Bottom-up-und Shotgun Proteomics, um eine umfassende Cochlear Proteome Identifizieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, mit verschiedenen proteomischen Techniken die größtmögliche Anzahl von Proteinidentifikationen aus dem sensorischen Epithel der Cochlea zu erreichen. Dies wird erreicht, indem Cochlea, sensorisches Epithel aus adulten Mäusen isoliert und in einem Lysepuffer beschallt wird, um in einem zweiten Schritt Protein zu erhalten. Verschiedene Verdauungsstrategien werden auf Volllysat oder auf fraktioniertes Proteinlysat angewendet, um die Abdeckung der Peptid- und Proteinsequenz zu verbessern.

Anschließend werden verschiedene Trenntechniken eingesetzt, darunter starker Kationenaustausch und Umkehrphasenchromatographie, um die Probenkomplexität vor der Massenspektrometrie zu reduzieren. Die Ergebnisse zeigen die Identifizierung einer großen Anzahl von membran- und löslichen Proteinen für das sensorische Epithel der Cochlea der Maus unter Verwendung mehrerer Proteomik-Ansätze und eines hochauflösenden Massenspektrometers. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Antikörper-Microarrays und zweidimensionaler Gelelektrophorese besteht darin, dass eine große Anzahl von löslichen Proteinen und Membranproteinen identifiziert wird, wodurch die Cochlea-Proteomdaten erweitert werden.

Obwohl diese Methode Einblicke in Biomarker im Zusammenhang mit Hör- und Tränenstörungen geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf die Identifizierung von Biomarkern in Bezug auf Alter und Brust- oder Lungenkrebs. Diese Methode kann auch auf die Untersuchung anderer biologischer Proben wie Blut angewendet werden. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir den begrenzten proteomischen Datensatz aus dem Innenohr von Säugetieren und insbesondere die begrenzte Anzahl von Membranproteinen beobachteten, die vor Beginn dieses Verfahrens identifiziert wurden.

Isolierung des sensorischen Cochlea-Epithels von Mäusen nach der Geburt 30. Nachdem Sie das Gewebe mit einem x Phosphatpuffer gewaschen haben, fügen Sie dem Gewebe 100 Mikroliter Lysepuffer hinzu und beschallen Sie die Mischung 30 Sekunden lang auf Eis mit einem Schalldismember. Kühlen Sie das Lysat zwischen jeder Beschallung eine Minute lang auf Eis ab und beschallen Sie die Probe dann insgesamt dreimal.

Centra schmolz die Suspension bei 16.000 mal G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Wenn Sie fertig sind, bewahren Sie den Überstand für die Verdauung auf. Geben Sie anschließend ein 30-Mikroliter-Aliquot Cochlea-Proteinextrakt direkt in einen 30-K-Spin-Filter und mischen Sie es mit 200 Mikrolitern achtmolaren Harnstoff in der Riss HCL-Zentrifuge.

Die Mischung bei 14.000 mal G für 15 Minuten. Wenn das Konzentrat fertig ist, verdünnen Sie es mit 200 Mikrolitern achtmoliger Harnstofflösung und wiederholen Sie die Zentrifugation unter den gleichen Bedingungen wie zuvor. Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter 10 XI Oto Acetamid und 90 Mikroliter acht molare Harnstofflösung zu dem Konzentrat im Filter hinzu und wirbeln Sie eine Minute lang vortexen.

Nachdem der Spin-Filter in ein Mikrozentrifugengestell gelegt wurde, inkubieren Sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln, nachdem Sie 10 Minuten lang bei 14.000 Mal G und 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter Endoprotease ly C in einem Enzym-Protein-Verhältnis von eins zu 50 zentrifugiert haben, und inkubieren Sie das Gemisch über Nacht bei 30 Grad Celsius. Wenn Sie fertig sind, geben Sie 40 Mikroliter 100 millimolare Ammoniumbicarbonatlösung in die Filtereinheit und zentrifugieren Sie das Gemisch bei 14.000 Mal G für 10 Minuten. Nachdem Sie den vorherigen Schritt wiederholt haben, waschen Sie die Filtereinheit mit 40 Mikrolitern achtmolaren Harnstoff. Anschließend waschen Sie die Filtereinheit zweimal mit 40 Mikrolitern Milli Q Wasser.

