Name: Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Erfahren Sie die Echtzeit-Visualisierung der Phagosomenreifung und Phagolysosomenbiogenese in Makrophagen mittels fluoreszenzmarkierter Dextrane und Live-Zell-Bildgebung. Diese quantitative Methode liefert hochaufgelöste Einblicke in Immunzellfunktionen.

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Wir danken Mitglieder der Phagosomen Biologie-Labor für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wird von einem Helmholtz-Young Investigator Grant (Impuls-und Vernetzungsfonds der Helmholtz-Gemeinschaft) und eine Schwerpunktprogramm SPP1580 Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt.

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<li>Huynh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAMP+proteins+are+required+for+fusion+of+lysosomes+with+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes.</a> EMBO J. 26, 313-324 (2007).</li>
<li>Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+mechanism+of+cargo+sorting+during+lysosome-phagosome+fusion+is+controlled+by+Rab34%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).</li>
<li>Snijder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li>
<li>Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).</li>
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<li>Underhill, D., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors%3A+key+mediators+of+microbe+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors: key mediators of microbe detection.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).</li>
<li>Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I+and+class+III+phosphoinositide+3-kinases+are+required+for+actin+polymerization+that+propels+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes.</a> J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+receptor-ligand+interactions+modulate+gene+expression+and+phagosomal+properties+during+both+early+and+late+stages+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis.</a> Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+phagosome+maturation+as+a+function+of+phagosome%2Flysosome+fusion+and+acquisition+of+hydrolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity.</a> Traffic. 6, 413-420 (2005).</li>
<li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126, 205-218 (2006).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+phagosome+maturation+through+the+real-time%2C+spectrofluorometric+measurement+of+hydrolytic+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities.</a> Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).</li>
<li>Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+phagosomal+degradation+and+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).</li>
<li>Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Responds+to+Chloride+and+pH+as+Synergistic+Cues+to+the+Immune+Status+of+its+Host+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
<li>Aziz, M., Yang, W. -L., Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current protocols in immunology. Coliganet, J. E., et al. 14, (2013).</li>
<li>Rogers, L., Foster, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).</li>
<li>Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+pH%2C+ROS+production%2C+maturation%2C+and+degradation+in+dendritic+cell+phagosomes+using+cytofluorometry-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays.</a> Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Im folgenden Abschnitt werden wir wichtige Schritte des vorgestellten Verfahrens und seine Grenzen zu diskutieren. Außerdem werden wir einige der häufigsten Probleme, mit ihren Lösungen zu verbinden, mögliche Änderungen einzuführen und betrachten Vorteile unserer Methode sowie geeignete komplementäre Methoden für diesen Ansatz. Die Herstellung der Kügelchen, einschließlich der Kopplung von IgG an die Oberfläche der Kügelchen, ist entscheidend und die Verwendung unfresh Zubereitungen sollten ...

