Name: Überwachung des Intraspezies-Wettbewerbs in einer bakteriellen Zellpopulation durch Kokultivierung fluoreszierender Stämme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Lernen Sie die Kokultivierung fluoreszierender Bacillus subtilis-Stämme zur Überwachung intraspezifischen Wettbewerbs in Bakterienpopulationen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung überlebender Kolonien und liefert Einblicke in mikrobielle Evolution.

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Die Arbeit im Autorenlabor wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (http://www.dfg.de; CO 1139/1-1), dem Fonds der Chemischen Industrie (http://www.vci.de/fonds) und dem Göttinger Zentrum für Molekularbiologie (GZMB). Die Autoren würdigen Jörg Stülke für hilfreiche Kommentare und die kritische Lektüre des Manuskripts.

1. Herstellung von Agar-Platten, Kulturmedien, Kryostocks und Vorkulturen
<ol><li>Bereiten Sie Wachstumsmedien und erforderliche Reagenzien vor (siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien).</li>
	<li>Streifen Sie die B. subtilis Stämme (z.B. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) und BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) aus, die ein bzw. zwei aktive GDHs ausdrücken)2, die im Wettbewerbsexperiment auf SP-Medium-Agarplatten verwendet werden, um einzelne Kolonien zu erhalten. Die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Nehmen Sie einzelne Kolonien und impfen sterile Kulturröhrchen mit 4 ml LB flüssiges Medium. Wachsen Sie die Bakterien über Nacht bei 28 °C und 220 Rpm.</li>
	<li>Wachsen Sie Übernachtkulturen bei 28 °C, um zu vermeiden, dass die Zellen lyse oder sporulate.</li>
	<li>Messen Sie die optische Dichte der Kulturen bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD600) mit einem Standardspektralphotometer.</li>
	<li>Wenn die Kulturen eine OD600 von 2,0 erreicht haben, mischen Sie 0,75 ml der Kulturen mit 0,75 ml einer sterilen 50%-Glyzerinlösung in 1,5 ml Reaktionsröhrchen. Die endgültige OD600 sollte 1,0 sein, um Kryostocks mit etwa 108 Zellen/ml zu erhalten.</li>
	<li>Bewahren Sie die Rohre bei -80 °C auf.</li>
	<li>Machen Sie drei Vorkulturen jeder Sorte, die mit den cfp- und yfp-kodierenden Fluorophorgenen gekennzeichnet sind. Impfen Sie die Präkulturen (sterile Kulturröhrchen mit 4 ml LB flüssigem Medium) mit 1 l Zellen aus -80 °C Kryostocks. Die Kulturen über Nacht bei 28 °C und 220 Rpm bebrüten.</li>
</ol>2. Kokultivierung von Bakterien, Probenentnahme und Probenlagerung
<ol><li>100 ml C-Glc und CE-Glc minimal enparieren (siehe Tabelle mit Reagenzien und Materialien) und 20 ml jedes Mediums in sterile 100 ml Schüttelkolben übertragen.</li>
	<li>Nehmen Sie 0,1 ml der Übernacht angebauten Vorkulturen, verdünnen Sie sie mit 0,9 ml LB-Medium in einer 1,5 ml Küvette und bestimmen Sie die OD600.</li>
	<li>Nehmen Sie für das Wettbewerbsexperiment die Vorkulturen der verschiedenen Stämme, die eine ähnliche OD600 zwischen 1.0-1.5 aufweisen.</li>
	<li>Um gemischte Zellpopulationen zu erhalten, verdünnen Sie die Zellen der Vorkulturen, die die entsprechende OD600 auf eine OD600 von 0,05 in 20 ml C-Glc und CE-Glc Minimalmedium in 100 ml Schüttelkolben ergänzt hatten. Für das Wettkampfexperiment sollten die beiden Stämme im Verhältnis 1:1 gemischt werden.</li>
	<li>10 ml Proben aus den Kolben nehmen, in 15 ml Kunststoffröhrchen übertragen, die Zellen durch Zentrifugieren 10 min bei 4.000 x g in einer Standardtischzentrifuge ernten und den Überstand entsorgen.</li>
	<li>Setzen Sie die Zellen in 0,5 ml frischem LB-Medium aus und übertragen Sie die Zellen in einen sterilen 1,5 ml Reaktionsbecher. 0,5 ml 50 % steriles Glycerin hinzufügen, die Suspension durch rigoroses Wirbeln mischen und die Proben bis zur weiteren Behandlung in einem Gefrierschrank von -80 °C lagern.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen, die in den Schüttelkolben für bis zu 24 Stunden bei 37 °C und 220 U/min übrig bleiben. Halten Sie die Schüttelkolben im Dunkeln, um ein Photobleichmittel der Fluorophore zu verhindern.</li>
	<li>Nehmen Sie weitere Proben von 0,1 ml nach 7 Stunden und 24 Stunden Wachstum. Messen und beachten Sie die OD600 von 1:10 Verdünnungen (in C-Glc oder CE-Glc minimal medium) der Proben.</li>
	<li>Nehmen Sie die entsprechende Menge an Zellen aus jeder Kultur, um Kryostocks herzustellen, die eine OD600 von 1,0 haben. Bewahren Sie die Proben bis zur weiteren Behandlung bei -80 °C auf.</li>
</ol>3. Probenbehandlung, Beschichtung und Inkubation für quantitative Analysen
<ol><li>Nach dem Sammeln aller Proben die Kryostocks auftauen und die Zellen in einer 0,9%igen Salinlösung (siehe Tabelle mit Reagenzien und Materialien) bis zu 10-3verdünnen.</li>
