Name: Eine modifizierte Niederschlag Methode zu Urinary Exosomen Isolieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Lernen Sie eine modifizierte Niederschlagsmethode zur Isolierung von Urin-Exosomen. Dieses schnelle, skalierbare Verfahren ermöglicht effiziente Extrazellulärer Vesikel für Biomarker-Analysen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken der Roney Family Foundation für die Unterstützung dieser Studie. Wir danken Dr. M. Lucrecia Alvarez für ihren Beitrag zur Planung und Durchführung der in dieser Arbeit beschriebenen Experimente.

. Hinweis: Der in der Isolierung der Exosomen Harn unter Verwendung der modifizierten Fällungsverfahren beteiligten Schritte sind in der Figur 1 dargestellten anfänglichen Schritte beinhalten die Entfernung von großen toten Zellen und Zelltrümmer durch Zentrifugation. Das endgültige Pellet aus der aus jedem nachfolgenden Schritt gesammelten Überstand erhalten entspricht der Exosomen, die in Isolationslösung für die weitere Gewinnung von Protein, RNA und DNA, gelöst wird. 1. Sammlung von Urin <ol><li> Vor der Urinsammlung, bereiten Protease-Inhibitor-Cocktail nach den Anweisungen des Herstellers und fügen 3,125 ml dieser Cocktail in ein leeres steriles Gefäß. Die Röhrchen mit dem Protease-Inhibitor-Cocktail kann dann Freiwillige für Urinsammlung verteilt werden. HINWEIS: Der Grund für das Hinzufügen von Protease-Inhibitor ist, Proteinabbau in der Urinprobe zu minimieren. Obwohl wir speziell verwendet einen Proteaseinhibitor-Cocktail ausSigma, können andere im Handel erhältliche Proteasehemmer ersetzt werden. </li><li> Sammeln Sie etwa 10 ml der ersten Urin. Verarbeiten Sie die Urin unmittelbar nach der Entnahme ohne Lagerung oder Kühlung. Isolieren Sie die Harnwege Exosomen in zweifacher Ausfertigung mit der modifizierten Fällungsverfahren; einer der beiden Analysen für DNA, Gesamt-RNA und Proteinextraktion, während die andere für die Quantifizierung von Harn Exosom-Partikel. HINWEIS: Ein 24-Stunden-Urinprobe für Exosom Isolierung durch Lagerung bei 4 ° C gewonnen werden. </li></ol> 2. Entfernung von Zelltrümmern und Tamm-Horsfall Protein (THP) <ol><li> Übertragen Urinproben auf 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge 10 ml Harn bei 17.000 × g für 10 min bei 37 ° C, um Zellen und Zelltrümmer (Figur 1) zu beseitigen. </li><li> Mit einer Pipette den Überstand in ein frisches Röhrchen für die weitere Verarbeitung. Das Pellet in 500 ul Isolierungslösung (250 mM Saccharose, 10 mM prüfetAmin, pH 7,6), gefolgt von 10-minütiger Inkubation mit DL-Dithiothreitol (DTT: Endkonzentration 200 mg / ml) bei 37 ° C. HINWEIS: DTT wird hinzugefügt, um THP, die Exosomen Fallen abgebaut, was zu einer verminderten Erträge. Achten Sie darauf, um das Pellet während der Übertragung des Überstandes ungestört zu lassen, und bestätigt, dass der Überstand frei von