Professionelle Phagozyten, einschließlich Makrophagen, spielen im Immunsystem eine kritische. Zusätzlich dazu, dass die erste Verteidigungslinie des angeborenen Immunsystems, sie spielen auch eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung des adaptiven Immunität durch ihre Signal-und Antigen-präsentierenden Rolle 03.01. Während die Funktion von professionellen Phagozyten ist vielfältig ist Phagosomenreifung die kritische Rückgrat der bakteriziden und Antigen-Verarbeitungsfunktion der professionellen Phagozyten 4,5. Bei der Rezeptor-vermittelten Phagozytose und die Aufnahme einer Phagozyten Ziel, wie Bakterien, geht die entstehenden Phagosom über ein komplexes und gut organisierten Ablauf der Interaktion und Austausch mit Fächern des endozytischen Netzwerk und mehreren anderen Zellorganellen 6. Die Art der Verbindungen ausgetauscht mit dieser zellulären Unternehmen als auch die Regulierung und der Zeitpunkt der Fusionsereignisse bestimmt die Lumen phagosomalen Milieu und die phagosomal Membranzusammensetzung und damit 7, das Schicksal der Reifung phagosome 8. Die physiologische Relevanz der Phagosomenreifung wird durch die durch verschiedene intrazelluläre Erreger eingesetzt zu entkommen, zu verhaften oder zu untergraben Phagosomenreifung 9 verschiedenen Strategien veranschaulicht. Die meisten dieser Strategien, die direkt oder indirekt verhindern, dass die letzte und entscheidende Phase der Phagosomenreifung Prozess: die Verschmelzung von Phagosom mit spät endosomale / lysosomale Kompartimente, die sie mit dem Großteil der hydrolytischen Enzymen und antibakteriellen Faktoren einer reifen phagosome 7 verleiht , 8,10. Die Analyse dieser letzte und entscheidende Schritt daher können Sie uns starke Indikatoren über den Zustand der Reifung der Phagosomen bieten und wenn sein wird das natürliche physiologische Zustand positiv oder negativ unter den jeweiligen experimentellen Einstellungen, die genutzt sind betroffen. Die späte endosomale / lysosomale Kompartiments werden im Allgemeinen betrachtet, um die Klemmenräume der endocytischen, definieren und von den frühen endozytotischen Kompartimente durch die Anwesenheit von verschiedenen, spezifischen Stadium, Markermoleküle sein. Zum Beispiel hydrolytische Enzyme oder Membrankomponenten wie lysosomale Membranproteinen assoziiert (Lampen) unter anderem 11. Das Terminal endozytischen-Fächer fortan einfach als Lysosomen-auch als Hauptstandort für die letzten Stadien der Verdauung am Ende der phagozytären / endocytischen 12 dienen bezeichnet. Auf diese Weise können unverdauliche Sonden durch Endozytose und Makropinozytose aus dem extrazellulären Milieu geladen und durch den endocytischen zu den Lysosomen, wo es sich ansammelt 13,14 nach nach einem bestimmten Zyklus der Aufnahme und Chase transportiert werden. Fluorophor-konjugierten Sonden zur Fluoreszenzmikroskopie wie organischen unverdaulichen Polymer Dextran werden üblicherweise als endocyticprobes 15-17. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Bei diesem Verfahren beschreiben wir die Verwendung von IgG-beschichteten Mikrokügelchen als phagozytischen Ladung Phagosomenreifung durch Analysieren der Lieferung von lysosomalen luminalen Inhalte Phagosomen untersuchen. Durch die Verwendung eines fluorophorkonjugierten Dextran Sonde als leicht nachweisbaren Marker von Lysosomen in Live-Knochenmark-Makrophagen (BMM) und Zeitraffer-Video-Imaging mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, folgen wir dem dynamischen Prozess der Zustellung der Ladung in Phagosomen mit hoher zeitliche Auflösung. Wir beschreiben dann, wie die gesammelten Zeitraffer-Bilddaten können mit dem Open-Source und frei verfügbaren Bildanalyse-Software, Fidschi (oder ImageJ) ausgewertet werden, mit Microsoft Excel statistisch analysiert und präsentiert mit GraphPad Prism Software 14,18. Nach der Beschreibung unserer Methode können analoge Versuche mit geänderten Einstellungen und Faktoren, deren Einfluss auf Phagosomenreifung untersuchen gestaltet werden; praktisch jede otihr Typ von adhärenten primären oder Zelllinie Fresszellen, genetische Funktionsverlust Experimente mit Gen-Knock-out und Knock-down, Mutanten oder Expression von Fusionsproteinen, phagocytic-Ziele, Mikrokügelchen Beschichtungsmassen, endosomalen / lysosomalen Sonden und Faktoren wie eine Zytokine, chemische Inhibitoren oder siRNA unter anderem alle Variablen, die auf den grundlegenden Ansatz dieser Methode angewendet werden kann. Wir definieren das Ziel und die grundlegenden Anforderungen dieser Methode wie folgt: <ul type="disc"><li> Ziel der Methode: direkte, quantitative und qualitative Beobachtung und Analyse der Phagosomenreifung mit hoher zeitlicher Auflösung in lebenden Fresszellen zu aktivieren. </li><li> Phagozytische Ladung: Ein entsprechend beschichteten Mikropartikel oder biologische Ziel. Hier verwenden wir IgG-beschichteten 3 um sphärische Polystyrol-Mikropartikel, die leicht über den Fc-γ-Rezeptor-vermittelten Phagozytose internalisiert werden. Alternativ jeder Mikroorganismus oder beschichtet microparticle für die eine phagozytische Rezeptor vorhanden ist an den Zellen verwendet werden. </li><li> Phagozyten: Adherent phagozytierenden Zellen, die die entsprechenden Rezeptoren phagocytic. Hier verwenden wir primären Maus BMM, die reichlich die Fc-γ-Rezeptoren exprimieren. Alternativ können dendritische Zellen (DC), Monozyten oder phagozytischen Epithelzellen oder ihre genetische Mutanten oder Knock-out-Varianten verwendet werden. </li><li> Lysosomal Ladung: Ein fluoreszenzmarkierte Sonde lysosomalen. Hier wird Texas Red-konjugiert 70.000 Kilodalton Dextran (Dex70kD) als Lumen Ladung von den Lysosomen verwendet. Alternativ kann jede Fluoreszenz nachweisbare Marker ein zelluläres Kompartiment oder Organelle oder einer geeigneten Sonde für phagosomalen Eigenschaften wie Säure-oder Abbauleistung, verwendet werden, um das Fortschreiten der Phagosomenreifung untersuchen. </li><li> Einflussfaktoren: Zum Beispiel, Signalmoleküle, chemische Verbindungen, Gen-knock-down oder transiente Expression des mutierten Proteine ​​konnte. Hier haben wir Förgein die Nutzung eines solchen Faktor für die der Einfachheit halber, aber für ein aktuelles Beispiel mit mutierten Proteinexpression und knock-down Einflussfaktoren finden Sie in 18 Kasmapour et al. Jeder Faktor, der Phagozytose oder die Umstände und die Mobilität von Phagosomen beeinflussen können und / oder die Fächer, die mit reif Phagosomen interagieren könnten verwendet werden. </li></ul>

