Rapid-Synthese und Screening von Chemisch aktivierte Transkriptionsfaktoren mit GFP-basierte Reporter

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, genetisch kodierte, induzierbare künstliche Transkriptionsfaktoren (ATFs) mit der gewünschten Spezifität zu erzeugen, zu testen und zu validieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das A-TF über eine einfache Hefetransformation erzeugt wird, bei der die Einbeziehung des A-DNA-Bindungsdomänen-PCR-Produkts zu einer In-Frame-Fusion mit einem humanen Östrogenrezeptor und VP 16 führt. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, ein GFP-Reporterplasmid für das A TF zu erzeugen, indem die Bindungsstellen im Plasmid PMN acht durch eine TF-Targeting-Sequenz ersetzt werden.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Fähigkeit des ATFs zur Aktivierung des GFP-Reporters zu testen und seine Wirkung auf die Hefephysiologie durch Messung der Wachstumsrate zu bewerten. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, das validierte TF zu verwenden, um ein natives genomisches Ziel bedingt zu exprimieren. Letztendlich kann jedes Zielgen von Interesse bedingt aktiv gemacht werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Galaktose-vermittelten Induktion der Genexpression besteht darin, dass eine selektive Induktion unter verschiedenen nährstoff- und physiologischen Bedingungen ohne pleotrope Effekte erreicht werden kann. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Hefebiologie zu beantworten, indem sie die gewünschte Genprodukte schnell und reversibel einführt und so die Untersuchung sowohl des Funktionsgewinns als auch des Funktionsverlusts ermöglicht. Zu Beginn wird die DNA-Bindungsdomäne oder DVD von Interesse mit einer High-Fidelity-Polymerase PCR-Amplifikation durchgeführt.

Wandeln Sie mehr als ein Mikrogramm des gereinigten PCR-Produkts mit der Lithiumacetat-Methode in Hefe um. Nach der Transformation drehen Sie die Zellen 15 Sekunden lang mit Höchstgeschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge, entfernen Sie die Transformationsmischung und resuspendieren Sie die Zellen in etwa 200 Mikrolitern sterilem Wasser, bevor Sie sie mit Hefeextrakt überziehen. Pepto Dextrose oder YPD Medium am nächsten Tag Replik Platte von YPD auf fünf Fluor Erotic Acid Platten.

Nach zwei- bis viertägigem Wachstum sollten mindestens fünf bis 10 Völker wieder auf YPD gesetzt werden. Führen Sie dann eine Kolonie-PCR mit den Primern im Textprotokoll und in der Sequenz durch, um die Aufnahme zu überprüfen. Verdünnen Sie die Oligos der gewünschten Bindungsregion auf äquimolare Konzentrationen.

Phosphorylieren Sie die Bindungsregion unter Verwendung der T-4-Polynukleotidkinase und dann eines Neo-Thermocyclers gemäß den Reaktionsbedingungen im Textprotokoll. Als nächstes verdauen Sie etwa ein bis zwei Mikrogramm PMN acht mit nicht einem HF und xb. Eines für eine Stunde bei 37 Grad Celsius Gel.

Reinigen Sie das Rückgratband und verdünnen Sie das gereinigte Rückgrat auf 10 Nanogramm pro Mikroliter. Verdünnen Sie dann die doppelsträngige phosphorylierte Bindungsstelle auf das Fünffache der molaren Konzentration des Rückgrats pro Mikroliter. Mit Hilfe von T vier wird die DNA-Ligase die Bindungsstellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in das verdaute Rückgrat ligiert.

Führen Sie die Transformation durch, indem Sie die Hälfte der Ligationsreaktion zu 50 Mikrolitern chemisch kompetenter Standard-EIA-coli-Zellen hinzufügen und das im Textprotokoll aufgeführte Verfahren befolgen. Nach der Entnahme der Zellen fügen Sie 100 bis 200 Mikroliter Zellen pro Luria berti oder Pfund plus Ampicillinplatte hinzu und inkubieren über Nacht. Am nächsten Tag züchten Sie e coli und lb plus Ampicillinflüssigkeit und ernten Sie die Plasmid-DNA, wie im Textprotokoll beschrieben.

Anschließend wird das neue Reporterplasmid aus Ligationskolonien sequenziell überprüft. Transformieren Sie schließlich das neue Reporterplasmid mithilfe der Lithiumacetat-Transformation in den A TF-haltigen E-Stamm. Zu Beginn des Anbaus eines TF plus Reporters, der den Stamm über Nacht in fünf Millilitern synthetischem Komplettmedium ohne Uracil enthält.

Man erhält 9 250 Milliliter, schüttelt den Kolben und fügt jeweils 25 Milliliter SC minus URA hinzu. Dann werden sieben der Kolben mit unterschiedlicher Verdünnung von Beta-Östradiol, wie im Textprotokoll aufgeführt, von der zehnfachen Serienverdünnung eines 25 millimolaren Beta-Östradiol-Stammes bei 125 Mikrolitern der Nachtkulturen auf diese sieben Kolben für die beiden verbleibenden Kolben mit einem konstitutiven GFP-produzierenden Stamm und einem Stamm ohne GFP inokuliert. Diese werden für die Kalibrierung des Durchflusszytometers benötigt.

