Name: Visualisierung Neuroblast Cytokinesis Während C. elegans Embryogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-12T18:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Erfahren Sie, wie man Neuroblasten-Zytokinese während der Embryogenese von Caenorhabditis elegans visualisiert. Diese Methode nutzt RNAi und Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von Zellteilungsmechanismen.

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Die Autoren möchten, um zu bestätigen, dass diese Arbeit wurde von der Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Zuschuss unterstützt.

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<li>Piekny, A. J., Glotzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin+is+a+scaffold+protein+that+links+RhoA%2C+actin+and+myosin+during+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin and myosin during cytokinesis.</a> Curr. Biol. 18, 30-36 (2008).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von verschiedenen Arten von Bildmikroskopie Zellteilungen in der Zwischenembryogenese. Insbesondere stellt dieses Protokoll, wie Bild die Aufteilung der Neuroblasten, epidermalen Zellen, die Morphogenese erleichtern können. Zell-Zell-Kommunikation wichtig für die Gewebebildung während metazoan Entwicklung und C. elegans ist ein ausgezeichnetes Modell zur Gewebebildung in vivo zu studieren. Ein Ereignis, das schön schildert das Zusammenspiel von epidermalen Gew...

Zwar gibt es Protokolle, die beschreiben, wie Bild der Zellteilung in der frühen C elegans Embryo, beschreibt dieses Protokoll, wie man Bild der Zellteilung in einem Gewebe während der Embryogenese Mitte. Eine der großen Herausforderungen bei der Abbildung Organismen während der Entwicklung ist ihre Empfindlichkeit gegenüber Phototoxizität. Allerdings hat erhöhte Zugänglichkeit zu drehenden Scheibe konfokalen Mikroskopen oder Wischfeld-Mikroskopen weiter verbreitet Imaging-Anwendungen erlaubt. Beide Systeme verwenden Festkörperlaser und gestreuten Lichts, die Begrenzung der Pegel von UV, das die Organismen ausgesetzt sind. Allerdings kann Weitfeld steht immer noch für die Bildgebung in vivo verwendet werden, insbesondere, wenn sie mit Kameras mit hoher Empfindlichkeit (z. B. EMCCD), Blendensteuerung und Lichtsteuerung (zB LEDs oder verstellbare Quecksilberbirnen) ausgestattet. Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie entweder auf der Basis eines konfokalen System oder ein Weitfeld-System, um Bild die Zellteilung in den Entwicklungs C verwenden elegans &lt;/ Em&gt; Embryos. Als wir beispielsweise, wie man Bild Neuroblast Zellteilung zu beschreiben. Neuroblasten kann epidermalen Morphogenese durch chemische oder mechanische Signale zu den darüberliegenden Epidermiszellen zu erleichtern, und liefern ein ausgezeichnetes Beispiel für die Bedeutung der interzellulären Kommunikation bei der Bildung von Geweben. Caenorhabditis elegans ist ein idealer Modellorganismus für die Mikroskopie basierte Studien aufgrund seiner Transparenz und einfache Gewebeorganisation ein. Außerdem C. elegans zugänglich ist genetischen Methoden und RNAi, und da viele der Gene humanen Homologen, kann es verwendet werden, um konservierte Mechanismen zur Gewebebildung 2-5 identifizieren. In C. elegans, die Bildung der Epidermis tritt in der Zwischenembryogenese, wenn der Embryo&gt; 300 Zellen. Epidermalen Morphogenese besteht aus mehreren Hauptphasen, in denen der Embryo wird in eine Schicht aus epidermalen Zellen, eingeschlossen verengen und zu erweitern, um die Transformation embryo aus eiförmigen Form in die längliche Form eines Schnecken 6. Ventrale Gehäuse beschreibt eine der morphogenetischen Ereignisse, als die ventralen epidermalen Zellen wandern in Richtung der ventralen Mittellinie, um die Bauchseite des Embryos (Abbildung 1) zu decken. Zuerst werden zwei Paare von vorderen Führungskante liegt Zellen wandern in Richtung der ventralen Mittellinie, wo sie anhaften und Sicherung mit ihren Nachbarn kontralateralen 6. Dies wird durch die Migration der hinteren Tasche befindet sich Zellen, die keilartige Formen Schaffung einer Bauchtasche 6-7 bilden gefolgt. Der Mechanismus, der die Tasche geschlossen ist nicht gut verstanden. Eine Möglichkeit ist, dass eine supra Aktin-Myosin kontraktile Struktur bindet die Tasche Zellen zusammen in einer Tabaksbeutel wie Mode, ähnlich wie Wundheilungs 8. Interessanterweise wird die Migration einiger der Tasche Zellen durch spezifische Teilmengen von Basisneuroblasten 9 (neuronale Vorläufer, die unter der epidermi gefunden werden vermitteltens, Fig. 1B). Frühere Studien zeigten, dass die Neuroblasten regulieren ventralen epidermalen Zellmigration und ventralen Gehäuse. VAB-1 (Ephrin-Rezeptor) und VAB-2 (Ephrin-Liganden) sind hoch in der Neuroblasten ausgedrückt und voneinander erleichtert das Sortieren der vorderen und hinteren Neuroblasten und Mutationen in vab-1-oder-2 vab Ursache ventralen Gehäuse Phänotypen 10-13. Jedoch Promotor Rettungsexperimente zeigten, daß VAB-1 wird auch in der darüberliegenden Bauch epidermalen Zellen und Rezeptoren für andere Führungssignale von den Neuroblasten sezerniert erforderlich sind in den ventralen Hautzellen 9 ausgedrückt. Obwohl Mutationen in einem dieser Rezeptoren verursachen Bauch Gehäuse Phänotypen, ist es nicht klar, ob Defekte entstehen durch Probleme in der Neuroblast Positionierung oder durch Ausfall der ventralen epidermalen Zellen zu reagieren Führung 14 Queues. Ändern der Teilung der Neuroblasten wiThout die ihre Fähigkeit, Führungssignale absondern könnte Licht auf die Rolle der Neuroblasten und ihre Fähigkeit, mechanische Eingangs während epidermalen Morphogenese bieten zu vergießen. Kürzlich wurde festgestellt, daß eine Zellteilung Gen ani-1 (Anillin) ist hoch in Neuroblasten (2A) ausgedrückt und seine Erschöpfung verursacht Neuroblasten Teilungsfehler. Interessant ist, dass diese Embryonen anzuzeigen ventralen Gehäuse Phänotypen (Fotopoulos, Wernicke und Piekny, unveröffentlichte Beobachtungen). Anillin ist für die