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM)</td><td>PAA, Österreich</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium ohne Phenolrot (D-MEM)</td><td>PAA, Österreich</td><td>E15-047</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>PAA, Österreich</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>PAA, Österreich</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA, Österreich</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>PAA, Österreich</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>WillCo-dish&reg; Glasbodenschale (35 mm &leer;, #1.5)</td><td>WillCo Wells, Niederlande</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>CELLviewTM Glasbodenschale, 35 mm</td><td>Greiner Bio one, Deutschland</td><td>627871</td><td>Alternativ: Erhältlich als segmentierte</td></tr><tr><td>Carboxylierte Latex-Mikrosphären</td><td>Polysciences, USA</td><td>#09850</td><td>Erhältlich in verschiedenen Durchmessern, wir haben 3 &mu; m</td></tr><tr><td>Polystyrol-Mikropartikel</td><td>Kisker Biotech, Deutschland</td><td>PPs-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH, Deutschland</td><td>305.1.3</td><td></td></tr><tr><td>Maus ganzes IgG</td><td>Rockland, USA</td><td>010-0102</td><td></td></tr><tr><td>EDAC-Vernetzer</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>E6383-1g</td><td></td></tr><tr><td>10 mM</td><td>Tris Sigma-Aldrich, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>1-ml-Spritze Omnifix -F</td><td>B.Braun, Deutschland</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>26&nbsp; G-Nadel (0,45*25 mm)</td><td>B.Baun, Deutschland</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA, Österreich</td><td>E15-039</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Gibco, USA</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>MES-Hydrat</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &mu; M Spritzenfilter</td><td>Sartorius, Deutschland</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr></tbody></table>

studium der biogenese phagolysosom im live-makrophagen

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Fresszellen spielen eine wichtige Rolle in der angeborenen Immunsystems durch Entfernen und Beseitigen eindringende Mikroorganismen in ihren Phagosomen. Phagosomenreifung sind die komplexen und stark regulierten Prozess, bei dem eine im Entstehen begriffene phagosome erfährt drastische Transformation durch gut organisierte Interaktion mit verschiedenen zellulären Organellen und Fächer im Zytoplasma. Dieser Prozess, der essentiell für die physiologische Funktion der Fresszellen durch auszustatten Phagosomen mit ihren lytischen und bakteriziden Eigenschaften ist, gipfelt in Fusion von Phagosomen mit Lysosomen und Biogenese der Phagolysosomen, die als die letzte und entscheidende Phase der Reifung für Phagosomen sein wird. In diesem Bericht beschreiben wir eine Live-Cell-Imaging-basierte Methode zur qualitativen und quantitativen Analyse des dynamischen Prozess der Lysosomen, die Lieferung, die ein Markenzeichen der Phagolysosom Biogenese ist Phagosom. Dieser Ansatz verwendet IgG-beschichteten Mikroperlen als Modell für phagocytose und fluorophorkonjugierten Dextranmolekülen als Lumen lysosomalen Fracht-Sonde, um die dynamische Bereitstellung von lysosmal Inhalte an die Phagosomen in Echtzeit im Live-Makrophagen folgen mit Zeitraffer-Imaging und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie. Hier beschreiben wir detailliert den Hintergrund, die Vorbereitungsschritte und den Schritt-für-Schritt-Versuchsaufbau zur einfachen und präzisen Einsatz dieser Methode in anderen Labors zu ermöglichen. Unsere beschriebene Verfahren ist einfach, robust und vor allem leicht angepasst phagosomalen Wechselwirkungen und Reifung in verschiedenen Systemen und unter verschiedenen experimentellen Bedingungen, wie die Verwendung von verschiedenen Arten Phagozyten, Verlust-Funktion Experimenten verschiedene Sonden zu untersuchen, und phagozytierenden Partikel.

