Name: Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Erfahren Sie, wie Polysom-Profiling Stress-Effekte auf die Translationsinitiation in Säugetierzellen analysiert. Diese Methode nutzt Saccharose-Gradienten-Ultrazentrifugation und Western Blot zur Untersuchung ribosomaler Aktivität.

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PA ist ein Empfänger eines Stipendiums &quot;Pierre Durand&quot; von der Fakultät für Medizin der Universität Laval. Diese Arbeit wurde von der Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (MOP-CG095386) gestützt auf RM Die Polysom ​​Fraktionators wurde durch einen kanadischen Stiftung für Innovation Zuschuss (MOP-GF091050) bis RMR M hat einen neuen Ermittler CIHR Gehalts Auszeichnung erworben. Wir sind dankbar, dass DRS. E. Khandjian, I. Gallouzi, S. Di-Marco und A. Cammas für hilfreiche Ratschläge.

Das Protokoll folgt den Richtlinien von Laval Ethical Review Board genehmigt. 1. Herstellung von Zellkulturen und Gehirnmanipulation <ol><li> Säuger-und Drosophila-Zellen <ol><li> Wachsen HeLa-Gebärmutterhalskrebszellen und embryonale Zellen Drosophila Schneider wie von der American Type Culture Collection ist. Arbeiten mit Zellen auf einem niedrigen Gang. </li><li> Teller Zellen, um den Tag des Experiments 80% Konfluenz erreichen. Für beste Ergebnisse verwenden ~ 12 x 10 6 Zellen für jede Versuchsbedingung. Vor Extrakte für Polysom ​​Analyse, stimulieren Übersetzung durch Zugabe von frischem Vollmedium für mindestens 90 min. </li></ol></li><li> Gehirn-Trennung: Isolieren Gehirnen von Mäusen, zwischen 9 und 16 Tage nach der Geburt im Alter. Sterbehilfe beinhaltet CO 2-Inhalation nach der Narkose und Genickbruch. Nach der Tötung, zu isolieren, das ganze Gehirn und entweder den Ort, den icht bei -80 ° C oder direkt übertragen sie in kaltem PBS 1X für den sofortigen Einsatz. </li></ol> 2. Vorbereitung der Dichte Gradient-System Fraktionierung <ol><li> Waschen Sie das Schlauchsystem mit 0,1% SDS für 5 min. </li><li> Mit 70% Ethanol für 5 min Waschen Sie das Schlauchsystem, dann mit RNaseZAP Lösung für 5 min vor dem Waschen mit DEPC Wasser. </li><li> Luftpumpe, um das Rohrleitungssystem der Vorrichtung zu trocknen. </li></ol> 3. Vorbereitung der Saccharose-Gradienten <ol><li> Machen 15% und 55% Saccharose-Lösungen in 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 1,25 mM MgCl 2, 150 mM NaCl und 1 mM DTT. </li><li> Erzeugen die lineare 15-55% Saccharose-Gradienten mit einem Isco Modell 160 Gradientenformer, wie von der Herstelleranleitung beschrieben. Es ist jedoch wichtig, um die Schaffung von Blasen oder Turbulenzen an den