	<li>Platte 0,1 ml der 10-3 Verdünnungen auf SP-Mittelagarplatten und verteilen die Zellen mit sterilen Glaspipetten.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C im Dunkeln, bis einzelne Kolonien entstanden sind.</li>
</ol>4. Zählen der Überlebenden durch Stereo Fluoreszenzmikroskopie für die quantitative Analyse
<ol><li>Teilen Sie den Boden der Agarplatte mit einem schwarzen Stift in vier Teile für eine bessere Orientierung, während die Überlebenden unter dem Stereofluoreszenzmikroskop gezählt werden.</li>
	<li>Stellen Sie die Platte kopfüber unter das Mikroskop und bringen Sie die Kolonien mit der Kaltlichtquelle in den Fokus.</li>
	<li>Sobald die Kolonien im Fokus sind, wechseln Sie zum entsprechenden Filtersatz für CFP, um die überlebenden Zellen des cfp-markiertenStammes zu visualisieren. Zählen Sie die Überlebenden dieser Sorte, indem Sie die Kolonien mit einem Stift beschriften und notieren Sie die Zahl.</li>
	<li>Entfernen Sie die Etiketten mit Ethanol, und wechseln Sie zum YFP-Filtersatz, um die verbleibenden Zellen des yfp-markiertenStammes zu visualisieren. Zählen Sie die Überlebenden erneut, indem Sie die Kolonien mit einem Stift beschriften und die Zahl notieren.</li>
</ol>5. Probenbehandlung und Mikroskopie für semiquantitative Analysen
<ol><li>Zur Veranschaulichung der Abbildungen erkennen Sie 10 l der Verdünnung von 10-4 (ca. 100 Zellen) aus Schritt 3.1 auf einer SP-Agarplatte (siehe Abbildung 3).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C im Dunkeln, bis einzelne Kolonien entstanden sind.</li>
	<li>Stellen Sie die Petrischale ohne Deckel unter das Mikroskop und bringen Sie den Punkt mit der Kaltlichtquelle in den Fokus.</li>
	<li>Machen Sie Fotos von den Spots für illustrative Figuren. Wählen Sie eine geeignete Belichtungszeit, um die Bilder der Kolonien mit der Kaltlichtquelle zu machen.</li>
	<li>Ohne die Platte zu bewegen, wechseln Sie zum CFP-Filtersatz, passen Sie die Belichtungszeit an und machen Sie ein Bild. Tun Sie das gleiche mit dem YFP-Filtersatz und speichern Sie die Bilder für weitere Analysen.</li>
</ol>6. Datenanalyse
<ol><li>Verwenden Sie Software wie Excel für die quantitativen Datenanalysen. Berechnen Sie anhand der gezählten Kolonien den prozentualen Anteil der gelben und blauen Kolonien in Bezug auf die gesamte Anzahl der Kolonien, die auf 100% festgelegt sind.</li>
	<li>Verwenden Sie die berechneten Zahlen, um ein gestapeltes Balkendiagramm zu erstellen (siehe Abbildung 4 und Abbildung 5). Verwenden Sie ein Bildverarbeitungsprogramm wie Adobe Photoshop, um zusammengeführte Bilder der Bilder zu erstellen, die von den verschiedenen Spots aufgenommen wurden. Alternativ kann die frei verfügbare Software ImageJ, die von <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> herunterladbar ist, für die Bildverarbeitung verwendet werden.</li>
	<li>Öffnen Sie die Bilder von einer Stelle, die mit dem CFP-Filtersatz und dem YFP-Filtersatz aufgenommen wurden. Optimieren Sie den Kontrast und die Helligkeit, um die Hintergrundfluoreszenz von den Medien zu reduzieren.</li>
	<li>Gehen Sie zu einem der Bilder und wählen Sie alle aus. Kopieren Sie das Bild, und fügen Sie es in das andere Bild ein.</li>
	<li>Verwenden Sie entweder die Funktion "Color Dodge", um die Bilder zusammenzuführen, oder überlagern Sie die fluoreszierenden Bilder über die Registerkarte Kanäle. Zusammengeführte Bilder der Kolonien aus verschiedenen Medien und unterschiedlichen Zeitpunkten stellen das Wachstum der verschiedenen Stämme innerhalb der flüssigen Kultur dar.</li>
</ol>7. Spezifische Tipps: Farbstoffschalter-Experiment und Kokultivierung von isogenen Stämmen, die mit cfp und yfp gekennzeichnet sind
Die Expression eines der beiden fluorophorkodierenden Gene in B. subtilis könnte die Fitness und damit die Wachstumsrate der Bakterien beeinflussen. Daher wird empfohlen, die folgenden Experimente durchzuführen, um auszuschließen, dass die Eliminierung eines KonkurrierendenStamms aus der Zellpopulation während des Anbaus einfach auf eine negative Wirkung des Fluorophors zurückzuführen ist:
<ol><li>Wiederholen Sie das ganze Experiment und kokultiv beschriftete Stämme(z.B. wird der frühere cfp-markierteStamm nun mit dem yfp-Gen beschriftet und umgekehrt). Obwohl inverse, sollten die erhaltenen Ergebnisse mit der vorherigen Beobachtung vergleichbar sein, dass ein Stamm einen selektiven Wachstumsvorteil gegenüber dem anderen Stamm hat.</li>
	<li>Wiederholen Sie das gesamte Experiment und kokultivieren Sie isogene Stämme mit yfp und cfp (z.B. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) und BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)). Schätzen Sie die negativen Auswirkungen eines der beiden Fluorophore auf die Fitness der Bakterien, indem Sie die Zusammensetzung der Zellpopulation im Laufe der Zeit verfolgen.</li>
</ol>

