Name: Isolierung von Double Negative αβ T-Zellen aus der Niere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Double Negative αβ T-Zellen aus der Niere für Immunologie und Nierenforschung. Diese Methode ermöglicht die Analyse ihrer Rolle bei Nierenverletzungen.

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Diese Arbeit wird von NIH PBS (R21 AI095484) unterstützt. Wir danken NHI Tetramer Core Facility für CD1d Tetramer.

1. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, Medien und Reagenzien <ol><li> Instrumente: Bereiten Sie die Reagenzien unter sterilen Bedingungen und unter Verwendung einer Steril. </li><li> Herstellung von 1 l RPMI-Gewebekulturmedium mit 5% fötalem Rinderserum, 2,1 g Natriumbicarbonat, 10 ml Glutamat 100x, 10 mg HEPES, 1 mg Natriumpyruvat und 10 ml 100x Penicillin / Streptomycin. Hinweis: Die empfohlene Gewebekulturmedium RPMI, ist austauschbar mit DMEM. </li><li> Vorbereitung 5% Collagenase &quot;D&quot;-Lösung (5 ml Collagenase &quot;D&quot; zu 9 ml Gewebekulturmedium). </li><li> Machen Percoll-Lösung bei drei verschiedenen Konzentrationen: 100%, 80% und 40%. Die folgenden Konzentrationen sind 1 Probe berechnet. Halten Lösungen bei Raumtemperatur. <ol><li> Percoll Lösung: 9 ml unverdünntem Percoll (aus Stammlösung); 1 ml PBS 10x. </li><li> Percoll-Lösung: 8 ml Percoll 100%; 2 ml PBS 1x. </li><li> Percoll-Lösung:4 ml Percoll 80%; 4 ml PBS 1x. </li></ol></li><li> Auffüllen auf 1 L der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS)-Puffer; 5 ml 10% BSA (0,1% BSA), 1 ml 10% Natriumazid (0,1%), 2 ml EDTA-Agent, machen bis zu 1.000 ml mit 1x PBS. </li></ol> 2. Vorbereitung von Nieren Verdauung <ol><li> Nach dem Erwerb aller erforderlichen institutionellen Genehmigung opfern und exsanguinate die Mäuse mit Standardmethoden und nach den aktuellen Vorschriften und Tierpflege-Richtlinien. <ol><li> Betäuben die Maus mit Pentobarbital (0,07 mg / kg). </li><li> Fahren Sie mit dem Ausbluten. </li><li> Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf einem Operationstisch. </li><li> Sprühen Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol. </li></ol></li><li> 10 ml Collagenase D Lösung der Petrischale. </li><li> Entfernen und entkapseln beide Nieren aus jeder Maus. <ol><li> Öffnen abdomimal Hohlraum, indem eine Mittelschnitt durch die Bauchhaut und Peritoneum vom Brustbein bisdas Schambein. </li><li> Die linke Niere freizulegen, indem der Darm seitlich zur Seite. </li><li> Trennen Sie vorsichtig die linke Kapsel mit der Zange. Hinweis: Die Kapsel wird als transparente Schicht rund um die Nieren-und teilweise durch perinephric Fettgewebe bedeckt. </li><li> Entfernen Sie die linke Niere durch Schneiden der Stiel Schiffe, die mit einer chirurgischen Schere. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für die rechte Niere. Hinweis: Die rechte Niere ist Schädel und näher an der Mittellinie (Blütenstiele sind kürzer). </li></ol></li><li> Legen Sie die Niere in der Petrischale. </li><li> Schneiden Sie das Nierengewebe in kleine Stücke (1-2 mm in der Abmessung) mit einem normalen Metallformung Klinge und legen die Stücke in den Collagenase-Lösung für 30-45 min im Brutschrank bei 37 ° C (Abbildung 1). </li></ol> 3. Vorbereitung von Nieren mononukleären Zellen (KMNC) aus der Niere Verdauung <ol><li> Eine Zellsuspension zu erhalten, der NiereVerdauung durch mechanisches Aufbrechen der Gewebe mit einem Sieb (70 um) und Resuspension in 25 ml Gewebekulturmedium und mischen. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei 4 ° C, um die Zellsuspension pelletieren. </li><li> Re-suspend das Pellet in 4 ml 40% Percoll-Lösung und sanft überlagern auf 4 ml 80% Percoll-Lösung mit einer Übertragungsplastikpipette, sehr langsam und vorsichtig. Dies wird in zwei Phasen klar durch eine transluzente Schicht getrennt führen. Auf der Oberseite wird eine gelbe Schicht, die den Lipiden sein. </li><li> Zentrifugieren bei 1500 × g für 30 min bei Raumtemperatur mit der Zentrifuge in Brems Aus-Modus. </li><li> Durch Absaugen entfernen das gelbe und dicke Deckschicht (ca. 1-2 ml). </li><li> Sammeln nur die leichte weißlich durchscheinende Schicht von der Grenzfläche der beiden Phasen mit einer Transferpipette. Diese Suspension sehr sorgfältig übertragen in eine 15 ml konischen Röhrchen mit 2 ml Gewebekulturmedium und fügen Sie dann 13 ml Medium, um ein Volumen von insgesamt machen15 ml. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren der Proben in 1 ml des Mediums. </li><li> Zähle die Anzahl der KMNC mit Trypanblau-Ausschluss auf einer Zählkammer und das Ergebnis wird als Zahl der KMNC pro ml pro Niere. </li><li> Einmal wie oben waschen. </li></ol> 4. Isolierung von hämatopoetischen (CD45 +) Zellen aus KMNC (Schritt I) <ol><li> Resuspendieren der Zellen bis zu 10 7 in 90 ul des Laufpuffers. </li><li> In 10 ul CD45-Mikroperlen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C </li><li> 1 ml Laufpuffer, um die Reaktion zu stoppen. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei 4 ° C und Resuspendieren in 500 ul Laufpuffer. </li><li> Vorbereitung der Magnetspalte, indem an dem Magneten und gründlich mit 3 ml Laufpuffer. </li><li> Übergeben Sie die Zellsuspension durch die Magnetsäule und sammeln Sie die unmarkierte Zellen, die durch die Säule. </li><li> Mit 3 ml runn Waschen Sie die Zellen dreimalten Puffer. Dann sammeln das Abwasser. </li><li> Entfernen Sie die Spalte aus dem Separator und Pipette 5 ml Laufpuffer auf die Säulen und spülen Sie die markierten Bruch sofort. Diese Fraktion enthält die CD45 +-Zellen. Zählen Sie die Zellen. </li><li> Um die absolute Anzahl verschiedener T-Zellen in Teilmengen Nieren Errechnung der Gesamtzahl von KMNC durch den Prozentsatz positiver Zellen mittels Durchflusszytometrie bestimmt (Abbildung 2). </li></ol> 5. Isolierung von DN-T-Zellen aus CD45 + Vorbereitung durch negative Selektion (Schritt II) <ol><li> Add 2,5 ul (0,5 mg / ml, 1,25 &amp;mgr; g) von jedem der folgenden biotinylierten Antikörper: anti-CD4, anti-CD8, anti-Fc-Rezeptor (CD16/32), Anti-MHC-Klasse II (IA b), anti- CD1d Tetramer PBS-57 für alle 10 7 hämatopoetischen Zellen. </li><li> Inkubieren Zellen für 30 min in kalten Raum. </li><li> 1 ml anti-Biotin-Mikrokügelchen. </li><li> Inkubation für 30 min in einem kalten Raum. </li><li> Das Röhrchen wird in ter Magnet und fahren Sie mit Erschöpfung. </li><li> Zählen der lebensfähigen Zellen, die Gesamtzahl von DN-T-Zellen in der negativen Fraktion unter Verwendung einer Zählkammer bestimmen. </li><li> Überprüfen Reinheit der DN-T-Zellen mit Durchflusszytometrie, indem Sie dieses Gating-Strategie: erste Tor CD45 +, zweite Tor TCRαβ +. Ausschließen CD1d +-Zellen. Grundstück CD4 + vs CD8 + T-Zellen auf DN (Abbildung 3) zu identifizieren. </li><li> Multiplizieren Sie die Gesamtzahl der in der Reinheit bestimmt Prozentsatz. Hinweis: Die Verwendung dieses Protokolls zu einer Bevölkerung von mehr als 90% rein DN T-Zellen. </li></ol>

