Name: Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Erfahren Sie die 4D-konfokale Mikroskopie zur Analyse kraniofazialer Morphogenese in Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von Pharynxbogenbewegungen und liefert wertvolle Einblicke in Entwicklungsprozesse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir danken Melissa Griffin und Jenna Rozacky für ihre Fisch-Experte Pflege. PDM Dank für EGN schriftlich Unterstützung, Großzügigkeit und Geduld. Diese Arbeit wurde von NIH / NIDCR R01DE020884 zu JKE unterstützt.

1. Tierhaltung und Mutant Allele <ol><li> Heben und Zebrafisch zu züchten, wie beschrieben 21. </li><li> Zebrafisch-Mutante Allele in dieser Studie verwendet wurden, waren 16 PDGFRA B1059, B1100 Smad5 22 und 23 smo B577. Quellen für diese Zebrafisch-Stämme schließen ZIRC. </li></ol> 2. Herstellung von Lösungen und Werkzeuge Hinweis: Alle Lösungen und Geräte können im Voraus und für eine spätere Verwendung gespeichert werden. <ol><li> Machen Embryo Medien (EM), wie zuvor beschrieben 21. </li><li> Machen Sie 4 g / L MS-222 (Tricaine). Löse 4 g Natriummonohydrogenphosphat (Na 2 HPO 4) in 450 ml sterilem Wasser. 2 g MS-222 auf die Lösung. PH-Wert auf 7,0 bis 7,2 innerhalb. Hinzufügen sterilem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml. </li><li> Optional: Stellen Sie 4 g / L Nelkenöl. Wiegen 0,2 g reines Nelkenöl in einem 50 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen EM auf ein Gesamtvolumen von 50 ml. Lagern bei 4 ° C </li><li> Machen Sie 3% methylcellulose. Bringt 50 ml EM + 0,1 M HEPES zum Kochen bringen. Vom Herd nehmen. Stir in 1,5 g Methylcellulose, bis die Lösung homogen ist. Lagern bei 4 ° C </li><li> Machen 0,2% Agarose. In 0,1 g Agarose auf 50 ml EM. Bringen EM zum Kochen in der Mikrowelle oder auf einer Heizplatte und überprüfen, dass die Agarose aufgelöst hat. Aliquot in 500 ul-Volumina in Mikrozentrifugenröhrchen und bei 4 ° C Anmerkung: Band kann nach Bedarf eingestellt werden. </li><li> Machen Kapillare Poker. Geben Sie einen Tropfen Superkleber in einem 0,9 mm ID Kapillare. Legen Sie eine 4-5 cm Länge von 6 lb-Test Monofile Angelschnur in der Kapillare, so dass etwa 3-4 mm Linie erstreckt sich über das Ende der Röhre. </li><li> Machen Sie zwei überbrückt Deckgläser pro Probe. Superkleber 22 x 22-1 Deckglas auf jedes Ende eines 24 x 60-1 Deckglas Verlassen der Mitte frei. Machen Sie Singles (1 kleines Deckglas pro Ende) Embryonen für weniger als einen Tag alt, Doppel (2 kleine Deckgläser auf der jeweils anderen pro-Ende) für Embryonen 03.59 days alt, oder Tripel (3 kleine Deckgläser auf der jeweils anderen pro-Ende) für Embryonen fünf Tage oder älter. </li><li> Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit Hochvakuumfett. Hinweis: Vakuumfett dient als Dichtmittel, um eine Dehydratation der Proben über lange Zeiträume hinweg zu verhindern, und hat eine niedrige potentielle Toxizität gegenüber volatiler Dichtstoffe. </li></ol> 3. Montagezebrafischembryonen für konfokale Mikroskopie (Siehe Abbildung 1) <ol><li> Bereiten Betäubung Medium. Schmelzen Sie ein Aliquot 0,2% Agarose durch die Mikrowelle in 20 Sekunden-Intervallen, bis sie vollständig flüssig. Mischen 8 ul MS-222 in 192 ul 0,2% Agarose oder 5 &amp;mgr; l von 4 g / L Nelkenöl in 195 ul 0,2% Agarose. Pflegen Sie in einem 42 ° C Heizblock. Hinweis: Langzeitbelichtung zu MS-222 verursacht stärkere Entwicklungsverzögerungen als Nelkenöl hat in der embryonalen Zebrafisch-24. </li><li> Falls erforderlich: Manuell dechorionate unhatched transgenen Embryos, nur vor der Analyse analysiert werden. Mit einer Pinzette langsam tear das Chorion offen, bis der Embryo wird befreit. </li><li> Anesthetize das Zebrafisch-Embryonen. 