Bottom-up-und Shotgun Proteomics, um eine umfassende Cochlear Proteome Identifizieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe verschiedener proteomischer Techniken die größtmögliche Anzahl an Proteinidentifikationen aus dem cochleären Sinnepithel zu erzielen. Dies wird erreicht, indem Cochleae und Sinnepithel von adulten Mäusen isoliert und im zweiten Schritt in Puffer zur Zelllyse ultraschallbehandelt werden, um Proteine zu gewinnen. Um die Peptid- und Proteinsequenzabdeckung zu verbessern, werden unterschiedliche Verdauungsstrategien entweder am gesamten Lysat oder an fraktioniertem Proteinlysat angewandt.

Danach werden verschiedene Trenntechniken eingesetzt, einschließlich starken Kationenaustausch und umgekehrter Phasenchromatographie, um die Probenvielfalt vor der Massenspektrometrie-Analyse zu reduzieren. Die Ergebnisse zeigen die Identifizierung einer großen Anzahl von membranständigen und löslichen Proteinen des sensorischen Epithels der Mauscochlea durch Anwendung mehrerer Proteomik-Ansätze und eines Massenspektrometers mit hoher Auflösung. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie Antikörper-Microarrays und zweidimensionaler Gelelektrophorese liegt darin, dass eine große Zahl sowohl löslicher als auch membranständiger Proteine identifiziert wird, wodurch die Daten zum Cochlea-Proteom erweitert werden.

Obwohl diese Methode Einblicke in Biomarker im Zusammenhang mit Hör- und Tränenfunktionsstörungen ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, beispielsweise zur Identifizierung von Biomarkern im Zusammenhang mit dem Alter sowie Brust- oder Lungenkrebs. Diese Methode kann zudem zur Untersuchung anderer biologischer Proben wie Blut verwendet werden. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir die begrenzte Verfügbarkeit proteomischer Datensätze aus dem Säugetier-Innenohr feststellten, insbesondere die geringe Anzahl an identifizierten Membranproteinen vor Beginn dieses Verfahrens.

Isolieren Sie das cochleäre sensorische Epithel von 30 Tage alten Mäusen nach der Geburt. Nach dem Waschen des Gewebes mit einem Mal Phosphatpuffer, geben Sie 100 Mikroliter Puffer zur Zelllyse zum Gewebe hinzu und beschallen Sie die Mischung für 30 Sekunden auf Eis mit einem Ultraschallzerreißer. Kühlen Sie das Lysat zwischen den einzelnen Beschallungen jeweils eine Minute auf Eis ab und führen Sie insgesamt drei Beschallungen durch.

Centrifugieren Sie die Suspension bei 16.000 × g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Danach behalten Sie den Überstand für die Verdauung bei. Fügen Sie danach ein 30 µL-Aliquot des cochleären Proteinextrakts direkt einem 30-K-Spinfilter hinzu und mischen Sie es mit 200 µL acht molarer Harnstofflösung in Riss HCl im Zentrifugenröhrchen.

Das Gemisch bei 14.000 × g für 15 Minuten. Danach das Konzentrat mit 200 µL einer achtmolaren Harnstofflösung verdünnen und die Zentrifugation unter den gleichen Bedingungen wie zuvor wiederholen. Anschließend 10 µL 10× Iodacetamid und 90 µL achtmolare Harnstofflösung zum Konzentrat im Filter geben und eine Minute lang vortexen.

Nachdem der Spin-Filter in einem Mikrozentrifugenständer platziert wurde, 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, nach einer Zentrifugation bei 14.000 × g für 10 Minuten mit 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter Endoprotease Ly-C im Verhältnis von 1:50 (Enzym zu Protein), und das Gemisch anschließend über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubieren. Danach 40 Mikroliter einer 100 Millimolar-Ammoniumbicarbonat-Lösung zum Filtereinheit hinzufügen und das Gemisch bei 14.000 × g für 10 Minuten zentrifugieren. Nach Wiederholung des vorherigen Schritts die Filtereinheit mit 40 Mikrolitern achtmolarer Harnstofflösung waschen. Anschließend die Filtereinheit zweimal mit jeweils 40 Mikrolitern Milli-Q-Wasser waschen.

