Effizienten Herstellung und Reinigung von rekombinantem murinem Kindlin-3 von Insektenzellen für biophysikalische Studien

Das übergeordnete Ziel der folgenden Experimente ist es, effizient Milligrammmengen von Miran Kinlin drei und Insektenzellkulturen herzustellen, die in anderen Expressionswirten nicht hergestellt werden können. Dies wird durch COT-Transektion, einen KINLIN-Drei-Transfervektor zusammen mit einem manipulierten Bao-Virus in der Mitte erreicht, um ein rekombinantes Bao-Virus zu erzeugen, das das KINLIN-Drei-Gen trägt. In einem zweiten Schritt wird das Virus in Insektenzellen amplifiziert, um eine ausreichende Menge an Virionen für zukünftige Schritte zu produzieren.

Als nächstes werden Insektenzellen infiziert, um große Mengen des Kinlin-3-Proteins zu produzieren, um uns eine Reinigung durch schnelle Flüssigkeitschromatographie zu ermöglichen. Es werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass funktionelles Kellin drei von hoher Reinheit in Milligrammmengen hergestellt werden kann, basierend auf der SDS-Seitenanalyse und der Größenausschlusschromatographie. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Anzündung der Drei-Expression in Bakterien besteht darin, dass die Expression von mit Makulaviren infizierten Insektenzellen die Ausbeute an rekombinanten Proteinen um das Zehnfache erhöht.

Die SF-Neun-Zellen für dieses Verfahren werden unter Verwendung von SF 902-Medien, die mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Penicillin und 100 Mikrogramm pro Milliliter Streptomycin ergänzt werden, kultiviert und in Suspension gehalten. Für die Erzeugung von Bao-Viren sollten die Zellen in einem Dichtebereich von fünf mal 10 bis fünf mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter kultiviert werden. Um die SF neun Zellen für die Transfektion vorzubereiten, sehen Sie etwa einmal 10 zu den sechs Zellen pro Vertiefung einer sterilen sechs Hülsen Gewebekulturplatte in zwei Millilitern SF 902 Medien versetzt mit Penicillin und Streptomycin aus und verlassen die SF neun Zellen für etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur in der Abzugshaube, um an der Basis der Kunststoffvertiefungen zu haften und somit eine Monoschicht zu bilden rekombinante Baloviruserzeugung wird erreicht durch Durchtrennen von Plasmid, DNA und BMid-DNA auf eine Monolayer-SF-Neun-Kultur.

Der Expressionsvektor Papin-Neuron Firma T drei hat die Maus KINLIN drei Gen Firma T drei. Unter der Kontrolle des P 10 BAO-Viruspromotors besitzt er flankierende Bao-Virussequenzen, um eine Rekombination mit der hinteren Mitte zu ermöglichen, und kodiert für eine C-terminale Hiss-Six-Markierung für die nachgeschaltete Reinigung; für jede Transfektion ergibt sich ein bis zwei Mikrogramm gereinigtes MFI T, drei mit 0,5 Mikrogramm gereinigtem B-Mid und 100 Mikrolitern SF 902 SFM ohne Antibiotika. Dies ist Lösung A in einem separaten Röhrchen, verdünnen Sie sechs Mikroliter Zellwirkung in zwei Reagenz mit 100 Mikrolitern SF 902 SFM ohne Antibiotika.

Für jede Transfektionsreaktion kann hier ein Mastermix für ein reduziertes Liquid Handling erstellt werden, wenn mehrere Transfects erforderlich sind. Dies ist Lösung B. Mischen Sie die beiden Lösungen A und B mit jeweils etwa 200 Mikrolitern pro Transfektion und inkubieren Sie Raumtemperatur für 20 Minuten, um Lipid-DNA-Komplexe zu bilden. Nach 20 Minuten verdünnen Sie die Lipid-DNA-Komplexe mit 800 Mikrolitern pro Transfektion von SF 902 SFM ohne Antibiotika. Aspirieren Sie anschließend vorsichtig das SF-Neun-Zellen-Monolayer-Medium und pipettieren Sie vorsichtig die AB-Lösung und das Mediengemisch auf die SF-Neun-Monoschicht.

Inkubieren Sie die transfizierten Zellen über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 27 Grad Celsius, um eine befeuchtete Umgebung zu schaffen, die ein Austrocknen der Zellen verhindert. Legen Sie die Sechs-Well-Schale in einen mit Plastik gefüllten Behälter neben ein feuchtes Papiertuch. Geben Sie am nächsten Tag einen weiteren Milliliter SF 900 zu SFM ohne Antibiotika Zu jeder Monolayer-Kultur inkubieren Sie die Zellen bei 27 Grad Celsius für weitere fünf Tage.

