Überwachung des Intraspezies-Wettbewerbs in einer bakteriellen Zellpopulation durch Kokultivierung fluoreszierender Stämme
18. Januar 2014
Bakterien können sich während ihres Lebens entweder schädliche oder vorteilhafte Mutationen ansammeln. In einer Population von Zellen können Individuen, die vorteilhafte Mutationen angesammelt haben, ihre Mitmenschen schnell übertreffen. Hier stellen wir ein einfaches Verfahren zur Visualisierung der intraspezies-Konkurrenz in einer bakteriellen Zellpopulation im Laufe der Zeit mit fluoreszierend markierten Individuen vor.
Diese Methode nutzt die Co-Kultivierung von fluoreszenzmarkiertem Bacillus sutilis, um die schnelle klonale Expansion und Eliminierung von nützlichen und schädlichen Mutationen in einer bakteriellen Zellpopulation im Laufe der Zeit zu überwachen. Bereiten Sie zunächst die Vorkulturen der Bakterien für das Wettbewerbsexperiment vor. Mischen Sie gleiche Mengen der fluoreszenzmarkierten Stämme und kultivieren Sie die Bakterien unter verschiedenen Ernährungsbedingungen.
Sammeln Sie dann die Proben zu verschiedenen Zeitpunkten, verdünnen Sie sie entsprechend und vermehren Sie die Zellen auf Agarplatten. Visualisieren und zählen Sie nun die überlebenden Stämme mit Hilfe der Stereofluoreszenzmikroskopie. Letztendlich können die Ergebnisse den prozentualen Anteil der überlebenden Bakterien in Bezug auf die Gesamtzahl der gezählten Kolonien bestimmen.
Im Gegensatz zur Überwachung der Konkurrenz innerhalb der Spezies mit verschiedenen Antibiotika-Re-Kassetten für die Stammmarkierung. Bei dieser Methode sind fluoreszenzmarkierte Konkurrenzstämme fast vollständig isotonisch und in der Lage, auf den gleichen AGA-Platten zu brauen. Das Vorverfahren wird von Lorena vorgestellt, die Doktorandin in meinem Labor ist: Impfen Sie die vier Milliliter LB-Medium mit einem Mikroliter Bakterien von minus 80 Grad Celsius, kryo-Bestände und züchten Sie die Vorkulturen über Nacht bei 28 Grad Celsius und 220 U/min, verdünnen Sie 0,1 Milliliter Kultur zu 0,9 Millilitern LB-Medium in einem 1,5-Milliliter-Vete, und bestimmen Sie die optische Dichte.
Um gemischte Zellpopulationen für die Wettbewerbsexperimente zu erhalten, inokulieren Sie dann 100-Milliliter-Schüttelkolben, die 20 Milliliter CGLC und CGLC enthalten. Minimales Medium im Verhältnis eins zu eins, 10 Milliliter der Kulturen in 15 Milliliter Kunststoffröhrchen umfüllen. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 4.000-facher Schwerkraft und entsorgen Sie den Überstand.
Dann resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 Millilitern frischem LB-Medium und überführen Sie die Zellen in einen sterilen 1,5-Milliliter-Reaktionsbecher, fügen Sie 0,5 Milliliter 50% steriles Glycerin hinzu. Mischen Sie die Suspension durch rigoroses Vortexen und lagern Sie die Proben in einem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Als nächstes werden die restlichen Bakterien in den Schüttelkolben kultiviert.
Bewahren Sie die Schüttelkolben im Dunkeln auf, um ein Photobleichen der Flora Force Probe zu verhindern, messen Sie 0,1 Milliliter der Kulturen nach sieben Stunden und 24 Stunden Wachstum und beachten Sie die optische Dichte von eins zu 10 Verdünnung der Proben, machen Sie Kryovorräte der Proben, um sie bei minus 80 Grad Celsius zu lagern. Nachdem Sie alle Proben entnommen haben, tauen Sie die Kryo-Vorräte auf und verdünnen Sie die Zellen in einer 0,9%igen Kochsalzlösung für jede Stammplatte. 0,1 Milliliter der 10 bis zur negativen fünften Verdünnung auf eine SP-Medium-Agarplatte geben und die Zellen mit einer sterilen Glaspipette verteilen.
Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius im Dunkeln, bis einzelne Völker mit einem schwarzen Stift erschienen sind. Teilen Sie den Boden der Agarplatte zur besseren Orientierung in vier Teile, während Sie die Überlebenden unter dem Stereofluoreszenzmikroskop zählen. Legen Sie nun die Platte kopfüber unter das Mikroskop und bringen Sie die Kolonien mit der Kaltlichtquelle in den Fokus.
