Name: Die Beurteilung der Entwicklung der Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen in Peyer-Patches mit Adoptiv Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-17T16:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Erfahren Sie, wie hämatopoetische Vorläuferzellen plasmazytoide dendritische Zellen in Peyer-Patches von Mäusen generieren. Diese Methode nutzt adoptive Übertragung und Flt3L-Stimulation zur Analyse der Zellentwicklung in vivo.

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Wir danken Drs.. Alex Gelbard und Willem Overwijk für Beratung in hydrodynamischen Gentransfer. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der NIH (AI098099, SSW), dem MD Anderson Cancer Center for Epigenetik, dem MD Anderson Center for Entzündung und Krebs (SSW) und der RE Bob Smith Education Fund (HSL) unterstützt.

Institutionelle Genehmigung ist im Voraus für alle hier beschriebenen experimentelle Manipulationen an Mäusen gewonnen werden. Diese umfassen die Verwendung von C57BL/6-Mäuse zur Isolierung von Knochenmarksvorläuferzellen, IFNAR - / - Mäusen als Empfänger für die adoptive Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen und der Verwendung von CGT für Zytokin-Überexpression in vivo. Entsprechende Gehäuse und Pflege der Tiere muss auch von dem Prüfer oder Institution gestellt werden. Darüber hinaus können institutionelle Zulassung für die in hydrodynamischen Gentransfer (dh rekombinante DNA-Zulassung) verwendeten Plasmide erforderlich. Die hier beschriebenen Untersuchungen wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss bei UT MD Anderson Cancer Center genehmigt. 1. Hydrodynamische Gentransfer (HGT) Dieser Schritt soll 2 Tage vor dem adoptiven Transfer von CDPs herbeigeführt werden, um zirkulierende Flt3L für DC-Expansion in vivo-5. Prepare mindestens 5 Empfänger Mäuse / Gruppe. <ol><li> Um eine effiziente HGT zu erreichen, die Blutgefäße des Empfängers IFNAR - / - sollte Mäusen (CD45.2 +), indem Mäusen zu einer Wärmelampe für 5-10 min erweitert werden. </li><li> Legen Sie die Maus in einem Rückhalteeinrichtung und zu desinfizieren sein Schwanz mit 70% Ethanol. </li><li> Injizieren 5 ug Plasmid kodierend Flt3L in 2 ml sterilem PBS in die Schwanzvene unter Verwendung einer 27 G-Nadel. Für die Steuerung Kohorte injizieren 5 ug leeren Vektor (PORF) über die Schwanzvene wie angegeben. </li><li> Überwachung der Mäuse 15-30 min, um sicherzustellen, gibt es keine nachteiligen Auswirkungen der Injektion in die Schwanzvene. Zurück Mäuse Wohnanlage für 2 Tage. </li></ol> 2. Isolierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen aus Knochenmark der Maus Dieser Schritt sollte 2 Tage nach HGT durchgeführt werden. Verwenden kongenen CD45.1 +-Mäusen als Quelle der Knochenmarkvorläuferzellen für Adoptiv-Transfer in Empfänger IFNAR - /- Tiere (CD45.2 +). In diesem Protokoll werden kongenen Stämmen erforderlich Spender und Empfänger abgeleiteten DCs unterscheiden, sowie Immunverarmung durch MHC-Fehlanpassung zu vermeiden. Ungefähr 10-20 Mäuse werden benötigt, um eine ausreichende Anzahl von hämatopoetischen Vorläuferzellen (10 5 Zellen / Empfängermaus) für die Transferexperimente liefern. <ol><li> Euthanize 10 kongenen CD45.1 + Mäusen durch CO 2-Erstickung und Genickbruch. </li><li> Platzieren Sie jede Karkasse auf einer Dissektion Tablett und sterilisieren Sie den Bauch und Beine mit 70% Ethanol. </li><li> Einen Einschnitt in der Mitte Bauch und Messer durch die Haut aus dem Bauch, um jedes Bein, Schneiden Haut nach unten der Länge des Beines. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Haut von jedem Bein, und schneiden und entfernen Sie die Beine von der Karkasse im Hüftgelenk mit einer scharfen Schere. </li><li> Die Muskeln vorsichtig aus Femur und Tibia von jedem Bein mit einer scharfen Klinge. </li><li> Entfernenbeide Enden des Oberschenkelknochens und des Schienbeins mit einem scharfen Skalpell und legen Knochen in einer Kulturschale mit komplettem RPMI (RPMI mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat und 50 uM β-Mercaptoethanol) . </li><li> Vorbereitung einer Spritze mit 1 ml vollständigem RPMI zu einer 27 G Nadel verbunden. </li><li> Legen Sie die 27 G-Nadel in ein Ende des Oberschenkelknochens oder Tibia. Spülen Sie das Knochenmark aus dem Femur oder Tibia durch leichtes Einspritzen des kompletten RPMI in den Knochen. Stellen Sie sicher, dass Knochenmarkzellen