Pellets. </li><li> Vortex Pelletproben alle 2 min, bis das Pellet vollständig aufgelöst ist. Dann fügen Sie 500 ul der Isolation Lösung des gelösten Pellets. </li><li> Unmittelbar nach der Zugabe der Isolierungslösung zu dem Pellet, Zentrifuge bei 17.000 × g für 10 min bei 37 ° C. Pipette die überstehende und sich mit dem früheren Überstand gesammelt. </li><li> Das Pellet in 50 ul Isolierungslösung für die SDS-PAGE-Analyse. HINWEIS: PBS oder TBS kann anstelle Isolierungslösung verwendet, um das Pellet zu resuspendieren. </li></ol> 3. Isolierung Exosom Pellet <ol><li> Bis 11 ml des gesammelten supernatant Fügen 3,3 ml ExoQuick-TC Reagenz und Inkubieren bei 4 ° C für mindestens 12 Std. ANMERKUNG: Das Verhältnis des Volumens des Überstandes, um ExoQuick-TC Reagenz eingestellt werden kann, um zu erhöhen oder zu verringern exosomalen Ausbeute. Wir beobachteten, dass geringere Mengen an Reagens hinzugefügt kleinere Erträge von Exosomen. </li><li> Nach der Inkubation Zentrifuge wird die Probe / ExoQuick-TC Mischung bei 10.000 × g für 30 min bei 25 ° C. </li><li> Den Überstand in ein frisches Röhrchen für die SDS-PAGE-Analyse. </li><li> Die exosome Pellet bei -80 ° C für DNA, RNA und Protein-Extraktion und Quantifizierung von Exosom-Partikel mit CD9 ELISA 11 gespeichert werden. HINWEIS: Die exosome Pellet bei -80 ° C für 1 Jahr bei begrenzten Einfrieren und Auftauen gelagert werden. </li></ol> 4. Biomarker-Erkennung und Analyse der Exosom Pellet <ol><li> Für Downstream-Analysen, extrahieren DNA, RNA und Protein aus dem Exosom Pellet unter Verwendung des DNA / RNA / Protein-Extraktions-Kit und eine RNA-Isolierung kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bestimmen Konzentrationen unter Verwendung eines Nanodrop Spektralphotometer durch Messung der Absorption bei 260 nm und 280 nm mit 2 ul Probe. </li><li> Führen quantitative Echtzeit-RT-PCR (qPCR) mit TaqMan MicroRNA Assays (in unserem Fall haben wir menschliche miR-192- und miR-1207-5p spezifische Assays) oder miRNA-spezifischen Primern. </li><li> Für SDS-PAGE-Analyse, verwendet 4-12% Bis-Tris-Gel und getrennte Proteinproben durch eindimensionale Elektrophorese. Visualisieren Gele unter Verwendung der Silberfärbung Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Führen Western Blot Analyse unter Verwendung von PVDF-Membranen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden polyklonalen Kaninchen-Antikörper, um die Apoptose-verknüpften Gens-2 interagierende Protein X oder ALIX und monoklonalen Maus-Antikörpers an Tumor Suszeptibilitätsgens 101 Protein oder TSG101 in der Western-Blot-Detektion. Quantifizieren Sie die Dichte der Banden von Open-Access-NIH ImageJ Software (http://rsbweb.nih.gov/ij/) oderein ähnliches Programm. </li><li> Quantifizieren Sie die Anzahl der Harnwege mit einem CD9 ELISA-Kit nach Herstellerangaben erhalten Exosom Partikel. </li></ol>