Sobald die Völker im Fokus sind, wechseln Sie zum entsprechenden Filterset für CFP Flora vier. Um die überlebenden Zellen des CFP-markierten Stammes zu visualisieren, zählen Sie die Überlebenden dieses Stammes, indem Sie die Kolonien mit einem Stift markieren. Und notieren Sie sich die Zahl.
Entfernen Sie die Etiketten mit Ethanol. Wechseln Sie dann zum YFP-Filterset. Zur Visualisierung der überlebenden Zellen des YFP-markierten Stammes.
Zähle die Überlebenden erneut, indem du die Kolonien mit einem Stift beschriftest. Und notieren Sie sich die Zahl. Öffnen Sie die Bilder von einer Stelle, die mit dem CFP-Filterset und dem YFP-Filterset aufgenommen wurden.
Optimieren Sie den Kontrast und die Helligkeit, um die Hintergrundfluoreszenz des Mediums zu reduzieren. Gehen Sie zu einem der Bilder und wählen Sie alle aus. Kopieren Sie das Bild, und fügen Sie es in das andere Bild ein.
Führen Sie die Bilder zusammen, indem Sie im Ebenenmenü die Option hellere Farbe auswählen. In diesem Experiment wurde eine Zellpopulation, bestehend aus zwei BCI-Stämmen, mit dem Fluor CFP und YFP markiert, um die Wirkung verschiedener Stickstoffquellen auf das Wachstum durch Plattieren geeigneter Verdünnung auf Agarplatten zu bewerten. Die klonale Zusammensetzung einer Zellpopulation im Laufe der Zeit kann einfach durch das Zählen der gelb und blau fluoreszierenden Kolonien genau bestimmt werden.
Die Aktivität des Glutamat-Dehydrogenase-Enzyms beeinflusst die Fitness des Otus stark in Abhängigkeit von der Verfügbarkeit von exogenem Glutamat. In Abwesenheit von exogenem Glutamat ist eine hohe GDH-Aktivität für die Bakterien nachteilig, da die Enzyme Rock G und gutes B das Glutamat abbauen, das für den Anabolismus benötigt wird. Im Gegensatz dazu ist die Synthese von zwei funktionellen gdhs für die Bakterien vorteilhaft, wenn exogenes Glutamat zur Verfügung steht, da neben G auch Glukoseglutamat als Kohlenstoffquelle verwendet wird.
Ähnliche Ergebnisse wurden in einem Die-Switch-Experiment erzielt. Auch hier wurden Bakterien, die über eine hohe GDH-Aktivität verfügten, von Zellen mit reduzierter GDH-Aktivität in Wachstumsmedien ohne Glutamat verdrängt. Im Gegensatz dazu wurden Bakterien, die nur ein aktives GDH synthetisierten, aus der Kultur eliminiert.
Wenn das Medium mit Glutamat ergänzt wurde, blieb die anfängliche Zusammensetzung der gemischten Zellpopulation über die Zeit nahezu konstant. Unabhängig von Fluor zusammen. Der Einsatz von Flora Force ist ein leistungsfähiges Instrument zur Überwachung der Konkurrenz innerhalb der Spezies in einer bakteriellen Zellpopulation, sobald die Stärken der Mitbewerber ermittelt wurden.
Diese Technik kann in fünf Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zur Visualisierung der Intraspezies-Konkurrenz in bakteriellen Populationen unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Bacillus subtilis vor. Der Ansatz ermöglicht die Beobachtung der klonalen Expansion und Eliminierung von vorteilhaften und nachteiligen Mutationen über die Zeit hinweg.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Genetik
- Zellbiologie
Hintergrund
- Bakterien können sowohl vorteilhafte als auch nachteilige Mutationen ansammeln.
- Vorteilhafte Mutationen können zu konkurrierenden Vorteilen in bakteriellen Populationen führen.
- Die Visualisierung dieser Dynamiken kann das Verständnis der mikrobiellen Evolution verbessern.
- Die fluoreszenzmarkierte Kennzeichnung erleichtert die Verfolgung einzelner Bakterienstämme.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur Beobachtung der Konkurrenz zwischen Bakterienstämmen entwickeln.
- Den Einfluss ernährungsbedingter Faktoren auf das Überleben von Mutationen bewerten.
- Den Anteil überlebender Stämme über die Zeit quantifizieren.
Verwendete Methoden
- Kokultivierung von fluoreszenzmarkierten Bacillus subtilis-Stämmen.
- Vermischung gleicher Mengen markierter Stämme unter variierenden Ernährungsbedingungen.
- Probenahme zu verschiedenen Zeitpunkten zur Analyse.
- Visualisierung und Zählung der überlebenden Stämme mittels stereoskopischer Fluoreszenzmikroskopie.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der Wettbewerbsdynamik in bakteriellen Populationen.
