Name: In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Erfahren Sie die MAROI-Methode zur in vivo Fluoreszenzbildgebung von Hirntumoren und Arthritis in Mausmodellen. Diese Technik ermöglicht die Bestimmung optimaler Aufnahmewinkel für präzise quantitative Analysen.

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH / NCI Grants Anzahl 1R01CA158372-01 (Qi) und New Drug Staat Key Project Grant Number 009ZX09102-205 (Qi) unterstützt. Schreiben Hilfe wurde von Dr. Judy Racadio vorgesehen ist, und wurde von der Universität von Cincinnati Abteilung für Hämatologie und Onkologie finanziert. Vontz Core-Imaging Lab (VCIL) in der Hochschule für Medizin an der Universität von Cincinnati.

Ethik-Erklärung der Tiernutzung. Und des Cincinnati Children Hospital Research Foundation (Tierschutz-Assurance-Nummer A3108-01): Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Universität von Cincinnati (11-05-05-02 IACUC Protocol Number) genehmigt. Alle Versuche mit Mäusen folgten die Tierpflege-Richtlinien der Universität von Cincinnati und des Cincinnati Children Hospital Research Foundation. 1. Bereiten Tiermodelle Hinweis: Drei verschiedene Tiermodelle unten skizziert haben in unserer früheren Studien verwendet: <ol><li> Orthotopische Gehirntumor der Maus: Mit Nu / Nu athymischen weiblichen Mäusen, die mit der menschlichen intrakranial U87-ΔEGFR-Luc Zellen injiziert worden. Diese Mäuse entwickeln einen aggressiven Tumor, die typische Merkmale der menschlichen Glioblastom. </li><li> Gentechnisch veränderte Gehirntumor Mausmodellen 13: Rasse MUT3 (GFAP-cre; Nf1loxP / +; Trp53-/ +) männlichen Mäusen mit Trp53loxP/loxP; PtenloxP / loxP Weibchen Mut6 Mäuse zu erzeugen (GFAP-cre; Nf1loxP / +; Trp53-/loxP; PtenloxP / +). Pflegen MUT3 Mäuse in B6CBAF1 / J-Stamm durch Zucht männlich MUT3 Mäuse mit weiblichen B6CBAF1 / J-Mäusen. Genotyp der Mäuse zwischen P9 und P12 und bestätigen Sie die Genotypen nach der Ernte ihren Geweben. </li><li> K / B × N-Arthritis: Verwenden C57Bl/6J Mäusen, die intraperitoneal mit 150 ul Seren von KRN x NOD F1-Mäusen verabreicht wurden. Diese Mäuse entwickeln Arthritis 24 bis 48 Stunden nach Injektion Seren. Imaging der arthritischen Mäusen an Tag 7 durchgeführt folgenden Seren Verwaltung, ein Zeitpunkt, bei dem Mäuse zeigen offene makroskopische Arthritis. Mäuse sollte anhand der Kriterien in dem nächsten Schritt beschrieben ausgewertet werden. <ol><li> Bewertung von Mäusen für makroskopische Arthritis mit einer arthritischen Index makroskopischen Scoring-System wie folgt: 0 = keine nachweisbare Arthritis, 1 = Schwellung und / oder Rötung der Pfote oder eine Ziffer, 2 = zwei Gelenke beteiligt, 3 = drei Gelenke INVOLved, und 4 = schwere Arthritis der gesamten Pfote und Stelle. Die arthritischen Punktesystem wird verwendet, um die Anzahl der betroffenen Gelenke und der Schwere der Arthritis in der Maus Pfoten bestimmen. Auch Mäuse, die mit der höchstmöglichen Punktzahl arthritischen zeigen nur selten Anzeichen von Unbeweglichkeit. Allerdings ist Arthritis wachten 3x/Woche und Mäusen in übermäßige Schmerzen (wie schwere Immobilität von geschwollenen Pfoten, die Lebensmittel-und Wasserverbrauch hemmt) geopfert werden. </li><li> Hinweis: Flüssigkeiten injiziert IV in die Schwanzvenen der Maus haben Sterilität während des Experiments gehalten. Sauber, steril, Einweg-Spritzen und Ampullen sind für Studien Lösung Zubereitung und Verabreichung verwendet. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von fluoreszenzmarkierten SapC-DOPS Nanovesicles <ol><li> SapC Proteinproduktion: Rekombinante SapC Protein mit genauen menschlichen SapC Sequenz wurde in E. hergestellt coli-Zellen wie zuvor mit Modifikationen 4 beschrieben.SapC wurde von Ethanol, gefolgt von Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie-Reinigungen fällt. Nach der Gefriertrocknung, trocken SapC verwendet wurde und die Konzentration wurde durch sein Gewicht bestimmt. </li><li> Mischen SapC Protein wie zuvor beschrieben 7,10,11. Mix DOPS (0,18 mg) und CVM (0,03 mg) in einem Glasröhrchen und mit Stickstoffgas auf Lipid Lösungsmittel verdampfen. </li><li> Hinzufügen SapC Proteinpulver (0,32 mg) zu der Mischung, die Aussetzung der Trockenmischung in 1 ml PBS-Puffer und beschallen Bad für etwa 15 min, wie vorstehend beschrieben 7,10,11. Dann übergeben Sie die Suspension durch eine Sephadex G25-Säule (PD-10), freie CVM Farbstoff zu entfernen. Anregungs-und Emissionsmaxima des Endprodukts, dh SapC-DOPS-CVM nanovesicles, sind 653 nm und 677 nm auf. </li></ol> 3. Imaging <ol><li> Verwenden Gehirntumor und Arthritis Mausmodellen (oben in Schritt 1 beschrieben), um das System zu testen Maroi. Anesthetize Mäuse mit 2% Isofluran bewirken. 1-2% Isofluran ist maintaINED für die Dauer der bildgebenden Verfahren. Warmluft wird kontinuierlich und sanft in die Abbildungskammer für die Dauer der Bildgebungs geliefert. Eine kleine Perle von sterilen künstliche Tränen Salbe wird jedem Auge der Maus angelegt, um zu decken und schmieren das Auge. Platzieren Mäuse in der MARS-System durch Positionieren der Mäuse in Rückenlage mit ihrem Rücken zunächst in Richtung der Kamera (1) gerichtet ist. Kalibrieren Sie den MARS 380 ° Trägerfolie und positionieren Sie die Maus mit der Dreh Software in der Registerkarte Protokoll Bruker MI. Erhalten Basis-Images von Mäusen vor SapC-DOPS-CVM Verwaltung in der unten beschriebenen Weise. </li><li> Injizieren Sie 200 ul SapC-DOPS-CVM intravenös in die Schwanzvene der Maus. Verabreichen und arthritischen Mäusen oder Hirntumor-tragenden Mäusen zu steuern. </li><li> Bild Mäuse 24 Stunden nach der Injektion wieder auf 7-9 Tage nach der Injektion, indem Fluoreszenz (25 sec Belichtungszeit) und X-ray (10 sec Belichtungszeit) iMagier bei 10 °-Schritten über einen Zeitraum von 380 °, wodurch eine geringe Überlappung, um sicherzustellen, gibt es keine Lücken in der Drehdatenmenge. Mit Bruker MI-Software, überlagern Fluoreszenz auf Röntgenbildern für anatomische Lokalisierung. </li></ol> 4. Bildanalyse <ol><li> Zeichnen Sie eine rechteckige ROI umfasst die Breite des Sichtfeld (FOV) der Erkrankung Website (Tumor-und Arthritis). Der ROI muss groß genug sein, um die Krankheit Merkmals innerhalb des FOV das Tier bewegt sich im Verlauf der 380 °-Drehung zu halten. Für Gehirntumor Mäuse (orthotope und transgene Modelle), verwenden Sie die gleiche rechteckige ROI auf jeden Tumor-Modell und seine drei (3) entsprechenden Kontrollmäusen für alle Zeitpunkte (Baseline, 24 Stunden und 9 Tage). Die Positionierung der rechteckigen ROI für jede Maus über alle Zeitpunkte durch Verwendung anatomischer Landmarken auf entsprechenden Röntgenbilder eines jeden Tieres erhalten. Die anatomische Wahrzeichen (s) auf der Tumormodell identifiziert, müssen auch pla verwendet werdence identischen rechteckigen ROIs auf entsprechenden Kontrollen jedes Modell. Anatomische Landmarken auf den Röntgenbildern ermöglicht konsistente Platzierung ROI identifiziert sind die Basis des Schädels und der hinteren Seite des Jochbogens. Sie sind auf der rechten und linken Seiten visualisiert Schädel in der posterior-anterior (PA) Bild. </li><li> Nach der automatischen Hintergrundabzug, Ermittlung der mittleren Fluoreszenzintensität für jedes Bild. Konvertieren Sie die Fluoreszenzbilder Photonen / s / mm 2 mit Bruker MI Imaging-Software. Zeichnen Sie die Fluoreszenzwerte als Funktion der Bildwinkel und gelten als Fehlerbalken die Standardabweichung der von Kontrollmäusen mit Excel oder andere Grafik-Software erhalten gemittelte Fluoreszenzwerte. </li></ol>

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</ol>

Es gibt nichts zu offenbaren.