<ol><li>Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acids+within+urinary+exosomes%2Fmicrovesicles+are+potential+biomarkers+for+renal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease.</a> Kidney Int. 78, 191-199 (2010).</li>
<li>Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+proteomic+profiling+of+exosomes+in+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).</li>
<li>Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+quantitative+proteomics+strategy+for+protein+biomarker+studies+in+urinary+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes.</a> Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).</li>
<li>Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+systems+biology+principles+to+protein+biomarker+discovery%3A+urinary+exosomal+proteome+in+renal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation.</a> Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).</li>
<li>Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+exosomes+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of exosomes in urine.</a> Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).</li>
<li>Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection%2C+storage%2C+preservation%2C+and+normalization+of+human+urinary+exosomes+for+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery.</a> Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Prot+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).</li>
<li>Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).</li>
<li>Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+proteomics+and+phosphoproteomics+of+urinary+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes.</a> J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).</li>
<li>Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+methods+for+isolation+of+urinary+microvesicles+to+identify+biomarkers+of+nephrotic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome.</a> Kidney Int. 78, 810-816 (2010).</li>
<li>Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein%2C+microRNA%2C+and+mRNA+yields+using+different+methods+of+urinary+exosome+isolation+for+the+discovery+of+kidney+disease+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int.+Nov%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers.</a> Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).</li>
<li>Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+association+of+-667+aquaporin-2+%28AQP-2%29+A%2FG+promoter+polymorphism+with+the+incidence+and+clinical+course+of+chronic+kidney+disease+in+Korea%5BTitle%5D)+AND+%22Renal+Fail%22%5BJournal%5D)">Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea.</a> Renal Fail. 29, 693-698 (2007).</li>
</ol>