Nach fünf Tagen wird das rekombinante Bao-Virus direkt aus dem Nährmedium geerntet und in ein sauberes Zentrifugenröhrchen überführt. Alle SF-Neunzell-Trümmer werden durch Zentrifugation bei 1000 G für fünf Minuten geklärt. Bei Raumtemperatur kann davon ausgegangen werden, dass das Virus, das in den resultierenden Supernamen und als P one bezeichnet wird, in eine saubere Röhre P one Virusgeneration einen erwarteten Virustiter von eins mal 10 bis sieben PFU pro Milliliter aufweist.

Obwohl bei Bedarf eine Plaque-SA durchgeführt werden kann, ist der P-1-Virusbestand bei vier Grad Celsius im Dunkeln zu lagern, bis die SF-Neun-Zellen, die für die Amplifikation des rekombinanten Balo-Virus in Suspension verwendet werden, sollten eine Dichte von 1,4 mal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter aufweisen, und die Kultur sollte ein 20stel des gesamten Kolbenvolumens einnehmen. Zum Beispiel 50 Milliliter in einem Zwei-Liter-Kolben. Im Allgemeinen sollte die SF-Neunzelle für eine optimale Amplifikation des Vao-Virus und eine optimale Proteinproduktion einheitlich groß und kugelförmig sein.

Infizieren Sie die SF-Neun-Zellkultur mit dem P-1-Virusstamm bei einer Multiplizität der Infektion oder einem MOI von 0,1 unter Verwendung der folgenden Formel. Inkubieren Sie die mit P one infizierte Insektenkultur bei 27 Grad Celsius und schütteln Sie sie 72 Stunden lang bei 100 U/min. Drei Tage später ernten Sie das Virus, indem Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1000 g für fünf Minuten vom Medium trennen.

Bei Raumtemperatur wird das geklärte Virus in ein sauberes Röhrchen überführt. Dieser Virusbestand wird als P zwei bezeichnet, und der erwartete Virustiter beträgt zweimal 10 hoch acht PFU pro Milliliter. Lagern Sie diesen Virusbestand bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius im Dunkeln, bewahren Sie die resultierenden Zellpellets bei minus 20 Grad Celsius auf, um die spätere Bestätigung der rekombinanten Virusproduktion zu bestätigen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, züchten Sie ein ausreichendes Volumen von SF neun Zellkulturen in Suspension und SF 902 s fm. Ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Penicillin und 100 Mikrogramm pro Milliliter Streptomycin. Das Verhältnis des Gesamtkulturvolumens zum Kolbenvolumen sollte eins zu fünf betragen.

Inkubieren Sie die Suspensionskulturen bei 27 Grad Celsius unter Schütteln bei 100 U/min, bis sie eine Zelldichte von zweimal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter erreichen. Wenn die SF-Neun-Kulturen eine Dichte von zwei mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter haben, sind sie bereit für eine Balovirus-Infektion. Ergänzen Sie die Kulturen mit einer Endkonzentration von 1 % fötalem Rinderserum, gefolgt von dem P 2-Virusbestand.

Um einen MOI von eins zu erhalten, inkubieren Sie die infizierten Kulturen bei 27 Grad Celsius unter Schütteln bei 100 U/min 72 Stunden nach der Infektion, ernten Sie rekombinantes Polyhistamin-markiertes Lin drei, das SF neun Zellen exprimiert, durch Zentrifugation bei 1000 GS für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Lagern Sie das resultierende Zellpellet bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius oder bei minus 80 Grad Celsius für die Langzeitlagerung. Dieser Vorgang beginnt mit dem Auftauen auf Eis.

Die gefrorenen Pellets des Vao-Virus infizierten SF neun, das rekombinantes Kinlin drei exprimierte, und Resus, das die Pellets mit Lysepuffer suspendierte. Nachdem Sie die resuspendierten Zellen fünf bis 10 Minuten lang mit dem Lysepuffer inkubiert haben, wird ein Vortex durchgeführt, bis eine homogene Reanimationssuspension für den weiteren Zellaufschluss erreicht ist. Beschallen Sie die Probe in einem Eisbad.

Klären Sie das Lysat durch Zentrifugieren bei 48.000 GS für eine Stunde bei vier Grad Celsius. Laden Sie die resultierenden Supernamen auf eine Hist-Fallensäule mit einem Volumen von fünf Millilitern, die mit einem Lysepuffer bei vier Grad Celsius und einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute voräquilibriert wurde. Die nachfolgenden Schritte für den Austausch von Proteinelutionspuffern und die Proteinkonzentration werden hier nicht demonstriert, sondern im begleitenden Manuskript ausführlich beschrieben.