Die genaue Bestimmung der Lage und Größe von soliden Tumoren und Entzündungsherde bei rheumatischen Bedingungen ist entscheidend für die Umsetzung eine angemessene Behandlung und Follow-up Krankheitsprogression oder Remission. Während wertvolle, aktuelle Bildstrategien (Röntgenstrahlen, MRI, Ultraschall, Röntgen-Computertomographie) liefern unvollständige Bewertung des Krankheitsstatus. Zum Beispiel wird arthritischen Gelenkschäden üblicherweise durch Röntgenstrahlen, die Informationen über die Knochenstruktur, aber nicht auf weichem Gewebe Entzündung und Zerstörung, die charakteristisch für frühe Stadien der Erkrankung liefert bewertet. Die hier vorgestellte Maroi Verfahren verbindet die Vorteile der beiden Röntgenbilder und anspruchsvolle Weichgewebeabbildungsmodalitäten (z. B. MRI oder Ultraschall) in einem integrierten, nicht invasiv und einfacher Plattform, ermöglicht auch eine vollständige 3D-Mapping-und Wiederaufbau des erkrankten Gewebes oder Organs in Kleintiere wie Mäuse. Diese Methode nutzt die selektive Affinität of SapC-DOPS nanovesicles für exponierte Phosphatidylserin-Reste, die in den Membranen von Krebs und Entzündungszellen reichlich vorhanden sind. Die Determinante dieser Bindung ist SapC eine fusogene lysosomale Protein mit einer starken Affinität für anionische Phospholipide wie Phosphatidylserin 7,10,11. Wenn zu einer Fluoreszenzsonde (CVM) konjugiert sind, können systemisch injiziert SapC-DOPS, Tumor und arthritischen Websites durch Fluoreszenz-Bildgebung verfolgt werden. Einschränkungen der Methode sind, um die Empfindlichkeit, die derzeit schränkt seine Verwendung zu Abbildung von kleinen Tieren wie Mäusen verwandt. Wie bei anderen bildgebenden Verfahren wird eine optimale Fluoreszenzsignal-Rausch-Verhältnis von der Größe des Tumors oder den Umfang der Arthritis beschränkt und kann bei der Abbildung Geweben oder Organen mit hohen Hintergrund (Autofluoreszenz), wie Nasen (Bildgebung), Darm beeinträchtigt werden / Kot (abdominale Bildgebung) und Pfoten (Hinterbein-Bildgebung). In diesem Zusammenhang haben wir festgestellt, daß ein dunkelrotes Farbstoff wie CVM proVides bessere spektrale Trennung und Auflösung in der in-vivo-Einstellung als die anderen fluoreszierenden Sonden im sichtbaren Bereich. Weitere Fallstricke sind potenzielle Bewegung des Tieres während der Bildgebung, die beide während der Narkose und post mortem (Rigor mortis). Hinterbein Positionierung, insbesondere ist oft schwierig zu stabilisieren, um eine Bewegung während der Drehung zu vermeiden. Im gegenwärtigen Zustand der Technik ist auch zeitaufwendig, mit Scan-mal so lang wie 60 Minuten benötigt, um eine volle Drehung vollenden und zu erwerben qualitativ hochwertige Bilder. Die Maroi Verfahren weist eine Anzahl von Vorteilen gegenüber anderen bildgebenden Verfahren. Die Fähigkeit, Bild erkrankte Gewebe ab 38 (oder mehr) unterschiedlichen Winkeln ermöglicht die Visualisierung von Fluoreszenz, die bei der Beurteilung der aus einer einzigen Ebene behindert werden kann; Das ist wertvoll in Tierstudien, weil es kann helfen, die Zahl der falsch-negative, die von der Bildgebung zu unpassenden Winkel führen zu minimieren. Durch overlying Röntgen-und Fluoreszenzbilder kann eine genaue anatomische Lokalisation der erkrankten Stelle bestimmt werden. Schließlich ist die Möglichkeit der Live (in vivo)-Bildgebung ermöglicht Langzeitstudien durchgeführt werden.

