Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Bewegungen des Rachenbogens im sich entwickelnden Zebrafischkopf zu beobachten und zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein transgener Zebrafischembryo in ein anästhetisches Akrostengel eingebettet wird. Der zweite Schritt besteht darin, den in Agarose eingebetteten Embryo in einem Tropfen Methylcellulose auf einen Objektträger zu montieren.

Anschließend wird der Embryo zwischen zwei Objektträgern mit Vakuumfett versiegelt. Letztendlich wird die konfokale Zeitraffermikroskopie verwendet, um Unterschiede zwischen Wildtyp- und mutiertem Zebrafisch und die morphogenetischen Bewegungen der Rachenbögen aufzuzeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber statischen Bildgebungsverfahren besteht darin, dass sie die Entwicklung des Rachenbogens in Echtzeit erfasst, so dass ein Untersucher die Gewebebewegungen, die für die Morphogenese entscheidend sind, direkt beobachten kann.

Um ein Überbrückungsglas herzustellen, kleben Sie Sekundenkleber mit einem Deckglas von 22 x 22 auf jedes Ende eines Deckglases von 24 x 60. Die Mitte frei lassen. Machen Sie Singles für Embryonen, die weniger als einen Tag alt sind.

Verdoppelt sich für Embryonen, die ein bis vier Tage alt sind, oder verdreifacht sich für Embryonen, die fünf Tage oder älter sind. Und für jedes Exemplar verwenden Sie zwei überbrückte Deckgläser. Füllen Sie nun eine 10 Milliliter Spritze mit Hochvakuumfett.

Bereiten Sie ein frisches Anästhetikum in 0,2 % flüssigem Aros vor und halten Sie es in einem 42 Grad Celsius warmen Heizblock. Um die noch nicht geschlüpften transgenen Embryonen manuell zu enthüllen, wird der Corian langsam aufgerissen, bis der Embryo befreit ist. Übertragen Sie nun die beschichteten Embryonen in saubere Medien, die MS 2, 22 und ästhetisch enthalten.

Um ein Überbrückungsglas herzustellen, drücken Sie das Vakuumfett langsam aus der Spritze, so dass eine glatte Endlosraupe entsteht, die an und innerhalb der Brücken und der Kante des Deckglases liegt. Verteilen Sie einen Kreis aus 4 % Methylcellulose in der Mitte des Stegs, um den Slip abzudecken. Wenn der Embryo betäubt ist, ziehen Sie ihn in eine Glaspipette.

Halten Sie die Pipette senkrecht nach oben, damit der Embryo auf den Boden der Flüssigkeit in der Pipette sinken kann. Schieben Sie dann die Pipette in die Agro-Lösung und lassen Sie den Embryo in den Aros fallen, ohne die Flüssigkeit auszustoßen. Ziehe etwas Agro-Lösung und den Embryo in die Pipette.

Stoßen Sie dann den Embryo in einem Tropfen Aro-Lösung aus. Auf der Methylcellulose. Schieben Sie den Embryo nach unten auf die Methylcellulose und richten Sie den Embryo wie gewünscht für die Bildgebung aus, um die Probe zu versiegeln.

Legen Sie einen überbrückten Abdeckschub auf den montierten mit der Vorderseite nach unten. Üben Sie gleichmäßigen Druck auf beide Seiten der Sandwich-Deckgläser aus, bis die Brücken direkten Kontakt haben und die Agros-Falldichtungen an beiden Deckgläsern dichten. Vergewissern Sie sich, dass der Embryo richtig ausgerichtet ist.

Reiben Sie mit einem Holzapplikator über das Glas, um Risse und Lücken in der Vakuumfettgeschwindigkeit auszugleichen. Wischen Sie überschüssiges Fett von den Rändern ab. Aktivieren Sie das Konfokalmikroskop und alle externen Lasergeräte.

Schalten Sie auch den an das konfokale Mikroskop angeschlossenen Computer ein und wählen Sie System starten und die konfokale Bildgebungssoftware. Senken Sie anschließend die Staging-Plattform des Konfokalmikroskops ab und bewegen Sie die Objektive aus der Position. Ersetzen Sie die Standardstufe durch eine elektronisch beheizte Stufe.

Schalten Sie den Regler für die beheizte Stufe ein und stellen Sie die Temperatur auf 29,5 Grad Celsius ein. Legen Sie die montierte Probe auf den beheizten Tisch. Bringen Sie die 20-fach-Objektivlinse in Position und heben Sie die Staging-Plattform an.

Aktivieren Sie dann den sichtbaren Lichtstrahler und zentrieren Sie den Kopf des Embryos im Sichtfeld. Um die Fluoreszenzkanäle zu aktivieren, wählen Sie die zu detektierende Fluoreszenzwellenlänge aus und wählen Sie für jeden Kanal Farbnachschlagetabellen aus. Stellen Sie für jeden Fluoreszenzkanal die Laserintensität auf 10,0 und die Photomultiplier-Spannung zwischen 600 und 700 ein.