1 ml einer 4 g / L Lager von MS-222 bis 24 ml Embryo Medien. Alternativ fügen 390 ul von 4 g / L Nelkenöl auf 24 ml Wasser 24 Fische. Hinweis: Nelkenöl wirkt langsam so mindestens 15-20 min vor Zeitraffer-Mikroskopie führen Sie diesen Schritt. </li><li> Platzieren einer Wulst aus Vakuumfett um die Mittelfläche von einer nach oben gerichteten Deck überbrückt. Langsam schieben Sie den Vakuumfett aus der Spritze, so dass eine glatte, durchgehende Raupe, die neben und innerhalb der Brücken und der Kante der Deckglas ist. </li><li> Verbreiten Sie einen Kreis von 4% Methylcellulose in der Mitte des Brückendeckglas mit einem Holz Applikator. </li><li> Übertragen des Embryos, die abgebildet werden. Wenn der Embryo wird betäubt ziehen Sie es in eine Glaspipette. Halten Sie die Pipette vertikal, damit der Embryo auf der Unterseite der Flüssigkeit in die Pipette zu versenken. Bewegen Sie die Pipette in die Agarose-Lösung und damit der Embryo zu fallenin der Agarose. Sie vertreiben die Flüssigkeit nicht. </li><li> Legen Sie die Probe. Zeichnen Sie eine Agarose-Lösung und den Embryo in die Pipette. Vertreibt den Embryo in einem Tropfen Agarose-Lösung auf der Oberseite der Methylcellulose. Verwenden Sie ein Kapillar-Poker um den Embryo nach unten auf die Methylcellulose schieben und richten den Embryo als für die Bildgebung gewünscht. </li><li> Verschließen Sie die Probe. <ol><li> Legen Sie eine überbrückt Deckglas auf der montierten ein, nach unten zeigt. Bewerben mäßigen Druck auf beiden Seiten der Deckgläser eingeklemmt, bis die Brücken machen den direkten Kontakt und die Agarose-Drop-Dichtungen an beiden Deckgläser. Stellen Sie sicher, dass der Embryo richtig ausgerichtet ist. </li><li> Reiben Sie eine Holz Applikator entlang der Glas zu glätten Risse und Lücken in der Vakuumfett Perle. Überschüssiges Fett von den Rändern. </li></ol></li></ol> 4. Zeitraffer-konfokale Imaging transgener Zebrafischembryonen (Dieses Protokoll wurde für eine Zeiss LSM 710 konfokalen Mikroskop uns optimierting ZEN Imaging Software und kann zur Verwendung mit anderen Systemen modifiziert werden.) <ol><li> Aktivieren Ausrüstung. Schalten Sie den konfokalen Mikroskop und externer Lasergeräte. Einschalten des Computers, um das konfokale Mikroskop verbunden. Offene konfokalen Imaging-Software und wählen Sie &quot;Start System&quot;, um die Bildaufnahme Kontrollen zu aktivieren. </li><li> Bereiten beheizten Bühne. Senken Sie die Testplattform des konfokalen Mikroskops und bewegen Sie die Objektive aus der Position. Ersetzen Sie den Standardstufe mit einer elektronischen beheizten Bühne. Schalten Sie den Controller für das erwärmte Bühne und die Temperatur 29,5 ° C </li><li> Positionieren der Probe in das Blickfeld. Legen Sie die Probe montiert auf der Bühne. Bewegen Sie den 20X Objektiv in Position und heben Sie die Testplattform. Aktivieren Sie den sichtbaren Lichtemitter und schauen durch die Okulare. Zentrieren Sie den Kopf des Embryos in das Blickfeld. </li><li> Definieren Sie die Testeinstellungen. <ol><li> Fluoreszenzkanäle aktivieren, indem Siedie Fluoreszenzwellenlänge erfasst werden, und wählen Farbnachschlagtabellen (LUT) für jeden Kanal. Falls erforderlich, verwenden Sie den manuellen Kontrollen in der Software, um auf die erforderlichen Laser (z. B. 561 nm für RFP) zu drehen. Für jeden Fluoreszenzkanal, stellen Sie