Veröffentlichungskosten für diesen Artikel wurden von SBI Biosciences bezahlt.

Die meisten Verfahren, die Ausfällung der Exosomen aus Urin adressieren nicht die Entfernung des polymeren Netzwerks von Tamm-Horsfall-Protein (THP) gebildet. Dieses Protein ist in großen Mengen im Urin, wo sie mutmaßlich Fallen Exosomen während der anfänglichen Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit vorhanden ist. In unserem modifizierten Methode reduzierten wir THP mit DTT vor Exosom Niederschlag. Wie in Figur 2 gezeigt, wurde eine größere Menge von THP in unverändertem Urin und Pellet beobachte...

Urinary Exosomen sind kleine interne Bläschen von 100 nm von multivesicular bodies (MVB) von allen Zelltypen unter normalen und pathologischen Bedingungen in Urin-Raum einschließlich der glomerulären Podozyten, Nierentubuluszellen und Zellen entlang der Urindrainage-Systeme, die für die miRNAs 1 angereichert werden angezeigt abgeleitet -2. Viele Forscher haben unterschiedliche Proteine ​​in Exosomen aus dem Urin von gesunden Personen als auch solche mit eingeschränkter Nieren- und / oder systematische Erkrankungen 3-5 getrennt erfasst. Exosomen kann unter Verwendung verschiedener Verfahren, wie zweistufige Differential Ultrazentrifugation mit oder ohne Sucrose 6-7 isoliert werden, die Kombination Nanofilter mit Ultrazentrifugation 8-9 oder Präzipitation 10-11. Vor kurzem haben wir eine einfache, schnelle, skalierbare und effektive Methode zur Behandlung von Harn Exosomen isolieren und zu erkennen miRNA und Protein-Biomarkern 11 entwickelt. Obwohl Biomarker können in einer Vielzahl von verschiedenen biologischen Flüssigkeiten nachgewiesen werden, urine ist die ideale Wahl für Patienten mit Erkrankungen der Niere und der ableitenden Harnwege, weil es in großen Mengen in einem relativ nicht-invasive Art und Weise erhalten werden. Obwohl es verschiedene Verfahren zur Behandlung von Harn Exosomen isolieren 6-11, hängt die am meisten verwendeten Verfahren auf Differential Ultrazentrifugation mit einer 30% Saccharose-Kissen. Während dieses Verfahren effizient und die Qualität der resultierenden Exosomen mit diesem Verfahren isoliert hoch ist, das Verfahren selbst erfordert geschultes Personal und ist zeitaufwendig und erfordert mehrere Ultrazentrifugationsschritte. Andere Verfahren, wie Filtration und Fällung, wurden für die Isolierung der Exosomen entwickelt worden, einschließlich eine, die einen proprietären Ausfällungsreagenz verwendet (dh ExoQuick-TC: System Biosciences; Mountain View, CA). Obwohl Fällung mit dieser Reagenz schnell und relativ einfach, die Reinheit der Exosomen isoliert ist gering im Vergleich zu der Ultrazentrifugation method. Vor kurzem haben wir sechs Methoden zur Isolierung von Harn Exosomen, einschließlich einer Modifizierung der Fällungsverfahren unter Verwendung ExoQuick-TC, die in unserem Labor entwickelt 11 verglichen. Wir fanden, dass diese modifizierte Präzipitationsverfahren lieferte höhere Mengen an Protein, miRNA, und mRNAs und das Verfahren selbst schneller und einfacher zu implementieren als Ultrazentrifugation war. Hier beschreiben wir die Versuchsprotokoll unserer modifizierten Fällungsverfahren stufenweise, und verfügen über eine Diskussion der Vor- und Nachteile dieser Technik im Vergleich zu anderen Methoden der Exosom Isolation. Das modifizierte Fällungsverfahren beinhaltet eine anfängliche Ausfällung von Exosom-Partikel, gefolgt von der Entfernung Tamm-Horsfall-Protein, das mit exosomalen Proteine ​​korreliert, und bekanntlich exosome Ausbeute von Urin zu verringern. Wir fanden, dass diese Modifikationen erhöht die Ausbeute und Reinheit des exosomalen Präparat aus Urin.