<ol><li>Buescher, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+network+reorganization+during+dynamic+adaptations+of+Bacillus+subtilis+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism.</a> Science. 335, 1099-1103 (2012).</li>
<li>Gunka, K., Stannek, L., Care, R. A., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection-driven+accumulation+of+suppressor+mutants+in+Bacillus+subtilis%3A+the+apparent+high+mutation+frequency+of+the+cryptic+gudB+gene+and+the+rapid+clonal+expansion+of+gudB%2B+suppressors+are+due+to+growth+under+selection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Selection-driven accumulation of suppressor mutants in Bacillus subtilis: the apparent high mutation frequency of the cryptic gudB gene and the rapid clonal expansion of gudB+ suppressors are due to growth under selection.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Al Mamum, A. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+and+function+of+a+large+gene+network+underlying+mutagenic+repair+of+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identity and function of a large gene network underlying mutagenic repair of DNA breaks.</a> Science. 338, 1344-1348 (2012).</li>
<li>Koeppel, A. F., Wertheim, J. O., Barone, L., Gentile, N., Krizanc, D., Cohan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speedy+speciation+in+a+bacterial+microcosm%3A+new+species+can+arise+as+frequently+as+adaptations+within+a+species%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Speedy speciation in a bacterial microcosm: new species can arise as frequently as adaptations within a species.</a> ISME J. 7, 1080-1091 (2013).</li>
<li>Maughan, H., Nicholson, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fitness+and+alteration+of+metabolic+pathways+during+Bacillus+subtilis+evolution+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Increased fitness and alteration of metabolic pathways during Bacillus subtilis evolution in the laboratory.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 4105-4118 (2011).</li>
<li>Burkholder, P. R., Giles, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+biochemical+mutations+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Bot%22%5BJournal%5D)">Induced biochemical mutations in Bacillus subtilis.</a> Am. J. Bot. 34, 345-348 (1947).</li>
<li>McLoon, A. L., Guttenplan, S. B., Kearns, D. B., Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+domestication+of+a+biofilm-forming+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tracing the domestication of a biofilm-forming bacterium.</a> J. Bacteriol. 193, 2027-2034 (2011).</li>
<li>Zeigler, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+168%2C+W23%2C+and+other+Bacillus+subtilis+legacy+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The origins of 168, W23, and other Bacillus subtilis legacy strains.</a> J. Bacteriol. 190, 6983-6995 (2008).</li>
<li>Gunka, K., Tholen, S., Gerwig, J., Herzberg, C., Stülke, J., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-frequency+mutation+in+Bacillus+subtilis%3A+requirements+for+the+decryptification+of+the+gudB+glutamate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A high-frequency mutation in Bacillus subtilis: requirements for the decryptification of the gudB glutamate dehydrogenase.</a> 194, 1036-1044 (2012).</li>
<li>Commichau, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Bacillus+subtilis+mutants+with+carbon+source-independent+glutamate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Bacillus subtilis mutants with carbon source-independent glutamate biosynthesis.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 12, 106-113 (2007).</li>
<li>Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+suppressors+and+recovery+of+repressed+biochemical+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic suppressors and recovery of repressed biochemical memory.</a> J. Biol. Chem. 284, 12585-12592 (2009).</li>
<li>Gunka, K., Commichau, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+glutamate+homeostasis+in+Bacillus+subtilis%3A+a+complex+interplay+between+ammonium+assimilation%2C+glutamate+biosynthesis+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control of glutamate homeostasis in Bacillus subtilis: a complex interplay between ammonium assimilation, glutamate biosynthesis and degradation.</a> Mol. Microbiol. 85, 213-224 (2012).</li>
<li>Yan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+the+glutamate+pool+concentrations+in+enteric+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protection of the glutamate pool concentrations in enteric bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9475-9480 (2007).</li>
<li>Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+and+regulation+of+Bacillus+subtilis+glutamate+dehydrogenase+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Role and regulation of Bacillus subtilis glutamate dehydrogenase genes.</a> J. Bacteriol. 180, 6298-6305 (1998).</li>
<li>Commichau, F. M., Herzberg, C., Tripal, P., Valerius, O., Stülke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+protein-protein+interaction+governs+glutamate+biosynthesis+in+Bacillus+subtilis%3A+the+glutamate+dehydrogenase+RocG+moonlights+in+controlling+the+transcription+factor+GltC%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A regulatory protein-protein interaction governs glutamate biosynthesis in Bacillus subtilis: the glutamate dehydrogenase RocG moonlights in controlling the transcription factor GltC.</a> Mol. Microbiol. 65, 642-654 (2007).</li>
<li>Gordo, I., Perfeito, L., Sousa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+effects+of+mutations+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fitness effects of mutations in bacteria.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 21, 20-35 (2011).</li>
<li>Rabatinová, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B4+subunit+of+RNA+polymerase+is+required+for+rapid+changes+in+gene+expression+and+competitive+fitness+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The δ subunit of RNA polymerase is required for rapid changes in gene expression and competitive fitness of the cell.</a> J. Bacteriol. 195, 2603-2611 (2013).</li>
<li>Capra, E. J., Perchuk, B. S., Skerker, J. M., Laub, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+mutations+that+prevent+crosstalk+enable+the+expansion+of+paralogous+signalling+protein+families%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adaptive mutations that prevent crosstalk enable the expansion of paralogous signalling protein families.</a> Cell. 150, 222-232 (2012).</li>
<li>García-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+Bacillus+subtilis+biofilms+using+fluorescence+microscopy+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (15), (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Mehrere Methoden wurden entwickelt, um die Wettbewerbstauglichkeit von Bakterien zu analysieren16. In vielen Fällen wurden die Bakterien mit verschiedenen Antibiotika-Resistenzkassetten17gekennzeichnet. Ähnlich unserem Ansatz ermöglicht die Kennzeichnung der Zellen mit Antibiotikaresistenzkassetten die Beurteilung der Wettbewerbstauglichkeit der Bakterien während der Kokultivierung unter definierten Wachstumsbedingungen. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um die Wettbewerbstauglichk...

