Reduzierte Itraconazol Konzentration und Dauer sind erfolgreich in der Behandlung von

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Amphibien, die mit dem Amphibienpilz Batrachochytrium dendrobatidis, BD, infiziert sind, mittels der antimykotischen Chemotherapie mit Triazol zu behandeln. Dies wird erreicht, indem zunächst BD-Kulturen angezüchtet und Tiere mit dem Pilzpathogen infiziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Tiere mittels DNA-Extraktion und qPCR an Abstrichen der Haut zu testen, um die BD-Infektion zu bestätigen.

Anschließend werden die infizierten Tiere behandelt, indem sie sechs Tage lang täglich fünf Minuten in einer 0,0025%igen Econazollösung gebadet werden. Der letzte Schritt besteht darin, den Infektionsstatus der behandelten Tiere durch QPCR-Analysen von Hautabstrichen über einen Zeitraum von mindestens vier Wochen nach Abschluss der Behandlung zu überwachen, um eine erfolgreiche Therapie sicherzustellen. Dieses Verfahren zeigt, dass eine verminderte Konzentration und kürzere Behandlungsdauer mit dem Antimykotikum Itraconazol wirksam ist, um mit Bd infizierte Tiere zu behandeln. Der Hauptvorteil dieser Behandlungsregimen im Vergleich zur empfohlenen Standarddosis – einer 0,01%igen Itraconazollösung über 11 Tage – liegt darin, dass eine um drei Viertel reduzierte Konzentration und eine Verkürzung der Behandlungsdauer auf sechs Tage weiterhin ausreicht, um eine BD-Infektion zu heilen, gleichzeitig jedoch die negativen Nebenwirkungen der empfohlenen Dosis minimiert werden.

Nach der Inkubation der BD in Triton-Brühe gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll und Überprüfung der Zo-Sporen-Bewegung übergießen Sie jede Platte mit fünf Millilitern abgestandenem Leitungswasser und warten 10 Minuten, damit die ZO-Sporen in das Medium eindringen können. Danach gießen Sie die ZO-Sporen-Suspension in einen tragbaren Behälter. Schätzen Sie die ZO-Sporen-Konzentration mit einem Hämozytometer ab und verdünnen Sie die Suspension auf eine Konzentration von 1 × 10⁶ pro drei Milliliter mit abgestandenem Leitungswasser, um damit ein Tier wie das hier gezeigte Latoria vei Alpina zu infizieren.

Halten Sie es über einen 50-Milliliter-Behälter und gießen Sie drei Milliliter der Inokulum-Mischung über seinen Venter. Anschließend stellen Sie das Tier in den Behälter zusammen mit dem Abfluss des Inokulums. Setzen Sie einen Deckel auf den Behälter und lassen Sie das Tier 24 Stunden lang im Inokulationsbehälter, um eine Infektion sicherzustellen.

Um eine Kontamination mit dem BD-Erreger zu verhindern, die alten Handschuhe ausziehen und vor der Entsorgung zur Autoklavierung bereitstellen. Nach dem Anlegen eines neuen Paars Handschuhe das nächste Tier impfen.

Nach 24 Stunden der Inokulation die Tiere für zwei Wochen in ihre individuellen desinfizierten Terrarien zurückbringen. Denken Sie daran, alle flüssigen Abfälle vor der Entsorgung zu desinfizieren, indem Sie die Lösung nach zwei Wochen auf 10 % Bleiche bringen. Überprüfen Sie das Vorliegen einer erfolgreichen BD-Infektion, indem Sie die Tiere mit einem sterilen Wattestäbchen abstrichen.

Den Abstrich vorsichtig während und zwischen den Strichen drehen. Fünf Abstriche auf jeder Seite am Venter, jedem Oberschenkel und an jedem der vier Gliedmaßen durchführen, insgesamt 45 Striche. Die Abstriche in 1,5-Milliliter-Mikrogefäßen bei minus 20 Grad Celsius lagern.