werden aus dem Knochen entfernt, dies kann durch visuelles Erfassen vertrieben Medien, die trüb erscheint geführt werden. </li><li> Wiederholen Spülung jeweils Femur und Tibia 3x gründlich zu entfernen, Knochenmarkszellen. </li><li> Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension durch vorsichtiges Pipettieren Zellen nach oben und unten 3-5x in der Kulturschale. </li><li> Entfernen Sie Schmutz, indem die Knochenmarkszellen durch ein 40 uM Zellsieb, indem die Zellen ausgeschieden in eine neue culturE Gericht. Stören keine Zellklumpen, die auf dem Sieb durch sanften Druck mit dem Ende einer sterilen Spritzenkolben angezeigt. </li><li> Lyse der roten Blutzellen (RBC) an der Gesamtknochenmarkzellsuspension mit kommerziellen RBC Lyse-Puffer pro Anweisungen des Herstellers vor. Verwenden 2 ml RBC-Lyse buffer/4-6 x 10 7 Zellen (Zellen aus generell eine Maus) und einer Inkubationszeit von 5 min bei RT. </li><li> Waschen der Knochenmarkzellen durch Pelletieren Zellen durch Zentrifugation für 4 min bei 500 xg, sanft Absaugen des Kulturmediums resuspendiert in 10 ml FACS-Puffer (1 × PBS + 2 mM EDTA + 1% FBS), Pelletierung Zellen durch Zentrifugation und Absaugen von Wasch sanft Puffer. </li><li> Wiederholen des Wasch, wie in Schritt 2.13 beschrieben, für insgesamt 2 Wäschen. </li></ol> 3. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) zu isolieren CDPs Dieser Schritt erfordert Zugang zu einem MidiMACS Zellseparator und MACS LD Spalten für eine anfängliche negative Selektionsverfahren,sowie eine FACS-Maschine mit mindestens 3, um die Mehrfarben-Laser-Vorläufermenge nach Färbung mit fluoreszenz konjugierten Antikörper zu reinigen. <ol><li> Nach dem zweiten Waschen in Schritt 2.14, zählen die Knochenmarkszellen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation in Schritt 2.13 beschrieben und resuspendieren in FACS-Puffer auf eine Endkonzentration von 4 x 10 7 Zellen pro 30 &amp;mgr; l FACS-Puffer zu erreichen. </li><li> Um Zellen für die FACS vorbereitet werden liniennegativen Zellen zuerst durch eine negative Selektionstechnik, die Linie-positiven Zellen aus dem Knochenmark Mischung mit magnetischen Kügelchen Säulenchromatographie entfernt angereichert. Für die negative Selektionsverfahren, fügen 1 ug jeder der folgenden Handels Ratte-Anti-Maus-Antikörper (Abs), die hämatopoetischen Linie Marker erkennen: CD3, CD19, CD11c, CD11b und Ter-119 Abs. Das ABS ist in einem Volumen von 2 ul / Ab zu den 30 &amp;mgr; l Zellsuspension in FACS-Puffer zugegeben werden. </li><li> Inkubieren der Zellsuspension bei 4 ° C für 30Minute Nach der Inkubation wurden die Zellen werden zweimal mit 10 ml FACS-Puffer, wie in Schritt 2.13 beschrieben. </li><li> Die Zellen in einer Endkonzentration von 4 × 10 7 Zellen/40 &amp;mgr; l FACS-Puffer zu erreichen. In 20 ul Ziege-anti-Ratte-IgG magnetischen Mikrokügelchen pro jeweils 40 ul Zellsuspension. Vorsichtig mischen und Inkubieren bei 4 ° C für 30 min. Waschen der Zellen mit 10 ml FACS-Puffer, wie in Schritt 2.13 beschrieben. </li><li> Resuspendieren bis 10 8 Knochenmarkzellen in 500 &amp;mgr; l FACS-Puffer. </li><li> Legen Sie eine MACS LD Spalte auf eine Zelle MidiMACS Trenn pro Anweisungen des Herstellers und Vorspülen der Säule mit 2 ml FACS-Puffer. </li><li> Gelten die Knochenmarkszellsuspension auf die Säule geladen bis 5 x 10 8 Zellen in 2,5 ml FACS-Puffer. Achten Sie auf eine Sammelröhrchen (15 ml konischen Röhrchen) wird unter der Spalte platziert. Die Säule 3x mit 2 ml FACS-Puffer / Waschanlage, und sammeln Sie die Zellen, die durch die Säule, die angereichert werden vergehenLineage-negativen Zellen. Zählen Sie die Zellen, die in dem Material eluiert (Wash-Through) von der Säule. </li><li> Um eine positive Selektion von hämatopoetischen Vorläufermengen durch FACS zuführen, Flecken Zellen mit dem folgenden fluoreszenz konjugierten Abs: IL-7R (Pacific Blue), Flt3-(PE), Sca-1 (PE.Cy7), CD115 (APC), c-kit (APC.Cy7) Abs, sowie eine Mischung von Linienmarker Abs gegen CD3, CD19, CD11c, CD11b, F4/80 und TER119 (alle mit PerCP Cy5.5 markiert) gerichtet ist. Verwenden 0,5-1 ul jeder Ab in einem Gesamtvolumen von 100 ul. Inkubieren Zellsuspension bei 4 ° C für 20-30 min. </li><li> Waschen der Zellen in einer Konzentration von 2-3 x 10 7 Zellen / ml wie in Schritt 2.13 und resuspendieren in FACS-Puffer angegeben. Filter-Zellen durch ein 35 uM Zellsieb Kappe Rohr Zellklumpen zu