Eine modifizierte Niederschlag Methode zu Urinary Exosomen Isolieren
16. Januar 2015
Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von Exosomen aus menschlichem Urin unter Verwendung einer modifizierten Fällungstechnik.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine modifizierte Exosomenfällungsmethode zu entwickeln, die eine schnelle, skalierbare und effektive Alternative für die Isolierung von Exosomen aus dem Urin bietet. Dies wird erreicht, indem zunächst große abgestorbene Zellen und Zelltrümmer durch Zentrifugation aus der Urinprobe entfernt werden und die Snat, die die Urin-Exosomen enthält, in ein frisches Röhrchen überführt wird. Im zweiten Schritt wird das Pellet in einer DVB-T-haltigen Isolierlösung aufgelöst, um das TAM-Pferdefallprotein zu entfernen.
Nach weiterer Zentrifugation wird der TP-freie Überstand über Nacht mit dem Reagenz exo quick TC inkubiert, um die Exosomen am nächsten Tag auszufällen. Die mit Exo Quick TC behandelten Proben werden ein letztes Mal zentrifugiert, um das Exosom-Pellet zu erhalten. Letztendlich können nachgelagerte Prozesse wie Western Blot und Echtzeit-QPCR an den Exosomen durchgeführt werden, um die interessierenden Biomarker zu identifizieren.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Ultrazentrifizierungsfiltration und Fällung besteht darin, dass die ARM-Methode keine Ultra-Zertifizierungsschritte erfordert, relativ schnell durchzuführen ist und dennoch eine hohe, relativ reine Exosomenausbeute für die anschließende molekulare Analyse vor der Uringewinnung bietet. Bei 3,125 Millilitern des frisch zubereiteten Proteasehemmer-Cocktails in ein leeres steriles Gefäß geben und dann etwa 10 Milliliter des ersten Void-Urins in das Gefäß sammeln. Die Probe wird in konische 15-Milliliter-Röhrchen überführt.
Bitte beachten Sie, dass eine 24-Stunden-Urinprobe, die entnommen wurde, auch für die Exosomenisolierung verwendet werden kann, indem sie bei vier Grad Celsius gelagert wird. Drehen Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 17.000 GS und 37 Grad Celsius, um zelluläre Trümmer aus den Exosomen des Urins zu entfernen oder zu trennen. Achten Sie anschließend darauf, das Pellet nicht zu stören, übertragen Sie den Überstand in ein frisches Rohr und resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern Isolierlösung.
Inkubieren Sie das Pellet mit DTT bei einer Endkonzentration von 200 Milligramm pro Milliliter bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Die Probe alle zwei Minuten vortexen. Wenn das Pellet vollständig aufgelöst ist, fügen Sie der Probe 500 Mikroliter Isolierlösung hinzu und schleudern Sie die resultierende Suspension sofort herunter.
Den Überstand mit dem zuvor gesammelten Überstand poolen und das neue Pellet in 50 Mikroliter Isolationslösung resuspendieren. Für die SDS-Seitenanalyse zur Isolierung der Exosomen inkubieren Sie zunächst 11 Milliliter des gepoolten Überstands mit 3,3 Millilitern exo quick TC Reagenz bei vier Grad Celsius für mindestens 12 Stunden. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe, dann überführen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen für die SDS-Seitenanalyse, und das Pellet mit den Urin-Exosomen wird zur Extraktion von D-N-A-R-N-A oder Protein verwendet oder bei minus 80 Grad Celsius gelagert.