Steigungen zu vermeiden und steuern die TRIS Schlauchpumpe Geschwindigkeit. Halten Sie die Gradienten bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Während der Zeit, wenn der Gradient Herstellerprogramm ausgeführt wird, kühlen die Ultrazentrifuge auf 4 ° C </li></ol> 4. Herstellung von Zell-und Maus-Gehirn-Extrakte <ol><li> Herstellung von Zellextrakten <ol><li> Platz Platte (n) auf Eis und Wasch Zellen 3x mit kaltem PBS 1X. </li><li> Ernten der Zellen (~ 12 × 10 6) in 1 ml Lysepuffer (20 mM Tris-HCl bei pH 7,4, 1,25 mM MgCl 2, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% Nonidet P40, 5 U / ml RNase-Inhibitor ergänzt mit kompletter Mini-EDTA-freie Protease-Inhibitor-Cocktail Tabletten), übertragen Sie sie auf einem Eppendorf-Röhrchen, und gut mischen, indem man sie durch ein 15x 1cc U100 Insulinspritze 28 G 1/2. Lassen Sie das Zelllysat ruhen auf Eis für 15 min. </li><li> Setzen einige Tropfen Zelllysats auf eine Folie, zelluläre Lyse durch Beobachtung unter einem Phasenkontrastmikroskop unter Verwendung eines 10X-Objektiv beurteilen. Nur Kerne sichtbar sein soll und keine Zellmembranen sichtbar Attesting für Zell-Lyse sein. Als Kontrolle beobachtenlysierten Zellen. </li><li> Klärung des Zelllysats mittels Zentrifugation bei 11.000 × g für 20 min bei 4 ° C und halten das lösliche Lysat mit den Polyribosome. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Maus Gehirnextrakten <ol><li> Homogenisierung des gesamten Gehirns isoliert (~ 500 mg) durch 10 Hübe in einem eiskalten Dounce-Homogenisator mit 2 ml Lyse-Puffer und Klärung des Homogenats durch Zentrifugation bei 11.000 × g für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Laden des resultierenden Überstands auf ein Kissen aus 50% Saccharose und füllen Sedimentation für 2 Stunden bei 200.000 × g unter Verwendung einer Ultrazentrifuge Rotor TH-641 bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren Sie das Pellet, das die schein Polyribosomen in 1 ml Lyse-Puffer und gut mischen durch Pipettieren von oben und unten. Lassen Sie die Suspension Rest auf dem Eis für 30 Minuten, bevor sie auf Steigungen. </li></ol></li></ol> 5. Einlegen der Auszüge auf Saccharose-Gradienten und Ultrazentrifugation <ol><li> Messen Sie die Konzentrationder in der cytoplasmatischen Extrakt mit einem Spektralphotometer vorhandenen RNA. 20 OD 260 Einheiten des Extraktes vorsichtig und langsam laden ~ auf die 15% bis 55% Saccharose-Gradienten. Stellen Sie sicher, dass es 2-3 mm der verfügbaren Raum an der Oberfläche des Rohres zu vermeiden, während der Zentrifugation Überlaufen der Rohre. </li><li> Zentrifugieren