Visualisierung Neuroblast Cytokinesis Während C. elegans Embryogenese

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, sich teilende Zellen innerhalb eines sich entwickelnden Gewebes während der C-Eleganz-Embryogenese zu beobachten. Um Gene zu untersuchen, die die Zellteilung steuern, wird dies erreicht, indem ein Ölstamm geschaffen oder erhalten wird, der transgene Marker, die die interessierenden Zellen markieren, stabil exprimiert. In einem zweiten Schritt schalten Sie selektiv ein Gen von Interesse aus, indem Sie D-S-R-N-A für 24 bis 48 Stunden an L-Vier-Larven füttern.

Die RNAI-Embryonen werden von grafischen Hermaphroditen entnommen und für die Live-Bildgebung auf ein Aros-Pad übertragen. Anschließend werden mit Hilfe der Weitfeld- oder Konfokalmikroskopie Embryonen abgebildet, um die Phänotypen der Zellteilung zu visualisieren. Die Ergebnisse werden zeigen, wie sich Neuroblasten während der Embryogenese von Seeelgin teilen und welche Rolle die Gene spielen, die für ihre Teilung erforderlich sind.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungs- und Zellbiologie zu klären. So könnten beispielsweise Gene und Mechanismen aufgedeckt werden, die an der Regulation der Mitose während der Gewebeentwicklung, der Zellkommunikation, der Zellmigration oder der Zellpolarität beteiligt sind. Verwenden Sie transgene Würmer, die die entsprechenden Marker exprimieren und 24 bis 48 Stunden lang auf Kontroll- oder RNAI-Platten aufbewahrt werden.

Nehmen Sie vier bis sechs erwachsene Tiere und geben Sie sie in 20 bis 30 Mikroliter M neun Puffer in einem Depressionsobjektträger. Um die Embryonen freizusetzen, verwenden Sie ein steriles Skalpell und schneiden Sie die Würmer auf beiden Seiten der Spermathek oder Vulva. Als nächstes entnehmen Sie die Embryonen mit einer gezogenen Kapillare, die an einem Pipettenkolben befestigt ist und breit genug ist, um die Embryonen zu passieren. Übertragen Sie die Embryonen mit einer Wimper, die auf einen Zahnstocher geklebt ist, auf ein frisch vorbereitetes Aros-Pad.

Bilden Sie Gruppen von fünf bis 10 Embryonen, indem Sie die Embryonen nebeneinander schieben. Decken Sie den Objektträger mit einem Deckglas ab und fügen Sie bei Bedarf mehr M nine Puffer hinzu, dann verschließen Sie den Deckglas mit vorgewärmter Flüssigkeit Valla. Verwenden Sie ein epi-fluoreszierendes Weitfeldmikroskop mit automatisierten Filtern.

Objektive, eine hochauflösende CCD-Kamera und ein hochmotorisierter Tisch. Alles wird mit Software gesteuert. Obwohl dieses System keine LEDs und eine E-M-C-C-D verwendet, wird die Phototoxizität für den Embryo bei geringer Vergrößerung begrenzt.

Fokussieren Sie manuell auf die Embryonen, um den Neuroblasten abzubilden. Erhöhen Sie die Vergrößerung und wählen Sie Embryonen aus, die einer dorsalen Interkollation oder einem frühen ventralen Verschluss am Weitfeldmikroskop unterzogen werden. Wählen Sie die GFP- und Texas-Rotfilter und bestimmen Sie die optimalen Z-Ebenen auf dem Weitfeldsystem.

Die Verwendung von weniger Zacks und weniger Zeitpunkten reduziert die Phototoxizität und schließt die Blende auf 30 %, und wenn möglich, wird die Lichtintensität durch Verringern der Lichtintensität weiter reduziert. Alternativ können Sie ein konfokales Live-Scan-Swept-Field- oder Spinning-Disc-Mikroskop mit Software zur Steuerung der Scanning-Laserobjektive, eine E-M-C-C-D-Kamera und einen hochmotorisierten Tisch verwenden. Nachdem die Aufnahmeeinstellungen optimiert wurden, können Sie die Embryonen am Weitfeldmikroskop abbilden.

Es wird empfohlen, Kontrollembryonen zuerst vor RNAI-Embryonen zu filmen. Mit dem Kehrfeldsystem. Stellen Sie die Laser 4 88 und 5 61 100 Milliwatt auf 40 % Leistung mit einem Spalt von 50 und einer Belichtungszeit von 300 Millisekunden ein.

Es ist wichtig zu beachten, dass diese Einstellungen für andere Mikroskope unterschiedlich sind. Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch und verwenden Sie dann ein Objektiv mit geringer Vergrößerung, um die Embryonen zu finden. Wechseln Sie dann zum 60 oder 100 x Ölimmersionsobjektiv

Nach dem Fokussieren werden alle zwei Minuten insgesamt 10 Minuten lang 20 Z-Stapel mit einer Dicke von 0,2 Mikrometern gesammelt. Die Belichtungszeit muss wahrscheinlich angepasst werden. Phototoxizität muss berücksichtigt werden, wenn lebende Embryonen mittels Fluoreszenzmikroskopie die Öffnung schließen und weniger Zacks oder Zeitpunkte wählen.