Ganze Tierbildgebung hat sich zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Untersuchung von Tierarzneimitteltherapie. Unter aktuellen Imaging-Systeme, ermöglicht die MS PRO FX Forscher genau visualisieren fluoreszenzmarkierten (oder lumineszierende)-Verbindungen und / oder Geweben in lebenden Mäusen, und gleichzeitig erhalten Röntgenbilder. Mit der kürzlich eingeführten multimodale Tierrotationssystem (MARS) eine vollständige, automatische Rotation der Maus, um sowohl die fluoreszierenden / lumineszierende und Röntgenbilder in bestimmten Winkeln zu erfassen 1 erreicht. Bildaufnahme kann so programmiert, daß sequentielle Bildfolge kann zu bestimmten, der Zwischenwinkel so klein wie 1 ° erfasst werden. Dies ermöglicht es, die optimale Orientierung des Tieres, dh zu identifizieren. , in dem der Abstand zwischen dem intern erzeugten Fluoreszenz / Lumineszenz-Signal und die Erfassungseinrichtung des Systems ist der kürzeste. Dies wiederum erleichtert die genaue Positionierung des Tieres für die nachfolgende Abbildungs ​​SEssions während Längsschnittstudien. In diesem Bericht beschreiben wir die Umsetzung einer Multi-Angle-Dreh optische Bildgebung (Maroi)-System zur in vivo Quantifizierung von fluoreszierenden Marker Intensität. Maroi Signalkurvenanalyse kann in Längsschnittstudien für die direkte Korrelation von Fluoreszenzsignalverteilung präzise Karte erkrankten Stellen oder biologische Prozesse von Interesse verwendet werden. Dieses System wurde verwendet, um die Absorption von fluoreszenzmarkierten SapC-DOPS nanovesicles nach orthotopen und spontane Tumoren zu überwachen, als auch von arthritischen Foci in lebenden Mäusen; vorgesehen, multispektrale und multimodaler Datensätze von kompletten Dreh Deckung der Tiere abgeleitet. Unter den vielen Fluoreszenzsonden derzeit für die in vivo-Bildgebung zur Verfügung, denen emittierenden im nahen Infrarot und fernen roten Spektralbereich verleihen den niedrigsten Interferenz mit der Haut und Gewebe, und stellen die größte Verbreitung und Bild reslösung. Wir verwendeten CellVue Maroon (CVM) 2,3, eine weit rot fluoreszierenden Zell Linker (Ex 647/Em 667), um SapC-DOPS (SapC-DOPS-CVM) 4-12 zu beschriften.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>11965</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco (Grand Island, NY)</td><td>16000077</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Hyklon</td><td>(Logan, Utah)</td><td>SV30010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dioleoylphosphatidylserin</td><td>Avanti Polare Lipide (Alabaster, AL)</td><td>840035C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CellVue Maroon</td><td>Molecular Targeting Technologies, Inc. (Exton, PA)</td><td>C-1001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sephadex G25 Säule PD-10</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, (Piscataway, NJ)</td><td>17-0851-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Neuer stereotaktischer Standard für Ratten und Mäuse</td><td>Harvard-Apparatur (Holliston, MA)</td><td>726335</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bransonic Ultraschallreiniger Modell 1510</td><td>Branson Ultraschall (Danbury, CT)</td><td>CPN-952-118</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Multispektrales FX-System</td><td>Bruker Corporation (Billerica, MA)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Optisches Mehrwinkel-Rotationsbildgebungsgerät</td><td>Bruker Corporation (Billerica, MA)</td><td></td> &<td>nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vivo optical imaging von hirntumoren und arthritis mit fluoreszierenden sapc-dops nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

Wir beschreiben eine Mehrfachwinkel-Dreh optischen Abbildungs ​​(Maroi)-System für die in vivo-Überwachung von physiopathologischen Prozessen mit einem fluoreszierenden Marker markiert ist. Mausmodelle (Gehirntumor und Arthritis) wurden verwendet, um die Nützlichkeit dieses Verfahrens zu beurteilen. Saposin C (SapC)-Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) nanovesicles mit CellVue Maroon (CVM) Fluorophor markiert wurden intravenös verabreicht. Die Tiere wurden dann in der Drehhalterung (MARS) des in vivo-Bildgebungssystem angeordnet ist. Die Bilder wurden in 10 °-Schritten über 380 ° erworben. Eine rechteckige Region von Interesse (ROI) wurde über die gesamte Bildbreite auf das Modell Erkrankungsstelle angeordnet. Innerhalb der ROI, und für jedes Bild, mittlere Fluoreszenzintensität wurde nach Subtraktion des Hintergrunds berechnet. In den Mausmodellen untersucht wurden die markierten nanovesicles sich sowohl in den orthotopen und transgene Hirntumoren entnommen und in den arthritischen Stellen (Zehen und Knöchel). Curve Analyse des Multi-Winkel-image ROIs bestimmt den Winkel mit dem höchsten Signal. Somit wird der optimale Winkel für die Abbildung jedes Erkrankungsstelle charakterisiert. Die Bildgebung von fluoreszierenden Verbindungen angewendet Maroi Verfahren ist eine nichtinvasive, wirtschaftlich und präzise Werkzeug für In-vivo-quantitative Analyse der Krankheitszustände, die in den beschriebenen Mausmodellen.

