Die Beurteilung der Entwicklung der Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen in Peyer-Patches mit Adoptiv Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, die Fähigkeit gereinigter hämatopoetischer Vorläuferzellen zu untersuchen, plasmazytoide dendritische Zellen in Darmpflastern nach adoptivem Transfer hervorzubringen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein hydrodynamischer Gentransfer des Plasmids durchgeführt wird, das für den dendritischen Zellwachstumsfaktor kodiert. FLIT drei Liganden in PIs Pflaster plasmazytoide dendritische Zellen beeinträchtigte Mäuse.

Im zweiten Schritt werden gemeinsame dendritische Vorläuferzellen aus dem Wildtyp-Knochenmark durch magnetische Kügelchentrennung und Fließsortierung isoliert. Im letzten Schritt werden die Vorläuferzellen adoptiv durch intravenöse Injektion in plasmazytoide dendritische Zellen beeinträchtigte Mäuse übertragen, die durch hydrodynamischen Gentransfer behandelt wurden. Letztendlich kann die von den hämatopoetischen Vorläuferzellen abgeleitete Population der plasmazytoiden dendritischen Patch-Zellen des Spenders mittels Durchflusszytometrie bewertet werden.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Immunologie zu beantworten, z. B. was der Entwicklungsursprung der Plasma-Cy-Dendri-Zellen ist, die sich in den Piratenfeldern lokalisieren. Diese Methode kann jedoch Aufschluss über die Herkunft der plasmazytoiden dendritischen Zellen des Scheiterhaufenpflasters geben. Es kann auch angewendet werden, um zu verstehen, wie plasmazytoide dendritische Zellen die Lymphozytenpopulationen in diesen Geweben beeinflussen.

Zwei Tage vor dem adoptiven Transfer erweitern Sie die Blutgefäße von fünf CD 45 2-positiven Interferon-Alpha-Rezeptor-Knockout-Empfängermäusen unter einer Wärmelampe für fünf bis 10 Minuten. Legen Sie dann für jede Maus das Tier in einen Fixierer und desinfizieren Sie den Schwanz mit 70 % Ethanol. Als nächstes injizieren Sie mit einer 27-Gauge-Nadel fünf Mikrogramm Plasma und überziehen Sie drei Liganden und zwei Milliliter steriles PBS in die Schwanzvene jedes Tieres.

Injizieren Sie für die Kontrollkohorte fünf Mikrogramm des leeren Vektors. Nachdem Sie die Mäuse 15 bis 30 Minuten lang überwacht haben, bringen Sie sie in ihre Haltungseinrichtung zurück. Am Tag des Versuchs werden der präparierte Femur und die Tibia von 10 kongenen CD 45 1 positiven C 57 schwarzen sechs Mäusen in eine Kulturschale mit dem vollständigen Medium gegeben.

Führen Sie dann eine 27-Gauge-Nadel in ein Ende jedes Knochens ein und spülen Sie das Knochenmark dreimal pro Knochen mit einem vollständigen Medium in die Schale. Stellen Sie sicher, dass die Knochenmarkzellen entfernt werden, indem Sie bestätigen, dass das ausgestoßene Medium trüb erscheint. Stellen Sie eine Einzelzellsuspension her, indem Sie das Medium drei- bis fünfmal in der Kulturschale vorsichtig auf und ab pipettieren.

Entfernen Sie dann die Ablagerungen, indem Sie die Knochenmarkzellen durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb führen, und brechen Sie alle Zellklumpen auf, indem Sie vorsichtig das Ende eines sterilen Spritzenkolbens anbringen. Auf dem Sieb schleudern Sie die Zellen herunter, entfernen Überstände und läusen die roten Blutkörperchen in zwei Millilitern Lysepuffer pro vier- bis sechsmal 10 bis zu den siebten Zellen für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie dann 10 Milliliter Faxpuffer in die Knochenmarkzellen und schleudern Sie vier Minuten lang bei 500-facher G-Temperatur bei Raumtemperatur.