Eine Verkürzung der Expositionszeit kann die Phototoxizität nach Möglichkeit begrenzen. Die Verwendung eines konfokalen SW-Feld- oder Spinning-Disc-Mikroskops kann helfen, dieses Problem zu verbessern. Bestimmen Sie Ihre Zeit, Punkte und Z-Ebenen von Interesse mit der Erfassungssoftware.

Exportieren Sie die gewünschten Bilder als mehrere TIFFs. Öffnen Sie die gewünschten Z-Ebenen für jeden Zeitpunkt und Kanal, der in Verarbeitungssoftware wie Image J von Interesse ist, und erstellen Sie einen Stack-Neuroblasten, der sich oft nur über wenige Ebenen erstreckt. Stapeln Sie die Z-Ebenen für jeden Zeitpunkt, und erstellen Sie Z-Stapelprojektionen.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für weitere Kanäle. Sobald alle Zack-Projektionen für die gewünschten Zeitpunkte abgeschlossen sind, öffnen Sie die Projektionen, um eine Zeitsequenz zu erstellen. Führen Sie dies für jeden Kanal separat aus.

Nehmen Sie für jeden Kanal die Helligkeit und den Kontrast nach Bedarf an. Drehen Sie die Bilder bei Bedarf. Wählen Sie dann einen Interessenbereich aus und schneiden Sie die Bilder zu.

Erstellen Sie nun ein zusammengeführtes Bild mit der Funktion "Zusammengeführte Kanäle". Auswählen einer anderen Farbe für jeden Kanal. Speichern Sie das zusammengeführte Bild als RGB-Datei, um die Bilder klarer zu visualisieren.

Verwenden Sie die 16-Bit-TIFF-Bilder und wählen Sie unter Bearbeiten die Funktion Umkehren, um grau skalierte Bilder für jeden Kanal zu erstellen. Um die Größe eines interessierenden Objekts auf Mikrometer genau zu bestimmen, zeichnen Sie eine Linie und multiplizieren Sie ihre Länge mit der Größe der Pixel, die durch die Bildgebungsparameter bestimmt wird. Erstellen Sie nun einen Maßstabsbalken, der einen Anteil der berechneten Länge in Mikrometern darstellt.

Speichern Sie abschließend die endgültigen Bilder als Acht-Bit-Tiffs. Falls gewünscht, konvertieren Sie die TIFFs in Filme mit Bild J epidermal. Die Morphogenese von C elegance erfolgt aufgrund einer Kombination von Veränderungen der epidermalen Zellform, Migration und Adhäsion mit Hilfe des zugrunde liegenden proliferativen Neuroblasten.

Epidermale Zellen wandern zur ventralen Mittellinie und bilden eine einzelne Zellschicht, um Neuroblasten-Teilungsembryonen zu untersuchen, stabil Coex-exprimierende und Neuroblasten-spezifische Marker, die mit GFP markiert sind, und ein maternal getriebener Membranmarker, der mit m-Kirsche markiert ist, wurden während der ventralen Einhausung bei erhöhter Vergrößerung abgebildet. Die Neuroblastenkerne wurden bei der Teilung visualisiert, die Neuroblastenkerne sind grün dargestellt und die umgebenden Membranen sind in rot dargestellt. Zeitrafferbilder von sich teilenden Neuroblasten, die mit der mCherry-Membransonde in einem Kontrollembryo skizziert wurden, wurden mit einem Weitfeldmikroskop aufgenommen, um die sich teilenden Neuroblasten in den Kontrollembryonen besser sichtbar zu machen. Jeder Kanal wurde in Graustufen gehalten und die Bilder wurden mit Hilfe von konfokalen Swept-Field-Mikroskopie-Kontrollembryonen invertiert.

Der pH-Wert von Coex, der Schinken exprimiert, eins, GFP und M, Kirsche, wurden in einer Region mit teilendem Neuroblasten abgebildet. Dieselben Embryonen, die mit RNAI behandelt wurden, um eine kranke Expression zu unterdrücken, wurden mit Hilfe der Weitfeldmikroskopie sichtbar gemacht. Im Gegensatz zu Kontrollembryonen stagnierten oder bildeten sich viele Neuroblasten während der Teilung zurück und wurden mit Hilfe der Sweept-Field-Mikroskopie mehrkernig.

Es war auch klar, dass viele Neuroblasten während der Teilung ins Stocken gerieten oder sich zurückbildeten und mehrkernig wurden. Diese Technik kann auch verwendet werden, um wandernde Zellen während der Gewebebildung abzubilden. Wenn Ihre Zacks verwendet werden, um eine schnellere Bildgebung zu ermöglichen, können auch mehr Informationen über die subzelluläre Dynamik erhalten werden.

Darüber hinaus könnte diese Technik mit der entsprechenden Ausrüstung für die Aktivierung von photoabstimmbaren Sonden zur Durchführung von Optogenetik verwendet werden. Auch Mikroskopietechniken wie Bünd oder Bund können angewendet werden, um Proteine, Proteinwechselwirkungen oder Proteindynamik zu untersuchen.