die Laserintensität auf 10,0 und die Photomultiplier-Spannung (HV oder Verstärkung) zwischen 600-700. Stellen Sie die Mittelung bis 4 und die Bit-Tiefe auf 16 Bit. </li><li> Aktivieren Sie die Z-Stapel und Zeitreihen-Module. Stellen Sie die Lochblende für eine 5 um oder kleiner Z-Auflösung, und stellen Sie die Z-Intervall auf den vorgeschlagenen optimalen Abstand. Hinweis: Im Allgemeinen erlaubt 5 um Z-Auflösung jedes Bild Z-Stapel, um schnell genug für gesammelt werden eine &quot;Momentaufnahme&quot; des Embryos zu einem bestimmten Zeitpunkt, während auch die Lösung einzelner Zellen. Absenken des Mittel reduziert auch die Menge an Zeit pro Bild. </li><li> Definieren Sie das gewünschte Zeitintervall zwischen den Bildern (in der Regel 10 bis 20 Minuten) und die Gesamtlänge des Experiments. </li></ol></li><li> Stellen Sie PositionsInformationen. <ol><li> Schalten Sie die Kamera, um den Live-Modus. Stellen Sie den Fokus und Laserintensität erhöhen, wenn notwendig, um die Fluoreszenz zu sehen. Stellen Sie den digitalen Zoom bis 0,6 für eine größere Ansicht, wenn gewünscht. </li><li> Positionieren Sie die Bühne, so dass alle interessierenden Strukturen sichtbar sind und es gibt Platz im Sichtfeld für Auswuchs dorsal und ventral. Konzentrieren durch den Embryo an den oberen und unteren Grenzen der Fluoreszenz. Einstellen der ersten und der letzten Z-Stapel-Schichtpositionen mindestens 100 &amp;mgr; m oder mehr über diese Grenzen hinaus. </li></ol></li><li> Optimieren Fluoreszenzintensität. <ol><li> Stellen Sie die Display-Anzeige LUT zu reichen. Leuchtstoff-Strukturen sollte jetzt weiß, und der Rest des Sichtfeldes sollte blau (keine Erkennung) oder schwarz sein. </li><li> Steigern HV / Gewinn auf ein Niveau knapp unter dem gesättigten (rot) Pixel angezeigt. Falls erforderlich, versetzt, so eine Mehrheit der Hintergrund wird nicht erkannt (blau). Hinweis: Kleinere Lochblendendurchmesser und höhere Laserintensität sowohl Verbesserung der Bild definition, aber Laserintensität muss niedrig gehalten werden, um lebende Gewebe zu bewahren. Erhöhte HV / Gewinn-und Lochblendendurchmesser (&lt;5 um) sind in der Regel vorzuziehen, erhöhte Laserintensität. </li><li> Halten Sie den Lochblendendurchmesser breit genug, um Bilder in einer zeitgemäßen Weise zu sammeln, durchschnittlich bis 4 Sätze. Die Z-Intervall sollte immer auf die vorgeschlagenen optimalen Abstand für den Lochblendendurchmesser eingestellt werden. Führen kurzen Scans (Mittelwertbildung = 1) mit verschiedenen Einstellungen, und verwenden Sie die minimale Laserintensität, die gewünschte Auflösung erreicht. </li></ol></li><li> Abwicklung des Versuchs für die gewünschte Zeitdauer. Danach entfernen Embryo von der beheizten Bühne und trennt langsam die Deckgläser. Tauchen Sie das Deckglas und Embryo im EM in einer 30 mm Petrischale. Mit einer Glaspipette vorsichtig waschen, den Embryo aus der Deckglas und entfernen Sie das Deckglas aus der Petrischale. Setzen Sie den Embryo in eine 28,5 ° C Inkubator weiter zu entwickeln. </li><li> Wachstum vergleichen. Am Ende des Experiments, nehmen einzelne ZsKlebrigkeit Bilder Agarose montierten Geschwister Embryonen, die ähnlich zu den Proben zu Beginn des Versuchs aufgeführt wurden, wurden aber in EM in einem 28,5 ° C-Inkubator angehoben. </li><li> Messen Sie Schlundbögen, wie gebraucht. Die Messungen können in einigen konfokalen Software-Suiten durchgeführt werden. Die Messungen wurden hier durch Import und Z-ragt. Lsm-Dateien der einzelnen Frames unter Verwendung Fiji25. </li></ol>