Nachdem die Filtereinheit dreimal mit je 100 Mikrolitern 50 Millimolarer Ammoniumbicarbonatlösung gewaschen wurde, fügen Sie 0,4 Mikrogramm pro Mikroliter Trypsin im Verhältnis von 1 zu 100 (Enzym zu Protein) hinzu und inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation eluieren Sie die tryptischen Peptide, indem Sie 40 Mikroliter 50 Millimolarer Ammoniumbicarbonatlösung zur Filtereinheit geben und die Mischung 10 Minuten bei 14.000 × g zentrifugieren. Wiederholen Sie diesen Schritt anschließend noch einmal.

Zu diesem Zeitpunkt 50 bis 100 Mikrogramm des verdauten Proteinsamples auf eine 200 mal 2,1 Millimeter große Fünf-Mikrometer-Strong-Cation-Austauschsäule auftragen. Um die Peptide zu trennen, überwachen Sie die Peptidfraktionen bei 280 Nanometern und sammeln die Fraktionen in zwei-minütigen Intervallen. Sammeln Sie die Fraktionen mithilfe eines Fraktionssammlers und trocknen Sie diese anschließend in einem Vakuumkonzentrator. Bewahren Sie die getrockneten Fraktionen nach Fertigstellung bei minus 80 Grad Celsius auf, bis sie für die Flüssigkeitschromatographie verwendet werden sollen.

Analyse durch Tandem-Massenspektrometrie. Bei einem anderen Ansatz wurde eine gelfreie Fraktionierung zur Trennung des Protein-Gemischs verwendet. Sobald der Proteinüberstand aus dem Innenohr durch Acetonfällung entsalzt wurde, geben Sie 30 Mikroliter eines 5×-Probenpuffers zum vorher in 112 Mikrolitern Milli-Q-Wasser suspendierten entsalzten Protein hinzu.

Fügen Sie anschließend acht µL einer einmolaren DTT-Lösung hinzu und erhitzen Sie das Gemisch fünf Minuten lang auf 95 °C, um die Disulfidbrücken der Proteine zu reduzieren. Lassen Sie die Mischung nach dem Erhitzen abkühlen. Geben Sie acht mL Puffer in das Anodenreservoir, 150 µL Puffer in die Proben-Sammelkammer und sechs mL Puffer in das Kathodenreservoir.

Nach dieser Beladung 150 Mikroliter der kokleären Proteinmischung in die Probeladekammer geben, unter Verwendung einer 8 %igen Tris-Acetat-Kassette mit einem Massenbereich von 3,5 bis 150 Kilodalton. Nach dem Starten des Laufs die Probe aus der Sammelkammer bei jedem angehaltenen Intervall am Gerät mit einer Pipette sammeln und in ein frisch beschriftetes Mikroröhrchen überführen. Anschließend die Sammelkammer zweimal mit jeweils 150 Mikrolitern Laufpuffer spülen und die Spülflüssigkeit verwerfen.

Nach der eindimensionalen Gelelektrophorese der gelfreien Fraktionen. Jede einzelne Fraktion direkt zu einer 30-K-Filtereinheit geben. Anschließend jede Fraktion mit 200 Mikrolitern acht Molar Harnstoff in Tris-HCl vermischen und nach einer Zentrifugation bei 14.000 × g für 25 Minuten 10 Mikroliter 10× Iodoacetamid in Harnstofflösung zum Konzentrat in jeder Filtereinheit hinzufügen und eine Minute lang verwirbeln.

Nachdem die Spin-Filter in einem Mikrozentrifugenständer platziert wurden, inkubieren Sie die Proben 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Als Nächstes geben Sie 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter LY C im Verhältnis von 1:50 (Enzym zu Protein) zu den Filtereinheiten. Nach einer Übernacht-Inkubation bei 30 Grad Celsius geben Sie 40 Mikroliter einer 100 Millimolar-Ammoniumbicarbonat-Lösung zu den Spin-Filtern hinzu und zentrifugieren die Proben bei 14.000 × g für 10 Minuten. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt einmal, waschen Sie die Spin-Filter anschließend dreimal mit jeweils 100 Mikroliter 50 Millimolar-Ammoniumbicarbonat-Lösung und geben Sie danach 0,4 Mikrogramm pro Mikroliter Trypsin im Verhältnis von 1:100 (Enzym zu Protein) nach der letzten Wäsche hinzu. Sobald die Proben über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert wurden, eluieren Sie die tryptischen Peptide aus jeder Filtereinheit, indem Sie 40 Mikroliter einer 50 Millimolar-Ammoniumbicarbonat-Lösung hinzufügen, und zentrifugieren die Proben bei 14.000 × g für 10 Minuten.