Extrahieren Sie die genomische DNA aus den Abstrichen mithilfe eines im Handel erhältlichen DNA-Isolationskits und führen Sie die QPCR wie im Textprotokoll beschrieben durch. Bereiten Sie drei Behandlungsbäder vor, eines für jede der drei Itraconazol-Dosierungen, wie im Textprotokoll beschrieben. Stellen Sie anschließend einzelne Amphibien in desinfizierten Bädern unter.

50-Milliliter-Dosen mit 35 Millilitern der Behandlungslösung. Unter Beachtung des Handschuhwechsels zwischen den Tieren die Dose gelegentlich vorsichtig schwenken, um sicherzustellen, dass die Tiere fünf Minuten lang vollständig benetzt sind. Nach fünf Minuten die Tiere in ihren desinfizierten Bereich zurückbringen.

Wiederholen Sie die fünfundzwanzigminütige Behandlung täglich für weitere fünf Tage. Testen Sie die Tiere erneut auf BD-Infektion eine Woche nach Beendigung der Behandlung und anschließend einmal wöchentlich über vier Wochen, um sicherzustellen, dass die Infektion abgeklungen ist. Beachten Sie, dass die Tiere auch nach Abschluss der Behandlung so behandelt werden müssen, als stellten sie weiterhin ein Kontaminationsrisiko dar.

Die Tiere müssen mindestens einen Monat lang nach der Infektion in getrennten Bereichen gehalten werden. Falls die Behandlung erfolglos ist, muss sie wiederholt werden. Unterschiedliche Arten und Lebensstadien reagieren unterschiedlich auf die Infektion und auf Behandlungsschemata, weshalb die Behandlung vor ihrer breiten Anwendung erprobt werden muss.

Da BD ein Biohazard darstellt, desinfizieren Sie das einzelne Terrarium wöchentlich, indem Sie das Terrarium und die Behälter für die Behandlung in einer 10%igen Bleichlösung baden. Das Bad sollte mindestens 30 Sekunden dauern, anschließend wird die Bleiche mit zwei Spülgängen mit Wasser entfernt, und die Behälter müssen vor der Wiederverwendung 24 Stunden lang trocknen, um das Überleben der Frösche sicherzustellen. Nachfolgend sind Ergebnisse nach 11-tägiger BD-Behandlung oder nach 6-tägiger BD-Behandlung dargestellt.

Die schwarzen Pfeile zeigen den letzten Behandlungstag an. Die durchgezogenen Linien zeigen die Überlebensrate der Kontrollgruppen. Die durchgezogenen schwarzen Linien beziehen sich auf Tiere, die BD-positiv waren, aber keine BD-Behandlung erhielten.

Die durchgezogenen grauen Linien zeigen Tiere, die BD-negativ waren und keine BD-Behandlung erhielten. Die gestrichelten Linien zeigen die Überlebensraten der Behandlungsgruppen, die die angegebene Konzentration von Econazol erhielten. Alle Tiere, die sechs Tage lang mit 0,0025 % im Vernebler behandelt wurden, waren vier Wochen nach Beendigung der Behandlung BD-negativ, weshalb diese Behandlung als erfolgreich angesehen wurde.

Außerdem zeigte diese Dosierung der Econazol-Behandlung im Vergleich zu den BD-positiven Kontrollen keinen signifikanten Unterschied in der Mortalität. Beachten Sie, dass die Behandlungen mit 0,01 % und 0,005 % Econazol über einen Zeitraum von 11 Tagen im Vergleich zu den BD-positiven Kontrollen zu einem signifikanten Anstieg der Mortalität führten. Vergessen Sie nicht, dass der Pilzpathogen BD eine Biohazard darstellt, weshalb Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen und Wechseln von Handschuhen, das Autoklavieren aller festen Abfälle und die Desinfektion erforderlich sind.

Alle flüssigen Abfälle müssen bei Durchführung dieses Verfahrens entsorgt werden.