Die systemische Injektion von Neural Stem / Progenitor-Zellen in Mäusen mit chronischer EAE

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, neurale Stammvorläuferzellen durch intravenöse Injektion in das ZNS bei Mäusen zu liefern, die von experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis betroffen sind, einem Krankheitsmodell, das Multiple Sklerose nachahmt. Dies wird erreicht, indem zunächst neurale Stammvorläuferzellen oder NPCs aus der subventrikulären Zone des Gehirns von erwachsenen Mäusen gewonnen werden. Der zweite Schritt besteht darin, NPCs mit viraler Vektortechnologie für die In-vivo-Zellidentifizierung und -verfolgung genetisch zu markieren.

Als nächstes werden proliferierende Neurosphären in eine Einzelzellsuspension dissoziiert, mit der gewünschten Dichte resuspendiert und auf dem Höhepunkt der Erkrankung in die Schwanzvene von EAE-Mäusen injiziert. Letztendlich werden postmortale Organ- und Gewebepathologien sowie Immunhistochemie durchgeführt, um die Überlebensverteilung und Integration der injizierten Stammzellen zu identifizieren und zu charakterisieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine minimalinvasive, sichere und effektive Methode zur Transplantation von Stamm- und Vorläuferzellen in das inflamme Nervensystem bietet.

Diese Methode hilft bei der Beantwortung von drei Schlüsselfragen im Zusammenhang mit der Sicherheit und Wirksamkeit von systemisch injizierten Stammzellen in Modellen für entzündliche Erkrankungen des Nervensystems. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist vor allem für junge Wissenschaftler nützlich, da sie zum Verständnis kritischer experimenteller Schritte beiträgt, von der Isolierung von Hirnstammzellen bis zur Vorbereitung für die systemische Injektion in ein Mausmodell für Multiple Sklerose. Der erste Schritt besteht darin, alle für die Dissektion benötigten Lösungen zusammenzustellen. Mit der richtigen sterilen Technik.

Platzieren Sie ein frisch isoliertes Gehirn auf einer Brain-Slicer-Matrix. Verwenden Sie zwei Rasierklingen, um koronale Schnitte herzustellen, zwei Millimeter vom vorderen Pol des Gehirns entfernt, ohne die Sehspuren und drei Millimeter hinter dem vorherigen Schnitt. Legen Sie die Gehirnschnitte auf eine saubere Petrischale und arbeiten Sie unter einem Präpariermikroskop, um das Gewebe der subventrikulären Zone zu isolieren.

Nachdem Sie das Gewebe zerkleinert haben, fügen Sie es zu 30 Millilitern zuvor zubereiteter und filtrierter Verdauungslösung hinzu. Vorsichtig schütteln und 30 Minuten inkubieren, dabei alle 15 Minuten schütteln. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern vollständigem Wachstum.

Medium oder CGM durch Pipettieren. Zuerst mit einer P 1000, dann mit einer P 200 Pipette. Sobald eine einzellige Suspension erreicht ist, wird sie mit CGM auf bis zu fünf Milliliter angefüllt und in einen neuen Kolben umgefüllt.

Legen Sie die Zellen in einen Inkubator und lassen Sie die Neurosphären fünf bis sieben Tage lang entstehen. Wenn Sie fertig sind, sammeln Sie die Suspension in einem 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie den Gaumen in 200 Mikrolitern CGM.

Dissoziieren Sie die Neurosphären mechanisch, indem Sie sie 100 bis 150 Mal durch eine Pipettenspitze P 200 führen. Bringen Sie die Federung mit CGM auf bis zu einem Milliliter. Verdünnen Sie anschließend die Suspension genau.

Mischen Sie das entsprechende Volumen mit einer Vitalfärbung und befüllen Sie ein Hämozytometer, um die Zellzahl zu bestimmen. Die Zellen werden in der richtigen Konzentration resuspendiert und in einen neuen Kolben umgefüllt. Wiederholen Sie diese Schritte alle vier bis fünf Tage, um die Identifizierung transplantierter Zellen in vivo zu unterstützen.

NPCs werden 72 Stunden nach der NPC-Transduktion mit viralen Vektoren transduziert, die für Reportergene kodieren. Die Expression fluoreszierender Reportergene ist entweder durch Immunfluoreszenz oder Durchflusszytometrie nachweisbar. Wenn Sie fertig sind, ernten Sie die GFP-exprimierenden Neurosphären durch Zentrifugation und entfernen Sie den Überstand.

Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter Dissoziationslösung für Zellaggregate hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang. Entnehmen Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie vorsichtig, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden.

Nachdem Sie die Zellen gezählt und verdünnt haben, bewahren Sie die Zellsuspension bis zur Verwendung auf Eis auf. Sobald die Neurosphären fertig sind, entnehmen Sie Mäuse, die zuvor als Mausmodell für das ZNS vorbereitet wurden. Die Behandlung von Schäden sollte auf dem Höhepunkt der Krankheitsausprägung erfolgen.

Beginnen Sie damit, die Mäuse für etwa 10 Minuten in eine Warmhaltebox zu legen, damit sich die Schwanzvene erweitern kann. Wenn Sie fertig sind, übertragen Sie eine Maus aus der Warmhaltebox in einen Maus-Rückhaltebehälter. Schließen Sie den Rückhaltebehälter, um die Bewegung einzuschränken und den Schwanz zu isolieren.

Sterilisieren Sie den Injektionsbereich am Schwanz mit einer geeigneten topischen Lösung. Füllen Sie eine Ein-Milliliter-Insulinspritze mit 150 Mikrolitern Zellsuspension und achten Sie darauf, alle Blasen zu entfernen. Lokalisieren Sie die Vene auf der dorsalen Oberfläche des Schwanzes und positionieren Sie die Nadel parallel zur Vene im mittleren unteren Teil des Schwanzes.

Hier befindet sich die Vene näher an der Hautoberfläche. Das erleichtert den Eingriff. Führen Sie die Nadel vorsichtig in die Vene ein und stellen Sie sicher, dass sie richtig positioniert ist, indem Sie einige Mikroliter Blut entnehmen.

Injizieren Sie dann die Lösung langsam in die Schwanzvene Entfernen Sie nach der Injektion die Nadel und üben Sie einige Sekunden lang Druck aus, um die Blutung zu verlangsamen. Legen Sie die Maus in einen frischen Käfig und überwachen Sie, bis sie wiederhergestellt ist. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren für alle Mäuse zu vorher festgelegten experimentellen Zeitpunkten.

Proben werden von behandelten und kontrollierten Tieren entnommen und analysiert, um die Infiltration und Integration von NPCs in das ZNS und andere Gewebe zu bestimmen, wenn sie sich vermehren, da NPCs in Neurosphären Marker für mitotische Aktivität exprimieren, wie z. B. Phospho Hion, H, drei in grün dargestellt, und von undifferenzierten Nervenzellen wie Nest in rot dargestellt, wenn sie unter geeigneten Differenzierungsbedingungen plattiert werden. NPCs exprimieren Marker, die typisch für die drei neuronalen Linien sind, wie z. B. den Astroglia-Marker, GFAP, den neuronalen Marker, das mikrotubuläre assoziierte Protein zwei und die Oligo-Dyl-Gliamarker O vier und Myelin-basische Proteinkerne sind mit dpi gegengefärbt. Undifferenzierte MPCs, die nach der Transplantation therapeutisch wirksam sein sollen, müssen Zelloberflächenadhäsionsmoleküle exprimieren, die CD 44 und die Alpha-Vier-Untereinheit des sehr späten Antigens vier enthalten. Diese Beispiele zeigen, dass transduzierte NPCs GFP exprimieren, sowohl als proliferierende Neurosphären als auch bei der Differenzierung in vitro nach Entzug des Wachstumsfaktors. Syngene NPCs, die systemisch in EAE-Mäuse injiziert wurden, werden bis zu 45 Tage nach der Transplantation fast ausschließlich in perivaskulären Bereichen mit ZNS-Schäden gefunden, die durch die Pfeile sowohl im Gehirn als auch im Rückenmark angezeigt werden.

Ein wichtiger Schritt dieses Verfahrens ist die Zelldissoziation. In der Tat ist die Herstellung einer einzelligen Suspension von grundlegender Bedeutung, um Klemmen oder Aggregate zu vermeiden, die nach ihrer Entwicklung zu einem Gefäßverschluss führen können. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher in der regenerativen Medizin, die minimalinvasive Protokolle für die effiziente Verabreichung von nicht-periodischen Stammzellen in das Gehirn von kleinen Labortieren und in naher Perspektive von Menschen, die von entzündlichen neurologischen Erkrankungen betroffen sind, erforschten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, haben Sie hoffentlich ein klares Verständnis für die Fehlerbehebungen im Zusammenhang mit der Isolierung, Vorbereitung und systemischen Injektion von gewebespezifischen Haltungen bei Labortieren mit Hirnerkrankungen.