<ol><li>Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+previously+unknown+antigen-specific+regulatory+T+cell+and+its+mechanism+of+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression.</a> Nat Med. 6, 782-789 (2000).</li>
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<li>Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+T+cell+depletion+in+murine+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury.</a> Transplantation. 74, 759-763 (2002).</li>
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<li>Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+analyses+on+T-cell+subsets+in+lymph+nodes+of+MRL%2FMp-lpr%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).</li>
<li>Dowdell, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+FAS+mutations+are+common+in+patients+with+genetically+undefined+autoimmune+lymphoproliferative+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome.</a> Blood. 115, 5164-5169 (2010).</li>
<li>Juvet, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcRgamma+promotes+T+cell+apoptosis+in+Fas-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice.</a> J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).</li>
<li>Thomson, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcR+gamma+presence+in+TCR+complex+of+double-negative+T+cells+is+critical+for+their+regulatory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function.</a> J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es gibt immer mehr Interesse an DN-T-Zellen, da sie, die in verschiedenen pathologischen Bedingungen, wie Autoimmunerkrankungen, Krebs, Transplantat-Toleranz und primären Erkrankungen der Niere einschließlich akuten Nierenschädigung (AKI) in Verbindung gebracht, Glomerulonephritis 8, 13. Daher besteht Bedarf, die pathophysiologische Funktionen DN-T-Zellen besser zu verstehen und zu charakterisieren. Derzeit jedoch mangelt es in Verständnis der Funktion dieser Zellen im Vergleich zu CD4 und CD8 T-Zellen. Ein w...

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/51192/isolation-of-double-negative-t-cells-from-the-kidney">Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney</a>.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle

A correction was made to: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney.

Erratum: Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Periphere αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - doppelt-negative (DN) T-Zellen werden in verschiedene Untergruppen, die unterschiedliche Phänotypen und Funktionen besitzen 1-4 unterteilt. DN-T-Zellen sind wenig verstanden, aber zunehmend auch in pathophysiologischen Immunantworten in verschiedenen Krankheitsmodellen 4-6 verwickelt. DN-T-Zellen sind eine einzigartige Immunzelltyp, der immer an der Regulation von verschiedenen Immun-und Autoimmunreaktionen und die Modulation der Allotransplantat-Toleranz in Verbindung gebracht wird. 4-6, 9 Sie sind selten im peripheren Blut und sekundären lymphatischen Organen (Milz und Lymphknoten ). Allerdings sind sie großen Bewohner der normalen Nieren-und Darmepithel 10-12. Sehr wenig ist über ihre Funktion 7 in der Niere im stationären Zustand und unter pathologischen Bedingungen, wie akute Nierenschädigung (AKI) mit Nieren Transpl. verbundenen bekanntAmeise. Wegen der komplizierten Rollen der verschiedenen Immunzellen bei der Regulierung der Immunantworten einschließlich alloresponses, die Definition der Rolle der einzelnen Spieler ist entscheidend für das Verständnis alloresponses und Gestaltung neuer Therapeutika. Angesichts der erheblichen Zahl von DN-T in der Niere unter physiologischen und unterschiedliche Krankheitszustände vorliegenden Zellen sind DN-T-Zellen wahrscheinlich eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Immun-und Autoimmunreaktionen in Mäusen und Menschen, und alloresponses bei Transplantatempfängern spielen. Thesaurierend wenn auch noch zerstreut Beweise bringen DN-T-Zellen in beiden pathogenen und immunsuppressive Funktionen, aber es ist schlecht verstanden, warum und wie sie eine spezifische schädliche oder drück Funktion aufweisen und wie die Umwelt beeinflusst sie. Aufgrund ihrer geringen Menge in der Niere, sind verbesserte Verfahren zur Isolierung erforderlich. Derzeit gibt es keine Standard-Protokoll für die Isolierung von DN T-Zellen von ter nicht-lymphatischen Geweben. Unser Protokoll beschreibt ein neues Verfahren zur Isolierung von DN-T-Zellen aus der Niere; Jedoch kann das Verfahren auch für verschiedene nicht-lymphoiden Geweben verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Laminar-Flow-Haube</td><td>Baker Company, Inc</td><td></td><td>Oder gleichwertige Ausrüstung&nbsp;</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Beckman-Schar</td><td></td><td>oder gleichwertige Ausrüstung&nbsp;</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Atmosphärengesteuerter Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&nbsp;( 37°; C mit 5 % CO2)</td></tr><tr><td>Analytisches Durchflusszytometer</td><td>LSR II</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Media Tech</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Serum für fötale Rinder</td><td>Corning Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,1 % Natriumazid (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Puffer phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Mediatech</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Puffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1161</td><td></td></tr><tr><td>LS Säulen&nbsp;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD45+ Mikrokügelchen</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>6.78E-51</td><td></td></tr><tr><td>Biotin Mikrokügelchen&nbsp;</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (Klon: 30-F11) PerCP&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Klon: 30-F11) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR Pacific Blue&nbsp; (ab-Kette, Klon: H57-597)</td><td>Invitrogen</td><td>HM3628</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0043</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 FITC</td><td>eBioscience</td><td>8011-0087</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 biotinyliert (GK1.5)</td><td>BD</td><td>553728</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 biotinyliert&nbsp; (Klon 53-6.7)</td><td>BD</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>anti-MHC Klasse II (I-A b) biotinyliertes</td><td>BD</td><td>553609</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Laufpuffer - MACS Trennpuffer&nbsp;</td><td>MIlteny I Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Mäuse</td><td>Jackson Labs</td><td>000664</td><td>Nieren - Lymphknoten</td></tr><tr><td>Petrischale&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>356517</td><td></td></tr><tr><td>70 &#956; m Filter&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Stößel&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Oder gleichwertige Ausrüstung&nbsp;</td></tr><tr><td>GeneMate Röhrchen 50 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-3</td><td>Oder gleichwertige Geräte&nbsp;</td></tr><tr><td>GeneMate Röhrchen 15 ml</td><td>Bioexpress</td><td>C-3394-1</td><td>Oder gleichwertige Geräte&nbsp;</td></tr><tr><td>CD1d &#945;-Galcer Tetramer</td><td>NHI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von double negative αβ t-zellen aus der niere

