Verschiedene Modelle</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB oder FlowJo</td><td>MATLAB oder FlowJo</td><td></td><td>Software für die Analyse von . FCS-Dateien aus Durchflusszytometrie-Experimenten</td></tr><tr><td>R</td><td>Open Source</td><td></td><td>Zur Analyse von Wachstumsratendaten von Plattenlesern.</td></tr><tr><td>Falcon Tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml Eppendorf&nbsp; Röhrchen</td><td>GeneMate</td><td>C3262-1</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Schüttelkolben</td><td>Corning</td><td>4446-250</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten mit flachem Boden</td><td>Costar</td><td>3635</td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader (Synergy H1 Multi-Mode Plate Reader)</td><td>BioTek</td><td>H1MG</td><td></td></tr><tr><td>Breathe-Easy Membranen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>verschiedene Firmen</td><td>Verschiedene Modelle</td><td></td></tr><tr><td>: SC-Ura Pulver</td>, <td>MP Biomedicals</td><td>, 114410622</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA,</td><td>Zymo Research</td><td>F9001-1</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid-synthese und screening von chemisch aktivierte transkriptionsfaktoren mit gfp-basierte reporter

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetische Biologie zielt darauf ab, rational planen und bauen Kunstkreise mit gewünschten Eigenschaften quantitative als auch bieten Werkzeuge, um die Struktur von nativen Regelkreise zu befragen. In beiden Fällen kann die Fähigkeit, die Genexpression in einer schnellen und abstimmbare Mode zu programmieren, ohne Off-Target-Effekte, nützlich sein. Wir haben Hefestämme, die die ACT1 Promotor stromaufwärts einer URA3-Kassette, gefolgt von der Ligandenbindungsdomäne des humanen Östrogen-Rezeptor und VP16 aufgebaut. Durch Transformation dieses Stammes mit einer linearen PCR-Produkt, enthaltend eine DNA-Bindungsdomäne und Auswählen gegen die Anwesenheit von URA3 kann ein konstitutiv exprimiert künstlichen Transkriptionsfaktor (ATF) durch homologe Rekombination erzeugt werden. ATF auf diese Weise konstruiert werden eine einzigartige Zielgens in der Gegenwart eines Induktors aktiviert, wodurch sowohl das Off-Target-Aktivierung und nicht-physiologischen Wachstumsbedingungen mit häufig verwendeten conditi gefunden Beseitigungonal-Gen-Expressionssystemen. Ein einfaches Verfahren für die schnelle Konstruktion von GFP-Reporter-Plasmiden, die spezifisch an ein natives oder künstlichen Transkriptionsfaktors von Interesse reagieren, ist ebenfalls vorgesehen.