Zellteilung erforderlich ist, und insbesondere für die Cytokinese, die das Verfahren, bei dem eine Mutterzelle physikalisch unterteilt in zwei Tochterzellen beschreibt. Zytokinese wird durch die Bildung eines Aktomyosin Kontraktionsring, der fest in Raum und Zeit gesteuert werden, um sicherzustellen, dass er richtig mit Schwester-Chromatid-Trennung gekoppelt werden muss angetrieben. Die Master-Regulator der Zellteilung ist metazoan RhoA (RHO-1 in C. elegans), eine kleine GTPase, die eine istctive in seiner GTP-gebundenen Form. Die GEF Ect2/ECT-2 RhoA aktiviert, nach der RhoA-GTP interagiert mit Effektoren, die die Kontraktionsring zu bilden und zu vermitteln seine Eindringen 15. Anillin ist ein Multidomänen-Protein, das RhoA über seinen C-Terminus und an Actin und Myosin über seinen N-Terminus bindet. Anillin erforderlich ist, um die Position des kontraktilen Ring in Säugetier-oder Drosophila S2 Zellen 16 zu stabilisieren. Anillin Erschöpfung verursacht Kontraktionsringe, um seitliche Schwingungen zu unterziehen, und Zytokinese schließlich ausfällt Bildung kernigen Zellen 17-19. Interessant, wenn auch C. elegans ani-1-Koordinaten Aktomyosin Kontraktilität im Embryo, ist es nicht wesentlich für die Cytokinese. Jedoch, wie oben beschrieben, ani-1 ist für Neuroblast Zytokinese in der Zwischenembryogenese (Fotopoulos, Wernicke und Piekny, unveröffentlichte Beobachtungen) erforderlich. Cytokinesis Scheitern würde die Anzahl und Position der Neuroblasten verändern und könnte die Lok beeinflussenation von chemischen Führungssignale, oder es könnte die mechanischen Eigenschaften des Gewebes verändern. Beide Modelle unterstreichen die Rolle der nichtautonomen für Neuroblasten ventralen Gehäuse, und die Bedeutung der Gewebe-Gewebe-Kommunikation während der embryonalen Entwicklung. Das Versuchsprotokoll beschreibt, wie Bild Zellteilung während C. elegans Mitte Embryogenese unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie. Die Mehrzahl der Experimente, die die Mechanismen der Zellteilung in Einzelzellen in Kulturschalen (zB. HeLa-Zellen oder S2) oder in frühen Embryonen mit einer begrenzten Anzahl von Zellen (z. B. C. elegans ein Embryo, Xenopus oder stachelhäuter durch Embryonen). Jedoch ist es wichtig, auch die Zellteilung im Gewebe zu untersuchen, wie es externe Signale, die den Zeitpunkt und die Platzierung der Teilungsebene beeinflussen können. Weiterhin können Zellen, chemische oder mechanische Signale bereitzustellen, um die Entwicklung der benachbarten Gewebe beeinflussens, und es ist wichtig zu verstehen, wie die interzelluläre Kommunikation hilft Geweben während der Entwicklung zu bilden.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>BioShop Kanada Inc.</td><td>#AGR001.1</td><td>Zur Herstellung von C. elegans NGM- und RNAi-Platten</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>#9002-18-0</td><td>Zur Herstellung von LB-Agarplatten für Bakterien</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-Antikörper Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies Corporation (Invitrogen)</td><td>#A11029</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-Anti-GFP-Antikörper</td><td>Roche Applied Science</td><td>#11814460001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen Alexa Fluor 568 Antikörper</td><td>Life Technologies Corporation (Invitrogen)</td><td>#A11011</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#AMP201.5</td><td>Pulver bei 4 Grad lagern; C und gelöstes Ampicillin bei -20 &°; C</td></tr><tr><td>Bactopeton&nbsp; (Pepton-A)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td></td><td></td>#G213</tr><tr><td>CaCl2 (Calciumchlorid)</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#C302.1</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>BioShop Deutschland Inc.</td><td>#CHL380.25</td><td>In Ethanol</td></tr><tr><td>DAPI lösen&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D9542</td><td>Zur Färbung von Nukleinsäuren (DNA)</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#GLY001.1</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropylthio-&beta;-Galactosid)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>#367-93-1</td><td>Pulver und gelöstes IPTG bei -20 Grad lagern; C</td></tr><tr><td>KH2PO4 (Kaliumphosphat, einbasisch)</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#PPM666.1</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (Kaliumphosphat, zweibasisch)</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#PPD303.1</td><td></td></tr><tr><td>L4440&nbsp; (Fütterungsvektor)</td><td>Addgene</td><td>#1654</td><td>Als Glycerin-Vorrat bei -80 &deg halten; C</td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp; &nbsp; (Magnesiumsulfat)</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#MAG511.500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (Natriumchlorid)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>#7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (Natriumphosphat, zweibasisch)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>#7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Normales Eselserum (NDS)</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>#035-110</td><td></td></tr><tr><td>n-Propyl-3,4,5-trihydroxybenzoat (Propylgallat)</td><td>Alfa Aesar</td><td>#A10877</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8920</td><td>Für optimale Ergebnisse beschichten Sie Objektträger dreimal&nbsp;</td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#STP101.50</td><td>Pulver bei 4 Grad lagern; C und gelöstes Streptomycin bei -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#TET701.10</td><td>Pulver bei 4 Grad lagern; C und gelöstes Tetracyclin bei -20 &°; C</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>CAS#9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>#TRP402.500</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>#8013-01-2</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisierung neuroblast cytokinesis während<em&gt; c. elegans</em&gt; embryogenese