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Derzeit gibt es keine Standard-Protokoll für die Isolierung von DN-T-Zellen von den nicht-lymphatischen Gewebe trotz ihrer zunehmend berichtet Beteiligung an verschiedenen Immunantworten. DN-T-Zellen sind eine einzigartige Immunzelltyp, der bei der Regulierung der Immun-und Autoimmunreaktionen und Toleranz zu allotransplants 1-6 gebracht wurde. DN-T-Zellen sind jedoch selten im peripheren Blut und sekundären lymphatischen Organen (Milz und Lymphknoten), jedoch sind die Haupt Bewohner der normalen Niere. Sehr wenig ist über die pathophysiologische Funktion 7 aufgrund ihrer Mangel in dem Umfang bekannt. Wir haben vor kurzem beschrieben, eine umfassende phänotypische und funktionelle Analyse dieser Bevölkerung in der Niere 8 in stationären und während der Ischämie Reperfusion. Analyse der DN-T-Zell-Funktion wird stark durch die Entwicklung eines Protokolls für ihre Isolation von der Niere verbessert werden. Hier ein neues Protokoll, das ermöglicht isolatio beschreiben wirn von hochreinem ab CD4 + CD8 + T-Zellen und DN-T-Zellen aus der Maus-Nieren. Kurz gesagt, wir verdauen Nierengewebe mittels Collagenase und zu isolieren, Nierenmononuklearen Zellen (KMNC) durch Dichtegradientenzentrifugation. Dies wird durch zwei Schritte auf hämatopoetischen T-Zellen von 3% bis 70%, gefolgt von KMNC bereichern. Der erste Schritt besteht aus einer positiven Selektion von hämatopoetischen Zellen mit einer CD45 +-Isolierungs-Kit. Im zweiten Schritt werden negativ DN-T-Zellen durch Entfernen von nicht-gewünschten Zellen mit CD4, CD8, MHC Klasse II und monoklonale Antikörper und CD1d α-GalCer Tetramer isoliert. Diese Strategie führt zu einer Bevölkerung von mehr als 90% rein DN T-Zellen. Oberflächenfärbung mit den oben erwähnten Antikörper, gefolgt von FACS-Analyse wird verwendet, um die Reinheit zu bestätigen.

Wildtyp C57BL / 6 (B6) Niere enthält etwa 1,5 bis 2,1 x 10 6 mononuklearen Zellen pro Niere. Weniger als etwa 10% hämatopoetische CD45 +-Zellen. Für die Herstellung von Nieren mononukleären Zellen (KMNC) werden die Nieren in kleine Stücke geschnitten, wie in Fig. 1 gezeigt, gefolgt von Verdauung mit Collagenase 5%. Dies wird durch Durchführen einer Dichte-Gradienten-Zentrifugation auf KMNC Schicht (Fig. 2, links) zu sammeln, gefolgt. KM...