<ol><li>Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+plasticity+of+neural+crest+cells+and+their+roles+in+jaw+and+craniofacial+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution.</a> Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).</li>
<li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133, 1069-1077 (2006).</li>
<li>Wada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li>
<li>Roessler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+human+sonic+hedgehog+gene+cause+holoprosencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly.</a> Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).</li>
<li>Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+in+the+neural+crest+cells+regulates+the+patterning+and+growth+of+facial+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia.</a> Genes Dev. 18, 937-951 (2004).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SHH-responsive+signaling+center+in+the+forebrain+regulates+craniofacial+morphogenesis+via+the+facial+ectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm.</a> Development. 136, 107-116 (2009).</li>
<li>Cordero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+perturbations+in+sonic+hedgehog+signaling+elicit+the+spectrum+of+holoprosencephaly+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes.</a> J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).</li>
<li>Westphal, H., Beachyr, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclopia+and+defective+axial+patterning+in+mice+lacking+Sonic+hedgehog+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function.</a> Nature. 383, 3(1996).</li>
<li>Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+Sonic+hedgehog+along+the+anterior-posterior+axis+regulates+patterning+of+pharyngeal+pouch+endoderm+and+pharyngeal+endoderm-derived+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs.</a> Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).</li>
<li>Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hh+signaling+regulates+patterning+and+morphogenesis+of+the+pharyngeal+arch-derived+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton.</a> Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).</li>
<li>Balczerski, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Sphingosine-1-phosphate+signaling+mutants+reveals+endodermal+requirements+for+the+growth+but+not+dorsoventral+patterning+of+jaw+skeletal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors.</a> Dev. Biol. , (2011).</li>
<li>Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signalling+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">BMP signalling in craniofacial development.</a> Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).</li>
<li>Alexander, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+roles+for+BMPs+and+Endothelin+1+in+patterning+the+dorsal-ventral+axis+of+the+craniofacial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton.</a> Development. 138, 5135-5146 (2011).</li>
<li>Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gremlin+2+regulates+distinct+roles+of+BMP+and+Endothelin+1+signaling+in+dorsoventral+patterning+of+the+facial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton.</a> Development. 138, 5147-5156 (2011).</li>
<li>Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+a+palatogenic+gene+program+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Examination of a palatogenic gene program in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).</li>
<li>Eberhart, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Mirn140+modulates+Pdgf+signaling+during+palatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis.</a> Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PDGF+alpha+receptor+is+required+for+neural+crest+cell+development+and+for+normal+patterning+of+the+somites%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites.</a> Development. 124, 2691-2700 (1997).</li>
<li>Tallquist, M. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+autonomous+requirement+for+PDGFRalpha+in+populations+of+cranial+and+cardiac+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells.</a> Development. 130, 507-518 (2003).</li>
<li>Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+PDGF+A+and+PDGFR+alpha+mRNA+in+Xenopus+embryos+suggests+signalling+from+neural+ectoderm+and+pharyngeal+endoderm+to+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells.</a> Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).</li>
<li>Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor+A+%28pdgf-a%29+expression+during+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development.</a> Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3B+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%22">The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio)</a>. , (1993).</li>
<li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp+and+Shh+Signaling+Mediate+the+Expression+of+satb2+in+the+Pharyngeal+Arches%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches.</a> PloS one. 8, e59533(2013).</li>
<li>Varga, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+smoothened+functions+in+ventral+neural+tube+specification+and+axon+tract+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation.</a> Development. 128, 3497-3509 (2001).</li>
<li>Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+clove+oil+as+an+anesthetic+for+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio.</a> 1, 46-53 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+Fgfs+in+endodermal+pouch+formation+influences+later+craniofacial+skeletal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning.</a> Development. 131, 5703-5716 (2004).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derive+from+the+more+apical+daughter+in+asymmetric+divisions+in+the+zebrafish+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube.</a> Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Zeitraffer-konfokale Mikroskopie ist ein mächtiges Werkzeug für die Analyse der Entwicklung. Hier zeigen wir, Nützlichkeit der Methode bei der Untersuchung Pharyngealbogen Morphogenese in Zebrafisch-Mutante, die für wichtige Signalwege, die mit einem transgenen Neuralleistenzellen Etiketten sind. Neben Gewebe-Ebene analysiert, Zeitraffer Analysen sind auch auf zellulärer Ebene zu einem 28-Analysen. Viele verbreitete Zebrafisch Verfahren können auch in Zeitraffer-Mikroskopie Experimente, einschließlich Mikroin...