Wir zeigen hier, dass SapC-DOPS nanovesicles mit einem dunkelroten Farbstoff (CVM) markierten spezifisch akkumulieren in orthotopen und spontane Mausgehirntumoren sowie in arthritischen Gelenken von K / B × N-Mäusen. Serien aus einer ROI während vollständige Umdrehungen der Mäuse über jedem Erkrankungsstelle angeordnet erfassten Fluoreszenz / Röntgenbilder wurden Maroi Kurvenanalyse, welche die optimale Abbildungswinkel mit der höchsten Fluoreszenzintensität ergab, ausgesetzt. Der primäre Zweck für die Verwendung des MARS-Systems ist es, den optimalen Winkel der Fluoreszenz zu bestimmen, so daß die genauesten Messungen können genommen werden. Repräsentative Ergebnisse aus drei Experimenten mit Mäusen, die mit Gehirntumoren oder Arthritis gezeigt. Mit SapC-DOPS-CVM und das MARS-System (Abbildung 1), die bestmögliche Bildwinkel für die Beobachtung der Tumor oder Entzündung durch Arthritis bestimmt. Fluoreszenzbilder, gefolgt von einer Röntgennahme wurden alle 10 ° erworbenwährend einer 380 °-Drehung der Maus. Fluoreszenzbilder wurden auf die entsprechenden Röntgenbilder für die Bildanzeige-und Rotationsfilmerzeugungslagert. Ergebnisse der orthotopen Gehirntumormodell sind in Abbildung 2 gezeigt. Das Fluoreszenzbild eines repräsentativen orthotopen Tumor-tragenden Mäusen (Ortho1) ist in 2A gezeigt. Die optimalen Bildwinkel für dieses Tier ist 10 °, die Position, an der die Fluoreszenz Photonenintensität am größten ist (2B). Die Messungen wurden vor der Injektion mit SapC-DOPS-CVM (Baseline) 24 Stunden nach der Injektion genommen und. Kontrollmäuse (tumorfrei) erhielt eine ähnliche Behandlung. Abbildung 3 zeigt vergleichbare Daten aus der gentechnisch veränderten Gehirntumor-Mausmodell. Die Fluoreszenzbilder und Photonen Messungen wurden vor der Injektion mit SapC-DOPS-CVM (Grundlinie) aufgenommen und 24 Stunden (Fig. 3A und &lt;strong&gt; 3B) und 9 Tage (3C) nach der Injektion. Diese Grafiken zeigen, dass die optimale Bildwinkel in der tumortragenden Tier (Tumor Mut49) 20 ° 24 Stunden nach der Injektion, aber Änderungen bis 10 ° 9 Tage nach der Injektion. Dies deutet darauf hin, dass die Fluoreszenzsignaländerung mit morphologischen Veränderungen, wahrscheinlich reflektieren Tumorwachstum korreliert. Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, zeigt deutlich die Maroi Verfahren, dass das Fluoreszenzsignal abnimmt, für Vorsprünge mit zunehmender Drehung weg von der optimalen Abbildungswinkel. In Hirntumoren, wurde eine durchschnittliche Abnahme des Fluoreszenzsignals 7% erhalten, wenn physische Ausrichtung des Tieres war ± 10 ° versetzt von der optimalen Bildwinkel. Eine durchschnittliche 21% ige Abnahme der Fluoreszenz-Signal wurde bei ± 20 ° gemessen. So relativ kleine Verschiebungen aus dem optimalen Winkel kann zu erheblichen Signaldämpfung führen. Mit Hilfe der Technik für Maroi Bildpositionierung wird inve ermöglichenstigators mehr konsistente und zuverlässige Daten zu erzeugen. Die Maroi Verfahren wurde schließlich verwendet werden, um die Ausrichtung der arthritischen Gelenke durch SapC-DOPS-CVM 24 Stunden nach SapC-DOPS-CVM Injektion zu beurteilen. Dieses Tier hat 3 mit drei arthritischen Gelenken. Fluoreszenzbilder der Zehe und Knöchel des arthritischen Maus sind in den 4A und 4B gezeigt. Entsprechenden Photonen Messungen bei 10 ° Drehintervalle sind in Fig. 4C und 4D graphisch dargestellt. Die optimalen Bilderzeugungswinkel für die Zehen-und Knöchel gefundenen 140 ° und 120 °. Zusammenfassend