<table><tbody><tr><td>Corning 15 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning (Sigma Aldrich)</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor Cocktail</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Sorvall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9779</td><td>verwendet in einer Endkonzentration von 200 mg/ml</td></tr><tr><td>Novex NuPAGE SDS-PAGE System (4-12% Bis-Tris Gel 1,0 mm, 10 Wells</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td>Für die SDS-PAGE-Analyse</td></tr><tr><td>ECL Advance Western Blot Detection Kit</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2135</td><td>Für den Western Blot Nachweis von Biomarkern</td></tr><tr><td>Exoquick-TC Reagent</td><td>System Biosciences (SBI)</td><td>EXOTC50A-1</td><td>Für die Exosomenisolierung</td></tr><tr><td>Exosom CD9 ELISA Complete Kit</td><td>System Biosciences (SBI)</td><td>EXOEL-CD9-A-1</td><td>Für die Exosomenquantifizierung</td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA/Protein Mini-Kit</td><td>Qiagen</td><td>80004</td><td>Für die Isolierung von DNA, RNA und Proteinen</td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 UV-Vis Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Für die Proteinquantifizierung</td></tr><tr><td>ProteoSilver Sliver Stain Kit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PROTSIL1-1KT</td><td>Zum Färben von SDS-PAGE Gelen</td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Zellelektrophorese-System</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Für die Ausführung der SDS-PAGE-Gele</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA-Assays</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Für RT-PCR-Assays</td></tr><tr><td>qBasePlus v1.5 Software</td><td>Biogazelle NV</td><td></td><td>Für die Analyse von RT-PCR-Assay-Daten</td></tr><tr><td>Polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen ALIX</td><td>Millipore</td><td></td><td>Für den Western-Blot-Nachweis von Biomarkern</td></tr><tr><td>Monoklonaler Maus-Antikörper gegen TSG101</td><td>Abcam</td><td></td><td>Für den Western-Blot-Nachweis von Biomarkern</td></tr></tbody></table>

eine modifizierte niederschlag methode zu urinary exosomen isolieren

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Die Identifizierung von Biomarkern, die eine frühzeitige Erkennung von Nierenerkrankungen im Urin und Plasma ermöglichen, ist seit mehreren Jahren ein Bereich von aktivem Interesse. Exosomenvesikel im Urin, 40-100 nm groß, werden unter normalen Bedingungen von Zellen aus allen Nephronsegmenten in den Urin abgegeben und können Proteine, mRNA und microRNA enthalten, die für ihren Zelltyp repräsentativ sind. Bei Nierenfunktionsstörungen oder -verletzungen können Exosomen veränderte Anteile dieser Komponenten enthalten, die als Biomarker für Krankheiten dienen können. Derzeit stehen mehrere Methoden zur Isolierung von Exosomen im Urin zur Verfügung, und wir haben zuvor einen experimentellen Vergleich jedes dieser Ansätze durchgeführt, darunter drei auf Ultrazentrifugation, einen mit einem Nanomembran-Ultrafiltrationskonzentrator, einen mit einem kommerziellen Fällungsreagenz und eine mit einer Modifikation der Fällungstechnik unter Verwendung des ExoQuick-Reagenzes, das wir in unserem Labor entwickelt haben. Wir fanden heraus, dass die modifizierte Fällungsmethode die höchste Ausbeute an Exosomenpartikeln, miRNA und mRNA erzeugte, so dass dieser Ansatz für die Isolierung von Exosomen für die anschließende RNA-Profilierung geeignet ist. Wir kommen zu dem Schluss, dass die modifizierte Exosomenfällungsmethode eine schnelle, skalierbare und effektive Alternative für die Isolierung von Exosomen aus dem Urin bietet. In diesem Bericht beschreiben wir unsere modifizierte Fällungstechnik mit ExoQuick-Reagenz zur Isolierung von Exosomen aus menschlichem Urin.