Bodenbakterien sind in der Regel mit flexiblen regulatorischen Netzwerken und breiten stoffwechselnden Kapazitäten ausgestattet. Beide Eigenschaften ermöglichen es den Zellen, ihre katabolen und anabolen Bahnen anzupassen, um mit ihren Gefährten und anderen Mikroorganismen um die Nährstoffe zu konkurrieren, die in einer bestimmten ökologischen Nische verfügbar sind1. Wenn die Bakterien jedoch nicht in der Lage sind, sich an ihre Umgebung anzupassen, können andere Mechanismen für das Überleben einer Art verantwortlich sein. In der Tat, da viele Bakterien schnell vermehren und die Populationen hohe Zelldichten Subpopulationen erreichen können spontan angesammelt positive Mutationen, die die Zellen mit einem selektiven Wachstumsvorteil und damit ihre Fitness zu erhöhen. Darüber hinaus können Mutations-Hotspots und stressinduzierte adaptive Mutagenese die Entwicklung eines unangepassten Bakteriums2,3erleichtern. So ist die Anhäufung von Mutationen und Wachstum unter kontinuierlicher Selektion der Ursprung für die enorme mikrobielle Vielfalt, selbst innerhalb derselben Gattung4,5. Wie in der Natur findet auch die Formgebung bakterieller Genome im Labor aufgrund der kontinuierlichen Kultivierung unter Auswahl statt. Ein Beispiel dafür ist die Domestizierung des Gram-positiven Bakteriums B. subtilis, das weltweit in der Grundlagenforschung und in der Industrie eingesetzt wird. In den 1940er Jahren wurde B. subtilis mit DNA-schädigenden Röntgenstrahlen behandelt, gefolgt von der Kultivierung unter einer spezifischen Wachstumsbedingung6. Die Mutationen, die sich in den Bakterien während ihrer Domestizierung angesammelt haben, sind für den Verlust vieler Wachstumsmerkmale verantwortlich, d.h. der Laborstamm 168 von B. subtilis verlor die Fähigkeit, komplexe Kolonien zu bilden7,8.
Für die am besten untersuchten Modellbakterien Escherichia coli und B. subtilissteht heute eine Vielzahl leistungsstarker Werkzeuge zur Verfügung, um ihre Genome genetisch zu manipulieren, um spezifische wissenschaftliche Fragen zu beantworten. Manchmal verursacht die Inaktivierung eines Gens von Interesse einen schweren Wachstumsfehler, der dann auf dem Standardwachstumsmedium9deutlich sichtbar ist. Im Gegensatz dazu werden Mutationen, die einen schwachen Wachstumsfehler verursachen und damit nur geringfügig die Fitness der Sorte beeinträchtigen, oft ignoriert. In beiden Fällen führen jedoch eine längere Inkubation und Passage der mutierten Stämme für mehrere Generationen in der Regel zur Anhäufung von Suppressormutanten, die den Phänotyp des Elternstamms2,9wiederhergestellt haben. Die Charakterisierung von Suppressormutanten und die Identifizierung der Mutationen, die den Wachstumsdefekt des Stammstamms wiederhergestellt haben, ist ein sehr hilfreicher Ansatz, der eine Aufklärung wichtiger und oft neuartiger zellulärer Prozesse ermöglicht10,11.
Wir sind an der Kontrolle der Glutamathomöostase in B. subtilis12interessiert. Ähnlich wie E. colireagiert B. subtilis auf die Störung der Glutamathomöostase(d.h.Block im Glutamatabbau2) durch die Anhäufung von Suppressormutanten. Die genomischen Veränderungen in diesen Suppressormutanten, die durch spontane Mutation erworben wurden, erwiesen sich schnell wieder GlutamatHomöostase9,13. Daher ist es nicht verwunderlich, dass sich die Anpassung von B. subtilis an einen spezifischen Wachstumszustand während der Domestizierung des Bakteriums in der Enzymsynthese und in den entwickelten enzymatischen Aktivitäten widerspiegelt, die am Glutamatstoffwechsel beteiligt sind12. Es wurde vermutet, dass der Mangel an exogenem Glutamat im Wachstumsmedium während des Domestizierungsprozesses die treibende Kraft für die Entstehung und Fixierung des kryptischen Glutamatdehydrogenase (GDH) gudBCR-Gens im Laborstamm 1682,14war. Diese Hypothese wird durch unsere Beobachtung gestützt, dass die reduzierte Menge an GDH-Aktivität im Laborstamm den Bakterien einen selektiven Wachstumsvorteil verschafft, wenn exogenes Glutamat knapp ist2. Darüber hinaus führt die Kultivierung eines B. subtilis-Stamms, die die GDH GudB synthetisiert, in Ermangelung von exogenem Glutamat zur Anhäufung von Suppressormutanten, die das gudB-Gen inaktivierthaben 2 . Offensichtlich ist das Vorhandensein eines katabolisch aktiven GDH für die Zelle nachteilig, da endogen produziertes Glutamat, das sonst für Anabolismus verwendet werden könnte, zu Ammonium und 2-Oxoglutarat degradiert wird (Abbildung 1). Im Gegensatz dazu hat ein B. subtilis-Stamm, der mit hoher GDH-Aktivität ausgestattet ist, einen selektiven Wachstumsvorteil gegenüber einer Sorte, die nur einen funktionellen GDH synthetisiert. Es ist davon auszugehen, dass die hohe GDH-Aktivität es den Bakterien ermöglicht, Glutamat als zweite Kohlenstoffquelle zusätzlich zu anderen Kohlenstoffquellen zu nutzen, die vom Medium2 bereitgestellt werden (siehe Abbildung 1). So, GDH-Aktivität stark beeinflusst die Fitness von Bakterien, abhängig von der Verfügbarkeit von exogenen Glutamat.
Hier stellen wir eine sehr anschauliche Methode zur Überwachung und Visualisierung der intraspezies-Konkurrenz zwischen zwei B. subtilis-Stämmen vor, die sich in einem einzigen Ort auf dem Chromosom unterscheiden (Abbildung 2). Die beiden Stämme wurden mit den Yfp- und cfp-Genen beschriftet, die die Fluorophore YFP und CFP kodieren, und unter verschiedenen Ernährungsbedingungen kokultiviert. Durch Probenahmen im Laufe der Zeit und durch Das aufgeeignete Verdünnungen auf Agarplatten konnten die Überlebenden in jeder der Kulturen leicht mit einem gemeinsamen Stereofluoreszenzmikroskop überwacht werden. Das in diesem Papier beschriebene Verfahren ist einfach durchzuführen und geeignet, die schnelle klonale Expansion und Eliminierung von vorteilhaften bzw. schädlichen Mutationen in einer Zellpopulation im Laufe der Zeit zu visualisieren.

