Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, den dynamischen Prozess der Phagosomenreifung und der Phagolysosomenbiogenese in Phagozyten in Echtzeit zu erfassen. Dies wird erreicht, indem die lysosomalen Kompartimente der Zellen mit fluoreszierendem konjugiertem Dex-Strang beladen werden, um die Visualisierung lysosomaler Kompartimente und die Übertragung seiner luminalen Fracht auf Phagosomen zu ermöglichen. In einem zweiten Schritt werden Mikropartikel hinzugefügt, die als phagozytisches Modell dienen.

Als nächstes wird die Abgabe von lysosomalem Material an die Phagosomen mittels Live-Sale-Imaging und anschließender digitaler Bildverarbeitung analysiert. Um den Phagosomenreifungsprozess zu quantifizieren, zeigen die Ergebnisse die Wirkung verschiedener Faktoren auf den Prozess der Phagosomenreifung, basierend auf der Abgabe von lysosomem Inhalt an die Phagosomen. Der Hauptvorteil dieser Technik bestehender Methoden, wie z.B. der Bewertung der Makrophagenreifung in fixierten Zellen, ist die quantitative Auslesung mit hoher zeitlicher Auflösung: Beginnen Sie mit dem Auflösen von Texas rot markierten 70 Kilodalton DExT-Strang oder Dex 70 KD in PBS bei 20 Milligramm pro Milliliter und lagern Sie Aliquots bei minus 20 Grad Celsius.

Als nächstes verdünnen Sie den Dex 70 KD-Stamm in vollständiger Zellkultur Docos, modifiziertem Eagles-Medium oder DMEM auf etwa ein Milligramm pro Milliliter. Beschallen Sie den DExT-Strang fünf Minuten lang in einem Ultraschall-Wasserbad. Zentrifugieren Sie dann die Lösung in einer Mikrozentrifuge fünf Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit, um Klumpen oder Verunreinigungen aus der Lösung zu entfernen.

Schieben Sie den SuperAgent vorsichtig in ein frisches Rohr und vermeiden Sie dabei das Pellet am Boden. Verdünnen Sie dann die Lösung in einer vollständigen Zellkultur auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter. DMEM und Filter.

Sterilisieren Sie die Lösung durch einen 0,22-Mikrometer-Filter mit Spritze. Als nächstes sehen Sie zwei Milliliter aus dem Knochenmark gewonnene Mausmakrophagen bis zu einer Konzentration von fünfmal 10 bis vier Zellen pro Milliliter. Inkubieren Sie die Zellen in DMEM in einer unbeschichteten Glasbodenschale für mindestens 12 Stunden bei 37 Grad Celsius in einer mit 5 % Kohlendioxid gepufferten Atmosphäre.

Um die Anheftung und Akklimatisierung nach der Anheftung zu gewährleisten, aspirieren Sie das Medium und geben Sie zwei Milliliter Vorkriegs-DExT-Strang DMEM in die Glasbodenschale und inkubieren Sie die Zellen nach der Inkubation zwei bis acht Stunden lang. Waschen Sie die Zellen dreimal mit vollständigem DMEM. Nach der letzten Spülung das Medium ansaugen und zwei Milliliter vollständiges DMEM hinzufügen.

Inkubieren Sie die Zellen vier bis 12 Stunden lang. Spülen Sie dann die Zellen mit vorgewärmtem phenolrotfreiem vollständigem DMEM und fügen Sie mindestens 30 Minuten vor Beginn der Bildgebung zwei Milliliter vollständig gefiltertes phenolrotfreies DMEM hinzu. Anschließend wird ein Aliquot aus 1%IgG-beschichteter Rübensuspension, die wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben hergestellt wurde, auf Raumtemperatur gebracht.

Beschallen Sie die Lösung zwei bis drei Minuten lang in einem Ultraschall-Wasserbad. Geben Sie dann unter einer Biosicherheitswerkbank der Klasse zwei ein bis sechs Mikroliter der Bead-Suspension zu den Zellen. Zerstreuen Sie die dichte Wolke aus Kügelchen, indem Sie die Suspension mit einer Pipette vorsichtig in der Glasbodenschale mischen.

