Zerlegung des Transversus Abdominis Muskels für die neuromuskuläre Junction-Analyse

In diesem Video zeigen wir ein Protokoll zur Zerlegung des Transversus-Abdominis-Muskels der Maus und verwenden Immunfluoreszenz und Mikroskopie, um neuromuskuläre Knoten zu visualisieren.

Der transversale ADOS-Muskel ist ein dünner, flacher Muskel, der die tiefste Schicht der Bauchmuskulatur bildet. Er wird über das lineare alpha an der Mittellinie und über die tiefe Oberfläche des Thoraxkäfigs befestigt. In diesem Video werden wir den oberen Teil dieses Muskels sezieren und Immunfluoreszenz verwenden, um Innovationsmuster und die Struktur der neuromuskulären Verbindung zu visualisieren.

Für diese Sektion benötigen Sie diese Werkzeuge, die im beigefügten Protokoll separat aufgeführt sind. Nach dem Einschläfern der Mäuse mit einer geeigneten Methode mit 70%igem Ethanol besprühen, um die Ausbreitung des Fells zu minimieren. Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken und machen Sie einen Schnitt durch die Haut auf Höhe der Hüfte.

Achte darauf, dass du die Bauchmuskulatur nicht durchschneidest. Setzen Sie diesen Schnitt rund um die Maus fort. Ziehen Sie nach Abschluss des Schnitts die Haut über den Kopf der Maus.

Auch hier gilt: Achten Sie darauf, die Bauchmuskulatur nicht zu reißen. Schneiden Sie durch die Bauchmuskulatur und setzen Sie den Schnitt fort, bis Sie die Wirbelsäule erreichen. Schneide an dieser Stelle durch die Rippen nach oben, bis du dich über dem Brustbein befindest, und achte darauf, das Zwerchfell aus dem Brustkorb zu lösen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der anderen Seite der Maus. Schneiden Sie an dieser Stelle die Rippen und das Brustbein durch und geben Sie die Rippen mit den anhaftenden Muskeln in eine mit Algar beschichtete Sezierschale. Stecken Sie den Muskel mit Insekten-Seziernadeln fest.

Fixieren Sie Ihr Taschentuch in 4%PFA und lassen Sie es 15 Minuten lang auf einer Schaukelplattform liegen. Hier ist ein Beispiel dafür, wie dein herausgesteckter Muskel aussehen sollte. Auf der linken Seite des Bildes sind die oberflächlichen Muskeln zu sehen, zu denen der äußere schräge Bauchmuskel gehört, der blau umrandet ist, und der rektus abdominis, der rot umrandet ist.

Diese Schicht wurde auf der rechten Seite des Bildes zurückgeschält, um den inneren schrägen gelb umrandeten Bauchmuskel freizulegen, der grün umrandet ist. Unser Ziel ist es, den oberen Teil des Quermuskels abdominis zu präparieren. Hier im durchgehenden grünen Dreieck unter einem Präpariermikroskop zu sehen, schneiden Sie den äußeren schrägen Muskel an einer Stelle durch, an der er die Rippen bedeckt, dann schneiden Sie durch den äußeren schrägen Bauchmuskel nach unten, aber oberhalb der queren Bauchmuskeln Schneiden Sie nach unten, bis Sie den Anfang des inneren schrägen Muskels sehen, der hier als tangentiale Muskelfasern auf der linken Seite des Bildes zu sehen ist.

Entfernen Sie das Blutgefäß, indem Sie es vorsichtig von der Oberfläche des Muskels abziehen. Trennen Sie dann mit einer stumpfen Dissektion den Querbauchmuskel von der darüber liegenden Rippe. Schneiden Sie um die Ränder des Muskels herum und achten Sie darauf, den Teil unter der Rippe einzubeziehen.

Entfernen Sie die Rippe und übertragen Sie den Muskel zur Immunfluoreszenz auf eine 24-Well-Platte. Führen Sie alle Immunfluoreszenzverfahren in einer 24-Well-Platte durch. Verwenden Sie eine Pipette mit feiner Spitze und befolgen Sie das Protokoll in diesem Manuskript.

Stellen Sie sicher, dass Sie die in diesem Protokoll beschriebenen Reagenzien verwenden. Nach der immunfluoreszierenden Färbung von Mount-Muskeln auf Objektträgern und fluoreszierenden Eindeckmedien verwenden Sie eine Pinzette, um den Muskel vorsichtig zu entfalten, und stellen Sie sicher, dass er flach ist, bevor die Abdeckung verrutscht. Stellen Sie sicher, dass Sie fest nach unten drücken, um den Muskel während des Aufsteigens abzuflachen Wie in diesem Bild gezeigt, kann dieses Protokoll verwendet werden, um eine vollständige Färbung des transversalen Bauchmuskels durchzuführen und neuromuskuläre Verbindungen und Innovationsmuster sichtbar zu machen.

In diesem Bild sind Axone und synaptische Endigungen in grün dargestellt, markiert mit Antikörpern gegen SB zwei und Neurofilament und motorischem pls, wie in rot gezeigt, gekennzeichnet als Alpha-Bunger-Toxin. Die konfokale Mikroskopie der Z-Serie kann jetzt verwendet werden, um hochauflösende Bilder der Morphologie der neuromuskulären Verbindungen zu erhalten. Dieses Protokoll kann zur Untersuchung der Pathologie der neuromuskulären Verbindung in Mausmodellen angewendet werden.

Zum Beispiel diese Bilder, also die Pathologie der neuromuskulären Verbindung in einem Mausmodell der spinalen Muskelatrophie. Es ist zu beachten, dass es Hinweise auf eine vollständige oder teilweise Denervierung gibt, die durch weiße bzw. violette Pfeile gekennzeichnet ist, eine terminale Keimung durch blaue Pfeile und eine präsynaptische Schwellung, die durch gelbe Pfeile gekennzeichnet ist. Eine solche Analyse kann wichtige Einblicke in den pathologischen Prozess bei Erkrankungen der Motoneuronen geben.