der Gradienten unter Verwendung einer Ultrazentrifuge für 2 h 30 min bei 230.000 x g unter Verwendung einer Ultrazentrifuge Rotor TH-641 bei 4 ° C. Beim Zentrifugieren endet, entfernen Sie die Rohre und legen sie auf Eis vorsichtig, nicht die Steigungen stören. </li></ol> 6. Fraktionierung von Cytoplasmic Extrakte für Polysomen Profiling <ol><li> Zeigen Saccharose-Gradienten auf automatischer Dichte Fraktionierung System und fahren Sie mit Fraktionierung und automatisierte Sammlung von Fraktionen (jeweils 0,5 ml), wie vom Hersteller beschrieben. </li><li> Sammeln jeder Fraktion (~ 500 &amp;mgr; l) in einzelne Eppendorf-Röhrchen mit kontinuierlicher Überwachung der Absorption bei 254 nm auf. In parallel Fraktionierung des Gradienten Betrieb wird der polyribosomal Profil auf dem Diagrammpapier bearbeiten werden. Alternativ können Sie einen Datenerfassungseinheit auf den Schreiber, eine elektronische Erfassung der Polysom ​​Profil befestigt. </li><li> Am Ende jeder Fahrt, Transfer gesammelt Eppendorfs auf Trockeneis. Zu diesem Zeitpunkt entweder Speicher gesammelten Fraktionen bei -80 ° C ausgefällt oder direkt Protein-RNA-Komplexe wie folgt. </li></ol> 7. Proteinextraktion und-analyse <ol><li> Zu jeder gesammelten Fraktion der Saccharose-Gradienten, fügen 2 Volumen 100% kaltem Ethanol und lassen RNA-Protein-Komplexe zu fällen bei -20 ° C über Nacht. </li><li> Zentrifuge jeder RNA-Protein-Niederschlag bei 11.000 × g für 20 min bei 4 ° C und dann Waschen mit 70% Ethanol. Trockene und resuspendieren den Niederschlag in der SDS-PAGE-Probenpuffer, bevor Sie fortfahren mit Western-Blot mit spezifischen Antikörpern (siehe Abbildung 2). </li></ol> 8. RNA-Extraktion und Analyse <ol><li> Man fällt RNA-Protein-Komplexe, wie in Abschnitt 7.1. Resuspendieren jeder RNA-Protein-Niederschlag in dem Lysepuffer, enthaltend 0,1% SDS. Verdauen die Proteinkomponente des Niederschlags mit 2 mg / ml Proteinase K für 30 Minuten in einem 55 ° C Wasserbad. </li><li> Extrahieren RNA-Komponenten des Niederschlags durch Zugabe von 1 Volumen &quot;Phenol: Chloroform&quot;, 2 Volumina Chloroform und 0,1 Volumen 2 M NaOAc pH 4 und Zentrifugieren bei 10.000 × g bei 4 ° C für 20 min. Ausfällung von RNA aus der resultierenden wässrigen Phase von jeder Probe über Nacht bei -20 ° C durch Zugabe von 1 Volumen Isopropanol und 0,2 ug / ul Glykogen. Spin der Niederschlag 1 Stunde lang bei 10.000 × g bei 4 ° C. Mit 70% kaltem Ethanol waschen das RNA-Pellet. </li><li> Die RNA-Pellet in einem kleinen Volumen RNAse freies Wasser. Bewerten Sie die Menge und Qualität von RNA mit dem Spektralphotometer. </li></ol>