Kraniofazialen Morphogenese ist ein komplexes mehrstufiges Verfahren, die koordinierte Wechselwirkungen zwischen mehreren Zelltypen erfordert. Die Mehrheit der kraniofazialen Skelett aus Neuralleistenzellen stammen, müssen von denen viele aus dem dorsalen Neuralrohr in transienten Strukturen genannt Pharyngealbögen 1 migrieren. Wie bei vielen Geweben ist Morphogenese des kraniofazialen Skeletts komplizierter, als durch statische Bilder von Embryonen in bestimmten Entwicklungszeitpunkten zu verstehen. Obwohl es zeitaufwendig durchzuführen, stellt in vivo Zeitraffermikroskopie einen kontinuierlichen Blick auf Zellen und Gewebe eines sich entwickelnden Embryos. Jedes Bild in einem Zeitraffer-Serie verleiht Kontext zu den anderen, und hilft, einen Ermittler bewegen sich abzuleiten, warum ein Phänomen tritt nicht abzuleiten, was zu dieser Zeit auftreten. In-vivo-Bildgebung ist somit ein leistungsfähiges Werkzeug für die experimentelle deskriptive Ansätze zurdekonstruieren die Wege, die Morphogenese zu führen. Der Zebrafisch Danio rerio ist eine beliebte genetische Modell für die Wirbel embryonalen Entwicklung und ist besonders gut für die in vivo-Abbildung von Morphogenese geeignet. Moderne, bequeme Methoden zur Transgenese und genomische Modifikation schnell voran die Anzahl der Werkzeuge zur Verfügung, Zebrafisch-Forscher. Diese Tools verbessern bereits robuste Methoden zur genetischen Manipulation und Mikroskopie. In-vivo-Bildgebung von fast jedem Gewebe in fast jeder gewünschten genetischen Zusammenhang ist näher an der Realität als Phantasie. Morphogenetischen Bewegungen der Schlundbögen werden durch Signal Wechselwirkungen zwischen der Neuralleiste und dem benachbarten Epithelien, sowohl Ektoderm und Entoderm geführt. Es gibt zahlreiche Signalmoleküle durch die Epithelien exprimiert, die notwendig sind, um die Morphogenese der Gesichtsschädelskelettelemente fahren. Unter diesen Signalmoleküle, Sonic Hedgehog (Shh) ist von entscheidender Bedeutung foder kraniofazialen Entwicklung 8.2. Shh wird sowohl durch die orale Ektoderm und Entoderm Rachen 2,6,9,10 ausgedrückt. Die Expression von Shh im Endoderm regelt morphogenetischen Bewegungen der Bögen 10, Strukturierung Neuralleiste in den Bögen 10, und das Wachstum des Gesichtsschädelskelett 11. BMP-Signal ist auch für die kraniofaziale Entwicklung 12 von entscheidender Bedeutung und kann Morphogenese der Schlundbögen ändern. Bmp Signalweg reguliert dorsalen / ventralen Musterbildung im Wappen der Schlundbögen 13,14. Störung der Smad5 im Zebrafisch führt zu schweren Gaumendefekte und ein Ausfall des Meckel-Knorpel, angemessen an der Mittellinie 15 zu verschmelzen. Darüber hinaus sind die Mutanten und Fusions Reduktionen in den ventralen Knorpelelemente mit der 2., 3., 4. und manchmal Pharyngealbogen Elemente an der Mittellinie 15 verschmolzen zeigen auch. Diese Fusionen stark vermuten, dass BMP-Signal leitet die Morphogenese dieser Rachen-Elemente. PDGF-Signalisierung ist für kraniofaziale Entwicklung notwendig, hat unbekannte Rollen in Pharyngealbogen Morphogenese aber. Sowohl Maus und Zebrafisch-Mutanten PDGFRA haben tiefgreifende Mittelgesichts clefting 16-18. Zumindest in dieser Zebrafisch Mittelgesichtsspaltbildung ist aufgrund eines Fehlers der richtigen Neuralleiste Zellmigration 16. Neuralleistenzellen weiterhin PDGFRA äußern, nachdem sie die Schlundbögen eingetragen. Zusätzlich werden PDGF-Liganden durch Gesichts Epithelien exprimiert und in den Kiemenbögen 16,19,20, damit PDGF-Signal könnte auch in der Morphogenese der Schlundbögen nach der Migration eine Rolle spielen. Allerdings Analysen der Morphogenese der Schlundbögen in PDGFRA Mutanten wurden nicht durchgeführt. In vivo-Konfokalmikroskopie pharyngul Hier zeigen wir,a-Phase transgenen Zebrafisch und beschreiben Sie die Morphogenese der Schlundbögen innerhalb dieses Zeitraums. Wir zeigen weiter, Gewebe Verhaltensweisen, die durch Mutationen, die die Bmp, PDGF, Shh und Signalwege zu stören betroffen sind.