entfernen. Dieser letzte Schritt ist entscheidend, um ein Verstopfen zu vermeiden, die FACS-Maschine. </li><li> Legen Sie die Zellsuspension in einem FACS-Röhrchen auf der Bühne und sortieren FACS CDPs (lin - c-kit-lo CD115 + Flt3 +) auf derGrundlage der angegebenen Markerprofil. Sammeln gereinigten Zellen in einem 15 ml Röhrchen mit 5 ml vollständigem RPMI. </li><li> Erfassen die absolute Anzahl der sortierten Zellen am Ende der FACS laufen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation in Schritt 2.13 und Resuspension in sterilem PBS für die adoptive Transferexperimente gezeigt. </li></ol> 4. Adoptiven Transfer von CDP Dieser Schritt wird typischerweise in der Tierhaltung, wo die Empfänger-Mäuse untergebracht sind, durchgeführt. Abhängig von der Lage des FACS-Maschine kann es Transport der gereinigten Vorläuferzellpopulationen in der Tierhaltung vor adoptive Übertragung beinhalten. Vorläuferzellsuspensionen sollten steril gehalten und auf Eis transportiert werden. <ol><li> Zellsuspensionen herzustellen Injektions durch Verdünnen von 10 5 gereinigte CDPs in einem Gesamtvolumen von 100 &amp;mgr; l steriler PBS. Zeigen Zellsuspension in einer Spritze zu einer 27 G Nadel. </li><li> Setzen Sie die Empfänger IFNAR - / - </sup&gt; Mäuse (CD45.2 +) zu einer Wärmelampe für 5-10 min auf effiziente Injektion über die Schwanzvene zu erreichen. </li><li> Legen Sie die Maus in einem Rückhalteeinrichtung und zu desinfizieren sein Schwanz mit 70% Ethanol. </li><li> Inject 10 5 FACS-gereinigte CDPs in 100 ul PBS in die Schwanzvene mit einer 27 G-Nadel. </li><li> Überwachung der Mäuse 15-30 min, um sicherzustellen, gibt es keine nachteiligen Auswirkungen der Injektion in die Schwanzvene. Zurück Mäusen zu Wohnmöglichkeiten. </li></ol> 5. Isolierung von PP und Messung der pDC Beträge <ol><li> Bei 7-10 Tage nach Adoptivtransfer, einschläfern die Empfängermäuse. Öffnen Sie vorsichtig die Maus durch Dissektion und setzen den Darm. </li><li> Entfernen Sie den gesamten Darm und legen Sie es auf PBS-getränkten Papierhandtücher. Sammeln Sie alle sichtbar PPs entlang der Wand des Dünndarms mit einer feinen Pinzette und Schere. C57BL6 und IFNAR - / - Mäuse haben in der Regel 5-10 PP / Maus, die sich von isolierten lymphatischen Follikel gefunden werden, sindentlang des Dünndarms 18. Beachten Sie, dass die PPs sind oft strukturell sogar innerhalb einer einzigen Maus, so sorgfältig sicherzustellen, dass alle PPs werden identifiziert und seziert. </li><li> Zeigen PPs in eine Petrischale mit PBS, und verwenden Pinzette Kot zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal zu reinigen PPs. </li><li> Digest PPs mit 1 mg / ml Collagenase IV in 10 ml 1x Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) in einem 50-ml-Kolben unter kräftigem Rühren für 1 h bei 37 ° C. </li><li> Legen Sie das verdaut PP im oberen Fach eines 40 um Zellsieb und Kraftzellen durch Sieb mit einer sterilen Spritzenkolben. Sammeln Sie die PP-Zellsuspension in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Pellet gespannten PP Zellen durch Zentrifugation bei 500 xg für 5 Minuten und Resuspendieren in 6 ml 37% Percoll-Lösung (37% Percoll in RPMI Medium). Sanft Ort 6 ml 70% Percoll-Lösung (70% Percoll in RPMI-Medium) unterhalb der Zellsuspension, um eine Percoll Stufengradienten bilden. </li><li> Zentrifuge Zellen für 20 min einT 800 xg mit der Zentrifugen abbrechen. Mononuklearen Zellen werden dem 37/70%-Schnittstelle migrieren. Nach der Zentrifugation sollte die einkernigen Zellpopulation durch Pipettieren vorsichtig an der Schnittstelle Region gesammelt werden. Pellet durch Zentrifugation gesammelt und zweimal waschen Zellen in 50 ml RPMI / Waschgang. Ein großes Volumen wird verwendet, um die vollständige Entfernung Percoll gewährleisten. </li><li> Färben Sie die gesammelten PP-Zellen mit den folgenden Antikörpern gegen murine pDCs, die von den adoptiv übertragen Vorfahren (CD45.1 +) oder Empfängermäusen (CD45.2 +) ableiten zu erkennen: CD45.1 (APC.Cy7), CD45.2 (PE . Cy7), CD11c (Pacific Blue), CD11b (PerCP Cy5.5), B220 (APC), Siglec-H (PE) und PDCA-1 (FITC) Abs. Führen Durchflusszytometrie Analyse der PP-Zellen wie in den Schritten 3.9 und 3.10 angegeben. Identifizieren pDCs durch ihre CD11c + CD11b - B220 + Siglec-H + PDCA-1 +-Phänotyp. PDCs% x: Absolute pDC Zahlen können durch die folgende Gleichung bestimmt werdental PP-Zellzahl = PP pDCs. </li></ol>