<ol><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).</li>
<li>Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).</li>
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<li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), New York, N.Y. 414-421 (2007).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Polysomen-Profilanalyse auf Sucrosegradienten ermöglicht die Messung der Translationsinitiation durch Analysieren der Dichte von Polysomen aus Zellen oder Geweben isoliert 9,11-14. Diese Technik ist die besten (wenn nicht der einzige) Ansatz zur Initiation der Translation in vivo zu messen. Es wird verwendet, um den Status der Translations wachsenden Zellen während des Zellzyklus 15 zu überwachen, und um die Effekte von verschiedenen Arten von Stress, einschließlich viraler Infektionen...

Eukaryotischen Zellen ständig stoßen eine Reihe von physiologischen und schädlichen Umweltstressbedingungen, die eine schnelle Reaktion erfordern adaptive Zelle. Zellstressantwort beinhaltet eine präzise Balance zwischen anti-und pro-Überleben Überleben wirkende Faktoren. Die Störung dieses Gleichgewichts kann irreversible Folgen führend in der Entwicklung der menschlichen Krankheiten wie Krebs und neurodegenerativen Krankheiten. Während der ersten Stufe der Reaktion auf Stress, Zellen zu aktivieren Proüberleben Wege, die die koordinierte Steuerung von Änderungen in der Genexpression auf der Ebene der mRNA-Translation beinhalten. mRNA-Translation in Eukaryonten ist ein komplexer Prozess, der koordinierte zelluläre Wechselwirkungen zwischen Translationsinitiationsfaktoren (eIFs), spezifische RNA-bindende Proteine ​​(FGE) und RNA-Moleküle 1 beinhaltet. Initiation, Elongation und Termination: mRNA-Translation ist in drei verschiedene Phasen unterteilt. Obwohl alle drei Phasen unterliegen regelRegelungsmechanismen, Mechanismen der Translationskontrolle zielen meist die Anfangsphase der Übersetzung, die auf diese Weise bildet die geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Proteinsynthese 2. Translation Initiation ist eine hochgeordnete Prozess, der mit der Bildung der eIF2a.GTP.Met-tRNA i Met ternären Komplex und die anschließende Bindung an die 40S-Untereinheit Ribosomen, die zur Bildung des Präinitiationskomplexes beginnt. Der nächste Schritt ist die Einstellung der Präinitiationskomplexes an mRNA, die die Aktivität des Translationsinitiationsfaktoren wie eIF4F und eIF3 beinhaltet. Der so gebildete 48S Präinitiationskomplexes erfährt spezifische Konformationsänderungen, die diese Maschinen ermöglichen, scannen, die 5&#39;-untranslatierte Bereich der mRNA, bis er erkennt die Start-Codon August Die meisten der Translationsinitiationsfaktoren werden dann veröffentlicht und 60S-Untereinheiten werden rekrutiert, um eine 80S Ribosomen-Komplex bilden, der Übersetzung, eine kompetentet welchem ​​Punkt beginnt die Proteinsynthese (Abbildung 1). Mehr als ein 80S monosome kann die Übersetzung der mRNA in einer gleichen Zeit produziert so genannte Polysomen (oder Polyribosomen). Die Dichte der Polysomen auf einer mRNA spiegelt die Initiation, Elongation und Terminierungsentgelte und ist somit ein Maß für die Übersetzbarkeit einer bestimmten Transkript. Allerdings ist Polysom ​​Profil hauptsächlich verwendet, um Veränderungen in der mRNA-Translation bei der Einleitung Schritt zu beurteilen. Hier haben wir ein Proteasom-Inhibitor als Translationsinitiationsinhibitor verwendet. Die Behandlung von Krebszellen mit dieser Droge bewirkt eine Stressreaktion, gekennzeichnet durch die Aktivierung der Stresskinase HRI benannt, der die Translationsinitiationsfaktor eIF2a 3 phosphoryliert. Phosphorylierung von eIF2a ist eine der wichtigsten Ereignisse, die zur Inhibition der Translationsinitiation in Säugerzellen 4.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Zellen</td></tr><tr><td>HeLa-Gebärmutterhalskrebszellen</td><td>Amerikanische Typkultur-Sammlung (Manassas, VA; ATCC)</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Schneider Drosophila embryonale Zellen</td><td>American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)</td><td>CRL-1963<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Nährboden und Ergänzungen</td></tr><tr><td>Schneider" s Drosophila Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SO146-500ml</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lebenstechnologien</td><td>11995-073</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Wissenschaftler</td><td>Wissenschaftler SH30396-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Saccharoselösungen</td></tr><tr><td>D-Saccharose</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP220-212</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Fisher Scientist</td><td>B3925<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Lysepuffer</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tekniscience</td><td>3624-05</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DVB-T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D 9779</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (Igepal CA-630 )</td><td>MJS Biolynx</td><td>19628</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Tekniscience</td><td>4095-02</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RNase-Inhibitor (RnaseOUT Rekombinanter Ribonuklease-Inhibitor)</td><td>Lebenstechnologien</td><td>10777-019</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Antiproteasen (komplett, mini, EDTA-frei)</td><td>Roche</td><td>11.836.170.001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">RNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Lebenstechnologien</td><td>AM2542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform</td><td>Fisher Scientist</td><td>BP1754I-400</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Wissenschaftler</td><td>C298-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>Lebenstechnologien</td><td>10814-010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Acros organische Stoffe</td><td>327270010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Antikörper</td></tr><tr><td>Anti-FMRP-Antikörper</td><td>Fournier et al., Cancer Cell International, 2010</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

analyse der translation initiation während stress-bedingungen durch polysomprofile profiling