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie, um Bildteilenden Zellen in den Entwicklungs Caenorhabditis elegans Embryonen. Insbesondere konzentriert sich dieses Protokoll auf, wie man Bild Division Neuroblasten, die unterhalb der epidermalen Zellen zu finden sind und kann wichtig für den epidermalen Morphogenese sein. Gewebebildung ist entscheidend für die Entwicklung Metazoen und setzt auf externe Signale von benachbarten Geweben. C elegans ist ein ausgezeichneter Modellorganismus zur Morphogenese in vivo aufgrund seiner Transparenz und einfache Organisation zu studieren, was seine Gewebe einfach über Mikroskopie zu untersuchen. Ventralen Gehäuse ist der Prozess, wo die ventrale Oberfläche des Embryos durch eine einzige Schicht von Epithelzellen bedeckt. Dieses Ereignis wird angenommen, durch die zugrunde liegenden Neuroblasten, die chemische Führungssignale bereitzustellen, um die Migration der darüberliegenden Epithelzellen vermitteln erleichtert werden. Jedoch sind die Neuroblasten hochproliferative und kann auch handelnals mechanischer Träger für die ventrale Epidermiszellen. Studien mit diesen experimentellen Protokoll könnte die Bedeutung der interzellulären Kommunikation bei der Gewebebildung zu enthüllen, und könnte verwendet werden, um die Rollen von Genen in die Zellteilung in sich entwickelnden Geweben beteiligt zu offenbaren.

