Reduzierte Itraconazol Konzentration und Dauer sind erfolgreich in der Behandlung von Batrachochytrium dendrobatidis Infektion in Amphibien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Amphibien, die mit dem Amphibienpilz Kitt, Bera Key Tridium, Dendro, He oder BD infiziert sind, mit der antimykotischen Chemotherapie bei Triazol zu behandeln. Dies wird erreicht, indem zunächst BD-Kulturen gezüchtet und Tiere mit dem Pilzerreger geimpft werden. Der zweite Schritt besteht darin, Tiere mittels DNA-Extraktion und QPCR auf Hautabstrichen zu testen, um eine BD-Infektion sicherzustellen.

Anschließend werden die infizierten Tiere behandelt, indem die Tiere sechs Tage lang fünf Minuten lang täglich mit 0,0025%iger Econazollösung gebadet werden. Der letzte Schritt besteht darin, den Infektionsstatus der behandelten Tiere zu überwachen, indem mindestens vier Wochen nach Abschluss der Behandlung eine QPCR-Analyse des Hautaustauschs durchgeführt wird, um eine erfolgreiche Behandlung des Tieres zu gewährleisten. Dieses Verfahren zeigt, dass eine reduzierte Konzentration und eine kürzere Behandlungszeit des Antimykotikums Itraconazol für die Behandlung von Tieren, die mit BD infiziert sind, wirksam ist. Der Hauptvorteil der Anwendung dieses Behandlungsschemas gegenüber der empfohlenen Behandlungsdosis, die eine 0,01%ige Itraconazol-Lösung für 11 Tage ist, besteht darin, dass eine reduzierte Konzentration von einem Viertel dieser empfohlenen Dosis und eine verkürzte Behandlungszeit auf sechs Tage immer noch wirksam bei der Heilung von BD-Infektionen ist, aber auch die negativen Nebenwirkungen der Verwendung der empfohlenen Behandlungsdosis minimiert.

Nachdem Sie die BD in Tritonbrühe, wie im Textprotokoll beschrieben, inkubiert und auf Zo-Sporenbewegung überprüft haben, fluten Sie jede Platte mit fünf Millilitern gealtertem Leitungswasser und warten Sie 10 Minuten, bis die ZO-Sporen in das Medium gelangen können. Gießen Sie anschließend die Zo Spor Suspension in einen tragbaren Behälter. Schätzen Sie die ZO-Spor-Konzentration mit einem Hämozytometer und verdünnen Sie das Gemisch auf eine Konzentration von eins mal 10 bis sechs pro drei Milliliter mit Alter Leitungswasser, um ein Tier wie das hier gezeigte Latoria vei Alpina zu impfen.

Halten Sie es über ein 50-Milliliter-Gefäß und gießen Sie drei Milliliter der Inokulummischung über den Bauch. Legen Sie dann das Tier in den Behälter mit dem Abfluss aus dem Inokulum. Setzen Sie einen Deckel auf den Behälter und lassen Sie das Tier 24 Stunden lang im Impfbehälter, um eine Infektion zu gewährleisten.

Zur Vermeidung einer Kontamination mit dem BD-Erreger. Ziehen Sie die alten Handschuhe aus und legen Sie sie vor der Entsorgung zum Autoklavieren. Nach dem Anlegen wird ein neues Paar Handschuhe geimpft, um das nächste Tier zu impfen.

Nach 24 Stunden Impfung bringen Sie die Tiere für zwei Wochen in ihre individuellen desinfizierten Terrarien zurück. Denken Sie daran, alle flüssigen Abfälle vor der Entsorgung zu desinfizieren, indem Sie die Lösung nach zwei Wochen auf 10 % Bleiche bringen. Testen Sie auf eine erfolgreiche BD-Infektion, indem Sie die Tiere mit einem sterilen Wattestäbchen abtupfen.