Urinary Exosomen tragen Protein, miRNA und mRNA-Biomarker von Nierenepithelzellen abgesondert. Die Isolierung und Detektion dieser Exosomen kann ein nützliches Diagnosewerkzeug zur Früherkennung von Nierenkrankheiten bereitzustellen, wie diabetische Nephropathie. Es gibt verschiedene Verfahren zur Isolierung von Exosomen aus Urinproben von menschlichen Probanden gesammelt. Wir haben vorher gegen sechs Methoden der Urin Exosom Isolation und untersucht resultierende Protein, mRNA und miRNA Ebenen 11. Unser Ziel...

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von Exosomen aus menschlichem Urin unter Verwendung einer modifizierten Fällungstechnik.

Eine modifizierte Niederschlag Methode zu Urinary Exosomen Isolieren

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine modifizierte Exosomenfällungsmethode zu entwickeln, die eine schnelle, skalierbare und effektive Alternative zur Isolierung von Exosomen aus Urin bietet. Dies wird erreicht, indem zunächst große tote Zellen und Zelltrümmer durch Zentrifugation aus der Urinprobe entfernt werden und das Überstand enthaltend die urinären Exosomen in ein frisches Gefäß überführt wird. Im zweiten Schritt wird der Pellet in einer Isolationslösung, die DTT enthält, gelöst, um das TAM-Pferde-Fall-Protein zu entfernen.Anschließend wird nach erneuter Zentrifugation das TP-freie Überstand mit ExoQuick TC-Reagenz über Nacht inkubiert, um am nächsten Tag die Exosome auszufällen. Die mit ExoQuick TC-Reagenz behandelten Proben werden ein letztes Mal zentrifugiert, um das Exosomen-Pellet zu erhalten. Abschließend können downstream-Verfahren wie Western Blot und Echtzeit-QPCR an den Exosomen durchgeführt werden, um die gewünschten Biomarker nachzuweisen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Ultrazentrifugationsfiltration und der Präzipitation besteht darin, dass die Arm-Methode keine Ultrazentrifugationsschritte erfordert, einfach durchzuführen ist und relativ schnell verläuft, während sie dennoch eine hohe, relativ reine Exosomenausbeute für nachfolgende molekularbiologische Analysen liefert. Vor der Urinsammlung geben Sie 3,125 Milliliter frisch zubereitetes Proteaseinhibitor-Cocktail in einen leeren, sterilen Behälter und sammeln anschließend etwa 10 Milliliter Erststrichurin in diesem Behälter. Überführen Sie die Probe in 15-Milliliter-Konischgefäße. Beachten Sie, dass eine über 24 Stunden gesammelte Harnprobe ebenfalls zur Exosomen-Isolierung verwendet werden kann, indem sie bei vier Grad Celsius gelagert wird. Zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten bei 17.000 ×g und 37 Grad Celsius, um zellulären Zelltrümmern von den Harn-Exosomen zu trennen. Danach überführen Sie vorsichtig, ohne den Pellet zu stören, das Überstand in ein frisches Gefäß und resuspendieren den Pellet in 500 µL Isolationslösung.Das Pellet mit DTT bei einer Endkonzentration von 200 Milligramm pro Milliliter bei 37 Grad Celsius 10 Minuten lang inkubieren, wobei die Probe alle zwei Minuten verwirbelt wird. Sobald das Pellet vollständig gelöst ist, 500 Mikroliter Isolationslösung zur Probe hinzufügen und die entstandene Suspension unverzüglich abzentrifugieren.Vereinigen Sie das Überstandsvolumen mit dem zuvor gesammelten Überstand und resuspendieren Sie das neue Pellet in 50 Mikrolitern Isolationslösung. Für die SDS-Page-Analyse zur Isolierung der Exosomen inkubieren Sie zunächst 11 Milliliter des vereinigten Überstands mit 3,3 Milliliter Exo-Quick-TC-Reagenz bei vier Grad Celsius für mindestens 12 Stunden. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe, überführen anschließend den Überstand in ein frisches Gefäß für die SDS-Page-Analyse, und das Pellet, das urinäre Exosomen enthält, wird zur Extraktion von DNA, RNA oder Protein verwendet oder bei minus 80 Grad Celsius gelagert.Verwenden Sie ein NanoDrop-Spektrophotometer, um die Konzentrationen von DNA und RNA jeder Extraktion durch Messung der Absorption bei 260 und 280 Nanometern mit zwei Mikroliter Probe zu bestimmen. Eine modifizierte Wiedergabe einer SDS-Page-Analyse und Biomarker-Detektion mittels Western-Blot-Analyse von Blut wird in den Bahnen gezeigt, wobei bei unbehandeltem Urin und dem ersten Harn-Pellet-Protein-Band, entsprechend 90 bis 100 Kilodalton, das Vorhandensein beziehungsweise die Entfernung des TAM-Horse-Fall-Proteins angezeigt wird, und zwar im endgültigen Überstand und in den Exosomen-Pellet-Bahnen. Das Band des TAM-Horse-Fall-Proteins wurde nicht beobachtet, was auf eine Entfernung des TAM-Horse-Fall-Proteins in früheren Schritten hinweist und zu einer erhöhten Ausbeute an Exosomen-Pellet führt.In diesem Experiment wurden die Biomarker Alex und TSG 1 0 1 sogar bei Verwendung geringer Probenmengen nachgewiesen, was auf ein sehr reines Exosomen-Pellet für die Biomarker-Analyse sowie auf das Fehlen reichlich vorhandener löslicher Proteine hinweist, einschließlich des TAM horse fall Proteins nach dessen Entwicklung. Diese Technik hat den Weg dafür geebnet, dass Forscher im Bereich der chronischen Nierenerkrankung urinisolierter Exosomen zur frühen Erkennung und Diagnose der diabetischen Nephropathie nutzen können.

a-modified-precipitation-method-to-isolate-urinary-exosomes

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Die plasmaisolierten Exosomen können als nicht-invasive und wiederholbare Methode zum Nachweis und zur Nachverfolgung der Biomarker zur Früherkennung und zum Fortschreiten der Krankheit verwendet werden. Dieses Video beschreibt das Protokoll für die Trennung von Exosomen aus den Plasmaproben von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, die für DNA- und Proteinextraktionen verwendet werden könnten.

Exosomenisolierung: Eine Technik zur Trennung von Exosomen aus dem Plasma von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs

Dieses Video beschreibt eine dichtebasierte Ultrazentrifugationstechnik zur Isolierung von Exosomen aus konditionierten Medien, die aus menschlichen embryonalen Nierenzellkulturen unter Verwendung eines in Deuteriumoxid hergestellten 25% (w/w) Saccharosekissens gewonnen wurden. Die isolierten Exosomen können für Downstream-Anwendungen eingesetzt werden.

