Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Auswirkungen von Stressbedingungen auf die Translation, Initiation von Säugetierzellen und -geweben durch Polysomen-Profiling zu messen. Dies wird erreicht, indem Säugetierkrebszellen zunächst mit einem Krebsmedikament behandelt und dann Zellextrakte hergestellt werden. Der zweite Schritt besteht darin, Saccharose und Farbverläufe herzustellen.

Als nächstes werden die Zellextrakte auf die Saccharose geladen, gradient und ultrazentrifugiert, um ribosomale Fraktionen zu trennen. Abschließend wird eine Western-Blot-Analyse mit spezifischen Antikörpern durchgeführt, um die Assoziation der getesteten Proteine mit dem Polysom zu beurteilen. Der Hauptvorteil dieser Technik einer bestehenden Methode wie der metabolischen Markierung besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die Auswirkungen von Stressbedingungen auf den Initiationsschritt der Translation zu bewerten.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im stresstherapeutischen Bereich zu beantworten, z. B. ob und wie Krebsmedikamente die Initiation der Translation beeinflussen. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auch auf die Krebstherapie, da sie dazu beiträgt, neue regulatorische Wege der Translationsinitiierung aufzudecken. Obwohl diese Methode Einblicke in die Regulation der Translationsinitiation in Zellkulturen geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie isolierte Gewebe, einschließlich Gehirn und Tumore, angewendet werden.

Um das automatisierte Dichtegradientenfraktionierungssystem vorzubereiten, waschen Sie zuerst das Schlauchsystem des Geräts fünf Minuten lang mit 0,1 % SDS. Waschen Sie dann das Schlauchsystem fünf Minuten lang mit 70 % Ethanol, gefolgt von RNA Zap-Lösung für fünf Minuten. Und schließlich trocknen Sie das Schlauchsystem mit DEPC, Wasser, indem Sie Luft in das System pumpen.

Bereiten Sie als Nächstes 15%- und 55%Saccharoselösungen vor und erzeugen Sie den linearen 15- bis 55%Saccharose-Gradienten mit einem ISCO-Modell 1 60-Gradientenformer. Gemäß den Anweisungen des Herstellers ist es wichtig, die Drehzahl der tris-Peristaltikpumpe sorgfältig zu kontrollieren, um die Bildung von Blasen oder Turbulenzen in den Gradienten während der Zeit zu vermeiden, in der das Gradientenmacherprogramm läuft und die Ultra-Zentrifuge auf vier Grad Celsius abkühlt. Halten Sie die Gradienten bis zur Anwendung bei vier Grad Celsius. Dieses Experiment verwendet helo-Gebärmutterhalskrebszellen mit geringer Passage, die zuvor plattiert wurden, um eine Konfluenz von 80 % zu erreichen.

Am Tag des Experiments. Es ist wichtig, Extraktionen aus frischen Zellen vorzunehmen und eine RNA-Kontamination zu vermeiden. Während dieses Verfahrens wird 90 Minuten vor der Zugabe des Krebsmedikaments das Medium der Zellen durch frisches, vollständiges Medium ersetzt. Um die Translation zu stimulieren, bringen Sie die Zellen in den Inkubator zurück.

Geben Sie das Krebsmedikament als Kontrollzugabe direkt in die Zellkultur. DMSO inkubieren Sie vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid nach vier Stunden, legen Sie Platten auf Eis und waschen Sie die Zellen dreimal mit kalten PBS-Erntezellen in einem Milliliter Lysepuffer, um beste Ergebnisse zu erzielen. Verwenden Sie ca. 12 Millionen Zellen für jede Versuchsbedingung.

Übertragen Sie die Zellen von den geschabten Platten in ein Einor-Röhrchen und mischen Sie sie gut, indem Sie sie 15 Mal durch eine Spritze führen. Lassen Sie die Zelllysate 15 Minuten auf Eis ruhen. Geben Sie als Nächstes ein paar Tropfen Zelllysat auf einen Objektträger und beurteilen Sie die zelluläre Lyse durch Phasenkontrastmikroskopie mit einem 10-fach-Objektiv.

Sobald die Zelllyse verifiziert ist, wird das Zelllysat durch Zentrifugation bei 11.000 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius geklärt. Übertragen Sie das lösliche Lysat, das die Polyribosomen enthält, in ein neues Röhrchen und halten Sie es auf Eis, bevor Sie die zytoplasmatischen Extrakte auf Saccharosegradienten laden. Messen Sie die Konzentration der vorhandenen RNA vorsichtig mit einem Spektralphotometer und laden Sie langsam etwa 20 OD zwei 60 Einheiten des Extrakts auf den Saccharosegradienten von 15 bis 55 %.