Drehen Sie den Tupfer vorsichtig während und zwischen den Zügen. Tupfen Sie fünfmal auf jede Seite, jeden Oberschenkel und jedes der vier Gliedmaßen für insgesamt 45 Schläge. Lagern Sie die Tupfer in 1,5 Milliliter Mikroröhrchen bei minus 20 Grad Celsius.

Extrahieren Sie die genomische DNA aus den Abstrichen mit einem kommerziell erhältlichen DNA-Isolationskit und führen Sie die QPCR durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie drei Behandlungsbäder vor, eines für jede der drei Dosierungen von Itraconazol, wie im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes werden einzelne Amphibien desinfiziert.

50 Milliliter Dosenbehälter mit 35 Millilitern der Behandlungslösung. Denken Sie daran, die Handschuhe zwischen den Tieren zu wechseln, und schwenken Sie den Behälter gelegentlich, um sicherzustellen, dass die Tiere fünf Minuten lang vollständig bedeckt sind. Bringen Sie die Tiere nach fünf Minuten wieder in ihren desinfizierten Bereich zurück.

Wiederholen Sie die fünfminütige Behandlung täglich für weitere fünf Tage. Testen Sie die Tiere eine Woche nach Beendigung der Behandlung erneut auf BD-Infektionen und vier Wochen lang einmal pro Woche, um sicherzustellen, dass die Infektion abgeklungen ist. Beachten Sie, dass die Tiere auch nach Abschluss der Behandlung so behandelt werden müssen, als ob sie immer noch ein Kontaminationsrisiko darstellen würden.

Die Tiere müssen mindestens einen Monat nach der Infektion in getrennten Bereichen gehalten werden. Wenn die Behandlung nicht erfolgreich ist, muss sie wiederholt werden. Verschiedene Spezies und verschiedene Lebensstadien reagieren unterschiedlich auf Infektionen und Behandlungsschemata, weshalb die Behandlung getestet werden muss, bevor sie allgemein angewendet wird.

Da BD eine biologische Gefahr ist, desinfizieren Sie die einzelnen Terrien wöchentlich, indem Sie die Terria und die Behandlungsbehälter in einer 10%igen Bleichlösung baden. Baden Sie mindestens 30 Sekunden lang, waschen Sie das Bleichmittel mit zwei Spülgängen und Wasser ab und lassen Sie die Behälter 24 Stunden trocknen, bevor Sie das Überleben der Frösche wiederverwenden. Die folgenden 11 Tage BD-Behandlung oder sechs Tage BD-Behandlung sind hier dargestellt.

Die schwarzen Pfeile zeigen den letzten Tag der Behandlung an. Die durchgezogenen Linien zeigen das Überleben der Kontrollgruppen. Die durchgezogenen schwarzen Linien beziehen sich auf Tiere, die BD-positiv waren, aber keine BD-Behandlung erhielten.

Und die durchgezogenen grauen Linien gelten für Tiere, die BD-negativ waren und keine BD-Behandlung erhielten. Die gestrichelten Linien zeigen das Überleben der Behandlungsgruppen, die die angegebene Konzentration von Econazol erhielten. Alle Tiere, die sechs Tage lang mit 0,0025 % im Cousvernebler behandelt wurden, waren vier Wochen nach Beendigung der Behandlung BD-negativ, so dass diese Behandlung als erfolgreich angesehen wurde.

Darüber hinaus unterschied sich diese Dosierung der Econazol-Behandlung im Vergleich zu den BD-Positivkontrollen nicht signifikant in der Mortalität. Beachten Sie, dass die Behandlungen mit 0,01 % und 0,005 % Econazol für 11 Tage zu einem signifikanten Anstieg der Mortalität im Vergleich zu den BD-Positivkontrollen führten. Vergessen Sie nicht, dass es sich bei dem Pilzerreger BD um eine biologische Gefährdung handelt. Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen und Wechseln von Handschuhen, das Autoklavieren, alle festen Abfälle und die Desinfektion.

Alle flüssigen Abfälle müssen nach diesem Verfahren entnommen werden.