Nachdem die Filtereinheit dreimal mit 100 Mikrolitern 50 Millimolar Ammoniumbicarbonatlösung gewaschen wurde, fügen Sie 0,4 Mikrogramm Trypsin pro Mikroliter in einem Enzym-Protein-Verhältnis von eins zu 100 hinzu und inkubieren Sie die Mischung über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation eluieren Sie die triptischen Peptide, indem Sie 40 Mikroliter 50 Millimolare Ammoniumbicarbonatlösung in die Filtereinheit geben und das Gemisch 10 Minuten lang bei 14.000 mal G zentrifugieren. Wiederholen Sie dann diesen Schritt noch einmal.

Injizieren Sie zu diesem Zeitpunkt 50 bis 100 Mikrogramm verdaute Proteinprobe auf eine 200 x 2,1 Millimeter große fünf Mikrometer starke Kationenaustauschsäule. Um die Peptide zu trennen, überwachen Sie die Peptidfraktionen in 280 Nanometern und sammeln Sie die Fraktionen in Zwei-Minuten-Intervallen. Mit einem Fraktionssammler werden die Fraktionen anschließend in einem Vakuumkonzentrator getrocknet. Wenn Sie fertig sind, lagern Sie die getrockneten Fraktionen bei minus 80 Grad Celsius, bis sie für die Flüssigchromatographie verwendet werden können.

Tandem-Massenspektrometrie-Analyse. In einem anderen Ansatz wurde die gelfreie Fraktionierung verwendet, um das Proteingemisch zu trennen. Sobald der Cochlea-Proteinüberstand durch Acetonfällung entsalzt wurde, fügen Sie dem entsalzten Protein, das zuvor in 112 Mikrolitern Milli Q Wasser suspendiert war, 30 Mikroliter Fünffach-Probenpuffer hinzu.

Fügen Sie dann acht Mikroliter eines molaren DTT hinzu und erhitzen Sie die Mischung fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius, um die Proteindisulfidbindungen zu reduzieren. Nach dem Erhitzen die Mischung abkühlen lassen. Geben Sie acht Milliliter Laufpuffer in das Anodenreservoir, 150 Mikroliter Laufpuffer in die Probenentnahmekammer und sechs Milliliter Laufpuffer in das Kathodenreservoir

Nach dieser Beladung werden 150 Mikroliter des Cochlea-Proteingemisches mit einer 8%-Tris-Acetat-Kartusche mit einem Massenbereich von 3,5 bis 150 Kilodalton in die Probenladekammer gegeben. Nachdem Sie den Lauf gestartet haben, entnehmen Sie die Probe mit einer Pipette in jedem pausierten Intervall auf dem Gerät aus der Probensammelkammer und geben Sie sie in ein frisch markiertes Mikroröhrchen. Waschen Sie dann die Auffangkammer zweimal mit 150 Mikrolitern Laufpuffer und entsorgen Sie sie.

Im Anschluss erfolgt die 1D-Gelelektrophorese der gelfreien Fraktionen. Geben Sie jede einzelne Fraktion direkt in eine 30 K Filtereinheit. Mischen Sie dann jede Fraktion mit 200 Mikrolitern achtmolaren Harnstoff in Tris HCL nach Zentrifugation bei 14.000 mal G für 25 Minuten, fügen Sie 10 Mikroliter 10 XI oto-Acetamid in Harnstofflösung zum Konzentrat in jeder Filtereinheit hinzu und wirbeln Sie eine Minute lang vortexen.

Nachdem Sie die Schleuderfilter in ein Mikrozentrifugengestell gelegt haben, inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Als nächstes fügen Sie den Filtereinheiten nach der Inkubation über Nacht bei 30 Grad Celsius 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter LY C für ein Enzym-Protein-Verhältnis von eins zu 50 hinzu, fügen Sie 40 Mikroliter 100 millimolare Ammoniumbicarbonatlösung zu den Schleuderfiltern hinzu und zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 14.000 mal G, nachdem Sie den vorherigen Schritt einmal wiederholt haben. Waschen Sie die Schleuderfilter dreimal mit 100 Mikrolitern 50 Millimolar Ammoniumbicarbonatlösung, fügen Sie nach der letzten Wäsche 0,4 Mikrogramm pro Mikroliter Trypsin in einem Enzym-Protein-Verhältnis von eins zu 100 hinzu. Sobald die Proben über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert wurden, eluieren Sie die Triptychon-Peptide aus jeder Filtereinheit, indem Sie 40 Mikroliter 50 millimolare Ammoniumbicarbonatlösung hinzufügen und die Proben 10 Minuten lang bei 14.000 Mal G zentrifugieren.