Die richtige Vorbereitung der Zellen und die Perlen für die Bildgebung ist kritisch. Abbildung 1 zeigt den Umriss der Aussaat, Sonde-loading und erste Schritte in diese bildgebenden Verfahren auf der Grundlage unserer optimiertes Protokoll für BMM. Es ist daher wichtig, dass die Protokollparameter getestet und optimiert werden, je nach der Art der Zellen und Sonden, die verwendet werden sollen. Nach Zugabe der IgG-beschichteten Kügelchen an die vorgespannte Zellen ist es wic...

Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den dynamischen Prozess der Phagosomenreifung und der Biogenese von Phagolysosomen in Phagozyten in Echtzeit zu verfolgen. Dies wird erreicht, indem die lysosomalen Kompartimente der Zellen mit einem fluoreszenzmarkierten Dextranstrang beladen werden, um die lysosomalen Kompartimente sichtbar zu machen und den Transfer ihres luminalen Frachtguts zu Phagosomen zu ermöglichen. In einem zweiten Schritt werden Mikropartikel hinzugefügt, die als phagozytisches Modell dienen.Anschließend wird die Zufuhr lysosomalen Materials zu den Phagosomen mittels Live-Cell-Bildgebung und anschließender digitaler Bildverarbeitung analysiert. Um den Reifungsprozess der Phagosomen zu quantifizieren, zeigen die Ergebnisse die Wirkung verschiedener Faktoren auf den Reifungsprozess der Phagosomen basierend auf der Zufuhr lysosomalen Inhalts zu den Phagosomen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden, wie der Untersuchung der Makrophagenreifung in fixierten Zellen, ist die quantitative Auswertung mit hoher zeitlicher Auflösung. Lösen Sie zunächst Texas-Red-markierten 70-Kilodalton-DExT-Strang oder Dex 70 KD in PBS mit 20 Milligramm pro Milliliter auf und lagern Sie Aliquote bei minus 20 Grad Celsius.Als Nächstes verdünnen Sie den Dex-70-KD-Stamm in vollständigem Zellkulturmedium Docos, modifiziertem Eagles Medium oder DMEM auf etwa ein Milligramm pro Milliliter. Sonizieren Sie die DExT-Strang-Aliquot in einem Ultraschallbad für fünf Minuten. Zentrifugieren Sie anschließend die Lösung in einer Mikrozentrifuge bei maximaler Drehzahl für fünf Minuten, um eventuelle Klumpen oder Verunreinigungen aus der Lösung zu entfernen.Bewegen Sie den SuperAgent vorsichtig in ein frisches Röhrchen, wobei Sie das Pellet am Boden vermeiden. Verdünnen Sie die Lösung anschließend auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter in komplettem Zellkulturmedium. DMEM und Filter.Sterilisieren Sie die Lösung durch einen an einer Spritze befestigten 0,22-Mikrometer-Filter. Anschließend bringen Sie zwei Milliliter aus Knochenmark stammende mausmakrophagen auf eine Konzentration von 5 × 10⁴ Zellen pro Milliliter. Inkubieren Sie die Zellen in DMEM in einer unbeschichteten Glasbodenkulturschale mindestens 12 Stunden bei 37 °C in einer mit 5 % Kohlendioxid gepufferten Atmosphäre.Um die Anheftung und Akklimatisierung nach der Anheftung sicherzustellen, saugen Sie das Medium ab und geben Sie zwei Milliliter vorgewärmtes DExT-Strand-DMEM in die Glasbodenschale. Inkubieren Sie die Zellen anschließend zwei bis acht Stunden. Waschen Sie die Zellen dreimal mit vorgewärmtem vollständigem DMEM. Saugen Sie das Medium nach dem letzten Spülgang ab und geben Sie zwei Milliliter vollständiges DMEM hinzu.Inkubieren Sie die Zellen vier bis zwölf Stunden lang. Spülen Sie die Zellen anschließend mit vorgewärmtem vollständigem DMEM ohne Phenolrot und geben Sie mindestens 30 Minuten vor Beginn der Bildaufnahme zwei Milliliter vollständiges, filtriertes DMEM ohne Phenolrot hinzu. Danach bringen Sie eine Aliquotprobe der 1 % IgG-beschichteten Rübensuspension, die wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben hergestellt wurde, auf Raumtemperatur.Sonizieren Sie die Lösung in einem