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Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die beschriebene Adoptivtransfertechnik hier beurteilt den Beitrag der CDP auf die PP pDC Bevölkerung in Empfängermäuse, die einen Mangel an PP pDCs sind (zB IFNAR - / - Mäuse). In zukünftigen Experimenten wird es wichtig sein, das Potenzial der anderen Vorläuferuntermengen bei der Erzeugung von PP pDCs bewerten, insbesondere darüber, ob PP pDCs von Flt3 + CLP abzuleiten. Diese Frage ist von Bedeutung, da es unklar bleibt, warum PP pDCs sind eindeutig empfindlich auf IFNAR-STAT1 Signale fü...

Hier zeigen wir ein Protokoll zu prüfen, ob gemeinsame dendritischen Vorläuferzellen (CDP) sind in der Lage, aus der die plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDC) Bevölkerung in Peyer-Plaques (PP). Das übergeordnete Ziel der Verwendung dieser Methode war es, die Entwicklungsregulation von pDCs in Peyer-Plaques (PP pDCs) zu bewerten. Der Grund, warum dies wichtig ist, dass PP pDCs unterscheiden sich von pDCs in anderen Geweben, wie Knochenmark, Blut und Milz gefunden, und daher ist es unklar, ob PP pDCs pDC und andere Populationen sind entwicklungspolitisch und / oder funktionell verwandten. Insbesondere werden häufig für pDCs wobei der Haupt Typ I Interferon (IFN) Produzenten innerhalb der blutbildenden Systems, der Reaktion auf Toll-like Rezeptor 7 und 9 (TLR7 / 9) Stimulation durch schnelle IFN-Sekretion 3.1 bekannt. Allerdings sind PP pDCs mangelhaft in der Herstellung von Typ I IFN Antwort auf TLR-Agonisten-Stimulation 4,5. Darüber hinaus PP pDCs auch aus pDCs im Knochenmark und Milz gefunden unterscheidenSignale vom Typ I erfordert Interferon (IFN)-Rezeptor (IFNAR1) oder der IFN-Signalmolekül STAT1 für ihre Entwicklung und / oder Akkumulation 5. Diese Daten haben die Möglichkeit, dass verschiedene Regulationsmechanismen steuern PP pDCs gegen pDCs in anderen Organen (zB Knochenmark, Milz) 5 vorgeschlagen. Die Gründe, die zur Entwicklung dieser Methode führte, wurde über die jüngsten Fortschritte im Verständnis von dendritischen Zellen (DC)-Biologie. Die meisten, wenn nicht alle, abzuleiten DC Subsets von hämatopoetischen Vorläuferzellen, die das FMS-ähnliche Tyrosinkinase 3-Rezeptor (Flt3) 6-10 exprimieren, allerdings wird die DC-Entwicklung nicht zu den klassischen myeloiden und lymphoiden Wege beschränkt. Zum Beispiel Flt3 + gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen (CMPs, lin - IL-7R - Sca-1 - c-kit + CD34 + FcyR lo / -) Anlass zu CDPs (lin - c-kit + Flt3 lo CD115 +), which weiter zu differenzieren in pDCs und konventionelle DCs (cDCs) 9,10. Dagegen Flt3 + gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen (CLP, lin - IL-7R + Sca-1 lo lo c-kit) entwickeln in erster Linie in pDCs 11. Deshalb vor pDCs Studien zeigen, ergeben sich aus mindestens 2 verschiedene hämatopoetische Vorläuferpopulationen unter der Regulierung der Flt3L, obwohl der typische Analyse wurde dem Knochenmark, Milz und / oder Blut pDC Teilmengen eingeschränkt. Somit ist die Vorläufer-Population (n), PP pDCs erzeugt Untersuchung erforderlich. Das Verständnis der Ursprünge der PP pDCs wird Licht auf, ob sie gemeinsame Entwicklungswege mit anderen Populationen pDC Schuppen, oder nutzen verschiedene Mechanismen während ihrer Generation in PP. Ein einzigartiger Vorteil des hier beschriebenen Ansatz ist die Verwendung von Mäusen, die einen schweren Mangel im PP pDCs als Empfänger für den adoptiven Transfer von hämatopoetischen Vorläuferzellen zeigen. Mäuse, die mit Gen-tic Deletion im Gen für IFNAR1 (IFNAR - / - Mäuse) oder STAT1 (Stat1 - / -) zeigte eine auffallende Abbau in PP pDCs 5. Daher sind diese Stämme eine Umgebung, in der PP pDCs reduziert werden, so dass die adoptive Übertragung Studien, in Abwesenheit von starken Zellablation Regime wie letalen Bestrahlung durchgeführt werden. Eine zusätzliche Festigkeit des hier vorgestellten Verfahrens ist die Verwendung von hydrodynamischen Gentransfer (HGT) erhöhten zirkulierenden Mengen an Flt3L stimulieren. Dies bietet eine kostengünstige Möglichkeit der Flt3L in vivo zu induzieren, gegen Injektion von rekombinanten Proteins. Zahlreiche Studien, einschließlich der in unserem Labor haben HGT verwendet, um Cytokin-Mengen in einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen 5,12,13 induzieren. Die Arbeitsteilung und präzise Immunfunktionen für DCs ist von großem Interesse in der Immunologie. Insbesondere pDCs sind wichtige Mediatoren der oralen Toleranz und systemischen antiviralenReaktionen, aber sie scheinen auch an der Entstehung und Aufrechterhaltung von Autoimmunität und Krebs 14-17 beitragen. Die hier beschriebene Protokoll ermöglicht es den Entwicklungsmechanismen Regel PP pDCs zu mehr vollständig erforscht. Darüber hinaus kann dieses Konzept ermöglichen Studien PP PDC-Funktion zu beurteilen und kann zum Verständnis der Regulation und Funktion von anderen Immun Populationen innerhalb PPs erweitert werden.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J</td><td>JAX</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6. SJL</td><td>JAX</td><td>2014</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Konische Röhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Konische Röhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Sterile chirurgische Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile kleine Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile große Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m cell Sieb</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu; m cell Siebkappe Röhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysing Puffer</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>FACS Puffer</td><td></td><td></td><td>PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, Filter sterilisiert</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17089102</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Worthington</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Ratten-IgG-Mikrokügelchen</td><td>Milteyni Biotec</td><td>130-048-501</td><td></td></tr><tr><td>LD-Säule</td><td>Milteyni Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-D3</td><td>BD Biosciences</td><td>555273</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>553783</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>553308</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-CD11c</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>553799</tr><tr><td>Ratte Anti-Ter119</td><td>BD Biosciences</td><td>553671</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19 (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0193</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0112</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-0114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 ( PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-4801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter119 (PerCP)</td><td>eBiosciences</td><td>45-5921</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sca-1 (PE. Cy7)</td><td>eBiosciences</td><td>25-5981</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD115 (APC)</td><td>eBiosciences</td><td>17-1152</td><td></td></tr><tr><td>Anti-C-Kit (APC. Cy7)&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>47-1171</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IL-7R (Pacific Blue)</td><td>eBiosciences</td><td>48-1271</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLT3 (PE)</td><td>eBiosciences</td><td>12-1351</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45.1 (APC. Cy7)</td><td>BD Biosciences</td><td>560579</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45.2 (PE. Cy7)</td><td>Biolegend</td><td>109830</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Pacific Blue)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-B220 (APC)</td><td>eBiosciences</td><td>25-0452</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (PE)</td><td>eBiosciences</td><td>12-0333</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PDCA-1 (FITC)</td><td>eBiosciences</td><td>Nov-72</td><td></td></tr><tr><td>Zellsortierer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>z.B. BD Fortessa</td></tr><tr><td>Wärmelampe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus Rückhalteapparat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritzen</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td> 27&<td></td></tr><tr><td>frac12; G-Nadeln (steril)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr></tbody></table>