DNabT Zellen sind selten unter peripheren T-Zellen; aber reichlich sind sie in bestimmten Nicht-lymphatischen Gewebe. Schwierigkeitsgrad der Isolierung DN T-Zellen von nicht-lymphatischen Gewebe behindert ihre Funktionsanalyse trotz steigender erkannt pathophysiologische Bedeutung. Wir beschreiben eine neue Methode zur Isolierung von hoch gereinigten DN T-Zellen aus murinen Niere.

Isolierung von Double Negative αβ T-Zellen aus der Niere

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Isolierung reiner doppelnegativer T-Zellen aus der Mausniere zu beschreiben. Dies wird erreicht, indem die Niere zunächst in einer Kollagenase-Lösung verdaut wird. Anschließend werden die mononukleären Zellen durch eine Dichtegradientenzentrifugation getrennt, und die hämatopoetischen CD 45-positiven Zellen werden durch positive Selektion angereichert.Schließlich können die doppelt negativen T-Zellen anschließend durch negative Selektion isoliert werden. 1998 entdeckte unser Team, dass Immunzellen, insbesondere T-Zellen, entgegen der damaligen Lehrmeinung akute Nierenschädigungen vermitteln. Es gab nur sehr wenige dieser Zellen in der Niere und im Herzen, die untersucht werden konnten, weshalb wir eine Technik entwickelten, um diese besser untersuchen zu können.Es überraschte uns, eine Zellpopulation zu finden, die doppelt negativen T-Zellen ohne CD4 oder CD8, die sowohl in der normalen Niere als auch während einer Schädigung in hoher Zahl vorhanden waren. Die detaillierte und verbesserte Technik, um diese genauer zu untersuchen und die zugrundeliegenden Mechanismen zu erforschen, wird in dem folgenden Video beschrieben. Wir erforschen doppelt negative T-Zellen seit 2001 und haben kürzlich mit dem Labor von Dr. Rob zusammengearbeitet, um die regionale Methode zur Isolierung dieser Zellen zu modifizieren, um eine reine Population zu erhalten, die für verschiedene biologische Immunantworten verwendet werden kann.Obwohl diese Methode Einblicke in die Immunzellen der Niere ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme wie nichtlymphatische Gewebe anwendbar. Vor Beginn der Operation zunächst 10 Milliliter Kollagenase D in eine Petrischale zur Gewebesammlung geben. Anschließend den Bauchbereich einer euthanasierten Maus mit 70 % Ethanol besprühen.Anschließend führen Sie einen medianen Schnitt durch die Bauchhaut und das Peritoneum von dem Sternum bis zum Schambein durch und verschieben das Darmbein seitlich, um die linke Niere freizulegen. Identifizieren Sie die linke Kapsel, die als transparente Schicht erscheint, die die Niere umgibt und teilweise von perinierischer Fettgewebe bedeckt ist, und trennen Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette von der Niere ab. Danach schneiden Sie den Nierenstiel mit einer chirurgischen Schere durch, um das Gewebe zu entfernen, und legen die Niere in die Petrischale.Entfernen Sie danach die rechte Niere und schneiden Sie das Nierengewebe mit einer normalen metallischen Formenschneide in kleine Stücke von ein bis zwei Millimetern. Verdauen Sie die Stücke 30 bis 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in der Kollagenase-Lösung und isolieren Sie anschließend die mononukleären Nierenzellen, indem Sie die Nierenmasse mechanisch durch einen 70-Mikron-Sieb passieren. Resuspendieren Sie die Zellsuspension in 25 Milliliter Gewebekulturmedium.Und danach nach sanfter Rotation die Zellen abzentrifugieren und das Pellet in vier Milliliter 40 %iger Percoll-Lösung resuspendieren. Als Nächstes mit einer Plastik-Transferpipette die Percoll-Zelllösung vorsichtig auf vier Milliliter einer 80 %igen Percoll-Lösung aufschichten, um zwei Phasen zu erzeugen, die durch eine durchscheinende Schicht klar getrennt sind. Die Zellen 30 Minuten bei 1500 × g und Raumtemperatur ohne Bremse separieren und danach etwa ein bis zwei Milliliter der dicken, gelben, lipidenreichen oberen Schicht abpipettieren.Verwenden Sie eine neue Transferpipette, um die leicht