Um den Hintergrund zu reduzieren und die gesammelten Fluoreszenzinformationen zu erhöhen, stellen Sie die Mittelwertbildung auf zwei oder vier und die Bittiefe auf 16 Bit ein. Aktivieren Sie den ZS-Stack und die Zeitreihenmodule. Passen Sie die Lochblende bei Bedarf an.

Legen Sie das Zeitintervall und die Länge des Experiments fest. Schalten Sie die Kamera in den Live-Modus. Passen Sie den Fokus an und erhöhen Sie bei Bedarf die Laserintensität.

Um Fluoreszenz zu sehen. Stellen Sie den Digitalzoom auf 0,6 ein, um eine breitere Ansicht zu erhalten. Falls gewünscht.

Positionieren Sie die Bühne so, dass alle interessanten Strukturen sichtbar sind und im Blickfeld Raum für Wachstum ist. Dorsal und anterior fokussieren durch den Embryo bis zur oberen und unteren Grenze der Fluoreszenz. Stellen Sie die erste und letzte Zack-Slice-Position mindestens 100 Mikrometer oder mehr über diese Grenzen hinaus ein.

Legen Sie als Nächstes die Nachschlagetabelle für die Anzeige auf Bereichsindikatoren fest, sodass die fluoreszierenden Strukturen in einem Grauton angezeigt werden und der Rest des Felds blau oder schwarz sein sollte. Erhöhen Sie bei Bedarf die Spannung des Fotomultiplikators auf einen Pegel, der knapp unter dem Wert liegt, an dem gesättigte rote Pixel erscheinen. Wenn fluoreszierende Strukturen rot erscheinen, reduzieren Sie die Laserintensität und/oder die Verstärkung, bis sie einen Grauton annehmen.

Passen Sie ggf. den Versatz an. Bereiche außerhalb der Stichprobe sind also blau. Legen Sie die auf den kleinsten Durchmesser fest, der eine zeitnahe Erfassung von Bildern ermöglicht.

Das Z-Intervall sollte immer auf den empfohlenen optimalen Abstand für den Lochblendendurchmesser eingestellt werden, führen Sie kurze Scans durch, um die Einstellungen zu testen, immer mit der geringstmöglichen Laserintensität. Führen Sie nun das Experiment für die gewünschte Zeit aus. Nehmen Sie anschließend den Embryo aus dem erhitzten Stadium und trennen Sie langsam die Deckgläser, tauchen Sie die Abdeckung, den Slip und den Embryo in eine 30-Millimeter-Petrischale.

Waschen Sie den Embryo vorsichtig mit einer Glaspipette vom Deckglas ab und entfernen Sie das Deckglas aus der Petrischale. Legen Sie den Embryo in einen 28,5 Grad Celsius heißen Inkubator, damit er sich weiter entwickeln kann. Am Ende der Experimente nehmen Sie einzelne Zack-Bilder von Geschwisterembryonen auf, die zu Beginn der Experimente ähnlich wie die Probe inszeniert wurden, aber mit einem EM und einem 28,5 Grad Celsius Inkubator aufgezogen wurden.

Messen Sie die Rachenbögen nach Bedarf mit konfokaler Software oder einer anderen Bildgebungssoftware bei Wildtyp-Embryonen. Nach der Population des Neurokamms verlängern sich die Pharynxbögen entlang der vorderen, posterioren und dorsalen ventralen AEs, während sie sich in rostraler Richtung bewegen. An seinem vorderen Ende bildet der erste Pharynxbogen Oberkiefer- und Unterkieferdomänen, die durch das orale Ektoderm getrennt sind. Morphogenetische Schlüsselbewegungen sind bei geglätteten Mutanten stark gestört.

Hier gelingt es dem siebten Rachenbogen nicht, 48 Stunden nach der Befruchtung mit den vorderen Bögen zu überlappen. Zebrafisch SM fünf Mutanten weisen zahlreiche kraniale Gesichtsdefekte auf. In diesen statischen konfokalen Bildern.

Fusionen in den ventralen Domänen des zweiten und dritten Bogens sind 32 Stunden nach der Befruchtung sichtbar. Mit Hilfe der konfokalen Zeitraffermikroskopie analysieren wir die Morphogenese der Pharynxbögen. In Smad treten die Fusionen zwischen dem zweiten und dritten Bogen der fünf Mutanten erst 32 Stunden nach der Befruchtung auf.

Konsistent mit der statischen Analyse. Während die Expression von PDGF-Familienmitgliedern darauf hindeutet, dass es an der Morphogenese des Pharynxbogens beteiligt sein könnte, scheint die Bewegung der hinteren Bögen normal zu sein. Bei P-D-G-F-R-A-Mutanten scheint die Morphogenese des ersten Rachenbogens spezifisch gestört zu sein.

Dieses Verfahren ist für andere häufig verwendete Zebrafischtechniken wie die Morpho-Injektion oder die Erzeugung genetischer Mosaike geeignet. Zeitrafferanalysen ermöglichen die direkte Analyse der Folgen dieser Manipulationen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zeitraffer-In-vivo-Bildgebung von transgenen Zebrafischembryonen durchführt, indem Proben richtig anästhesiert und montiert und ideale Parameter für die konfokale Mikroskopie eingestellt werden.