die beurteilung der entwicklung der murine plasmazytoide dendritischen zellen in peyer-patches mit adoptiv Übertragung von hämatopoetischen vorläuferzellen

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Dieses Protokoll Details eine Methode, um die Fähigkeit der gereinigten hämatopoetischen Vorläuferzellen zu plasmazytoiden dendritischen Zellen (PDC) in Darm-Peyer-Plaques (PP) zu erzeugen, zu analysieren. Gemeinsame dendritischen Zellvorläuferzellen (CDPs, lin - c-kit lo CD115 + Flt3 +) wurden aus dem Knochenmark der C57BL/6-Mäuse durch FACS gereinigt und Empfängermäuse, die einen wesentlichen pDC Bevölkerung PP fehlt übertragen, in diesem Fall, IFNAR - / - Mäuse wurden als die Transferempfänger verwendet. In einigen Mäusen wurde die Überexpression der dendritischen Zellwachstumsfaktor Flt3-Ligand (Flt3L) vor der Übertragung von CDPs Adoptivdurchgesetzt, mit hydrodynamischen Gentransfer (HGT) von Flt3L-kodierenden Plasmid. Flt3L Überexpression erweitert DC-Populationen aus übertragen (oder endogenen) hämatopoetischen Vorläuferzellen stammen. Bei 7-10 Tage nach der Vorläufer Transfer wurden pDCs, die von den adoptiv übertragen entstehen aus Vorläuferzellen auf die Empfängerzellen unterschiedenGrundlage der Marker CD45 Expression mit pDCs aus übertragen CDPs als CD45.1 + und CD45.2 + als Empfänger. Die Fähigkeit der CDPs übertragen, um die Bevölkerung in pDC PP zu fördern und an Flt3L reagieren wurde mittels Durchflusszytometrie von PP-Einzelzellsuspensionen aus Empfängermäusen ausgewertet. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um zu testen, ob andere Vorläuferpopulationen der Lage ist, PP pDCs. Darüber hinaus könnte dieser Ansatz verwendet, um die Rolle von Faktoren, die voraussichtlich pDC Entwicklung PP beeinflussen, indem Vorläuferuntermengen mit einem geeigneten Zuschlags, KO oder Überexpression des mutmaßlichen Entwicklungsfaktor und / oder durch Manipulation einer zirkulierenden Cytokine über HGT untersuchen . Dieses Verfahren kann auch die eine Analyse der, wie PP pDCs beeinflussen die Frequenz oder die Funktion anderer Immunteilmengen in PPs. Ein einzigartiges Merkmal dieser Methode ist die Verwendung von IFNAR - / - Mäusen, die stark dezimiert pDCs PP im Vergleich zu Wildtyp-Tieren, so allowi zeigenng Rekonstitution von PP pDCs in Abwesenheit von Störfaktoren Effekte aus tödlichen Bestrahlung.