Das Versuchsprotokoll beschreibt, wie Bild der Zellteilung in C. elegans Embryonen während der Embryogenese Mitte. Insbesondere beschreibt sie, wie man Bild Neuroblasten, die epidermalen Morphogenese erleichtern können. Epidermalen Morphogenese tritt aufgrund einer Kombination von epidermalen Zellformänderungen, Migration und Adhäsion, sondern stützt sich auf chemische oder mechanische Signale aus den zugrundeliegenden Neuroblasten (Abbildung 1B). Die Neuroblasten sezerFührungsSignale, die durc...

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bild teilenden Zellen innerhalb eines Gewebes in Caenorhabditis elegans Embryonen. Während mehrere Protokolle beschreiben, wie Bild der Zellteilung im frühen Embryo, beschreibt dieses Protokoll, wie man Bild der Zellteilung in einem Entwicklungs Gewebe während der Embryogenese Mitte spät.

Visualisierung Neuroblast Cytokinesis Während<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, teilende Zellen in einem sich entwickelnden Gewebe während der Embryogenese von C. elegans zu beobachten. Um Gene zu untersuchen, die die Zellteilung steuern, wird dies erreicht, indem ein C. elegans-Stamm erzeugt oder beschafft wird, der stabil transgene Marker exprimiert, welche die Zellen von Interesse markieren. Als zweiter Schritt erfolgt eine gezielte Herunterregulation eines interessierenden Gens durch Fütterung von D-S-R-N-A an L4-Larven für 24 bis 48 Stunden.Die RNAi-Embryonen werden von hermaphroditen Tieren gesammelt und zur Live-Bildgebung auf ein Aros-Kissen übertragen. Anschließend werden die Embryonen mittels Weitfeld- oder konfokaler Mikroskopie abgebildet, um Zellteilungsphänotypen sichtbar zu machen. Die Ergebnisse zeigen, wie Neuroblasten während der Embryogenese von Sea Elgin teilen und welche Rolle Gene für ihre Teilung spielen.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungs- und Zellbiologie zu beantworten. Beispielsweise könnte diese Methode Gene und Mechanismen aufdecken, die an der Regulation der Mitose während der Gewebeentwicklung, der Zell-Zell-Kommunikation, der Zellw

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir beschreiben das Verfahren zur Vorbereitung...

Visualisierung des embryonalen Nervensystems in Whole-mount Drosophila Embryos

Imaging C. elegans Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Open Source Software

Dieser Artikel beschreibt eine Technik zur Visualisierung der frühen Ereignisse der Embryogenese in den...