<table><tbody><tr><td>(NH4)2SO4&nbsp;</td><td>Roth, Deutschland</td><td>3746</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Difco, USA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-Eisencitrat (CAF)</td><td>Sigma-Aldrich, Deutschland</td><td>9714</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp; </td><td>Roth, Deutschland</td><td>5239</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Applichem, Deutschland</td><td>A3617</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Roth, Deutschland</td><td>4043</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4&bull; 3H2O</td><td>Roth, Deutschland</td><td>6878</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Applichem, Deutschland</td><td>A3582</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth, Deutschland</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Roth, Deutschland</td><td>6751</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O&nbsp;</td><td>Roth, Deutschland</td><td>P027</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&nbsp;</td><td>Roth, Deutschland</td><td>T881</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&bull; 4H2O</td><td>Merck Millipore, Deutschland</td><td>102786</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth, Deutschland</td><td>9265</td><td></td></tr><tr><td>Nährstoffbrühe</td><td>Roth, Deutschland</td><td>X929</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumglutamat</td><td>Applichem, Deutschland</td><td>A3712</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Roth, Deutschland</td><td>8952</td><td></td></tr><tr><td>Tryptophan</td><td>Applichem, Deutschland</td><td>A3445</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Roth, Deutschland</td><td>2363</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Reaktionsgefäße</td><td>Sarstedt, Deutschland</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml Reaktionsgefäße</td><td>Sarstedt, Deutschland</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Kunststoffgefäße mit Schraubverschluss</td><td>Sarstedt, Deutschland</td><td>62.554.001</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Sarstedt, Deutschland</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Küvetten aus Polystyrol</td><td>Sarstedt, Deutschland</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Kulturgefäße aus Glas&nbsp;</td><td>Marke, Deutschland</td><td>7790 22</td><td></td></tr><tr><td>100 ml Schüttelkolben mit Aluminiumkappen</td><td>Marke, Deutschland</td><td>928 24</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 10 ml Glaspipetten</td><td>Marke, Deutschland</td><td>278 23</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator (28 und 37 > C)</td><td>New Brunswick</td><td>M1282-0012</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Pipettenset (2-20 &mu; l, 10-100 &mu; l, 100-1.000 &mu; l)</td><td>Eppendorf, Deutschland</td><td>4910 000.034, 4910 000.042,</td><td></td></tr> <tr><td>Tischzentrifuge für 1,5 und 2 ml Reaktionsgefäße</td><td>Thermo Scientific, Heraeus Fresco 21, Deutschland</td><td>75002425</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge für 15 ml Kunststoffröhrchen</td><td>Heraeus Biofuge Primo R, Deutschland</td><td>75005440</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Spektralphotometer</td><td>Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro, Deutschland</td><td>80-2112-21</td><td></td></tr><tr><td>Stereofluoreszenzmikroskop&nbsp;</td><td>Zeiss SteREO Lumar V12, Deutschland</td><td>495008-0009-000</td><td></td></tr><tr><td>Gefrierschrank (-20 und -80 &deg; C)</td> <td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Kühlschrank (4 Grad; C)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>Zirbus, LTA 2x3x4,</td> <td>Deutschland-pH-Messgerät</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>pH-Meter 766, Calimatic, Knick, Deutschland</td><td>766</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Vortex 3, IKA, Deutschland</td><td>3340000</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>CP2202S, Sartorius, Deutschland</td><td>ersetzt durch</td><td></td></tr><tr><td>Schwarzer Stift (Permanentmarker)</td><td>Staedler, Deutschland</td><td>317-9</td><td></td></tr><tr><td>Powerpoint-Programm</td><td>Microsoft, USA-Office</td> <td>Excel-Programm</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Microsoft, USA-Programm</td><td></td> <td>zur Datenverarbeitung</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS5</td><td>Adobe, USA</td><td>ersetzt durch CS6, Download</td><td>Computerprogramm zur Bildbearbeitung</td></tr><tr><td>Computer-PC</td><td>oder</td> <td>Mac-ZEN</td><td></td></tr> <tr><td>pro 2011 Software für das Stereofluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss, Deutschland</td><td>410135 