trübe, durchscheinende Schicht an der Grenzfläche der beiden Phasen in ein 15-Milliliter-Konischgefäß zu überführen, das zwei Milliliter Zellkulturmedium enthält. Fügen Sie anschließend 13 Milliliter Medium hinzu, um das Gesamtvolumen auf 15 Milliliter aufzufüllen. Nach dem Waschen und Zählen verdünnen Sie die Zellen auf eins mal 10 hoch sieben in 90 Mikroliter Laufpuffer.Anschießend inkubieren Sie die Zellen in 10 Mikrolitern CD45-Mikroperlen bei vier Grad Celsius. Nach 15 Minuten fügen Sie ein Milliliter Laufpuffer hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Danach zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren sie erneut.Suspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern frischem Laufpuffer. Bringen Sie anschließend eine Säule in einen Säulenmagneten und spülen Sie die Säule mit drei Millilitern Laufpuffer. Leiten Sie dann die Zellsuspension durch die magnetische Säule, wobei die nicht markierten Zellen, die die Säule durchlaufen, gesammelt werden.Spülen Sie das Röhrchen mit den Zellen dreimal mit je drei Milliliter Laufpuffer, wobei das Durchflussvolumen jeweils gesammelt wird, und entfernen Sie anschließend die Säule vom Magneten. Geben Sie fünf Milliliter Laufpuffer auf die Säule und eluieren Sie unverzüglich die markierte Fraktion, die die CD45-positiven Zellen enthält. Zählen Sie danach die Zellen und inkubieren Sie sie mit je 2,5 Mikroliter der biotinylierten Antikörper pro 1 × 10⁷ hämatopoetische Zellen bei vier Grad Celsius.Nach 30 Minuten inkubieren Sie die Zellen weitere 30 Minuten bei vier Grad Celsius in einem Milliliter Anti-Biotin-Mikroperlen. Setzen Sie eine neue Säule in das Magnetfeld und geben Sie die Zellen erneut auf die Säule, wobei diesmal die negative Fraktion gesammelt wird. Zählen Sie abschließend die lebensfähigen Zellen, um die Gesamtanzahl der doppelnegativen T-Zellen in der negativen Fraktion zu bestimmen, und multiplizieren Sie diese Zahl mit dem prozentualen Reinheitsgrad, wie er durch die Durchflusszytometrie ermittelt wurde.Während Typ C 57, schwarze sechs Nieren etwa 1,5 bis 2,1 × 10⁶ mononukleäre Zellen pro Niere enthalten, sind weniger als 10 % davon hämatopoetische CD45-positive Zellen. Nach Dichtegradientenzentrifugation zur Gewinnung der mononukleären Zellschicht der Niere können die CD45-positiven Zellen durch magnetische CD45-positive Bead-Seperation auf etwa 80 bis 95 % angereichert werden. Unter den angereicherten hämatopoetischen CD45-positiven Zellen sind etwa 30 bis 60 % doppelt negative T-Zellen.Negative Selektion der CD45-positiven Zellen zur Entfernung der CD4-positiven, CD8-positiven, MHC-Klasse-II-positiven und Tetramer-positiven Zellen führt zu hochgereinigten, 90 bis 95 % reinen doppelt negativen T-Zellen. Mit diesem Protokoll ist es möglich, bis zu 0,5 × 10⁶ hämatopoetische CD45-positive, magnetisch markierte Zellen pro Maus zu gewinnen. Dieses Verfahren wird ein besseres Verständnis der biologischen Funktionen und Mechanismen von Fraktionen doppelt negativer T-Zellen in verschiedenen Geweben ermöglichen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Isolation von Lymphozyten mit der Miltenyi MACs Kit ist eine zuverlässige Methode, um Zellen aus ganzen lymphatischen Gewebe-Homogenaten zu reinigen. Cells unter Verwendung der Miltenyi-System sind in der Regel ≥ 96% rein. Hier zeigen wir, welche Schritte unternommen wurden, um CD4 + T-Zellen, einer der vielen Kits von Miltenyi angeboten isolieren.

Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

Das Video erklärt eine Methode zur Reinigung von B-Zellen durch immunomagnetisches Targeting und Trennung von der Suspension der mononukleären Zellen des peripheren Blutes. Bei der Methode werden unerwünschte Zelltypen mit spezifischen Antikörpern oder Liganden (die an magnetische Partikel gebunden sind) markiert, die auf bestimmte Zelloberflächenproteine abzielen, die durch magnetische Trennung aus der heterogenen Zellsuspension entfernt werden sollen.