Achten Sie darauf, dass an der Oberfläche des Röhrchens zwei bis drei Millimeter Platz zur Verfügung stehen, um ein Überlaufen des Röhrchens während der Zentrifugation zu vermeiden. Laden Sie die Rohre auf den Rotor. Setzen Sie den Rotor auf die Ultra-Zentrifuge und zentrifugieren Sie die Gradienten bei 230.000 G bei vier Grad Celsius für zwei Stunden und 30 Minuten.

Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Röhrchen und legen Sie sie vorsichtig auf Eis, ohne die Gradienten zu stören. Um mit der Fraktionierung der zytoplasmatischen Extrakte zu beginnen, platzieren Sie die Saccharosegradienten auf einem automatisierten Dichtefraktionierungssystem und fahren Sie mit der automatischen Fraktionierung und Sammlung von Fraktionen fort, wie vom Hersteller beschrieben. Sammeln Sie jede 0,5-Milliliter-Fraktion in einzelne Einor-Röhrchen mit kontinuierlicher Überwachung der Absorption bei 250 Nanometern parallel zur Gradientenfraktionierung, wobei das polyribosomale Profil am Ende jedes Laufs auf dem Diagrammpapier bearbeitet wird.

Füllen Sie die Rohre mit den gesammelten Fraktionen auf Eis. Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie jeder gesammelten Fraktion zwei Volumen 100 % kaltes Ethanol hinzu und lassen Sie die RNA-Proteinkomplexe über Nacht bei minus 20 Grad Celsius ausfallen. Zur Extraktion von Proteinen wird jedes RNA-Proteinausfällung bei 11.000 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert, nach dem Waschen mit 70 % Ethanol an der Luft getrocknet und der Niederschlag resuspendiert.

Bevor Sie mit der Western-Blot-Analyse zur Extraktion von RNA-Resus fortfahren, suspendieren Sie jeden RNA-Proteinpräzipitat in einem Lysepuffer, der 0,1 % SDS enthält, verdauen Sie eine Proteinkomponente des Niederschlags mit zwei Milligramm pro Milliliter Proteinase K für 30 Minuten. In einem Wasserbad mit 55 % Celsius fügen Sie ein Volumen Phenolchloroform, zwei Volumen Chloroform und 0,1 Volumen zwei molare Natriumacetate mit einem pH-Wert von vier hinzu. 15 Minuten auf Eis ruhen lassen.

Zentrifugieren Sie bei 10.000 GS bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Sammeln Sie die resultierende wässrige Phase jeder Probe der Präzipitations-RNA, indem Sie ein Volumen Isopropanol und 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter Glykogen hinzufügen und über Nacht bei minus 20 Grad Celsius belassen. Am nächsten Tag schleudern Sie den Niederschlag bei 10.000 G bei vier Grad Celsius für eine Stunde.

Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das RNA-Pellet mit 70 % kaltem Ethanol, resuspendieren Sie das RNA-Pellet in ein kleines Volumen RNAs. Kostenloses Wasser. Beurteilen Sie die Menge und Qualität der RNA mit dem Spektrophotometer.

Hier sind repräsentative Polysomenprofile aus zytoplasmatischen Extrakten dargestellt. Hergestellt aus Helozellen, die entweder unter normalen Bedingungen oder nach vierstündiger Behandlung mit dem Proteasom-Inhibitor gezüchtet und zentrifugiert wurden, wurde ein linearer Saccharosegradient von 15 bis 55 % Volumen zu Gewicht durchgeführt. Die Positionen von 40 s-Ribosomen, 60 s, Ribosomen 80 s, Monosomen und Polysomen sind in jedem Profil angegeben.

Fraktionen von oben nach unten sind von links nach rechts dargestellt. Die Fraktionen wurden gesammelt und mittels Western Blot mit Antikörpern gegen das große ribosomale L 28-Protein sowie das Polysom-assoziierte Protein FMRP analysiert, die als Kontrollen für die Polysomenintegrität unter normalen Wachstumsbedingungen dienen. Translationsinitiationskomplexe werden in Polyribosomen umgewandelt, deren Nachweis durch Polysomenprofiling auf eine aktive Translationsinitiierung hindeutet, wie hier beobachtet. Die Behandlung mit dem Proteasom-Inhibitor reduziert die Polysomen-Peaks mit einem gleichzeitigen Anstieg eines DS-Monos, was auf eine Hemmung der Translationsinitiierung hinweist. Während der Teilnahme an diesem Verfahren ist es wichtig, in einer r nasenfreien Umgebung zu arbeiten, um Gradienten sorgfältig zu behandeln und die Zelllyse nach diesem Verfahren zu kontrollieren.

Andere Methoden, wie z.B. westliches Blut und nördliches Blut, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Assoziation eines spezifischen Proteins oder M MNA mit einem Polysom, das nach seiner Entwicklung von der Krebsbehandlung beeinflusst wird. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der ary-Translation, um die Auswirkungen der Regulierung von Translationsinitiationsfaktoren bei menschlichen Krankheiten wie Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen zu untersuchen.