1002 110</td><td>AxioCam MRc Rev. Gewonnen durch Zeiss</td></tr><tr><td colspan="4">Specific solution recipes</td></tr><tr><td colspan="4">SP Medium</td></tr><tr><td>8 g Nährstoffbrühe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25 mg MgSO4&bull; 7H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 g KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>15 g Agar für festes SP-Medium</td><td></td><td></td>, <td>bei Bedarf</td></tr><tr><td>1 L mit H2O</td><td></td><td></td><td>Autoklav für 20 min bei 121 & Grad; C</td></tr><tr><td>1 ml CaCl2 (0,5 M), sterilisiert durch Filtration</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml MnCl2 (10 mM), sterilisiert durch Filtration</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Ammonium-Eisencitrat (CAF, 2,2 mg/ml), sterilisiert durch Filtration</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">LB Medium</td></tr><tr><td>10 g Trypton</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 g Hefeextrakt</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>10 g NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>15 g Agar für festes LB>Medium</td><td></td><td></td>, <td>bei Bedarf</td></tr><tr><td>1 L mit H2</subO</td><td></td><td></td><td>für 20 min bei 121 μg zugeben; C</td></tr><tr><td colspan="4">C-Glc Minimal Medium</td></tr><tr><td>200 ml 5 x C-Salze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilisiert durch Filtration</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml Ammonium-Eisencitrat (CAF, 2,2 mg/ml), sterilisiert durch Filtration</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml III'-Salze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 ml Glukose (20%)</td><td></td><td></td><td>20 min bei 121 °C autoklaviert; </td></tr><tr><td>C 1 L mit sterilem H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td hinzufügen colspan="4">CE-Glc Minimal Medium</td></tr><tr><td>200 ml 5 x C Salze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml L-Tryptophan (5 mg/ml), sterilisiert durch Filtration</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml Ammonium(IIItricitrat) (CAF, 2,2 mg/ml), sterilisiert durch Filtration</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml III&rsquo; Salze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml Glutamat (40%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 ml Glukose (20%), autoklaviert für 20 min bei 121 &de; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 L mit sterilen H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 x C Salzen zugeben&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 g KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>80 g K2HPO4&bull; 3H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16,5 g (NH4)2SO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>add 1 L mit sterilem H2O</td><td></td><td></td><td>Autoklav für 20 min bei 121 &/deg; C</td></tr><tr><td>III'-Salze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,232 g MnSO4&bull; 4H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12,3 g MgSO4&bull; 7H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 L mit sterilem H2O zugeben, 20 min bei 121 μm autoklavieren; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40% Glutamatlösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 g L-Glutaminsäure</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 ein, indem Sie ca. 80 g KOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hinzufügen, fügen Sie 0,5 l mit sterilem H2O</td><td></td><td></td><td>Autoklaven für 20 min bei 121 & Grad hinzu; C</td></tr><tr><td colspan="4"><starke>0,9%ige Kochsalzlösung (NaCl)-Lösung</stark></td></tr><tr><td>Zugabe 1 L mit sterilem H2O-Autoklaven</td><td></td><td></td><td>für 20 min bei 121 α; C</td></tr><tr><td>50% Glycerinlösung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>295 ml Glycerin (87%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,5 l mit sterilem H2O</td><td></td><td></td><td>Autoklaven für 20 min bei 121 & Grad; C</td></tr><tr><td colspan="4">Bakterien (Alle Stämme basieren auf dem Bacillus subtilis Stamm 168)</td></tr><tr><td>Bacillus subtilis BP40 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-yfp)&nbsp;</td>Sammlung <td></td><td></td><td>von Laborstämmen</td></tr><tr><td>Bacillus subtilis BP41 (rocG+ gudBCR amyE::P gudB-cfp)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis BP52 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-cfp)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis BP156 (rocG+ gudB+ amyE::P gudB-yfp)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Überwachung des intraspezies-wettbewerbs in einer bakteriellen zellpopulation durch kokultivierung fluoreszierender stämme