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Präzise Steuerung der mRNA-Translation ist von grundlegender Bedeutung für die eukaryotische Zelle Homöostase, insbesondere in Antwort auf physiologische und pathologische Stress. Änderungen dieses Programms können das Wachstum von geschädigten Zellen, ein Markenzeichen der Krebsentwicklung oder zu vorzeitigem Zelltod wie bei neurodegenerativen Erkrankungen gesehen führen. Vieles von dem, was bekannt ist über die molekulare Grundlage für die Translationskontrolle ist von Polysomen-Analyse unter Verwendung eines Dichtegradienten Fraktionierung System erhalten. Diese Technik beruht auf der cytoplasmatischen Extrakte Ultrazentrifugation auf einem linearen Sucrose-Gradienten. Sobald der Spinn abgeschlossen ist, kann das System Fraktionierung und Quantifizierung zentrifugiert Zonen entsprechend unterschiedlichen Übersetzungs Ribosomen Populationen, wodurch eine Polysomen-Profil. Änderungen in der Polysomen-Profil sind, die Änderungen oder Fehler in Translationsinitiation, die in Reaktion auf verschiedene Arten von Stress auftreten. Diese Technik ermöglicht auch bewerten, the Rolle von spezifischen Proteinen auf Translations-Initiations-und translationale Aktivität bestimmter mRNAs zu messen. Hier beschreiben wir unser Protokoll zu Polysomprofile zur Translationsinitiation von eukaryotischen Zellen und Geweben, entweder unter normalen oder Stresswachstumsbedingungen durchführen zu beurteilen.

Wie zuvor erwähnt, ermöglicht die Polysomen Profil Analyse der Veränderungen der Translationsinitiation unter Stressbedingungen. Fig. 1 ist eine vereinfachte Ansicht, die die Translationsinitiation, wie zuvor beschrieben ist ein mehrstufiger Prozess, der eine geordnete Anordnung von Translationsinitiationskomplexen. Unter normalen Wachstumsbedingungen sind Translationsinitiationskomplexen in Polyribosome deren Erfassung durch Polysomen Profil zeugen für eine aktive Translationsinitiation (, unbehandelt ...

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um Veränderungen in der mRNA-Translationsinitiation eukaryontischer Zellen in Reaktion auf Stress-Bedingungen zu untersuchen. Dieses Verfahren basiert auf der Geschwindigkeit Trennung auf Saccharosegradienten übersetzen Ribosomen nicht übersetzen Ribosomen basiert.

Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Auswirkungen von Stressbedingungen auf die Translation und die Initiation in Säugetierzellen und -geweben mittels Polysom-Profilierung zu messen. Dies wird erreicht, indem man zunächst Säugetier-Krebszellen mit einem Anti-Krebs-Medikament behandelt und anschließend Zellextrakte herstellt. Der zweite Schritt besteht darin, Saccharosegradienten herzustellen.Anschließend werden die Zellextrakte auf die Saccharosegradienten aufgetragen und ultrazentrifugiert, um die ribosomalen Fraktionen zu trennen. Abschließend erfolgt eine Western-Blot-Analyse mit spezifischen Antikörpern, um die Assoziation der untersuchten Proteine mit dem Polysom zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber einer etablierten Methode wie der metabolischen Markierung besteht darin, dass wir damit die Wirkung von Stressbedingungen auf den Initiierschritt der Translation untersuchen können.Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Stresstherapie zu beantworten, beispielsweise, ob und wie krebsbekämpfende Wirkstoffe die Translationsinitiierung beeinflussen. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Krebstherapie, da s

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Extraktion des Übersetzens Ribosomen aus eukaryotischen Zellen. Sobald extrahiert, Ribosomen in monosomes und Polyribosomen durch Saccharose-Gradienten Fraktionierung getrennt, um verschiedene ribosomale Populationen analysiert werden. Als solche ist diese Methode der Goldstandard für die Untersuchung der Regulation der Translation.

Eukaryotische Polyribosome Profile Analysis

Ribosomen spielen eine zentrale Rolle bei der Proteinsynthese. Polyribosom (Polysomen) Fraktionierung durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation ermöglicht die direkte Bestimmung der Übersetzung Effizienz einzelner mRNAs auf einem genomweiten Maßstab. Darüber hinaus kann dieses Verfahren für die biochemische Analyse von Ribosomen und Polysomen-assoziierten Faktoren wie Chaperone und Signalmolekülen verwendet werden.

Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala

Die Fähigkeit der Zellen, sich an Stress anzupassen, ist entscheidend für ihr Überleben. Die Regulation der mRNA-Translation ist eine solche Anpassungsstrategie, die eine schnelle Regulation des Proteoms ermöglicht. Hier stellen wir ein standardisiertes Polysomen-Profiling-Protokoll zur Verfügung, um spezifische mRNAs zu identifizieren, die unter Stressbedingungen selektiv translatiert werden.

Bewertung der Selective mRNA Translation in Säugerzellen durch Polysomen Profilieren

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Extraktion und Fraktionierung von Transkripten aus pflanzlichem Gewebe auf der Grundlage der Anzahl der gebundenen Ribosomen. Es ermöglicht eine globale Abschätzung der Translationsaktivität und die Bestimmung des Translationsstatus spezifischer mRNAs.

Eine einfache Methode für Pflanzen Polysomen Profilieren

Translational Regelung spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von Protein Fülle. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Methode zur quantitativen Analyse der Übersetzung in der angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae.

Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung

Toeprinting zielt darauf ab, die Möglichkeit der in-vitro- Messung transkribierte RNA zu Form Übersetzung Einleitung komplexe mit Ribosomen unter den unterschiedlichsten Bedingungen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für Toeprinting Säugetieren RNA und kann zur GAP-abhängige und IRES-driven Übersetzung zu studieren.

Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

Das übergeordnete Ziel der Polysome Profilerstellung Technik ist Analyse der übersetzerischen Tätigkeit der einzelnen mRNAs oder Transkriptom mRNAs während der Proteinsynthese. Die Methode ist für Studien von Protein-Synthese-Verordnung, Übersetzung Aktivierung und Repression in Gesundheit und mehrere menschliche Krankheiten wichtig.

Polysome Profilerstellung in Leishmaniose, menschliche Zellen und Maus Hoden

Die Entwicklung des Säugetiergehirns erfordert eine ordnungsgemäße Kontrolle der Genexpression auf der Ebene der Translation. Hier beschreiben wir ein Polysomen-Profiling-System mit einer einfach zu montierenden Sucrose-Gradientenerstellungs- und Fraktionierungsplattform, um den Translationsstatus von mRNAs im sich entwickelnden Gehirn zu bewerten.

Analyse der Übersetzung im sich entwickelnden Mausgehirn mit Polysome Profiling

Wir stellen eine Technik zur schnellen Stabilisierung translationaler (Proteinbiosynthese) Komplexe mit Formaldehydvernetzung in lebenden Hefe- und Säugetierzellen vor. Der Ansatz ermöglicht die Sezierung transienter Zwischenprodukte und dynamischer RNA:Protein-Interaktionen. Die vernetzten Komplexe können in mehreren nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden, z. B. in Deep-Sequencing-basierten Profilierungsmethoden, Mikroskopie und Massenspektrometrie.

Schnelle In-vivo-Fixierung und Isolierung translationaler Komplexe aus eukaryotischen Zellen

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein Polysomenprofil generiert wird, ohne automatisierte Gradientenerzeuger oder Gradientenfraktionierungssysteme zu verwenden.

Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

Das hier vorgestellte Protokoll beinhaltet polysomales Profiling zur Isolierung von Translatomen, mRNAs, die mit Ribosomen assoziiert sind, in nicht-polysomale und polysomale RNAs aus Arabidopsis durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation. Diese Methode demonstriert die Translationseffizienz von hitzegestresstem Arabidopsis.

Translationseffizienztest mit Polysomenprofilen unter Hitzebelastung

Erfahren Sie, wie Polysom-Profiling Stress-Effekte auf die Translationsinitiation in Säugetierzellen analysiert. Diese Methode nutzt Saccharose-Gradienten-Ultrazentrifugation und Western Blot zur Untersuchung ribosomaler Aktivität.

Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling

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