Verwenden Sie ein NanoDrop-Spektralphotometer, um die Konzentrationen von DNA und RNA jeder Extraktion zu bestimmen, indem Sie die Absorption bei 260 und 280 Nanometern mit zwei Mikrolitern Probe messen. Eine modifizierte Reproduktion einer SDS-Seitenanalyse und des Biomarker-Nachweises mittels westlicher Blutanalyse ist in den Lanes mit unaufbereitetem Urin gezeigt und die ersten Pelletprotein-Bans im Urin entsprechend 90 bis 100 Kilodalton wurden beobachtet, was auf das Vorhandensein bzw. die Entfernung des TAM-Pferdefallproteins in den finalen Überstands- und Exosom-Pelletbahnen hinweist. Die TAM-Proteinbande für Pferdefallproteine wurde nicht beobachtet, was auf eine Entfernung des TAM-Pferdefallproteins in den früheren Schritten hindeutet und zu einer erhöhten Exosomenpellet-Ausbeute führt.
In diesem Experiment wurden die Biomarker Alex und TSG 1 0 1 auch dann nachgewiesen, wenn geringe Probenmengen verwendet wurden, was auf ein sehr reines Exosom-Pellet für die Biomarker-Analyse und das Fehlen von reichlich vorhandenen löslichen Proteinen, einschließlich des TAM-Pferdefallproteins nach seiner Entwicklung, hinweist. Diese Technik hat Forschern auf dem Gebiet der chronischen Nierenerkrankung den Weg geebnet, urinisolierte Exosomen zur Früherkennung und Diagnose der diabetischen Nephropathie zu verwenden.
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Übersicht
Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von Exosomen aus menschlichem Urin unter Verwendung einer modifizierten Präzipitationstechnik. Die Methode zielt darauf ab, eine schnelle, skalierbare und effektive Alternative für die Isolierung von Exosomen bereitzustellen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Exosomenforschung
Hintergrund
- Exosomen sind kleine extrazelluläre Vesikel, die an der interzellulären Kommunikation beteiligt sind.
- Die Isolierung von Exosomen aus Urin kann Einblicke in verschiedene biologische Prozesse liefern.
- Aktuelle Methoden können zeitaufwändig und weniger effizient sein.
- Eine modifizierte Präzipitationstechnik könnte die Gewinnung von Exosomen verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer schnellen Methode zur Isolierung von Exosomen aus Urin.
- Verbesserung der Skalierbarkeit und Effektivität der Exosomenextraktion.
- Erleichterung nachgeschalteter Anwendungen wie der Identifizierung von Biomarkern.
Verwendete Methoden
- Zentrifugation zur Entfernung großer Zellen und Partikel aus Harnproben.
- Aufschließen des Pellets in einer Isolationslösung mit DTT.
- Inkubation des Überstands mit ExoQuick-TC-Reagenz über Nacht.
- Endgültige Zentrifugation zur Gewinnung des Exosomenpellets.
Hauptergebnisse
- Die modifizierte Methode ermöglicht die erfolgreiche Isolierung von Exosomen aus Urin.
- Exosomen können für nachgeschaltete Analysen wie Western Blot und qPCR verwendet werden.
- Eine effiziente Entfernung von Kontaminationen verbessert die Reinheit der isolierten Exosomen.
- Das Protokoll ist für größere Probenmengen skalierbar.
Schlussfolgerungen
- Die modifizierte Präzipitationsmethode ist eine geeignete Methode zur Isolierung von Exosomen.
- Dieser Ansatz kann die Exosomenforschung in verschiedenen biologischen Studien vereinfachen.
- Zukünftige Studien könnten zusätzliche Anwendungen isolierter Exosomen untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung von Harn-Exosomen ermöglicht die nichtinvasive Entdeckung von Biomarkern für Nierenerkrankungen und unterstützt die Früherkennung sowie die mechanistische Entlastung bei der Entwicklung renaler Therapeutika. Die modifizierte Präzipitationsmethode bietet eine skalierbare, ertragreiche Alternative zur Ultrazentrifugation und verbessert die Reproduzierbarkeit und Durchsatzleistung bei Workflows zur Target-Validierung. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung von Biomarkern, indem er Kontaminationen reduziert und die Exosomenreinheit für die molekulare Profilanalyse nachgeschalteter Schritte verbessert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Isolierung von Exosomen, die zelltypspezifische Fracht aus Nephronabschnitten widerspiegeln.