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Viele Mikroorganismen wie Bakterien vermehren sich extrem schnell und die Populationen können hohe Zelldichten erreichen. Kleine Zellfraktionen in einer Population haben immer angesammelte Mutationen, die entweder schädlich oder vorteilhaft für die Zelle sind. Wenn der Fitnesseffekt einer Mutation der Subpopulation einen starken selektiven Wachstumsvorteil verschafft, können die Individuen dieser Subpopulation schnell überwettbewerben und sogar ihre unmittelbaren Mitmenschen vollständig eliminieren. So können kleine genetische Veränderungen und selektionsgesteuerte Anhäufung von Zellen, die vorteilhafte Mutationen erworben haben, zu einer vollständigen Verschiebung des Genotyps einer Zellpopulation führen. Hier stellen wir ein Verfahren zur Überwachung der schnellen klonalen Expansion und Eliminierung von vorteilhaften bzw. schädlichen Mutationen in einer bakteriellen Zellpopulation im Laufe der Zeit durch Kokultivierung von fluoreszierend markierten Individuen des Gram-positiven Modellbakteriums Bacillus subtilisvor. Die Methode ist einfach durchzuführen und sehr anschaulich, um intraartenWettbewerb unter den Individuen in einer bakteriellen Zellpopulation zu zeigen.