Negative immunomagnetische Selektion: Eine Methode zur Aufreinigung von B-Zellen aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur magnetischen Markierung einer niedrig konzentrierten Population von CD4+Vδ1+γδ T-Zellen aus humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs). Mit einer Kombination aus FITC-konjugierten Anti-Vδ1-Antikörpern, magnetischen Anti-FITC-Mikrokügelchen und mit Anti-CD4-Antikörpern beschichteten superparamagnetischen Kügelchen können die CD4+Vδ1+ T-Zellen erfolgreich aus der PBMC-Population aufgereinigt werden.

Selektive Isolierung von CD4+ Vδ1+ γδ T-Zellen aus mononukleären Zellen des humanen peripheren Blutes

Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll für die Isolierung und Klonierung der seltenen T-Zell-Einheit von peripheren Vδ1+CD4+ T-Zellen zur Verfügung, die, wie wir kürzlich gezeigt haben, ein extrathymer αβ T-Zell-Vorläufer ist. Diese Technik ermöglicht es, diese Zellen in ex vivo-Kulturen quantitativ zu isolieren, zu klonen und effizient zu expandieren.

Isolation und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur des Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T-Zellen, eine extrathymic αβT-Zell-Vorläufer

Techniken, die zuverlässig und effizient für die Isolierung von Nierenimmunzellen sind, werden für nachgelagerte Anwendungen benötigt. Dies erfordert die Markierung einer kleinen Anzahl von Nierenimmunzellen mit Oberflächenantikörpern. Im Folgenden beschreiben wir eine prägnante Methode zur Isolierung von Immunzellen der Niere, mit der dieses Ziel scheinbar erreicht wird.

Zuverlässig und High Efficiency Extraktion von Nieren-Immunzellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum induzieren Toleranz in der Transplantationsmedizin und in Vitro und in Vivo zu bewerten, die unterdrückende unterschiedliche Zelle Teilmengen des Empfängers und der Immunstatus des Empfängers in Richtung Spender oder exogene Antigene.

In Vitro und In Vivo Beurteilung der T, B und myeloische Zellen Suppressive Aktivität und humorale Reaktionen von Transplantationspatienten

Hier präsentieren wir eine neue klinische Grade Isolation und Kultur Methode zur Niere perivaskuläre Stromazellen Zellen (kPSCs) anhand der gesamten Organ Perfusion mit Verdauungsenzymen und NG2-Zelle Bereicherung. Mit dieser Methode ist es möglich, ausreichende Zellzahlen für Zelltherapie erwerben.

Eine neue klinische Grade Isolationsmethode für menschliche Niere perivaskuläre Stromazellen Zellen

Wir präsentieren ein einfaches Protokoll für die Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen aus Vollblut, das von Patienten mit diagnostiziertem Sézary-Syndrom gewonnen wurde, gefolgt von der Auswahl von CD4+ T-Zellen, ihrer Stimulation mit Phorbol12-Myristat13-Acetat und A23187-Ionophor und der Vorbereitung von RNA für die transkriptomische Profilerstellung.

Isolierung menschlicher mononukleärer Blutzellen und CD4+ T-Zellen von Patienten mit Sézary-Syndrom für transkriptomisches Profiling

Nach einer Virusinfektion beherbergt die Niere eine relativ große Anzahl von CD8+ T-Zellen und bietet die Möglichkeit, nicht-mukosaleT-RM-Zellen zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von Mausnierenlymphozyten für die Analyse der Durchflusszytometrie.

Isolierung von Maus-Kidney-Resident-CD8+ T-Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung hochwertiger Kerne aus gefrorenen Mausnieren vor, das die Repräsentation von medullären Nierenzelltypen verbessert und die Genexpressionsartefakte aus der enzymatischen Gewebedissoziation vermeidet.

Zellkernisolierung aus der Niere adulter Mäuse für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung

Dieses Protokoll beschreibt ein Überlebensverfahren für eine sichere und gut verträgliche beidseitige neurale Lymphadenektomie der Maus.

Murine bilaterale Nierenlymphadenektomie

Lernen Sie die Isolierung von Double Negative αβ T-Zellen aus der Niere für Immunologie und Nierenforschung. Diese Methode ermöglicht die Analyse ihrer Rolle bei Nierenverletzungen.

Isolierung von Double Negative αβ T-Zellen aus der Niere

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