<html> Abbildung 5 zeigt die Induktion von GFP durch Z 3 EV, Z 4 EV oder GEV über die Zeit. Beachten Sie die Erhöhung der GFP-Produktion in Reaktion auf die ATF nonyeast enthaltenden DNA-Bindungsdomänen. Wir haben vor kurzem spekuliert, dass dies ergibt sich aus diesen Faktoren Erreichung Single-Gen-Spezifität in das Genom der Hefe ein. GEV Induktion allein führt zur Aktivierung / Repression der Hunderte von Genen, während Z 3 und Z 4 EV EV nur die Expression eines Zielgens aktiviert hinter einem synthetischen Promotor, die geeignete Bindungsstellen (5&#39;-GCGTGGGCG-3 &#39;und 5&#39;-gelegt GCGGCGGAGGAG-3 &#39;, respectively) ein. Abbildung 7 zeigt die strenge Regulierung des Systems (keine Induktor zu keiner nachweisbaren GFP) und dass alle Zellen als Antwort bekommen Induktor induziert, um die Fähigkeit der Z 3 EV an GFP in einer Reihe von induzieren β-Östradiol-Konzentrationen ist in Fig. 8 gezeigt. <html> ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Künstliche Transkriptionsfaktoren interagieren mit Hsp90 in Abwesenheit von β-Östradiol. Wenn β-Östradiol bindet an das ATF, Hsp90 distanziert, so dass das ATF in den Zellkern einzudringen und Expression von Plasmid-Reporter. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung des Protokolls für Engineering-Stämme, die künstliche Transkriptionsfaktoren und Gebäude / Prüfung verwandten GFP Reporter enthalten. load/51153/51153fig3highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51153/51153fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. Die ACT1pr-URA3-EV-Sequenz in dem Stamm yMN15 an der LEU2-Locus. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig4.jpg" /> 4. Entwurf von PCR-Primern für die Amplifikation einer DNA-Bindungsdomäne von Interesse mit zusätzlichen Sequenzhomologie, um ein neues Fusionsprotein zu erzeugen, wenn erfolgreich in yMN15 transformiert. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig5.jpg" /> 5. GFP-Induktion durch drei ATF-Promotor-Paare in Reaktion auf 1 uM β-Östradiol. &lt;/ P&gt; <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig6.jpg" /> Abbildung 6. Ein MATLAB-Skript für die Verarbeitung der Durchflusszytometrie Daten. Dieses Skript wurde von angepasst <a href="http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data">http://openwetware.org/wiki/McClean:_Matlab_Code_for_Analyzing_FACS_Data</a> . <img alt="Fig. 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig7.jpg" /> Abbildung 7. Induktion von GFP durch Z 3 EV in Reaktion auf 0 μ M β-Estradiol und 1 uM β-Estradiol folgenden 18 Stunden der Induktion. Fluoreszenz war auch meavon Zellen ohne GFP, die strenge Regulierung des Z 3 EV-System veranschaulichen, sichergestellt ist. Diese Zahl wurde mit der Code in Abbildung 6 erzeugt. <img alt="Fig. 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51153/51153fig8.jpg" /> Figur 8. Die Beziehung zwischen Konzentration und Induktor Ausdruck Ausgang mit einem Hill-Koeffizienten von ca. 1 bewertet. (A) Verteilungen der GFP-Expression als Funktion der β-Estradiol-Konzentration. (B) Die mittlere Fluoreszenz der Ausschüttungen aus (A). Die Daten wurden an die Funktion G (D) = g min + (G max, G min) D n / (K + n D n), wobei D die Dosis β-Estradiol, G min und G max sind die minimalen und Höchstwerte GFP, resziehungs, n der Hill-Koeffizient, und K der β-Estradiol-Dosis, die ½ (G max + G min) ergibt. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="176"><tbody><tr><td> Oligonukleotidsequenz </td><td> Name </td></tr><tr><td> 5&#39;-TTGAAACCA AACTCGCCTCT-3 &#39; </td><td> DBD Zukunfts prüfen </td></tr><tr><td> 5&#39;-tccagagac ttcagggtgct-3 &#39; </td><td> DBD umge prüfen </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Primer zur Bestätigung korrekten Fusion DBD von Interesse für den Östrogen-Rezeptor. Der Vorwärts-Primer ist homolog der ACT1-Promotor und der Reverse-Primer ist homolog zu den Östrogen-Rezeptor. Typisch für DBDs (~ 300 bp), das PCR-Produkt &lt;1,5 kb. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Oligonukleotidsequenz </td><td> Name </td></tr><tr><td> 5&#39;-ggccgc ... DBD binging Seite ... t-3 &#39; </td><td> Top-Oligo </td></tr><tr><td> 5&#39;-ctaga ... DNA-Bindungsstelle umzukehren ... gc-3 &#39; </td><td> Bottom Oligo </td></tr><tr><td> 5&#39;-gcc gcGTGGGCG T GCGTGGGCG G G CGTGGGCG T GCGTGGGCG G GCGTG GGCG T GCGTGGGCG t-3 &#39; </td><td> Top-Oligo + 6x Zif268 Bindungsstellen </td></tr><tr><td> 5&#39;-ctagaCGCCCACGCACGCCCACGCC CGCCCACGCACGCCCACGCCCGCC CACGCACGCCCACgc-3 &#39; </td><td> Bottom-Oligo + 6x Zif268 Bindungsstellen </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. S truktur von Primern für die Erstellung von dsDNA enthält Bindungsstellen von Interesse. Um die Z 3 EV-responsive Promotor zu erstellen, die Oligonukleotide Oligo Top + 6x Zif268 Bindungsstellen und Bottom-Oligo + 6x Zif268 Binding verwendet.Sequenzen für die Erstellung der korrekten DNA-Überhänge sind in Kleinbuchstaben. Die Zif268 Konsens Bindungsstelle, GCGTGGGCG, wird in der oberen Oligo unterstrichen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Menge </td></tr><tr><td> T4 Polynukleotid-Kinase-Puffer </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> T4 Polynukleotid-Kinase (@ 10.000 Einheiten / ml) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Top Oligo (100 uM) </td><td> 1,5 ul </td></tr><tr><td> Boden Oligo (100 uM) </td><td> 1,5 ul </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 41 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Phosphorylieren und Glühen Primer in einem Thermocycler mit 50 ul der oben beschriebenen Reaktion. Es gibt zwei Thermocycler Schritte. Schritt 1: 37 ° C 30 min (Phosphorylierung), und Schritt 2: 95 ° C 30 sec (Schritt um 1 ° C alle 30 Sekunden, bis bei 4 ° C; Glühen). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Menge </td></tr><tr><td> XbaI </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> NotI-HF </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Plasmid-DNA </td><td> 5 ul (1-2 ug) </td></tr><tr><td> 10x Smart-Cut-Puffer </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 38 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Restriktionsverdau von Plasmid pMN8 mit XbaI und NotI. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr height="22" style="height:16.5pt"><td class="xl65" height="22" style="height:16.5pt;width:66pt" width="88"> Reagens </td><td class="xl66" style="width:66pt" width="88"> Menge </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> T4-Ligase Buffer </td><td> 2 ul </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> T4 Ligase </td><td> 0,2 ul </td></tr><tr height="43" style="height:32.25pt"><td> Backbone @ 10 ng / ul </td><td> 1 ul </td></tr><tr height="106" style="height:79.5pt"><td> Bindungssequenzen @ 5x Stoffmengenkonzentration / ul </td><td> 1 ul </td></tr><tr height="22" style="height:16.5pt"><td> Wasser </td><td> 15,8 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 5. Ligatbindung Websites in Plasmid-DNA. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="176"><tbody><tr><td> Grundierung </td><td> Beschreibung </td></tr><tr><td> ~ 40 bp stromaufwärts des ATG + CGCACTTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> Vorwärts-Primer zur Amplifikation KanMX-Promoter </td></tr><tr><td> 5&#39;-reverse Komplement (ATG + ~ 37bp) + TATAGTTTTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> Reverse-primer zur Verstärkung KanMX-Promoter </td></tr><tr><td> 5&#39;-caatttgtctgctcaagaaaataaa ttaaatacaaataaaCGCAC TTAACTTCGCATCTG-3 &#39; </td><td> Forward-Primer für die Herstellung GCN4 Promoter Swap. </td></tr><tr><td> 5&#39;-tggatttaaagcaaataaacttgg ctgatattcggacatTATAGTT TTTTCTCCTTGACG-3 &#39; </td><td> Reverse-Primer für die Herstellung GCN4 Promoter Swap. </td></tr></tbody></table> Tabelle 6. PCR verstärken KanMX-Promoter für die Herstellung titratible Allel.

Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren für die schnelle Konstruktion von künstliche Transkriptionsfaktoren (ATF) mit zugehörigen GFP-Reporter und Quantifizierung des ATF Fähigkeit GFP-Expression mittels Durchflusszytometrie stimulieren.

Rapid-Synthese und Screening von Chemisch aktivierte Transkriptionsfaktoren mit GFP-basierte Reporter

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, genetisch kodierbare, induzierbare künstliche Transkriptionsfaktoren oder ATFs mit gewünschter Spezifität herzustellen, zu testen und zu validieren. Dies wird zunächst erreicht, indem der ATF über eine einfache Hefetransformation erzeugt wird, bei der das Einbringen eines PCR-Produkts einer DNA-Bindedomäne zu einer in Leserichtung fusionierten Verbindung mit einem humanen Östrogenrezeptor und VP16 führt. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, ein GFP-Reportergebendes Plasmid für den ATF zu erzeugen, indem die Bindungsstellen im Plasmid PMN8 durch an den Transkriptionsfaktor gerichtete Sequenzen ersetzt werden.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Fähigkeit der ATFs, den GFP-Reporter zu aktivieren, zu testen und gleichzeitig deren Auswirkung auf die Hefe-Physiologie durch Messung der Wachstumsrate zu bewerten. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, den validierten a TF zu verwenden, um ein natives genomisches Zielgen bedingt zu exprimieren. Letztendlich kann jedes gewünschte Zielgen bedingt aktiviert werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Galactose-vermittelten Induktion der Genexpression liegt darin, dass eine selektive Induktion unter unterschiedlichen Nährstoff- und physiologischen Bedingungen ohne pleiotrope Effekte erreicht werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Hefebiologie zu beantworten, indem gewünschte Genprodukte schnell und reversibel eingeführt werden, wodurch die Untersuchung von Funktionsgewinn und Funktionsverlust ermöglicht wird. Beginnen Sie damit, mittels eines hochfidelitären Polymerase das DNA-Bindungsdomänen- oder DVD-Gen von Interesse per PCR zu amplifizieren.Transformieren Sie mehr als ein Mikrogramm des gereinigten PCR-Produkts mittels der Lithiumacetat-Methode in Hefe. Nach der Transformation zentrifugieren Sie die Zellen für 15 Sekunden mit maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge, entfernen das Transformationsgemisch und resuspendieren die Zellen in etwa 200 Mikrolitern sterilen Wassers, bevor sie auf Hefeextrakt-Pepton-Dextrose- oder YPD-Medium ausgestrichen werden. Am nächsten Tag übertragen Sie mittels Replikaplatte von YPD auf fünf Platten mit 5-Fluoroesigsäure.Nach einem Wachstum von zwei bis vier Tagen rereifen Sie mindestens fünf bis 10 Kolonien auf YPD erneut. Führen Sie anschließend eine Kolonien-PCR mit den im Textprotokoll angegebenen Primern durch und sequenzieren Sie, um die Integration zu verifizieren. Verdünnen Sie die gewünschten Oligos des Bindungsbereichs auf äquimolare Konzentrationen.Phosphorylieren Sie die Bindungsregion unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase und anschließend einem Neo-Thermocycler gemäß den Reaktionsbedingungen im Textprotokoll. Danach verdauen Sie etwa ein bis zwei Mikrogramm PMN8 mit NotI-HF und XbaI eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius Gel.Reinigen Sie das Bandskelett und verdünnen Sie das gereinigte Bandskelett auf 10 Nanogramm pro Mikroliter. Verdünnen Sie anschließend die phosphorylierte doppelsträngige Bindungsstelle auf die fünffache molare Konzentration des Bandskeletts pro Mikroliter. Fügen Sie mithilfe von T4-DNA-Ligase die Bindungsstellen bei Raumtemperatur 30 Minuten lang in das geschnittene Bandskelett ein.Führen Sie die Transformation durch, indem Sie die Hälfte der Ligationsreaktion zu 50 Mikroliter standardmäßiger chemisch kompetenter E. coli-Zellen hinzufügen und dem im Textprotokoll aufgeführten Verfahren folgen. Nach der Wiederherstellung der Zellen fügen Sie 100 bis 200 Mikroliter der Zellen pro Luria-Bertani- oder LB-Platte mit Ampicillin hinzu und inkubieren über Nacht. Am nächsten Tag züchten Sie die E. coli in flüssigem LB mit Ampicillin auf und isolieren die Plasmid-DNA gemäß der Beschreibung im Textprotokoll.Danach das neue Reportergekonid aus Ligationskolonien sequenzieren. Schließlich das neue Reportergekonid mittels Lithiumacetat-Transformation in den A TF enthaltenden E-Stamm transformieren. Beginnen Sie damit, einen TF- und Reporter-enthaltenden Stamm über Nacht in fünf Millilitern synthetischem komplettem Medium ohne Uracil anzuziehen.Bereiten Sie neun 250-Milliliter-Erlenmeyerkolben vor und geben Sie jeweils 25 Milliliter SC minus URA hinzu. Bereiten Sie anschließend sieben der Kolben mit unterschiedlichen Verdünnungen von Beta-Estradiol vor, wie im textlichen Protokoll angegeben, durch zehnfache serielle Verdünnung eines 25-Millimolar-Beta-Estradiol-Grundansatzes. Geben Sie 125 Mikroliter der Übernachtkulturen zu diesen sieben Kolben. Für die beiden verbleibenden Kolben verwenden Sie einen konstitutiven GFP-produzierenden Stamm und einen Stamm ohne GFP. Diese werden zur Kalibrierung des Durchflusszytometers benötigt.Schütteln Sie den Kolben bei 200 U/min und 30 Grad Celsius für 12 bis 18 Stunden. Entnehmen Sie anschließend 500 Mikroliter jeder Kultur und zentrifugieren Sie diese in separaten 1,7-Milliliter-Einwegröhrchen. Nach dem Absaugen des Überstandes waschen Sie das Zellpellet einmal mit Durchflusszytometriebuffer und resuspendieren die Zellen anschließend in einem Milliliter desselben Puffers.Fügen Sie anschließend ein Milliliter Durchflusszytometrie-Puffer zu neun Falcon-2 hinzu. Geben Sie die resuspendierten Zellen zu den Puffer enthaltenden Falcon-Röhrchen, um ein Endvolumen von zwei Millilitern zu erreichen. Führen Sie abschließend die Durchflusszytometrie durch.Verwenden Sie Vorwärtsstreuung und Seitwärtsstreuung, um Hefezellen zu identifizieren. Stellen Sie die Durchflussrate auf etwa 3000 Zellen pro Sekunde ein. Messen Sie die GFP über den 50-Kanal und verfahren Sie wie im Textprotokoll beschrieben: Streichen Sie aus gefrorenen Stämmen sowohl einen Stamm mit als auch einen Stamm ohne A TF auf YPD aus. Nach zwei Tagen Wachstum impfen Sie separate Kulturröhrchen, die fünf Milliliter flüssiges YPD enthalten, mit jeweils einem Stamm an und kultivieren diese über Nacht bei 30 Grad Celsius.Führen Sie zehnfache serielle Verdünnungen einer 0,25 mmolaren Beta-Estradiol-Standardlösung bis zu einer 10.000-fachen Verdünnung in 100 % Ethanol