- Operationeller Wert: Bietet eine schnelle, skalierbare Methode zur Isolierung von Exosomen ohne Ultrazentrifugation und verringert so die technische Variabilität.
- Predictiver Wert: Erhöht die Zuverlässigkeit bei der Biomarker-Detektion, da hochreine Exosomen-Pellets mit Anreicherung an miRNA und mRNA für die Profilierung gewonnen werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte Exosomenproben für nachgeschaltete Analysen wie Western Blot und qPCR zur Detektion krankheitsassoziierter Biomarker auf.
- Operativer Wert: Standardisiert die Isolierung von Exosomen mittels eines auf Präzipitation basierenden Workflows, der mit der Hochdurchsatz-Probenverarbeitung kompatibel ist.
- Eignung für Analysen: Erzeugt konsistente Exosomenausbeuten, die für die RNA-Extraktion und Proteinanalyse geeignet sind und somit eine reproduzierbare Biomarker-Screening-Untersuchung unterstützen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Unterstützt den Fortschritt von der Biomarker-Entdeckung in Urin zur präklinischen Validierung, indem krankheitsrelevante Exosomeninhalte bereitgestellt werden.
- Mechanistische Entlastung: Ermöglicht den Nachweis veränderter Exosomeninhalte bei Nierenfunktionsstörungen und klärt so pathophysiologische Signalwege auf.
- Prädiktive Sicherheit: Erleichtert risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem Exosomen-Biomarker mit frühen Anzeichen der diabetischen Nephropathie verknüpft werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung bis zur Identifizierung von Leitstrukturen ein und ermöglicht die nichtinvasive Isolierung von Biomarkern, die die Zielstrukturauswahl und die präklinische Kontinuität unterstützen.
- Entdeckungsbioanalytik: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Isolierung von Exosomen, die zellursprungsspezifische Fracht von Harntraktzellen widerspiegeln.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Exosomen-Daten, die für die Entwicklung von Biomarker-Assays und die Wirkstoffprüfung geeignet sind.
- Analytik: Ermöglicht die Messung von RNA- und Proteinspiegeln in Exosomen mittels qPCR und Western Blot zur vergleichenden Analyse unter verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet Biomarker aus Harnexosomen mit präklinischen Modellen von Nierenerkrankungen durch den Nachweis krankheitsrelevanter Fracht.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine skalierbare, standardisierte Isolationsplattform, die auf verschiedene Harnprobenarten und Forschungsprogramme anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verbessert die Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten durch die reine Isolierung von Exosomen für die Biomarker-Profilerstellung verringert werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Standardisierung und Skalierbarkeit, indem Ultrazentrifugationsschritte eliminiert und der Arbeitsablauf vereinfacht werden.
- Strategischer Wert: Unterstützt fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen, indem das Vertrauen in die frühe Detektion von Biomarkern für Nierenerkrankungen erhöht wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von renal wirksamen Therapiekandidaten basierend auf robusten Biomarker-Daten aus Exosomen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Exosomenbiologie und molekularbiologischen Methoden wie RNA-Extraktion und qPCR.
- Benötigt Zugang zu Zentrifugiergeräten, ExoQuick-TC-Reagenz und spektrophotometrischen Werkzeugen zur Quantifizierung von RNA/DNA.
- Erfordert eine Standardisierung zwischen den Teams, um konsistente Inkubationszeiten, Temperaturen und Reagenzienhandhabung sicherzustellen.
- Erfordert Anpassungserwägungen, wenn die Methode auf unterschiedliche Urinsammelprotokolle oder Lagerungsbedingungen angewendet wird.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Notwendigkeit einer Übernacht-Inkubation und eine sorgfältige Handhabung, um Exosomenverluste während der Übertragung zu vermeiden.