Unsere Ergebnisse zeigen die Gating-Strategie zur Isolierung von CDPs aus Mausknochenmarkszellen (Abbildung 1), in den Protokollen 2 und 3 beschrieben. CDPs enthalten etwa 0,1% des gesamten Knochenmarkzellen und etwa 4-6 x 10 4 CDPs kann von einer Maus isoliert werden. Bei Adoptivtransfer, unterscheiden CDPs in pDCs und cDCs 10. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51189/51189fig1highre...

Dieses Protokoll beschreibt experimentelle Verfahren, die die Differenzierung von dendritischen Zellen in plasmazytoiden Peyer-Plaques aus gemeinsamen dendritischen Vorläuferzellen zu bewerten, mit Hilfe von Techniken mit FACS-vermittelten Zellisolierung, hydrodynamische Gentransfer und Flow-Analyse von Immunteilmengen in Peyer-Plaques.

Die Beurteilung der Entwicklung der Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen in Peyer-Patches mit Adoptiv Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Das allgemeine Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, die Fähigkeit gereinigter hämatopoetischer Vorläuferzellen zu untersuchen, nach adoptiver Übertragung in den Peyer-Plaques des Darms plasmazytoide dendritische Zellen zu bilden. Dies wird erreicht, indem zunächst eine hydrodynamische Gentransferierung des Plasmids durchgeführt wird, das den Wachstumsfaktor für dendritische Zellen, den FLIT-Dreifachliganden, in Peyer-Plaques mit plasmazytoiden dendritischen Zellen defizienten Mäusen kodiert.Im zweiten Schritt werden gemeinsame dendritische Vorläuferzellen aus Wildtyp-Knochenmark mittels magnetischer Bead-Separation und Flusszytometrie sortiert. Im letzten Schritt werden die Vorläuferzellen durch intravenöse Injektion adoptiv in Pyres-Patch-plasmazytoide dendritische Zellen-defiziente Mäuse übertragen, die zuvor einer hydrodynamischen Gentransferbehandlung unterzogen wurden. Abschließend kann die Population der von donoralen hämatopoetischen Vorläuferzellen abstammenden PI's-Patch-plasmazytoiden dendritischen Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert werden.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Immunologie beantworten, beispielsweise welchen entwicklungsbiologischen Ursprung die plasmazytoiden dendritischen Zellen haben, die sich in den Peyer-Plaques befinden. Obwohl diese Methode Einblicke in den Ursprung der plasmazytoiden dendritischen Zellen der Peyer-Plaques ermöglicht, kann sie auch dazu verwendet werden, zu untersuchen, wie plasmazytoide dendritische Zellen die Lymphozytenpopulationen in diesen Geweben beeinflussen.Zwei Tage vor der adoptiven Übertragung die Blutgefäße von fünf CD45.2-positiven Empfängermäusen mit Knockout des Interferon-alpha-Rezeptors unter einer Wärmelampe fünf bis zehn Minuten lang weiten. Danach jedes Tier in einen Fixierapparat bringen und den Schwanz mit 70 %igem Ethanol desinfizieren. Anschließend mit einer 27-Gauge-Nadel jeweils fünf Mikrogramm Plasmacoating-Liganden und zwei Milliliter sterilem PBS in die Schwanzvene jedes Tieres injizieren.Für die Kontrollkohorte fünf Mikrogramm leeren Vektors injizieren. Nach einer Überwachung der Mäuse von 15 bis 30 Minuten werden sie in ihre Haltungseinrichtung zurückgebracht. Am Tag des Experiments wird der dissektierte Femur und Tibia von 10 kongenen CD 45 1 positiven C 57 black six Mäusen in eine Kulturschale mit komplettem Medium gegeben.Danach eine Kanüle mit 27 Gauge in jedes Knochenende einführen und mit komplettem Medium das Knochenmark dreimal pro Knochen in die Schale spülen. Sicherstellen, dass die Knochenmarkzellen entfernt werden, indem überprüft wird, ob das ausgestoßene Medium trüb erscheint. Eine Einzelzell-Suspension herstellen, indem das Medium im Kulturgefäß sanft drei- bis fünfmal auf- und abpipettiert wird.Entfernen Sie dann die Trümmer, indem Sie die Knochenmarkzellen durch einen 40-Mikrometer-Zellsieb filtern, und lösen Sie eventuelle Zellklumpen auf, indem Sie das Ende eines sterilen Spritzenkolbens vorsichtig auf den Sieb aufsetzen. Zentrifugieren Sie die Zellen auf dem Sieb, entfernen Sie die Überstände und lysieren Sie die roten Blutkörperchen mit zwei Milliliter Lysepuffer pro vier bis sechs mal 10 hoch 7 Zellen für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie anschließend 10 Milliliter FACS-Puffer zu den Knochenmarkzellen hinzu und zentrifugieren Sie vier Minuten bei 500 × g bei Raumtemperatur.Nachdem das Überstandsvolumen vorsichtig abpipettiert wurde, wird das Pellet in 10 Milliliter Fax-Puffer gewaschen. Anschließend färben Sie die Zellen mit Antikörpern, die spezifisch für hämatopoetische Linienmarker erkennend sind, gemäß der Antikörpermarkierung und anschließenden Wäsche. Inkubieren Sie die Zellen mit magnetischen Mikroperlen aus Ziege-anti-Ratte.Während der Inkubation mit Mikroperlen laden Sie eine Max LD-Säule an einen MIDI Max-Zellseparatoren und spülen die Säule vorab mit zwei Milliliter Fax-Puffer. Anschließend platzieren Sie einen 15-Milliliter-Kegelrohr unter die Säule und geben bis zu fünf mal 10 hoch acht Zellen in 2,5 Milliliter Fax-Puffer auf die Säule. Spülen Sie die Säule dreimal mit jeweils zwei Milliliter Fax-Puffer, wobei die durch die Säule hindurchgehenden linienunabhängigen Zellen im 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt werden.Zählen Sie die eluierten Zellen. Danach überführen Sie die Probe nach der Färbung der Zellen mit den geeigneten fluoreszenzmarkierten Antikörpern in ein FACS-Röhrchen, um die gemeinsamen dendritischen Vorläufer anhand des gewünschten Markerprofils zu sortieren. Sammeln Sie die mittels FACS gereinigten Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen, das fünf Milliliter komplettes Medium enthält, und notieren Sie am Ende des FACS-Laufs die absolute Anzahl der sortierten Zellen.Nach dem Zentrifugieren werden