Exosomenisolierung: Eine dichtebasierte Ultrazentrifugationstechnik, bei der Saccharosekissen verwendet werden, um Exosomen von konditionierten Medien kultivierter Zellen zu trennen

In diesem Artikel wird eine Methode zur Isolierung von Exosomen aus Vollblut und zur weiteren Analyse durch Nanopartikel-Tracking mit einem halbautomatischen Instrument vorgestellt. Die vorgestellte Technologie bietet eine äußerst empfindliche Methode zur Visualisierung und Analyse von Partikeln in flüssiger Suspension.

Eine innovative Methode zur Quantifizierung und Exosom Size Measurement

Gallenflüssigkeit ist eine wertvolle Quelle für extrazelluläre Vesikel/Exosomen, die potenziell wichtige Biomarker enthalten. Dieses Protokoll stellt eine robuste Methode zur Isolierung von Exosomen aus menschlicher Galle für weitere Analysen, einschließlich miRNA-Profiling, dar.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll exosomen von Plasma und Serum mit reduzierter CO Reinigung nicht Exosomal Blut zu reinigen. Das optimierte Protokoll beinhaltet Ultrafiltration, Protease Behandlung und Größe Ausgrenzung Chromatographie. Verbesserte Reinigung von exosomen Vorteile nachgeschalteten Analysen, einschließlich genauere Quantifizierung von Vesikeln und Proteomic Charakterisierung.

Proteinverdauung, Ultrafiltration und Größe Ausgrenzung Chromatographie, die Isolation der Exosomen aus menschlichem Blutplasma und Serum zu optimieren

Hier beschreiben wir zwei extrazellulären Vesikel Isolierung Protokolle, Ultrafiltration Zentrifugation und Ultrazentrifugation mit Dichte Steigung Zentrifugierung, extrazelluläre Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Flüssigkeitsproben zu isolieren. Die extrazelluläre Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid durch beide Methoden abgeleitet werden quantifiziert und charakterisiert.

Isolierung der extrazellulären Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid eine Ultrafiltration Zentrifugation Technik

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um vorübergehend verbessern Herzfunktion bei Duchenne-Muskeldystrophie Mäusen durch die Transplantation von Exosomen von normalen myogen Vorläuferzellen abgeleitet.

Reinigung und Transplantation von myogen Progenitor Cell abgeleitet Exosomen zur Verbesserung der Herzfunktion bei Duchenne muskulöse dystrophischen Mäusen

Dieses Protokoll veranschaulicht 1) die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus dem adulten Musculus gastrocnemius der Maus sowie 2) die Aufreinigung und Charakterisierung von Exosomen unter Verwendung einer differentiellen Ultrazentrifugationsmethode in Kombination mit Saccharosedichtegradienten gefolgt von Western-Blot-Analysen.

Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Skelettmuskelfibroblasten

Das vorliegende Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen für die effiziente Isolierung von extrazellulären Vesikeln im Urin unter Verwendung funktionalisierter magnetischer Beads. Darüber hinaus umfasst es nachfolgende Analysen, einschließlich Western Blotting, Proteomik und Phosphoproteomik.

Chemische affinitätsbasierte Isolierung extrazellulärer Vesikel aus Bioflüssigkeiten für die Proteomik- und Phosphoproteomik-Analyse

Extrazelluläre Vesikel sind für biomedizinische Anwendungen sehr vielversprechend, aber die derzeitigen Isolierungsmethoden sind zeitaufwändig und für den klinischen Einsatz unpraktisch. In dieser Studie stellen wir ein mikrofluidisches Gerät vor, das die direkte Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großen Mengen von Bioflüssigkeiten in einer kontinuierlichen Weise mit minimalen Schritten ermöglicht.

Einstufige Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großvolumigen Proben mit einem gegabelten mikrofluidischen A4F-Gerät

Lernen Sie eine modifizierte Niederschlagsmethode zur Isolierung von Urin-Exosomen. Dieses schnelle, skalierbare Verfahren ermöglicht effiziente Extrazellulärer Vesikel für Biomarker-Analysen.

Eine modifizierte Niederschlag Methode zu Urinary Exosomen Isolieren

Weitere Videos entdecken