<table><tbody><tr><td>6 lb Test monofile Schnur</td><td>Cortland Line Company</td><td>SLB16</td><td></td></tr><tr><td>Agarose I</td><td>Amresco</td><td>0710</td><td></td></tr><tr><td>Argonlaser</td><td>LASOS Lasertechnik GmbH</td><td>LGN 3001</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarschlauch, 100 mm, 0,9 mm ID</td><td>FHC</td><td>30-31-0</td><td></td></tr><tr><td>Nelkenöl</td><td>Hilltech Kanada, Inc.</td><td>HB-102</td><td></td></tr><tr><td>Hochvakuumfett</td><td>Dow Corning</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Trockenbad-Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>2050FS</td><td></td></tr><tr><td>Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas, 22 x 22-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas, 24 x 60-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-11321</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-11624</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>TempController 2000-2</td><td>PeCon GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyse craniofacial morphogenese in zebrafisch mit 4d konfokale mikroskopie

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Zeitraffer-Bildgebung ist eine Technik, die für die direkte Beobachtung des Prozesses der Morphogenese ermöglicht, oder die Erzeugung der Form. Durch ihre optische Klarheit und Zugänglichkeit für genetische Manipulation hat der Zebrafisch-Embryos zu einem beliebten Modellorganismus, mit der Zeitraffer-Analyse der Morphogenese in lebenden Embryonen durchzuführen. Konfokale Bildgebung eines lebenden Zebrafischembryo erfordert, dass ein Gewebe von Interesse ist, die dauerhaft mit einem fluoreszierenden Marker markiert ist, wie einem Transgen oder Farbstoff injiziert. Der Prozess verlangt, dass der Embryo wird betäubt und an Ort und Stelle in einer Weise, dass eine gesunde Entwicklung normal verläuft statt. Parameter für die Bildgebung muss auf für dreidimensionale Wachstum Rechnung zu tragen und die Anforderungen der einzelnen Zellen zu lösen, während sich schnelle Schnappschüsse der Entwicklung auszugleichen. Unsere Ergebnisse zeigen die Fähigkeit, langfristige In-vivo-Bildgebung von Fluoreszenz-markierten Zebrafisch-Embryonen durchzuführen und abwechslungsreiches Gewebe Verhaltensweisen erkennendie Schädel Neuralleiste, die kraniofaziale Anomalien verursachen. Entwicklungsverzögerungen, die durch Anästhesie und Montage verursacht werden, sind minimal, und Embryonen sind unversehrt durch den Prozess. Time-lapse abgebildet Embryonen zu flüssigen Medium bei später Punkte in der Entwicklung zurückgebracht werden und anschließend abgebildet oder fixiert. Mit einer zunehmenden Fülle von transgenen Zebrafischlinien und gut charakterisierten Schicksal Mapping-und Transplantationstechniken, Imaging ist eine beliebige Gewebe möglich. Als solche Zeitraffer-in-vivo-Bildgebung kombiniert kraftvoll mit Zebrafisch-genetischer Methoden, einschließlich der Analyse von Mutanten und mikroinjizierten Embryonen.