Nachdem Sie dies wiederholt haben, analysieren Sie die Proben in einem Schritt mit Hilfe der Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie. Es wurden zwei Doppelaufschlussverfahren angewendet. Der erste war ein Triptychon-Aufschluss, gefolgt von einem zweiten Aufschluss mit Trypsin, die auf einer starken Kationenaustauschsäule in 18 Fraktionen fraktioniert und mittels Nanoflüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert wurden.

Insgesamt wurden 1.485 Proteine mit einer FDR von 1 % identifiziert, wenn eine Einzellauf-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie durchgeführt wurde. Mit diesem experimentellen Ansatz. Von den identifizierten Proteinen wurden 324 bzw. 258 Proteine in den Mitochondrien bzw. in der Plasmamembran kategorisiert.

Das zweite Verfahren des doppelten Aufschlusses bestand aus dem Lys-C-Aufschluss, gefolgt vom Trypsin-Aufschluss. Jeder Aufschluss wurde einzeln beladen und auf der Säule mit starkem Kationenaustausch in 18 Fraktionen getrennt und mittels Nanoflüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Die Ergebnisse der LY-, C- und Trypsin-Verdauung ergaben insgesamt 3.503 Proteine mit einem FDR von 1 %.

Zusätzlich wurden 605 bzw. 617 Proteine in den Mitochondrien bzw. in der Plasmamembran kategorisiert. Dieser Ansatz lieferte die größte Anzahl von membranassoziierten Protein-IDs. Duplikatanalyse von LY C und Trypsin.

Die Fraktionen zeigten, dass mehr als 65 der identifizierten Proteine zwischen den Experimenten geteilt wurden. Es gab aber auch neu identifizierte Proteine in der Replikatanalyse. Die zusätzlichen Peptide und Proteine wurden aufgrund kleiner Veränderungen in der Chromatographie identifiziert, was zu unterschiedlichen Peptiden für die Fragmentierung führte.

Es wurde ein Silberbeizgel hergestellt, um die Ergebnisse der gelfreien Fraktionierung wie dargestellt zu visualisieren. Hier zeigte das Gel eine Proteintrennung, indem es das Molekulargewicht für jede aufeinanderfolgende Fraktion erhöhte. Daher wurden die 12 gelfreien flüssigen Fraktionen mit zwei verschiedenen facettenreichen Aufschlussansätzen aufgeschlossen und mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert.

Der erste Verdauungsansatz wurde mit einem doppelten Trypsinverdau durchgeführt, der zur Identifizierung von 2.165 Proteinen mit einem FDR von 1 % führte, wenn eine Single-Run-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie durchgeführt wurde. In diesem Experiment wurden 516 bzw. 399 Proteine in den Mitochondrien und in der Plasmamembran kategorisiert. Der zweite Verdauungsansatz wurde unter Verwendung der Endoproteinase ly C durchgeführt, gefolgt von einem Trypsinaufschluss und einer Single-Run-Flüssigkeitschromatographie.

Die Tandem-Massenspektrometrie identifizierte 2.211 Proteine mit einer FDR von 1 %. Dieser Ansatz zeigte eine ähnliche Anzahl von membranassoziierten Proteinen wie bei Verwendung des Trypsin-Trypsin-Ansatzes, die massenspektrometrischen Proteomik-Daten wurden mit der Datensatzkennung PXD 0 0 0 2 3 1 beim Proteome Exchange Consortium hinterlegt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, eine Kontamination bei jedem Schritt zu vermeiden und das Gewebe bei der Proteinextraktion auf Eis zu halten, um einen Proteinabbau zu vermeiden.