In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine 360-Grad-In-vivo-Bildgebung einer Maus durchzuführen, um den optimalen Winkel für die Fluoreszenzanalyse zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die orthotopen Hirntumor-, Ingenieur-Hirntumor- und Arthritis-Tiermodelle präpariert werden. Als nächstes wird das C-Protein von SAP hergestellt und SAP D-O-P-S-C-V-M Nanovesikel hergestellt.

Dann werden die Nano-Vesikel in die Schwanzvene der Tiere injiziert. Abschließend werden Fluoreszenz- und Röntgenbilder aufgenommen und analysiert. Letztendlich wird die M-A-R-O-I-Methode verwendet, um den optimalen Winkel für die Fluoreszenzbildgebung zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der planaren 2D-Fluoreszenzbildgebung besteht darin, dass die M-A-O-M-A-R-O-I-Methode es den Untersuchern ermöglicht, den optimalen Winkel für die Fluoreszenzbildgebung zu bestimmen. Die Implikationen dieser Technik erweitern sich auf die Therapie und Diagnose von Krebs und Arthritis, da CEP CS Vesical auf den Tumor und das Entzündungsgewebe abzielen kann. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Cincinnati und der Cincinnati Children's Hospital Research Foundation genehmigt, um diese Studien und orthotope Hirntumormaus durchzuführen.

Eine gentechnisch veränderte Hirntumormaus und ein A-K-B-X-N-Arthritis-Mausmodell werden verwendet. Gemäß dem Textprotokoll wird ein makroskopisches Bewertungssystem mit arthritischem Index verwendet, um Mäuse wie folgt auf Arthritis zu untersuchen: Null ist keine nachweisbare Arthritis, eins entspricht Schwellung und/oder Rötung der Pfote, oder eine Ziffer zwei entspricht zwei beteiligten Gelenken. Drei entspricht drei beteiligten Gelenken und vier entspricht schwerer Arthritis der gesamten Pfote und des Fingers, die rekombinantes humanes SAPs-C-Protein in E. coli-Zellen produzieren, bevor es mit Ethanol und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ausgefällt wird, die Reinigung nach der Lyophilisation bestimmt die Konzentration von trockenem SAP C nach Gewicht. Um das SAP-C-Protein zu mischen, kombinieren Sie 0,18 Milligramm DOPS und 0,03 Milligramm CVM in einem Glasröhrchen und verwenden Sie Stickstoffgas, um die Lipidlösungsmittel zu verdampfen.

Fügen Sie dann 0,32 Milligramm SAPs Meerproteinpulver zu der Mischung hinzu. Die trockene Mischung in einem Milliliter PBS-Puffer suspendieren und 15 Minuten lang im Bad beschallen. Die Suspension wird durch eine Cidex G 25-Säule geleitet, um den freien CVM-Farbstoff zu entfernen.

SAP C-D-O-P-S-C-V-M Nanopartikel haben Anregungs- und Emissionsmaxima von 653 Nanometern bzw. 677 Nanometern. Um die optische Mehrwinkel-Rotationsbildgebung oder M-A-R-O-I-Methode unter Verwendung des Mars-Systems zu testen, positionieren Sie nach der Betäubung einer Maus aus einem der beschriebenen Mausmodelle mit 2%ISO Fluor die Maus in Rückenlage im Mars-System, wobei ihre Wirbelsäule vom Vorschaubildschirm des Brucker MI-Rotator-Tabs auf die Kamera gerichtet ist, Kalibrieren Sie die Mars 380-Grad-Stützfolie. Um die Maus so zu positionieren, dass sie SAPs C-D-O-P-S-C-V-M in den Schwanz der Maus einführt, injizieren Sie 24 Stunden später 200 Mikroliter intravenös und dann erneut sieben bis neun Tage nach der Injektion, nehmen Sie Fluoreszenz- und Röntgenbilder in 10-Grad-Schritten über einen Verlauf von 380 Grad auf, wobei eine leichte Überlappung entsteht, um sicherzustellen, dass keine Lücken im Rotationsdatensatz vorhanden sind.