die Zellen in einer Konzentration von einer mal 10 hoch fünf der gereinigten gemeinsamen dendritischen Vorläuferzellen pro 100 Mikroliter steriler PBS pro Maus verdünnt und die Zellsuspensionen in jeweils eine Spritze mit 27-Gauge-Nadeln aufgezogen. Anschließend werden die CD45.1-positiven Vorläuferzellen in die Schwanzvene jeder empfängenden CD45.2-positiven Maus mit Knockout des Interferon-alpha-Rezeptors injiziert, wie gerade demonstriert, sieben bis zehn Tage nach der adoptiven Übertragung. Entfernen Sie anschließend die Därme von den mit gemeinsamen dendritischen Zellvorläufern behandelten Mäusen und legen Sie das Gewebe auf mit PBS getränkte Papiertücher.Verwenden Sie dann eine feine Pinzette und Schere, um alle sichtbaren Peyer-Plaques entlang der Wand des Dünndarms zu entnehmen. Beachten Sie, dass die Peyer-Plaques oft bereits innerhalb einer einzelnen Maus strukturell unterschiedlich sein können; achten Sie daher darauf, dass alle Peyer-Plaques identifiziert und präpariert werden. Waschen Sie die isolierten Peyer-Plaques dreimal in einer Petrischale mit PBS, wobei Sie mithilfe der Pinzette den Kot entfernen.Danach die P'S-Patches mit einem Milligramm pro Milliliter Kollagenase IV in 10 Milliliter HBSS in einem 50-Milliliter-Kolben bei 37&nbsp;Grad Celsius unter starker Rühration einwirken lassen. Nach einer Stunde die digerierten PIs-Patches in ein 40-Mikrometer-Zellsieb gießen und die Zellen mit einem sterilen Spritzenstößel in ein 15-Milliliter-Kegelrohr befördern. Nach dem Zentrifugieren der filtrierten Zellsuspension das Pellet in sechs Milliliter 37&nbsp;%per-Call-Lösung resuspendieren und in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführen.Danach vorsichtig sechs Milliliter einer 70 %igen Per-Call-Lösung darunter pipettieren, um einen Per-Call-Stufengradienten zu bilden. Anschließend die Zellen 20 Minuten bei 800 × g und Raumtemperatur ohne Bremse separieren. Danach die Population der mononukleären Zellen an der Phasengrenze sammeln.Nachdem die gesammelten Zellen pelletiert wurden, waschen Sie sie zweimal mit 50 Milliliter komplettem Medium. Anschließend färben Sie sie mit den geeigneten Antikörpern, um den CD 45 1 positiven PYS-Patch nachzuweisen. Plasmazytoide dendritische Zellen, die von den adoptiv übertragenen CD 41 positiven Vorläuferzellen abstammen.Analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie. Die plasmazytoïden dendritischen Zellen können anhand ihres CD11c-positiven, ClecH-positiven, PDCA-1-positiven, B220-positiven, CD11b-negativen Phänotyps identifiziert werden. Bestimmen Sie abschließend die absolute Anzahl der plasmazytoïden dendritischen Zellen mithilfe dieser Gleichung.Diese Dot-Plots zeigen die Gating-Strategie zur Isolierung gemeinsamer dendritischer Vorläuferzellen. Bei Maus-Knochenmarkzellen, wie gerade gezeigt, machen gemeinsame dendritische Vorläuferzellen etwa 0,1 % der gesamten Knochenmarkzellen aus und ungefähr vier- bis sechsmal 10 hoch 4 dieser Zellen können aus einer Maus isoliert werden, um PI-positive plasmazytoide dendritische Zellen mittels Durchflusszytometrie zu identifizieren.Es wird eine anfängliche Gating-Strategie anhand von Forward- und Side-Scatter verwendet, gefolgt vom Gating für CD11c-positive, ClecH-positive Zellen. Mäuse mit Knockout des Interferon-alpha-Rezeptors weisen eine signifikante Verringerung der pDC-artigen plasmazytoiden dendritischen Zellen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen auf. Gemeinsame dendritische Vorläuferzellen differenzieren ebenfalls in konventionelle dendritische Zellen aus.Im Gegensatz zu plasmazytoiden dendritischen Zellen weisen CD11c-positive, ClecH-negative konventionelle dendritische Zellen in beiden Mauslinien – Wildtyp und Knockout – ähnliche Mengen auf. Interferon-alpha-Rezeptor-Knockout-Mäuse bieten daher die Möglichkeit, die Rekonstitution von plasmazytoiden dendritischen Zellen mittels PS-Patch zu untersuchen, ohne die Auswirkungen einer letalen Bestrahlung. Wie gerade gezeigt, führt die adoptive Übertragung von Wildtyp-gemeinsamen dendritischen Vorläuferzellen in Interferon-alpha-Rezeptor-Knockout-Mäuse zu einer Zunahme der PI-S-Patch-plasmazytoide dendritischen Zellen.Außerdem verstärkt die Vorbehandlung mit FL-3-Ligand-Hydrodynamischer Gentransfer die Expansion plasmazelloid dendritischer Zellen in PIS-Patches, was darauf hindeutet, dass übertragene gemeinsame dendritische Vorläuferzellen und möglicherweise endogene FL-3-positive Vorläuferzellen auf den FL-3-Liganden reagieren, indem sie Pyrus-Patch-plasmazelloide dendritische Zellen induzieren. Beide Bedingungen stimulieren auch die Produktion von CD11C-positiven, ClecH-negativen konventionellen dendritischen Zellen, was mit der entwicklungsmäßigen Herkunft konventioneller dendritischer Zellen übereinstimmt. Die plasmazelloiden dendritischen Zellen der PYS-Patches exprimierten traditionelle Marker plasmazelloid dendritischer Zellen, einschließlich ClecH, PDCA-1, B220 und LAC CD11B. Zusätzlich zeigt die Analyse der PYS-Patches von Interferon-alpha-Rezeptor-Knockout-Mäusen, die sowohl FL-3-Ligand-Hydrodynamischen Gentransfer als auch übertragene gemeinsame dendritische Vorläuferzellen erhielten, dass etwa 70 % der plasmazelloiden dendritischen Zellen von donor-abstammenden CD45.1-positiven gemeinsamen dendritischen Vorläuferzellen stammen.Insgesamt zeigen diese Daten, dass die adoptive Übertragung gemeinsamer dendritischer Vorläuferzellen die Population der plasmazytoiden dendritischen Zellen im PIs-Patch als Reaktion auf FL-Drei-Ligand-vermittelte Signale in vivo induziert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man pars-patch-plasmazytoide D-Zellen isoliert und identifiziert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen

Antigen-Präsentation in sekundären lymphatischen Organen durch dendritische Zellen ist entscheidend für die Einleitung des T-Zell-vermittelten adaptive Immunantwort. Hier zeigen wir die Kultur von Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zellen, Aktivierung und Etikettierung für die 2-Photonen-Imaging.

Generierung von Knochenmark murinen dendritischen Zellen für den Einsatz in 2-Photonen-Imaging

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In vitro Erzeugung von plasmozytoiden dendritischen Zellen aus gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen

Es gibt ein wachsendes Interesse für das Verständnis der immunologischen Funktionen von bestimmten Subpopulationen von Zellen in Peyer-Plaques (PP), die primären induktiven Seiten des Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe. Hier beschreiben wir parallele Protokolle zur Herstellung PP Einzelzelle Zubereitungen für die durchflusszytometrische Analyse und PP Kryoschnitten für Immunfärbung.

Isolierung und Immunfärbung Lymphozyten und dendritische Zellen aus Murine Peyer-Plaques

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In-vitro-Erzeugung von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System

Wir berichten unter Verwendung eines Protokolls fluoreszenzaktivierte Zell plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) mit hoher Reinheit aus dem Knochenmark von Lupus-Mäusen anfällig für funktionelle Studien von pDC zu isolieren Sortierung.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

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Entwicklung und Charakterisierung von dendritischen Zellen murinen Tolerogene

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Isolation und Adoptiveltern Übertragung von hohen Salz behandelt Antigen-präsentierende dendritische Zellen

Graft-versus-Host-Krankheit ist eine große Komplikation nach allogenen Knochenmarktransplantation. Dendritische Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Transplantat-versus-Host-Krankheit. Der aktuelle Artikel beschreibt eine neuartige Knochenmarktransplantationsplattform, um die Rolle dendritischer Zellen bei der Entwicklung von Transplantat-versus-Host-Krankheit und dem Transplantat-versus-Leukämie-Effekt zu untersuchen.

Knochenmarktransplantationsplattform zur Untersuchung der Rolle dendritischer Zellen bei Graft-versus-Host-Krankheit

Hier stellen wir ein Protokoll für das Screening potenzieller Transkriptionsfaktoren zur Verfügung, die an der Entwicklung dendritischer Zellen (DC) beteiligt sind, unter Verwendung der lentiviralen Transduktion von shRNA, um stabile Knockdown-Zelllinien für die In-vitro-DC-Differenzierung zu erhalten.

Untersuchung der dendritischen Zellentwicklung durch kurze Haarnadel RNA-vermittelte Gen-Knockdown in einem hämatopoetischen Stamm und Vorläuferzelllinie In vitro

Erfahren Sie, wie hämatopoetische Vorläuferzellen plasmazytoide dendritische Zellen in Peyer-Patches von Mäusen generieren. Diese Methode nutzt adoptive Übertragung und Flt3L-Stimulation zur Analyse der Zellentwicklung in vivo.

Die Beurteilung der Entwicklung der Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen in Peyer-Patches mit Adoptiv Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen (Video) | JoVE Journal

Die Beurteilung der Entwicklung der Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen in Peyer-Patches mit Adoptiv Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen

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