ist die Kombination des Maroi System mit fluoreszierenden SapC-DOPS nanovesicles stellt eine nicht-invasive, genaue und hochempfindliche Strategie für die Bildgebung, die für quantitative Untersuchungen der Tumorprogression und Arthritis bei Kleintieren erlaubt. Die Möglichkeit des Erwerbs einer 360 ° multimodale Bildgebung Datenmenge erheblich Improes Datenanalyse und Interpretation, verglichen mit dem, was erreichbar mit einzelnen Winkel bildgebenden Verfahren. <img alt="Tabelle 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187table1.jpg" width="600px" /> Tabelle 1. Optimale Abbildungswinkel für jede Maus-Modell. Die Unterschiede zwischen dem Winkel der maximalen Photonenfluoreszenz (FLR optimalen Winkel) und der Standard anatomischen Winkel (X-ray) gesehen werden kann. Wenn diese beiden Winkel immer anders, ändert sich das Messsignal erheblich. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1.jpg" width="600px"/&gt; Abbildung 1. Multi-Winkel Dreh optische Bildgebung (Maroi) Gerät. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2.jpg" width="600px" /> Abbildung 2. Fluoreszenzsignal vs Bildwinkel in einem orthotopen Mausmodell Gehirntumor. (A). Bild des Peakfluoreszenzsignal bei der optimalen Bildwinkel von 10 °. Die blaue Box zeigt den ROI verwendet, um die emittierten Photonen quantifizieren. (B). Graph der Bildwinkel gegenüber Photonenemission. Der Vertreter orthotopen tumortragenden Maus (Ortho1) gegen gemittelte Fluoreszenzwerte aus identischen ROIs in drei nontumor Mäuse graphisch dargestellt. Die Messungen wurden an der Basislinie genommen (vor der Injektion) und 24 Stunden nach der injection. Fehlerbalken stellen Standardabweichung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3.jpg" width="600px" /> 3. Fluoreszenzsignals gegen Bildwinkel in einer spontanen Gehirntumor eines gentechnisch Mausmodell. (A). Bild des Spitzenfluoreszenzsignal des ROI 1 (oben blauer Kasten) an der optimalen Bildwinkel von 20 °. (B) und (C). Zeitlicher Verlauf der Bildwinkel gegenüber Photonenemission aus ROI ein. Werte aus einer Vertreter spontane Gehirntumor-tragenden Mäusen, Tumor-Mut 49, gegen gemittelten Werte von drei nicht Mäusen Tumor graphisch dargestellt. Messungen wurden an der Grundlinie (vor dem Einspritz) und 24 Stunden (B) und 9 Tage (C) nach der Injektion. Fehler b<html> ars repräsentieren die Standardabweichung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4.jpg" width="600px" /> Abbildung 4. Fluoreszenzsignal vs Bildwinkel in einer Maus mit Arthritis der Zehen-und Knöchelgelenke. (A) und (B). Bilder, die die Spitzenfluoreszenzsignal für die Zehen (A) und Sprunggelenk (B), innerhalb der in der roten Box gezeigt ROIs. (C). Graph von Winkel gegen meine Photonenemission für den Fuß. Peak-Photon Emission kann in einem Winkel von 140 ° zu sehen ist (D) Grafik der Winkel gegenüber bedeuten Photonenemission für den Knöchel.. Maximalintensität tritt bei einem Winkel von 120 °.target = &quot;_blank&quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Wir beschreiben eine Mehrfachwinkel-Dreh optischen Abbildungs ​​(Maroi)-System für die in vivo Quantifizierung einer Fluoreszenzmarkierung von Saposin C (SapC), Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) nanovesicles geliefert. Der Einsatz Mausmodellen von Krebs und Arthritis, zeigen wir, wie die Signalkurve Maroi Analyse kann für die genaue Zuordnung und biologische Charakterisierung von Krankheitsprozessen eingesetzt werden.