Nach dem sanften Ansaugen des Supnatins waschen Sie das Pellet in 10 Millilitern Faxpuffer. Als nächstes färben Sie die Zellen mit einem hämatopoetischen Linienmarker, der Antikörper erkennt, nachdem die Antikörper gefärbt und gewaschen wurden. Inkubieren Sie die Zellen mit magnetischen Mikrokügelchen aus Ziegen-Anti-Ratte.

Laden Sie während der Mikrobead-Inkubation eine max. LD-Säule auf einen MIDI max-Zellseparator und spülen Sie die Säule mit zwei Millilitern Faxpuffer vor. Legen Sie dann ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen unter die Säule und laden Sie bis zu fünfmal 10 bis zu den Achtelzellen in 2,5 Milliliter Faxpuffer in die Säule. Waschen Sie die Säule dreimal mit zwei Millilitern Faxpuffer pro Waschgang und sammeln Sie die negativen Zellen, die durch die Säule in das 15-Liter-Röhrchen gelangen.

Zählen Sie die entgangenen Zellen. Nach dem Färben der Zellen mit den entsprechenden fluoreszierend konjugierten Antikörpern wird die Probe auf ein Faxrohr übertragen, um die gemeinsamen dendritischen Vorläuferzellen auf der Grundlage des gewünschten Markerprofils zu sortieren. Sammeln Sie die durch das Fax gereinigten Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern des vollständigen Mediums, und notieren Sie am Ende des Faxlaufs die absolute Anzahl der sortierten Zellen.

Nach dem Schleudern verdünnen die Zellen einmal 10 bis ein Fünftel der gereinigten gemeinsamen dendritischen Vorläuferzellen pro 100 Mikroliter Gesamtvolumen an sterilem PBS pro Maus und aspirieren die Zellsuspensionen in eine Spritze, die mit 27 Gauge-Nadeln ausgestattet ist. Injizieren Sie dann die CD 45 1 positiven Vorläuferzellen in die Schwanzvene jeder Empfänger-CD 45 2 positiven Interferon-Alpha-Rezeptor-Knockout-Maus, wie gerade sieben bis 10 Tage nach dem adoptiven Transfer gezeigt. Entfernen Sie den Darm von den gemeinsamen dendritischen Zellvorläuferzellen, die Mäusen injiziert wurden, und legen Sie das Gewebe auf PBS-getränkte Papiertücher.

Verwenden Sie dann eine feine Pinzette und eine Schere, um alle sichtbaren Scheiterhaufenflecken entlang der Dünndarmwand zu sammeln. Beachten Sie, dass die Scheiterhaufen-Patches oft sogar innerhalb einer einzelnen Maus strukturell unterschiedlich sind, also stellen Sie sicher, dass alle P'S-Patches identifiziert und seziert werden. Waschen Sie die isolierten P'S-Pflaster dreimal in einer Petrischale, die PBS enthält, mit einer Pinzette, um den Kot zu entfernen.

Dann verdauen Sie die P'S-Pflaster mit einem Milligramm pro Milliliter, Kollagenase vier von 10 Millilitern HBSS in einem 50-Milliliter-Kolben unter kräftigem Rühren bei 37 Grad Celsius. Gießen Sie nach einer Stunde die verdauten PIs-Pflaster in ein 40-Mikrometer-Zellsieb und drücken Sie die Zellen mit einem sterilen Spritzenkolben in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Nachdem Sie die gefilterte Zellsuspension heruntergeschleudert haben, resuspendieren Sie das Pellet in sechs Millilitern mit 37 % pro Anruflösung und überführen Sie es in ein 15-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie dann vorsichtig sechs Milliliter 70 %-Lösung pro Anruf darunter, um einen Schrittgradienten pro Anruf zu bilden. Trennen Sie nun die Zellen für 20 Minuten bei 800 mal G bei Raumtemperatur mit dem Break-Off. Sammeln Sie dann die mononukleäre Zellpopulation an der Grenzfläche.