durch. Geben Sie 40 Mikroliter jeder Übernachtkultur zu 10 Milliliter flüssigem YPD. Geben Sie für jeden Stamm 96 Mikroliter der verdünnten Zellen in 18 Vertiefungen einer 96-Loch-Platte.Fügen Sie dann vier Mikroliter Beta-Estradiol zu den Zellen hinzu. Ein wesentlicher Punkt ist sicherzustellen, dass jedes Loch die gleiche Gesamtmenge an Ethanol enthält. Führen Sie eine dreifache Wiederholung mit drei Löchern pro Stamm durch, wobei nur Ethanol enthalten ist.Stamproben bedecken die 96-Well-Platte mit einer gasdurchlässigen Membran. Überwachen Sie das Wachstum bei einer optischen Dichte von 600 Nanometern in einem Plattenreader. Quantifizieren Sie die Wachstumsraten mit einer beliebigen Anzahl von Methoden, beispielsweise durch Ermittlung der maximalen Steigung.Nach der Herstellung des Plasmids gemäß der schriftlichen PCR-Anleitung amplifizieren Sie die canMX-Promotorkassette. Transformieren Sie das PCR-Produkt mittels der Lithiumacetat-Methode in einen ATF-exprimierenden Stamm, plattieren Sie die transformierten Zellen auf YPD und führen Sie am folgenden Tag eine Replikaplatte auf YPD plus G418-Antibiotikum durch. Bestätigen Sie abschließend die korrekte Insertion des Promotors unter Verwendung eines Vorwärtsprimers und eines Rückwärtsprimers, der innerhalb des Gens lokalisiert ist, dessen Promotor ersetzt wurde.Das endgültige PCR-Produkt ist etwa 1,2 KB groß. Dargestellt ist hier die Induktion von GFP durch drei verschiedene aTF-Promotor-Paare: Z4-EV, Z3-EV bzw. GEV über die Zeit hinweg in Reaktion auf ein Mikromolar Beta-Estradiol. Beachten Sie die Zunahme der GFP-Produktion als Antwort auf die aTFs, die nicht-yeast-spezifische DNA-Bindedomänen enthalten. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass diese Faktoren in dem Hefe-Genom eine Einzelgen-Spezifität erreichen.Die alleinige GEV-Induktion führt zur Aktivierung oder Repression von Hunderten von Genen, während Z drei EV und Z vier EV lediglich die Expression eines Zielgens aktivieren, das stromabwärts eines synthetischen Promotors mit geeigneten Bindungsstellen positioniert ist. Hier wird die Induktion von GFP durch Z drei EV in Reaktion auf null Nanomolar Beta-Estradiol sowie ein Mikromolar Beta-Estradiol nach 18 Stunden Induktion gezeigt. Die Fluoreszenz wurde zudem aus Zellen ohne GFP gemessen, um die straffe Regulation des Z drei EV-Systems zu veranschaulichen. Die Fähigkeit von Z drei EV, GFP über einen Bereich an Beta-Estradiol-Konzentrationen hinweg zu induzieren, ist hier dargestellt.Die mittlere Fluoreszenz der Verteilungen zeigt, dass die Beziehung zwischen Induktorkonzentration und Expressionsausgabe graduell ist, mit einem Hill-Koeffizienten von etwa eins, was auf eine unabhängige Bindung von Z drei EV hinweist. Mit dieser Methode könnten weitere Verfahren wie Genexpressions-Mikroarrays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie die veränderte Expression eines einzelnen Gens genomweite Expressionsmuster beeinflusst. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man künstliche Transkriptionsfaktoren konstruiert, testet und deren Wirksamkeit validiert. Diese künstlichen Transkriptionsfaktoren steuern bedingt die Expression von Genen, die downstream geeigneter DNA-Zielsequenzen positioniert sind.