In Wildtyp-Embryonen nach Neuralleiste Bevölkerung, länglichen die Schlundbögen entlang der anterior / posterior und dorsal / ventral Achsen während der Bewegung in einer Richtung rostral (Film 1). Bei 30 Stunden nach der Befruchtung (HPF) ist die vordere / hintere Länge des ersten Schlundbogen zwischen 1,8 bis 1,9-fache seiner dorsalen / ventralen Höhe. Rücken / Bauchdehnung schreitet stetig schneller als vorderen / hinteren Verlängerung bis 36,5 hpf. Von hier aus dorsal / ventrale Höhenplateaus rund 1...

Zeitraffer-konfokale Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik zur Charakterisierung der embryonalen Entwicklung. Hier beschreiben wir die Methodik und zu charakterisieren kraniofazialen Morphogenese in Wildtyp-als auch PDGFRA, Smad5 und SMO mutierten Embryonen.

Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Bewegungen der Pharyngealbögen im sich entwickelnden Kopf von Zebrafischen zu beobachten und zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein transgener Zebrafischembryo in anästhetisierendem Agarosegel eingebettet wird. Der zweite Schritt besteht darin, den in Agarose eingebetteten Embryo in einem Tropfen Methylcellulose auf einem Objektträger zu montieren.Anschließend wird das Embryo mit Vakuumfett zwischen zwei Objektträgern versiegelt. Letztendlich kommt die zeitraffende konfokale Mikroskopie zum Einsatz, um Unterschiede zwischen Wildtyp- und Mutanten-Zebrafischen sowie die morphogenetischen Bewegungen der pharyngealen Bögen darzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber statischen Abbildungsmethoden liegt darin, dass sie die Entwicklung der pharyngealen Bögen in Echtzeit erfasst und es dem Forscher ermöglicht, die für die Morphogenese entscheidenden Gewebebewegungen direkt zu beobachten.Um eine überbrückte Deckglasabdeckung herzustellen, kleben Sie mit Sekundenkleber ein 22 mal 22 großes Deckglas an jedes Ende eines 24 mal 60 großen Deckglases, wobei die Mitte frei bleibt. Stellen Sie Einzelabdecku

analyzing-craniofacial-morphogenesis-zebrafish-using-4d-confocal

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

Imaging von zerebrovaskulären Entwicklung in Zebrafisch-Larven beschrieben. Techniken zur 3D-Bildgebung zu erleichtern und zu ändern zerebrovaskuläre Entwicklung mit chemischen Behandlungen sind ebenfalls vorhanden.

Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch

Visualisierung von experimentellen Daten ist zu einem wichtigen Element in Präsentation der Ergebnisse für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Generation von Live-Zeitraffer-Aufnahme von wachsenden Embryos trägt zu einer besseren Präsentation und Verständnis für komplexe Entwicklungsprozesse. Dieses Protokoll ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Zellmarkierung über der Photo kaede Protein im Zebrafisch.

Visualisierung von Craniofacial Entwicklung in den sox10: kaede transgener Zebrafische Zeile mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie

Zellorganisation von Gesichtsschädelknochen war lange vermutet worden, aber nie direkt sichtbar gemacht. Multi-Spektral-Zellmarkierung und in vivo-Live-   Bildgebung ermöglicht Visualisierung dynamischer Zellverhalten im Zebrafisch Unterkiefer. Hier haben wir ausführlich das Protokoll zu manipulieren Zebrabow transgene Fische und direkt zu beobachten Zell Einlagerung und morphologischen Veränderungen der Knorpelzellen in der Meckel-Knorpel.

Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel

Hier präsentieren wir eine vielseitige Einbettungsmethode, die die Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung der hinteren Körperentwicklung von lebenden Zebrafischembryonen ermöglicht, ohne die normale Entwicklung zu stören.

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

Eine Kombination der erweiterten optischen Techniken der Laser-scanning-Mikroskopie mit langen Wellenlänge Multi-Photonen Fluoreszenzanregung wurde implementiert, um hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Bildgebung der Neuralleiste Migration mit Tg (Sox10:EGFP) und Tg (Foxd3:GFP) Zebrafish Embryos zu erfassen.

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

In vivo Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die zellulären Mechanismen zugrunde liegenden Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Technik zur Verwendung von Zeitraffer-Konfokalmikroskopie, um eine große Anzahl von mehrfarbigen Brainbow-markierten Zellen in Echtzeit innerhalb des sich entwickelnden Zebrafischnervensystems zu visualisieren.

Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur In-toto-Markierung und mehrdimensionalen Bildgebung der frühen Augenentwicklung von Zebrafischen. Wir beschreiben die Markierung, Einbettung und vierdimensionale (4D) Bildgebung mit hilfe der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und Überlegungen zur Optimierung der Erfassung von Datensätzen zur Sezierung von Mechanismen der optischen Cup-Morphogenese.

4-dimensionale Bildgebung der Zebrafisch-Optikbecher-Morphogenese

Das hier beschriebene Protokoll stellt ein einfaches und leicht verständliches Verfahren zum Färben und Präparieren von kraniofazialen Knorpeln bei einer 5 Tage alten Zebrafischlarve dar. Es kann verwendet werden, um die Anatomie, Form und Größe dieser Strukturen unter verschiedenen Entwicklungsbedingungen zu untersuchen.

Dissektion von kraniofazialem Gewebe von Zebrafischen nach Färbung mit Alcian Blue

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Quantifizierung der Kraniofacialform von Knorpelform mithilfe freier Software (tpsDigs2, MorphoJ und PAST), um Veränderungen der Gesichtsstruktur bei Zebrafischlarven zu messen.

Morphometrische Formanalysen: Die Analyse-Software-Werkzeugkaste zur Quantifizierung kraniofacialer Form bei Zebrafischen

Erfahren Sie die 4D-konfokale Mikroskopie zur Analyse kraniofazialer Morphogenese in Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von Pharynxbogenbewegungen und liefert wertvolle Einblicke in Entwicklungsprozesse.

Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie

Weitere Videos entdecken