Ultraschallbad für zwei bis drei Minuten. Geben Sie anschließend unter einem Biosicherheitswerkbank der Klasse zwei ein bis sechs Mikroliter der Perlsuspension zu den Zellen. Verteilen Sie die dichte Perlwolke, indem Sie die Suspension in der Glasbodenschale vorsichtig mit einer Pipette mischen.Bringen Sie dann die Probe zum Mikroskop und fokussieren Sie den interessierenden Bereich. Vor der Zeitrafferaufnahme optimieren Sie die Einstellungen, einschließlich Scannen, Geschwindigkeit, Vergrößerung und Auflösung, um alle sieben bis 20 Sekunden ein Bild aufnehmen zu können.Passen Sie die Einstellungen für Anregung und Emission basierend auf dem verwendeten Abbildungssystem und den verwendeten Sonden an, und optimieren Sie diese, um übermäßiges Photobleichen zu vermeiden. Nehmen Sie anschließend das Zeitraffervideo auf und speichern Sie es im nativen Dateiformat Ihres Mikroskops. Vermeiden Sie das Exportieren des Videos in komprimierten Formaten wie JPG oder PNG.Als Nächstes starten Sie Fiji, eine ImageJ-Distribution, die ein Bildverarbeitungspaket mit umstrukturierten Werkzeugmenüs und zusätzlichen nativen Plugins enthält, das kostenlos heruntergeladen werden kann. Öffnen Sie die Datei in Fiji und wählen Sie das Video aus, das ausgewertet werden soll. Anschließend legen Sie die Optionen, Filter und Messparameter gemäß dem begleitenden Textprotokoll fest.Als Nächstes scannen Sie die Bilder durch und notieren den Zeitrahmen, in dem ein vollständig ausgebildeter neuer Phagosom um die Bead entsteht und die saure F-Phase geschlossen ist. Verwenden Sie das Oval-Auswahlwerkzeug, um einen kreisförmigen interessierenden Bereich (ROI) auf der internalisierten Bead auszuwählen. Stellen Sie sicher, dass die Auswahl exakt am äußeren Rand der Bead anliegt.Danach zur Analyse wechseln und auf Messen klicken, um die Messung durchzuführen. Das Ergebnis wird in einem separaten Fenster mit dem Titel Ergebnisse angezeigt. Im nächsten interessierenden Bildausschnitt die Position des ROI anpassen, falls sich die Perle bewegt hat, und die Messung wiederholen, wodurch das Ergebnis der Liste im Ergebnisfenster hinzugefügt wird.Jeder analysierte Frame kann anhand des Werts in der Spalte „label“ identifiziert werden. Nachdem die Messung aller relevanten Frames abgeschlossen ist, kopieren Sie die Werte aus der Spalte „int den“ in eine Tabellenkalkulationsanwendung. Die Spalte „int den“ zeigt die Intensitäten des ausgewählten Bereichs an.Mithilfe dieser Methoden wurden klare Bilder von aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen aufgenommen, die mit den DExT-Strangsonden beladen worden waren. Dieses Bild stammt vom Zeitpunkt null, also genau dann, wenn die Zelle die hier markierte, mit IgG codierte Perle aufgenommen hatte. Die hier gezeigten Bilder wurden zur besseren Sichtbarkeit pseudogefärbt und zeigen das Phagosome von null bis 85 Minuten nach der Aufnahme.Der gemessene Phagosom, ROI, ist mit einer gestrichelten Linie umrissen, und die Fälle von Dextran-Zufuhr und -Anreicherung im Phagosom werden durch die Pfeile markiert. Anschließend wurden aus diesen Bildern Graphen erstellt, die einen klaren zeitlichen Trend der Signalassoziation mit dem Phagosom im Verlauf der Zeit zeigen. Dieser Graph stellt einen Durchschnitt von 10 Phagosomen aus den hier gezeigten zwei Zellen dar.Während die absolute Signalintensität oft zwischen den einzelnen analysierten Phagosomen variiert, ist der zeitliche Trend normalerweise sehr ähnlich. Der Nachweis von Dex 70 KD in den Phagosomen zeigte, dass innerhalb von 35 bis 40 Minuten nach der Phagozytose ein Plateau erreicht wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Phagosomenreifung mittels Zeitraffer-Konfokalmikroskopie bewerten kann.