Waschen Sie die gesammelten Zellen nach dem Pelletieren zweimal in 50 Millilitern vollständigem Medium. Färben Sie sie dann mit den entsprechenden Antikörpern, um das CD 45 1 positive PYS-Pflaster nachzuweisen. Plasmazytoide dendritische Zellen, die von den adoptiv übertragenen CD 41-positiven Vorläuferzellen abstammen.

Analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie. Die plasmazytoiden dendritischen Zellen können anhand ihres CD 11 C positiven Clec H positiven PDCA, eines positiven B und zwei 20 positiven CD 11 B negativen Phänotyps identifiziert werden. Bestimmen Sie schließlich die absolute Anzahl der plasmazytoiden dendritischen Zellen mit dieser Gleichung.

Diese Punktdiagramme zeigen die Gating-Strategie für die Isolierung gemeinsamer dendritischer Vorläuferzellen. Für Knochenmarkzellen der Maus machen gemeinsame, dendritische Vorläuferzellen, wie gerade gezeigt, etwa 0,1 % der gesamten Knochenmarkzellen aus und etwa vier- bis sechsmal 10 bis 4. Von diesen Zellen können aus einer Maus isoliert werden, um die plasmazytoiden dendritischen Patchzellen von PI mittels Durchflusszytometrie zu identifizieren.

Es wird eine anfängliche Vorwärts- und Seitenstreu-Gating-Strategie verwendet, gefolgt von einem Gating für CD 11 C positive clec H-positive Zellen. Interferon-alpha-Rezeptor-Knockout-Mäuse zeigen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eine signifikante Verringerung der plasmazytoiden dendritischen Zellen des PYS-Pflasters. Gewöhnliche dendritische Vorläuferzellen differenzieren sich ebenfalls zu herkömmlichen dendritischen Zellen.

Im Gegensatz zu plasmazytoiden dendritischen Zellen CD 11 C positiven clec H negativen werden konventionelle dendritische Zellen in ähnlichen Mengen sowohl bei Wildtyp- als auch bei Knockout-Mäusen beobachtet. Daher bieten Interferon-alpha-Rezeptor-Knockout-Mäuse die Möglichkeit, die Rekonstitution von dendritischen Zellen im PS-Patch ohne die Auswirkungen letaler Bestrahlung zu untersuchen. Der adoptive Transfer von Wildtyp-Vorläuferzellen in Interferon-alpha-Rezeptor-Knockout-Mäuse, wie gerade gezeigt, stimuliert eine Zunahme von PIs patch plasmazytoiden dendritischen Zellen.

Darüber hinaus erhöht die Vorbehandlung mit einem hydrodynamischen FL-Gentransfer mit drei Liganden die Expansion plasmazytoider dendritischer Zellen in PI-Pflastern weiter, was bedeutet, dass übertragene gemeinsame dendritische Vorläuferzellen und möglicherweise endogene FL drei positive Vorläuferzellen auf FL drei Liganden reagieren, indem sie plasmazytoide dendritische Zellen des Pyruspflasters induzieren. Beide Bedingungen stimulieren auch die Produktion von CD 11 C positiven clec H negativen konventionellen dendritischen Zellen, die mit dem Entwicklungsursprung konventioneller dendritischer Zellen übereinstimmen. PYS-Patch-plasmazytoide dendritische Zellen exprimierten traditionelle plasmazytoide dendritische Zellmarker, einschließlich clec H, PDCA eins und B zwei 20 und LAC CD 11 B.In Darüber hinaus zeigt die Analyse der PYS-Pflaster von Interferon-alpha-Rezeptor-Knockout-Mäusen, die sowohl einen hydrodynamischen FL-3-Liganden-Gentransfer als auch übertragene gemeinsame dendritische Vorläuferzellen erhalten, dass etwa 70 % der plasmazytoiden dendritischen Zellen von CD 45 1-positiven gemeinsamen dendritischen Vorläuferzellen des Spenders stammen.

Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass der adoptive Transfer gemeinsamer dendritischer Vorläuferzellen die plasmazytoide dendritische Zellpopulation des PIs-Patches als Reaktion auf FL-3-Liganden-vermittelte Signale in vivo induziert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man plasmazytoide D-Zellen des Pars-Patches isoliert und identifiziert.