Mit der Bruker-Rotationssoftware können Fluoreszenzbilder über Röntgenbilder zur anatomischen Lokalisierung gelegt werden. Um die Bilder zu analysieren, zeichnen Sie einen rechteckigen Interessenbereich oder ROI, der die Breite des Sichtfelds oder des FOV der Krankheitsstelle für Hirntumormäuse umfasst. Verwenden Sie für jedes Tumormodell und die jeweiligen Kontrollmäuse für alle Zeitpunkte den gleichen ROI, indem Sie anatomische Landmarken verwenden, um die Position des ROI nach der automatischen Hintergrundsubtraktion zu markieren.

Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität für jedes Bild, indem Sie die Brucker MI Software verwenden, um die Fluoreszenzbilder in Photonen pro Sekunde und Millimeter im Quadrat umzuwandeln, die Fluoreszenzwerte als Funktion der Abbildungswinkel darzustellen und als Fehlerbalken anzuwenden. Die Standardabweichung der durchschnittlichen Fluoreszenzwerte, die von Kontrollmäusen erhalten wurden. In dieser Abbildung ist das Fluoreszenzbild einer repräsentativen orthotopen Tumor tragenden Maus dargestellt.

Wir zeigen hier, dass sich SAPs-Samen, DOPS-Nanovesikel, die mit einem dunkelroten Farbstoff markiert sind, spezifisch in orthotopen und spontanen Maushirntumoren sowie in arthritischen Gelenken von KBXN-Mäusen anreichern. Der Hauptzweck des Mars-Systems besteht darin, den optimalen Fluoreszenzwinkel zu bestimmen, damit die genauesten Messungen durchgeführt werden können, wie hier zu sehen. Der optimale Bildwinkel für dieses Tier beträgt 10 Grad.

Die Position, an der die Intensität des Fluoreszenzphotons am größten ist, wurde vor der Injektion von SAP C-D-O-P-S-C-V-M gemessen, und 24 Stunden nach der Injektion erhielten tumorfreie Kontrollmäuse eine ähnliche Behandlung. Diese Zahlen zeigen vergleichbare Daten aus dem gentechnisch veränderten Hirntumor-Mausmodell. Die Fluoreszenzbilder und Photonenmessungen wurden zu Studienbeginn 24 Stunden und neun Tage nach der SAP C-D-O-P-S-C-V-M-Injektion aufgenommen.

Die Diagramme zeigen, dass der optimale Bildgebungswinkel im tumortragenden tierischen Tumorstumm 49 20 Grad, 24 Stunden nach der Injektion beträgt, sich aber neun Tage nach der Injektion auf 10 Grad ändert. Dies deutet darauf hin, dass die Veränderung des Fluoreszenzsignals mit morphologischen Veränderungen korrelierte, die wahrscheinlich das Tumorwachstum widerspiegeln. Wie in dieser Tabelle gezeigt, zeigt die M-A-R-O-I-Methode deutlich, dass das Fluoreszenzsignal bei Projektionen mit zunehmender Drehung weg vom optimalen Abbildungswinkel abnimmt.

Bei Hirntumoren wurde eine durchschnittliche Abnahme des Fluoreszenzsignals um 7 % festgestellt. Wenn die physische Orientierung des Tieres mehr als plus/minus 10 Grad vom optimalen Aufnahmewinkel abweicht. Eine durchschnittliche Abnahme des Fluoreszenzsignals um 21 % wurde bei plus oder minus 20 Grad gemessen.

Daher können relativ kleine Offsets vom optimalen Winkel zu erheblichen prozentualen Signalabnahmen führen. Die Verwendung der M-A-R-O-I-Technik für die Bildpositionierung ermöglicht es den Forschern, konsistentere und zuverlässigere Daten zu erstellen. Die M-A-R-O-I-Methode wurde schließlich verwendet, um das Targeting arthritischer Gelenke durch die SAPs C-D-O-P-S-C-V-M 24 Stunden nach der Injektion zu beurteilen.

Dieses Tier erzielte drei Punkte mit drei arthritischen Gelenken. Fluoreszenzbilder von Zehe und Knöchel der arthritischen Maus werden hier auf der Grundlage von Diagrammen entsprechender Photonenmessungen gezeigt. Bei 10-Grad-Drehungen betragen die optimalen Abbildungswinkel für die Zehe und den Knöchel 140 Grad bzw. 120 Grad. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie M-A-R-O-I-Daten vorbereiten und erfassen, die es den Prüfärzten ermöglichen, den optimalen Winkel für die Fluoreszenzbildgebungsanalyse zu bestimmen.