- Quantifizierung des Prozentsatzes überlebender Bakterien.
- Identifizierung von Bedingungen, die vorteilhaften Mutationen begünstigen.
- Erkenntnisse über die evolutionären Prozesse von Bakterien.
Schlussfolgerungen
- Die Methode demonstriert effektiv die intraspezifische Konkurrenz bei Bakterien.
- Die fluoreszenzmarkierte Färbung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Verfolgen von Mutationen.
- Das Verständnis dieser Dynamiken kann zur mikrobiellen Ökologie und Evolution beitragen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Überwachung des intraspezifischen Wettbewerbs in bakteriellen Populationen ermöglicht die frühzeitige Erkennung von Fitnessvorteilen durch genetische Veränderungen und unterstützt die Zielvalidierung bei der Entdeckung von Antimikrobiellen Wirkstoffen. Die Methode liefert quantitative, visuelle Aussagen über die klonalen Dynamiken unter kontrollierten Ernährungsbedingungen und trägt so zur mechanistischen Risikominderung bei der Stamm-Engineering-Strategie bei. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung von Leitstrukturen, indem er das Genotyp-Phänotyp-Verhältnis mit der konkurrierenden Fitness in krankheitsrelevanten Systemen verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem selektive Wachstumsvorteile mutanter Teilpopulationen gemessen werden.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die biologische Risikominimierung durch direkte Visualisierung des Einflusses von Mutationen auf die Fitness der Population.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Selektion von Portfoliooptionen, indem die Fitnessauswirkungen unter wechselnden Umweltbedingungen quantifiziert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Screening-Verfahren vor, indem die basale konkurrierende Fitness etabliert wird.
- Operationaler Wert: Liefert standardisierte, reproduzierbare quantitative Ergebnisse mittels fluoreszenzbasierter Koloniezählung.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform über verschiedene Stamm-Bibliotheken und ernährungsbedingte Variablen hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die Fitness-Messungen in der Entdeckungsphase mit der präklinischen Validierung durch den Vergleich isogener Stämme.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Klärt die beitragsmäßige Rolle von Wegen auf Ebene der Fitness, wie beispielsweise die Aktivität der Glutamat-Dehydrogenase, unter definierten Nährstoffbedingungen.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem Bedingungen identifiziert werden, die für oder gegen eingebaute Eigenschaften sprechen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode eignet sich für die frühe Entdeckungsphase bis zur Identifizierung von Leitverbindungen und liefert Fitnessdaten, die die Auswahl von Stämmen und die Prioritäten für das Engineering vor der präklinischen Investition informieren.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem genetische Modifikationen mit Wettbewerbsresultaten in Co-Kultur verknüpft werden.
- Screening: Liefert quantitative, versuchsfertige Fitness-Messungen unter kontrollierten Ernährungsbedingungen.
- Analytik: Ermöglicht den Vergleich der Stamm-Fitness durch Berechnung des prozentualen Überlebens anhand der Fluoreszenzmikroskopie.
- Translationale Forschung: Verbindet mit präklinischen Arbeiten, indem Fitness-Baselines für konstruierte Stämme in krankheitsrelevanten Medien etabliert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Plattform zur Fitness-Bewertung von Stamm-Bibliotheken und Umweltfaktoren.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten bezüglich des Beitrags zur Fitness reduziert werden.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch fluoreszenzmarkierte Nachweise und mikroskopiebasierte Quantifizierung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem frühzeitige, auf der Fitness basierende Go/No-Go-Entscheidungen in der Stammoptimierung ermöglicht werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem Bedingungen identifiziert werden, die den Wettbewerbsvorteil verstärken oder abschwächen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der mikrobiellen Genetik, Fluoreszenzmikroskopie und im Design von Wettbewerbsfitness-Assays.
- Benötigt eine sterile Kultivierungsinfrastruktur, Inkubatoren sowie eine Stereofluoreszenzmikroskopie mit geeigneten Filterkombinationen.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Probenpräparation, Verdünnungsprotokollen und Koloniezählverfahren voraus.
- Eine Übertragung auf verschiedene Modellsysteme erfordert die Validierung der Stabilität der fluoreszierenden Markierung und einer möglichst geringen metabolischen Belastung.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören eine mögliche Photobleiche und die Notwendigkeit einer Dunkelinkubation zur Erhaltung der Signalintegrität.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
1:16
Cocultivation of Bacteria, Sample Collection, and Sample Storage
3:00
Sample Treatment, Plating, and Incubation for Quantitative Analyses
3:32
Counting the Survivors by Stereo Fluorescence Microscopy for Quantitative Analysis
4:46
Results: Intraspecies Competition
6:25
Conclusion
0:05
Title