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Quelle: Williams, A. L., et al. Multi-Photonen-Zeitraffer-Bildgebung zur Visualisierung der Entwicklung in Echtzeit: Visualisierung von wandernden Neuralleistenzellen in Zebrafischembryonen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt ein Multi-Photonen-Zeitraffer-Bildgebungsprotokoll, um die Migration von Neuralleistenzellen in einem Zebrafischembryo in Echtzeit mit hoher Auflösung zu visualisieren.

Visualisierung der Migration von Neuralleistenzellen in einem Zebrafischembryo mit Hilfe von Multiphotonen-Zeitraffer-Bildgebung

Quelle: Jeong, S. Visualisierung des axonalen Projektionsmusters embryonaler Motoneuronen in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Visualisierung von axonalen Projektionen in Drosophila Embryonen. Die Immunmarkierung von Motoneuronen, die präzise Dissektion zur Freilegung neuronaler Strukturen und die differentielle Interferenzkontrastmikroskopie zeigen zusammen eine detaillierte neuronale Architektur, wobei die axonalen Projektionsmuster hervorgehoben werden.

Visualisierung axonaler Projektionsmuster embryonaler Motoneuronen in Drosophila

Neurale Vorläufer Mitose ist ein kritischer Parameter der Neurogenese. Viel von unserem Verständnis der neuralen Vorläufer Mitose basiert auf der Analyse von festen Gewebe basiert. Live-Bildgebung in der embryonalen Hirnschnitten ist eine vielseitige Technik zur Mitose mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung in einer kontrollierten Umgebung zu beurteilen.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Hier wird gezeigt, wie Entwicklungsprozesse in C. elegans verfolgt und quantifiziert werden können. Die vorgestellten Methoden basieren auf Open-Source-Tools, die einfach implementiert werden können. Es wird gezeigt, wie man 3D-Zellformmodelle rekonstruiert, wie man subzelluläre Strukturen manuell verfolgt und wie man die kortikale kontraktile Strömung analysiert.

Tracking und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwendung von Open-Source-Werkzeuge

Diese Arbeit beschreibt eine Standard-Immunhistochemie-Methode zur Visualisierung von Motor-Neuronen-Projektionen von späten Stadium-16 Drosophila Melanogaster Embryonen . Die gefilterte Präparation von festen Embryonen, die mit FasII-Antikörper gefärbt wurden, bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Gene zu charakterisieren, die für die motorische Axon-Pathfindung und die Zielerkennung während der neuronalen Entwicklung erforderlich sind.

Visualisierung des axonalen Projektionsmusters der embryonalen motorischen Neuronen in<em&gt; Drosophila</em

Hier stellen wir einen kombinatorischen Ansatz vor, bei dem hochauflösende Mikroskopie, Rechenwerkzeuge und Einzellen-Beschriftungen in lebenden C. eleganischen Embryonen verwendet werden, um die Einzelzellendynamik während der Neuroentwicklung zu verstehen.

Isotrope Licht-Sheet-Mikroskopie und automatisierte Zelllineage-Analysen zu Katalog-Caenorhabditis elegans Embryogenese mit subzellulärer Auflösung

Diese Arbeit beschreibt ein semi-high-throughput-Protokoll, das eine gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Embryogenese in 80–100 C. elegans Embryonen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Darüber hinaus sind Bildverarbeitungs- und Visualisierungstools enthalten, um die Datenanalyse zu optimieren. Die Kombination dieser Methoden mit kundenspezifischen Reporterstämmen ermöglicht eine detaillierte Überwachung der Embryogenese.

Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

Hier stellen wir Protokolle und Werkzeuge zur Visualisierung von Kalzium während der Befruchtung und der frühen Embryogenese unter Verwendung eines genetisch kodierten Kalziumreporters vor, der in der Keimbahn des Modellfadenwurms C . elegans exprimiert wird.

In vivo Visualisierung von Calciumtransienten während der Befruchtung und frühen Entwicklung bei C. elegans

Erfahren Sie, wie man Neuroblasten-Zytokinese während der Embryogenese von Caenorhabditis elegans visualisiert. Diese Methode nutzt RNAi und Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von Zellteilungsmechanismen.

Visualisierung Neuroblast Cytokinesis Während

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