Nachdem dieser Schritt einmal wiederholt wurde, analysieren Sie die Proben mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie. Es wurden zwei Doppelverdauungsverfahren angewandt. Das erste war eine Triptych-Verdauung, gefolgt von einer zweiten Verdauung mit Trypsin, die auf einer starken Kationenaustauschsäule in 18 Fraktionen angereichert und anschließend mittels Nano-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert wurden.

Insgesamt wurden 1.485 Proteine mit einer Falsch-Positiv-Rate von 1 % identifiziert, wenn eine einzelne Durchlauf-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie durchgeführt wurde. Unter Verwendung dieses experimentellen Ansatzes. Von den identifizierten Proteinen wurden 324 und 258 Proteine jeweils der Kategorie Mitochondrium und Plasmamembran zugeordnet.

Das zweite Doppelverdauungsverfahren bestand aus einer Lys-C-Verdauung, gefolgt von einer Trypsin-Verdauung. Jeder Verdau wurde separat auf der Kationenaustausch-Säule in 18 Fraktionen aufgetrennt und mittels nano-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Die Ergebnisse der Lys-C- und Trypsin-Verdauungen ergaben insgesamt 3.503 Proteine mit einer Fehlerrate von 1 %FDR.

Zusätzlich wurden 605 bzw. 617 Proteine in das Mitochondrium und die Plasmamembran eingeteilt. Diese Methode lieferte die größte Anzahl an IDs für membranassoziierte Proteine. Doppelte Analyse von LY C und Trypsin.

Es zeigte sich, dass mehr als 65 der identifizierten Proteine zwischen den Experimenten gemeinsam waren. Es wurden jedoch auch neue Proteine in der Wiederholungsanalyse identifiziert. Die zusätzlichen Peptide und Proteine konnten aufgrund kleiner chromatographischer Veränderungen nachgewiesen werden, was zu unterschiedlichen Fragmentierungspeptiden führte.

Ein Silberfärbefärbegel wurde zur Visualisierung der Ergebnisse der gel-freien Fraktionierung wie dargestellt präpariert. Das Gel zeigte eine Trennung der Proteine entsprechend steigendem Molekulargewicht für jede aufeinanderfolgende Fraktion. Daher wurden die 12 gel-freien flüssigen Fraktionen mittels zweier unterschiedlicher multifunktionaler Verdauungsansätze verdaut und durch Flüssigkeitschromatographie gekoppelte Massenspektrometrie analysiert.

Der erste Verdauansatz wurde unter Verwendung eines doppelten Trypsin-Verdaus durchgeführt, was bei einer einmaligen Durchführung der Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie zur Identifizierung von 2.165 Proteinen mit einer Fehlerrate von 1 %FDR führte. In diesem Experiment wurden 516 und 399 Proteine jeweils der Mitochondrien- und der Plasmamembran zugeordnet. Der zweite Verdauansatz wurde unter Verwendung von Endoproteinase Lys-C gefolgt von Trypsin-Verdau und einkanaliger Flüssigkeitschromatographie durchgeführt.

Die Tandem-Massenspektrometrie-Analyse identifizierte 2.211 Proteine mit einem 1 %FDR. Dieser Ansatz zeigte eine ähnliche Anzahl membranassoziiierter Proteine wie beim Trypsin-Ansatz; die Massenspektrometrie-Proteomik-Daten wurden beim Proteome-Xchange-Konsortium mit dem Datensatz-ID PXD 0 0 0 2 3 1 hinterlegt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, jegliche Kontamination in jedem Arbeitsschritt zu vermeiden und das Gewebe während der Proteinextraktion auf Eis zu halten, um eine Proteindegradation zu verhindern.