Bringen Sie dann die Probe zum Mikroskop und fokussieren Sie sich auf die interessierende Region. Vor der Zeitrafferaufnahme. Optimieren Sie die Einstellungen, einschließlich Scannen, Geschwindigkeitsvergrößerung und Auflösung, um alle sieben bis 20 Sekunden ein Bild aufnehmen zu können.

Passen Sie die Einstellungen für die Anregungsemission basierend auf dem verwendeten Bildgebungssystem und den verwendeten Sonden an und optimieren Sie die Einstellungen, um übermäßiges Photobleaching zu verhindern. Nehmen Sie dann das Zeitraffervideo auf und speichern Sie es im nativen Dateiformat Ihres Mikroskops. Vermeiden Sie es, das Video in komprimierte Formate wie JPG oder PNG zu exportieren.

Starten Sie als Nächstes die Distribution Fiji und Image J, die ein Bildverarbeitungspaket mit neu organisierten Werkzeugmenüs und zusätzlichen nativen Plugins enthält, die kostenlos verfügbar sind. Herunterladen. Öffnen Sie die Datei in Fidschi und wählen Sie das Video aus, das ausgewertet werden soll. Stellen Sie dann die Optionen, Filter und Messparameter ein, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.

Scannen Sie als Nächstes die Bilder und notieren Sie sich den Rahmen, in dem sich ein vollständig ausgebildetes entstehendes Perlenphagosom bildet und der saure F-Becher geschlossen ist. Verwenden Sie das Auswahlwerkzeug "Oval", um einen kreisförmigen Bereich von Interesse oder ROI auf der internalisierten Raupe auszuwählen. Stellen Sie sicher, dass die Auswahl eng an der Außenkante der Raupe anliegt.

Gehen Sie dann zu Analysieren und klicken Sie auf Messen, um die Messung auszuführen. Das Ergebnis wird in einem separaten Fenster mit dem Titel Ergebnisse angezeigt. Passen Sie im nächsten Frame of Interest die Position des ROI an, falls sich die Raupe bewegt hat, und wiederholen Sie die Messung, die der Liste im Ergebnisfenster hinzugefügt wird.

Jeder analysierte Rahmen kann anhand des Werts in der Beschriftungsspalte identifiziert werden. Nachdem Sie die Messung aller relevanten Rahmen abgeschlossen haben, kopieren Sie die Werte aus der Spalte "int den" in eine Tabellenkalkulationsanwendung. Die Spalte int den stellt die Intensitäten des ausgewählten Bereichs dar.

Mit diesen Methoden wurden klare Bilder von aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen aufgenommen, die mit den DExT-Strangsonden beladen worden waren. Dieses Bild stammt vom Zeitpunkt Null, d. h. zu dem Zeitpunkt, an dem die Zelle die Aufnahme der IgG-kodierten Perle, auf die hier hingewiesen wird, abgeschlossen hat. Die hier gezeigten Bilder wurden zur besseren Sichtbarkeit pseudogefärbt und zeigen das Phagosom von null bis 85 Minuten nach der Aufnahme.

Das gemessene Phagosom, ROI, ist mit der gestrichelten Linie umrandet und die Fälle von Dextranabgabe und -akkumulation im Phagosom sind durch die Pfeile gekennzeichnet. Aus diesen Bildern wurden dann Diagramme generiert, die einen klaren zeitlichen Trend der Signalassoziation mit dem Phagosom im Laufe der Zeit zeigen. Diese Grafik stellt einen Durchschnitt von 10 Phagosomen aus den beiden hier gezeigten Zellen dar.

Während die absolute Signalintensität oft zwischen den einzelnen analysierten Phagosomen variiert, ist der zeitliche Trend normalerweise sehr ähnlich. Nach der Abgabe von Dex 70 KD an die Phagosomen wurde innerhalb von 35 bis 40 Minuten nach der Phagozytose ein Plateau erreicht. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Phagosomenreifung mit Hilfe der konfokalen Zeitraffermikroskopie beurteilen können.