In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine 360-Grad-In-vivo-Bildgebung einer Maus durchzuführen, um den optimalen Winkel für die Fluoreszenzanalyse zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst das orthotopische Hirntumor-, das gentechnisch veränderte Hirntumor- und das Arthritis-Tiermodell hergestellt werden. Anschließend wird das SAPs C-Protein produziert und die SAP D-O-P-S-C-V-M-Nanovesikel hergestellt.Anschließend werden die Nanovesikel in die Schwanzvene der Tiere injiziert. Schließlich werden Fluoreszenz- und Röntgenbilder aufgenommen und analysiert. Letztendlich wird die M-A-R-O-I-Methode verwendet, um den optimalen Winkel für die Fluoreszenzbildanalyse zu ermitteln.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der 2D-Planar-Fluoreszenzbildgebung besteht darin, dass die M-A-O-M-A-R-O-I-Methode es Untersuchern ermöglicht, den optimalen Winkel für die Fluoreszenzbildanalyse zu bestimmen. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie und Diagnose von Krebs und Arthritis, da CEP CS Vesical Tumorgewebe und entzündliches Gewebe gezielt ansteuern kann. Alle Tierversuche wurden von dem Institutional Animal Care and Use Committee der University of Cincinnati und der Cincinnati Children's Hospital Research Foundation genehmigt, um diese Studien und das orthotopische Hirntumormausmodell durchzuführen.Ein genetisch veränderter Mausmodell mit Gehirntumor und ein Mausmodell für A-K-B-X-N-Arthritis werden verwendet. Gemäß dem Textprotokoll wenden Sie ein makroskopisches Bewertungssystem für den Arthritisindex an, um die Mäuse wie folgt auf Arthritis zu untersuchen: null entspricht keiner nachweisbaren Arthritis, eins entspricht Schwellung und/oder Rötung der Pfote oder eines einzelnen Fingers, zwei entspricht Beteiligung von zwei Gelenken, drei entspricht Beteiligung von drei Gelenken und vier entspricht einer schweren Arthritis der gesamten Pfote und der Finger. Stellen Sie rekombinantes humanes SAPs-C-Protein in E.-coli-Zellen her, fällen Sie es anschließend mit Ethanol und reinigen Sie es mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie. Nach der Lyophilisierung bestimmen Sie die Konzentration des trockenen SAP-C-Proteins durch Wägung. Um das SAP-C-Protein zu mischen, geben Sie 0,18 Milligramm DOPS und 0,03 Milligramm CVM in ein Glasröhrchen und verdampfen Sie die Lipidlösungsmittel mit Stickstoffgas.Fügen Sie dann 0,32 Milligramm SAPs-Meeresproteinpulver zur Mischung hinzu. Suspenderen Sie das trockene Gemisch in einem Milliliter PBS-Puffer und führen Sie eine Badsonikation für 15 Minuten durch. Leiten Sie die Suspension durch eine Cidex G 25-Säule, um freie CVM-Farbstoffe zu entfernen.SAP C-D-O-P-S-C-V-M-Nanopartikel weisen eine maximale Anregung bei 653 Nanometern und eine maximale Emission bei 677 Nanometern auf. Um die Methode der multiaxialen rotationsbasierten optischen Bildgebung (M-A-R-O-I) mithilfe des Mars-Systems zu testen, wird eine Maus aus einem der beschriebenen Mausmodelle mit 2 % Isofluran anästhesiert, danach in Rückenlage im Mars-System positioniert, wobei die Wirbelsäule in Richtung Kamera ausgerichtet wird. Auf dem Vorschaubildschirm des Brucker MI Rotator-Tabs kalibrieren Sie den 380-Grad-Trägerfilm des Mars-Systems. Um die Maus für die Injektion von SAPs C-D-O-P-S-C-V-M in den Schwanz zu positionieren, injizieren Sie 200 Mikroliter intravenös, nehmen 24 Stunden später sowie erneut sieben bis neun Tage nach der Injektion Fluoreszenz- und Röntgenaufnahmen in 10-Grad-Schritten über einen Winkelbereich von 380 Grad auf, wobei eine leichte Überlappung gewährleistet wird, um sicherzustellen, dass keine Lücken im rotationsbasierten Datensatz entstehen.Unter Verwendung der Bruker-Rotationssoftware wurden fluoreszierende Bilder zur anatomischen Lokalisation über Röntgenbilder gelegt. Zur Bildanalyse wird ein rechteckiger interessierender Bereich (ROI) gezogen, der die Breite des Sichtfeldes (FOV) der erkrankten Stelle bei Mäusen mit Hirntumor umfasst. Derselbe ROI wird für jedes Tumormodell und die jeweiligen Kontrollmäuse zu allen Zeitpunkten unter Verwendung anatomischer Markierungen zur Positionierung des ROI nach automatischer Hintergrundsubtraktion verwendet.Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität für jedes Bild, indem Sie die Brucker-MI-Software verwenden, um die Fluoreszenzbilder in Photonen pro Sekunde pro Quadratmillimeter umzuwandeln, tragen Sie die Fluoreszenzwerte in Abhängigkeit von den Bildgebungs-Winkeln auf und verwenden Sie als Fehlerbalken die Standardabweichung der durchschnittlichen Fluoreszenzwerte, die von Kontrollmäusen erhalten wurden. In dieser Abbildung ist das Fluoreszenzbild einer repräsentativen orthotopen Tumormaus dargestellt.Hier zeigen wir, dass SAPs, mit einem farnroten Farbstoff markierte DOPS-Nanovesikel, gezielt in orthotopen und spontanen Mausgehirntumoren sowie in den arthritischen Gelenken von KBXN-Mäusen anreichern. Der Hauptzweck des Mars-Systems besteht darin, den optimalen Winkel der Fluoreszenz zu bestimmen, um die genauesten Messungen durchführen zu können, wie hier dargestellt. Der optimale Bildwinkel für dieses Tier beträgt 10 Grad.Die Position, an der die Fluoreszenzphotonenintensität am größten ist, wurde bestimmt. Basislinienmessungen wurden vor der Injektion von SAP C-D-O-P-S-C-V-M sowie 24 Stunden nach der Injektion durchgeführt, wobei tumorfreie Kontrollmäuse eine vergleichbare Behandlung erhielten. Diese Abbildungen zeigen vergleichbare Daten aus dem genetisch veränderten Mausmodell für Hirntumoren. Die Fluoreszenzbilder und Photonenzählungen wurden zur Basislinie, 24 Stunden und neun Tage nach der Injektion von SAP C-D-O-P-S-C-V-M aufgenommen.Die Grafiken zeigen, dass der optimale Bildgebungs­winkel beim tumortragenden Tier Tumor Mute 49 20 Grad beträgt, 24 Stunden nach der Injektion, sich jedoch neun Tage nach der Injektion auf 10 Grad ändert. Dies deutet darauf hin, dass die Änderung des fluoreszenten Signals mit morphologischen Veränderungen korreliert, die wahrscheinlich dem Tumorwachstum entsprechen. Wie in dieser Tabelle dargestellt, zeigt die M-A-R-O-I-Methode eindeutig, dass das fluoreszente Signal bei Projektionen mit zunehmender Drehung weg vom optimalen Bildgebungs­winkel abnimmt.Bei Gehirntumoren wurde ein durchschnittlicher Rückgang des Fluoreszenzsignals um 7 % beobachtet, wenn die physikalische Ausrichtung des Tieres um mehr als plus/minus 10 Grad von dem optimalen Bildwinkel abwich. Bei einer Abweichung von plus/minus 20 Grad wurde ein durchschnittlicher Rückgang des Fluoreszenzsignals um 21 % gemessen.Daher können relativ kleine Abweichungen vom optimalen Winkel zu erheblichen prozentualen Signalabnahmen führen. Die Verwendung der M-A-R-O-I-Technik zur Bildpositionierung ermöglicht es Forschern, konsistentere und zuverlässigere Daten zu erzeugen. Die M-A-R-O-I-Methode wurde schließlich verwendet, um die Anreicherung von SAPs C-D-O-P-S-C-V-M in arthritischen Gelenken 24 Stunden nach Injektion zu bewerten.Dieses Tier erhielt eine Punktzahl von drei bei drei arthritischen Gelenken. Hier werden Fluoreszenzbilder von Zeh und Kn&ouml;chel der arthritischen Maus basierend auf den Graphen der entsprechenden Photonenz&auml;hlungen gezeigt. Bei 10-Grad-Drehungen betragen die optimalen Bildgebungsrichtungen f&uuml;r Zeh und Kn&ouml;chel jeweils 140 Grad und 120 Grad. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verst&auml;ndnis daf&uuml;r haben, wie man M-A-R-O-I-Daten vorbereitet und aufnimmt, die es Forschern erm&ouml;glichen, den optimalen Winkel f&uuml;r die Fluoreszenzbildanalyse zu bestimmen.

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