rapid-synthesis-screening-chemically-activated-transcription-factors

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und kostengünstige Screening-Methode zur Identifizierung von Transkriptionsregulatoren mit Hochdurchsatz-Roboter-Transfektionen und ein hausgemachtes Dual-Luciferase-Assay glühen. Dieses Protokoll erzeugt schnell direkten Seite-an-Seite funktionellen Daten für Tausende von Genen und ist leicht modifizierbar, um jedes Gen von Interesse zielen.

Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

Das Erreichen einer Systemebene Verständnis zellulärer Prozesse ist ein Ziel der modernen Zellbiologie. Wir beschreiben hier Strategien zum Multiplexen Luciferase Reporter von verschiedenen zellulären Funktion Endpunkte zur Genfunktion mit genomweiten RNAi-Bibliotheken zu verhören.

Ein Multiplex-Luciferase-basierte Screening-Plattform zur Abfrage Krebs-assoziierte Signaltransduktion in kultivierten Zellen

Persistent Aktivierung inhibierenden G-Protein-gekoppelten Rezeptoren führt Sensibilisierung von Adenylylcyclase-Signalisierung. Um die wesentlichen molekularen Signalwege zu identifizieren, sind nonbiased Ansätze notwendig, aber diese Strategie erfordert die Entwicklung einer skalierbaren zellbasierten Assay-cAMP-Sensibilisierung. Hier beschreiben wir eine Sensibilisierung Assay für Kleinmolekül-und siRNA-Screening.

Drug-induzierte Sensibilisierung der Adenylatzyklase: Assay Straffung und Miniaturisierung für Small Molecule-und siRNA-Screening-Anwendungen

Hier beschreiben wir einen zellbasierten Reportergen-Assay als wertvolles Werkzeug zum Screening chemischer Bibliotheken auf Verbindungen, die posttranskriptionelle Kontrollmechanismen modulieren, die durch 3' UTR ausgeübt werden.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Eine einfache Fluoreszenz-Assay wird präsentiert, um die Effizienz von amino-Acyl-tRNA-synthestase/tRNA-Paaren, die Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) in Proteine in Säugetierzellen zu bewerten. Die Anwendung des NcAAs auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) studieren wird beschrieben, einschließlich Foto-Vernetzung Zuordnung Websites und Bioorthogonal GPCR Kennzeichnung auf lebende Zellen zu binden.

Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen

Hier präsentieren wir Ihnen eine erweiterte Hefe One-Hybrid screening Protokoll um den Transkriptionsfaktoren (TFs) zu identifizieren, die an einer menschlichen DNA-Region of Interest binden können. Diese Methode nutzt eine Hochdurchsatz-Screening-Pipeline, die die Bindung von Verhören kann &gt; 1.000 TFs in einem einzigen Experiment.

Verbesserte Hefe One-Hybrid Screens, Transkriptionsfaktor Bindung an menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren

Um neue Regulatoren von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, entwickelten wir einen Ansatz für die Bildschirmanordnung von lentiviralen oder retroviralen RNAi-Bibliotheken unter Verwendung eines auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptions-Reporter-Assays. Dieser Ansatz bietet eine schnelle und relativ kostengünstige Möglichkeit, Hunderte von Kandidaten in einem einzigen Experiment zu überprüfen.

Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter

In dieser Arbeit wird ein intrazellulärer Hochdurchsatz-Calciumfluoreszenz-Assay für 384-Well-Platten beschrieben, um kleine Molekülbibliotheken auf rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) zu screenen. Das Ziel, der Kinin-Rezeptor aus der Rinderpestzecke Rhipicephalus microplus, wird in CHO-K1-Zellen exprimiert. Dieser Assay identifiziert Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der gleichen Zellen in einem "Dual-Addition"-Assay.

Ein "Dual-Addition"-Calciumfluoreszenz-Assay für das Hochdurchsatz-Screening von rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

Diese Arbeit beschreibt eine Methode für Hochdurchsatz-Experimente mit einem 3D-gedruckten LED-Array, um die lichtinduzierbare Genexpression in HEK293T Zellen zu optimieren.

Schnelle Optimierung eines lichtinduzierbaren Systems zur Kontrolle der Genexpression von Säugetieren

Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen

Lernen Sie die Konstruktion und Validierung chemisch induzierbarer künstlicher Transkriptionsfaktoren in Hefe mittels GFP-Reporter und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die bedingte Genexpression unter verschiedenen physiologischen Bedingungen.

Rapid-Synthese und Screening von Chemisch aktivierte Transkriptionsfaktoren mit GFP-basierte Reporter

Weitere Videos entdecken