Eine modifizierte Niederschlag Methode zu Urinary Exosomen Isolieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine modifizierte Exosomenfällungsmethode zu entwickeln, die eine schnelle, skalierbare und effektive Alternative für die Isolierung von Exosomen aus dem Urin bietet. Dies wird erreicht, indem zunächst große abgestorbene Zellen und Zelltrümmer durch Zentrifugation aus der Urinprobe entfernt werden und die Snat, die die Urin-Exosomen enthält, in ein frisches Röhrchen überführt wird. Im zweiten Schritt wird das Pellet in einer DVB-T-haltigen Isolierlösung aufgelöst, um das TAM-Pferdefallprotein zu entfernen.

Nach weiterer Zentrifugation wird der TP-freie Überstand über Nacht mit dem Reagenz exo quick TC inkubiert, um die Exosomen am nächsten Tag auszufällen. Die mit Exo Quick TC behandelten Proben werden ein letztes Mal zentrifugiert, um das Exosom-Pellet zu erhalten. Letztendlich können nachgelagerte Prozesse wie Western Blot und Echtzeit-QPCR an den Exosomen durchgeführt werden, um die interessierenden Biomarker zu identifizieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Ultrazentrifizierungsfiltration und Fällung besteht darin, dass die ARM-Methode keine Ultra-Zertifizierungsschritte erfordert, relativ schnell durchzuführen ist und dennoch eine hohe, relativ reine Exosomenausbeute für die anschließende molekulare Analyse vor der Uringewinnung bietet. Bei 3,125 Millilitern des frisch zubereiteten Proteasehemmer-Cocktails in ein leeres steriles Gefäß geben und dann etwa 10 Milliliter des ersten Void-Urins in das Gefäß sammeln. Die Probe wird in konische 15-Milliliter-Röhrchen überführt.

Bitte beachten Sie, dass eine 24-Stunden-Urinprobe, die entnommen wurde, auch für die Exosomenisolierung verwendet werden kann, indem sie bei vier Grad Celsius gelagert wird. Drehen Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 17.000 GS und 37 Grad Celsius, um zelluläre Trümmer aus den Exosomen des Urins zu entfernen oder zu trennen. Achten Sie anschließend darauf, das Pellet nicht zu stören, übertragen Sie den Überstand in ein frisches Rohr und resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern Isolierlösung.

Inkubieren Sie das Pellet mit DTT bei einer Endkonzentration von 200 Milligramm pro Milliliter bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Die Probe alle zwei Minuten vortexen. Wenn das Pellet vollständig aufgelöst ist, fügen Sie der Probe 500 Mikroliter Isolierlösung hinzu und schleudern Sie die resultierende Suspension sofort herunter.

Den Überstand mit dem zuvor gesammelten Überstand poolen und das neue Pellet in 50 Mikroliter Isolationslösung resuspendieren. Für die SDS-Seitenanalyse zur Isolierung der Exosomen inkubieren Sie zunächst 11 Milliliter des gepoolten Überstands mit 3,3 Millilitern exo quick TC Reagenz bei vier Grad Celsius für mindestens 12 Stunden. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe, dann überführen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen für die SDS-Seitenanalyse, und das Pellet mit den Urin-Exosomen wird zur Extraktion von D-N-A-R-N-A oder Protein verwendet oder bei minus 80 Grad Celsius gelagert.

Verwenden Sie ein NanoDrop-Spektralphotometer, um die Konzentrationen von DNA und RNA jeder Extraktion zu bestimmen, indem Sie die Absorption bei 260 und 280 Nanometern mit zwei Mikrolitern Probe messen. Eine modifizierte Reproduktion einer SDS-Seitenanalyse und des Biomarker-Nachweises mittels westlicher Blutanalyse ist in den Lanes mit unaufbereitetem Urin gezeigt und die ersten Pelletprotein-Bans im Urin entsprechend 90 bis 100 Kilodalton wurden beobachtet, was auf das Vorhandensein bzw. die Entfernung des TAM-Pferdefallproteins in den finalen Überstands- und Exosom-Pelletbahnen hinweist. Die TAM-Proteinbande für Pferdefallproteine wurde nicht beobachtet, was auf eine Entfernung des TAM-Pferdefallproteins in den früheren Schritten hindeutet und zu einer erhöhten Exosomenpellet-Ausbeute führt.

In diesem Experiment wurden die Biomarker Alex und TSG 1 0 1 auch dann nachgewiesen, wenn geringe Probenmengen verwendet wurden, was auf ein sehr reines Exosom-Pellet für die Biomarker-Analyse und das Fehlen von reichlich vorhandenen löslichen Proteinen, einschließlich des TAM-Pferdefallproteins nach seiner Entwicklung, hinweist. Diese Technik hat Forschern auf dem Gebiet der chronischen Nierenerkrankung den Weg geebnet, urinisolierte Exosomen zur Früherkennung und Diagnose der diabetischen Nephropathie zu verwenden.