Schütteln Sie den Kolben bei 200 U/min und 30 Grad Celsius für 12 bis 18 Stunden. Dann entnehmen Sie 500 Mikroliter jeder Kultur und schleudern sie in separate 1,7-Milliliter-Einorröhrchen. Nach dem Aspirieren des Überstands werden die pelletierten Zellen einmal mit Durchflusszytometrie-Puffer gespült und dann in einem Milliliter desselben Puffers resuspendiert.

Fügen Sie als Nächstes einen Milliliter Durchflusszytometrie-Puffer zu nine falcon zwei hinzu. Die resuspendierten Zellen werden in den Puffer mit den Falkenröhrchen gegeben, um ein Endvolumen von zwei Millilitern zu erhalten. Führen Sie abschließend eine Durchflusszytometrie durch.

Verwenden Sie Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung, um Hefezellen zu identifizieren. Stellen Sie die Flussrate auf ca. 3000 Zellen pro Sekunde ein. Messen Sie den GFP über den 50-Kanal und gehen Sie wie im Textprotokoll vor, indem sowohl ein A TF enthaltender Stamm als auch ein A TF ohne Stamm auf YPD ausgezogen werden. Nach zwei Tagen Wachstum beimpfen Sie separate Kulturröhrchen mit fünf Millilitern YPD-Flüssigkeit und züchten Sie jeden Stamm über Nacht bei 30 Grad Celsius.

Führen Sie zehnfache serielle Verdünnungen einer 0,25 millimolaren Beta-Estradiol-Stammlösung bis zu 10.000 durch und falten Sie 100 % Ethanol ein. Fügen Sie 40 Mikroliter jeder Übernachtkultur zu 10 Millilitern YPD-Flüssigkeit hinzu. Geben Sie für jeden Stamm 96 Mikroliter der verdünnten Zellen in 18 Vertiefungen einer 96-Well-Platte.

Geben Sie dann vier Mikroliter Beta-Östradiol in die Zellen. Ein wesentlicher Punkt ist es, sicherzustellen, dass jede Vertiefung die gleiche Menge an Gesamtethanol enthält. Führen Sie eine dreifache Ausfertigung durch, wobei drei der Vertiefungen für jeden Stamm nur Ethanol sind.

Die 96-Well-Platte ist mit einer gasdurchlässigen Membran bedeckt. Überwachen Sie das Wachstum bei einer optischen Dichte von 600 Nanometern in einem Platten-Reader. Quantifizieren Sie die Wachstumsraten mit einer beliebigen Anzahl von Methoden, z. B. der Ermittlung der maximalen Steigung.

Nach der Präparation des Plasmids gemäß den Anweisungen im Textprotokoll PCR amplifizieren Sie die Dosen-MX-Promotorkassette. Transformieren Sie das PCR-Produkt mit der Lithiumacetat-Methodenplatte in einen A-TF-exprimierenden Stamm, transformieren Sie die Zellen auf YPD und replizieren Sie die Platte am nächsten Tag auf YPD plus G vier 18 Antibiotikum. Bestätigen Sie abschließend die korrekte Insertion des Promotors mit dem Forward-Primer und einem Reverse-Primer innerhalb des Gens, dessen Promotor ersetzt wurde.

Das PCR-Endprodukt ist ca. 1,2 KB groß, hier gezeigt, ist die Induktion von GFP durch drei verschiedene a TF-Promotorpaare Z vier EVZ drei EV oder GEV im Laufe der Zeit als Reaktion auf ein mikromolares Beta-Östradiol. Beachten Sie den Anstieg der GFP-Produktion als Reaktion auf die ATFs, die Nicht-Hefe-DNA-Bindungsdomänen enthalten. Dies kann darauf zurückzuführen sein, dass diese Faktoren eine Einzelgenspezifität im Hefegenom erreichen.

Die GEV-Induktion allein führt zur Aktivierung oder Repression von Hunderten von Genen, während Z drei EV und Z vier EV nur die Expression eines Zielgens aktivieren, das hinter einem synthetischen Promotor mit entsprechenden Bindungsstellen platziert ist. Hier wird die Induktion von GFP durch Z drei EV als Reaktion auf null nanomolares Beta-Östradiol und ein mikromolares Beta-Östradiol nach 18 Stunden Induktion gezeigt. Die Fluoreszenz wurde auch von Zellen gemessen, denen GFP fehlte, um die strenge Regulation des Z-3-EV-Systems zu veranschaulichen. Die Fähigkeit von Z drei EV, GFP über einen Bereich von Beta-Östradiolkonzentrationen zu induzieren, wird hier gezeigt.

Die mittlere Fluoreszenz der Verteilungen zeigt, dass die Beziehung zwischen Induktorkonzentration und Expressionsleistung mit einem Hill-Koeffizienten von etwa eins abgestuft wird, was auf eine unabhängige Bindung von Z drei EV hinweist. Nach diesem Verfahren könnten andere Methoden wie Genexpressions-Microarrays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. wie sich die Änderung der Expression eines einzelnen Gens auf Genomweinmuster der Genexpression auswirkt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Wirksamkeit künstlicher Transkriptionsfaktoren entwickeln, testen und validieren können. Diese künstlichen Transkriptionsfaktoren steuern bedingt die Expression von Genen, die den entsprechenden DNA-Zielsequenzen nachgeschaltet sind.