Die hier beschriebene Methode wurde erfolgreich angewandt, um den Wettbewerb innerhalb von Arten in einer Zellpopulation zu visualisieren, die aus B. subtilis-Stämmen besteht, die mit den cfp- und yfp-Genen gekennzeichnet wurden, die die Fluorophore CFP bzw. YFP kodieren. Wie in Abbildung 3dargestellt, kann die Methode verwendet werden, um den Wettbewerb innerhalb der Spezies sehr anschaulich zu visualisieren. Durch das Aufspüren der Proben auf kleinen Flächen wurde die klonale...

Bakterien können sich während ihres Lebens entweder schädliche oder vorteilhafte Mutationen ansammeln. In einer Population von Zellen können Individuen, die vorteilhafte Mutationen angesammelt haben, ihre Mitmenschen schnell übertreffen. Hier stellen wir ein einfaches Verfahren zur Visualisierung der intraspezies-Konkurrenz in einer bakteriellen Zellpopulation im Laufe der Zeit mit fluoreszierend markierten Individuen vor.

Überwachung des Intraspezies-Wettbewerbs in einer bakteriellen Zellpopulation durch Kokultivierung fluoreszierender Stämme

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a ...

Diese Methode nutzt die Kokultivierung von fluoreszenzmarkierten Bacillus subtilis, um die schnelle klonale Expansion und Eliminierung von vorteilhaften und nachteiligen Mutationen in einer bakteriellen Zellpopulation über die Zeit hinweg zu überwachen. Bereiten Sie zunächst die Vorkulturen der Bakterien für das Wettbewerbsexperiment vor. Mischen Sie gleiche Mengen der fluoreszenzmarkierten Stämme und kultivieren Sie die Bakterien unter verschiedenen Ernährungsbedingungen gemeinsam.Sammeln Sie dann die Proben zu verschiedenen Zeitpunkten, verdünnen Sie diese angemessen und vermehren Sie die Zellen auf Agarplatten. Visualisieren und zählen Sie nun die überlebenden Stämme mittels Stereofluoreszenzmikroskopie. Letztendlich können die Ergebnisse den Prozentsatz der überlebenden Bakterien im Verhältnis zur Gesamtanzahl der gezählten Kolonien bestimmen.Im Gegensatz zur Überwachung der Intraspezies-Konkurrenz mithilfe verschiedener Antibiotikaresistenzkassetten zur Stammmarkierung sind in dieser Methode fluoreszenzmarkierte Konkurrenzstämme nahezu vollständig isotonisch und in der Lage, auf denselben AGA-Platten zu wachsen. Den Vorbereitungsschritt wird Lorena vorstellen, die Doktorandin

monitoring-intraspecies-competition-bacterial-cell-population

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Quelle: Speare, L., et al. Coinkubationsassay zur Quantifizierung kompetitiver Wechselwirkungen zwischen Vibrio fischeri Isolaten. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt einen Co-Inkubations-Assay, mit dem untersucht wird, wie Bakterienstämme in einer gemeinsamen Umgebung konkurrieren. Es wird in der Mikrobiologie häufig eingesetzt, um Mechanismen wie die kontaktabhängige oder kontaktunabhängige Abtötung zu identifizieren, die diese Wechselwirkungen antreiben.

Coinkubationsassay zur Untersuchung kompetitiver Wechselwirkungen zwischen Bakterienstämmen

Dieses Video zeigt eine auf Fluoreszenzmikroskopie basierende Methode zur Untersuchung der bakteriellen Konkurrenz auf Einzelzellebene. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die Struktur und Funktion von Bakteriengemeinschaften.

Bakterieller Co-Inkubations-Assay: Eine auf Fluoreszenzmikroskopie basierende Technik zur Visualisierung der intraspezifischen bakteriellen Konkurrenz auf Einzelzellebene

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Ein Visual Assay zur T6SS-vermittelte bakterielle Wettbewerb überwachen

Bakterien produzieren sezernierten Verbindungen, die das Potenzial, die Physiologie der Mikroorganismen ihre Nachbarn beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Co-Kultur Bildschirm, der Nachweis solcher chemisch vermittelte Inter Wechselwirkungen durch Mischen von Bodenmikroben mit fluoreszierenden Reporter-Transkriptions Stämmen von Bacillus subtilis auf festen Medien ermöglicht.

Mit Cokultur zur Erkennung chemisch vermittelte Interspezies-Interaktionen

Die Rolle des Sortiments (räumliche Trennung) in evolutionären Szenarien können mit einfachen mikrobiellen Systemen im Labor untersucht werden, die eine Anpassung der räumlichen Verteilung gesteuert ermöglichen. Durch eine Modifikation können die Gründer Zelldichte, verschiedene Sortiment Ebenen fluoreszenzmarkierte Bakterienstämme in der Kolonie Biofilme von Bacillus subtilis verwendet werden sichtbar gemacht .

Überwachung räumliche Trennung in Oberflächen Colonizing mikrobiellen Populationen

Bakterien kodieren verschiedene Mechanismen für die Teilnahme an interbakteriellen Wettbewerb. Hier stellen wir ein kulturbasiertes Protokoll zur Charakterisierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen bakteriellen Isolaten und deren Auswirkungen auf die räumliche Struktur einer gemischten Population vor.

Coincubation Assay zur Quantifizierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen Vibrio fischeri Isolaten

Dieses live-bakterielle Zellbildgebungsprotokoll ermöglicht die Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen mehreren Bakterienarten auf einzelzelliger Ebene im Laufe der Zeit. Die Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die Beobachtung jeder Bakterienart in Monokultur oder Kokultur, um Wechselwirkungen zwischen den Arten in bakteriengemeinschaften mit mehreren Arten, einschließlich individueller Zellbeweglichkeit und Lebensfähigkeit, zu untersuchen.

Kinetische Visualisierung von einzelzelligen Interspezies-Bakterien-Wechselwirkungen

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Verwendung der Einzelzellfluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung und Quantifizierung der bakteriellen Konkurrenz in der Kokultur.

Quantifizierung der interbakteriellen Konkurrenz mittels Einzelzell-Fluoreszenzbildgebung

Titel der Verkapselung von Zellen durch Tröpfchen

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Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

Lernen Sie die Kokultivierung fluoreszierender Bacillus subtilis-Stämme zur Überwachung intraspezifischen Wettbewerbs in Bakterienpopulationen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung überlebender Kolonien und liefert Einblicke in mikrobielle Evolution.

Überwachung des Intraspezies-Wettbewerbs in einer bakteriellen Zellpopulation durch Kokultivierung fluoreszierender Stämme

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