study-of-phagolysosome-biogenesis-in-live-macrophages

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Dieses Video zeigt eine hochauflösende Totalreflexionsfluoreszenz-Mikroskopietechnik (TIRF) zur Echtzeit-Visualisierung der Phagosomenbildung und des Verschlusses während der Makrophagen-vermittelten Phagozytose von IgG-opsonisierten roten Blutkörperchen (RBCs), die an der Oberfläche einer Glasbodenschale befestigt sind. Die Makrophagen dehnen Pseudopodien um die Erythrozyten aus und umhüllen sie in den Phagosomen, wodurch sie sich von der Glasoberfläche lösen.

TIRF-Mikroskopie-basierte Visualisierung der Phagosomenbildung und des Phagosomenverschlusses

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Wir beschreiben einen Versuchsaufbau, um die Bildung und den Verschluss von Phagosomen in lebenden Makrophagen mit Hilfe der Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie in drei Dimensionen zu visualisieren. Es ermöglicht die Überwachung der Basis des phagozytischen Bechers, der sich ausdehnenden Pseudopoden sowie der genauen Stelle der Phagosomenspaltung.

&quot;Phagosomen Closure Assay&quot; zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Wir beschreiben eine Methode zur Messung der Geschwindigkeit von Phagosomen, die sich in lebenden Zellen in Richtung des Zellzentrums bewegen, die mit oder ohne das humane Immundefizienzvirus (HIV) Typ 1 infiziert sind, wobei die konfokale Fluoreszenzmikroskopie der Spinning-Disk zur Identifizierung fluoreszierender infizierter Zellen und die Hellfeldmikroskopie zum Nachweis von Phagosomen  verwendet wird.

Phagosom Migration und Geschwindigkeit gemessen in Live-primären humanen Makrophagen mit HIV-1 infizierten

Hier beschreiben wir eine mikroskopbasierte Technik zur Visualisierung und Quantifizierung der frühen Kaskaden von Ereignissen während der Phagozytose von Krankheitserregern wie den Pilzen Candida albicans und Partikeln, die größer als 0,5 μm sind, einschließlich Zymosan und IgG-beschichteten Kügelchen.

Visualisierung der frühen Phasen der Phagozytose

Wir präsentieren Ihnen Methoden, um die phagocytic Fähigkeit der primären murinen Knochenmark stammenden Makrophagen mit Gewebekulturen beschrifteten Myelin Schutt und intrazellulären Lipid Droplet Färbung bewerten.

In-vitro- Phagozytose von Myelin Schutt durch Knochenmark stammenden Makrophagen

Wir beschreiben hier eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen durch die Beschichtung der Bakterien mit Biotin und Streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Hier beschreiben wir Methoden mit Spinning Disk konfokalen Mikroskopie zu Bild phagocytic Einzelveranstaltungen durch Maus resident peritonealen Makrophagen. Die Protokolle können auf andere phagocytic Zellen ausgedehnt werden.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Der Mechanismus, der mit Phagozytose bei Leishmanien-Infektionen verbunden ist, ist noch wenig verstanden. Hier beschreiben wir Methoden, um die frühen Ereignisse zu bewerten, die während der Leishmania-Interaktion mit den Wirtszellen auftreten.

Untersuchung der Phagozytose der Leishmanie mittels konfokaler Mikroskopie

Diese Studie klärt die phagozytäre Prozessierung von Godanti Bhasma (GB)-Partikeln in Säugetierzellen auf und charakterisiert deren zelluläre Aufnahme, Vakuolendynamik, Versauerung und Abbau. Diese Erkenntnisse verbessern nicht nur unser Verständnis grundlegender Phagozytose-Mechanismen, sondern etablieren GB auch als vielversprechendes Modellsystem für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien.

Erforschung der sequentiellen zellulären Ereignisse der durch Godanti Bhasma ausgelösten Phagozytose in Säugetierzellen

Erfahren Sie die Echtzeit-Visualisierung der Phagosomenreifung und Phagolysosomenbiogenese in Makrophagen mittels fluoreszenzmarkierter Dextrane und Live-Zell-Bildgebung. Diese quantitative Methode liefert hochaufgelöste Einblicke in Immunzellfunktionen.

Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

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