Sobald die Pufferaustauschproteinlösung erhalten ist, tragen Sie sie unter Verwendung eines ACTA FPLC mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Millilitern pro Minute auf eine voräquilibrierte Heparin-HP-Säule mit einem Volumen von fünf Millilitern auf. Das gebundene KINLIN drei wird unter Verwendung eines linearen Natriumchloridgradienten in demselben Puffer angedeutet, der mit einer Rate von 10 Millimolar pro Milliliter rekombinante Histamin-Tags zunimmt. Es wird erwartet, dass KINLIN drei nach der Konzentration des Proteins bei etwa 0,6 molaren Natriumchlorid eluiert, der letzte Schritt besteht darin, das Protein unter Verwendung der Größenausschlusschromatographie zu puffern, das gereinigte Protein auf eine SUEx S 210 30-Säule aufzutragen, die Proteine entsprechend der Größe zu reinigen, indem Puffer mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Millilitern pro Minute auf die Säule aufgetragen wird.

Das aus der Säule stammende Protein wird mit dem Absorptionsmittel bei 280 Nanometern fraktioniert und überwacht. Der Erfolg der rekombinanten Virusgenerierung wurde durch die Bewertung des Vorhandenseins von rekombinanten Kinlin drei und den COT TRANSFIZIERTEN SF neun Zellen mittels SDS-Seite und westlicher Analyse verifiziert, wie sie in diesem repräsentativen westlichen Blut von sechs kleinen SF 9-Kulturen unter Verwendung eines Anti-Hiss-Sechs-Antikörpers zu sehen war. Eine klare Bande, die einem 75 Kilodalton Hiss-markierten Protein entsprach, war in jeder Probe sichtbar, nachdem das Virus amplifiziert und zur Infektion verwendet worden war SF neun Zellen in groß angelegten Experimenten. Rekombinantes KINLIN drei wurde durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie teilweise aufgereinigt.

Das Hauptgelbild in dieser Abbildung zeigt eine SDS-Seite mit Nickelaffinität, gereinigtem rekombinantem Mauskinlin drei, exprimiert in BAO-Virus-infizierten SF-Neun-Zellen, das Protein wurde unter Verwendung eines Ole-Gradienten angedeutet, der über dem Gelbild gezeigt wurde. MW gibt an, dass der Molekulargewichtsmarker LYS das Ganzzelllysat ist, FT ist der Durchfluss, WI ist Waschgang eins und WII ist Waschgang zwei. Eine Western-Blot-Analyse wurde auch unter Verwendung der Elutionsfraktionen durchgeführt, um das Vorhandensein des manipulierten His-Tags auf dem rekombinanten Protein zu bestätigen.

Als nächstes wurde das teilgereinigte KINLIN drei durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer Heparinsäule weiter bis nahezu Homogenität aufgereinigt. Dieses Bild zeigt das bei 280 Nanometern beobachtete elucianische Profil in blau, wobei ein einzelner symmetrischer Peak unter einem linearen Natriumchloridgradienten, der in Grün dargestellt ist, unter Verwendung eines Natriumchlorid-Konzentrationsbereichs von 0,05 molar bis 1,0 molar ausweicht. Das untere Feld zeigt die Ergebnisse der SDS-Seitenanalyse der fraktionierten Elution, die das Vorhandensein des 75-Kilodalton-Proteins Kinlin drei zeigt.

In einem letzten Schritt wurde KINLIN three purity durch Größenausschlusschromatographie poliert, um Aggregate zu entfernen und Homogenität zu erreichen. Dieses repräsentative Elucian-Profil der Gelfiltration besteht aus gereinigtem Kinlin, drei unter Verwendung eines SUEx S 200 in Tris HCL, pH 7,5, 150 Millimolar Natriumchlorid und ein Millimolar DTT bei 20 Grad Celsius. Basierend auf dem Elutionsvolumen migriert KINLIN three wie für ein 75-Kilodalton-Protein erwartet, was darauf hindeutet, dass es überwiegend monomer ist.

Die nächste Abbildung zeigt die Ergebnisse der SDS-Seite von hochkonzentriertem gereinigtem rekombinantem Kinlin drei mit der Bezeichnung K drei bei 14,5 Milligramm pro Milliliter. Die Herstellung von Milligramm-Mengen von hochreinem Maus-Kinlin Three in voller Länge und Insektenzellkulturen wird umfangreiche Strukturstudien und biochemische Analysen des Proteins ermöglichen. In dieser Studie wurde auch ein Thermo-Floor-basierter Thermo-Shift-Assay durchgeführt, um zu bestimmen, welche Puffer für KINLIN drei stabilisierend waren.

KINLIN drei wurde in verschiedene Puffer verdünnt, die einen zweidimensionalen Schirm der pH- und Natriumchloridkonzentration umfassten. Das obere Feld ist ein 3D-Histogramm der Übergangstemperaturen und das untere Bild zeigt die Änderung der Übergangstemperatur vom berechneten Durchschnitt von 50,4 Grad Celsius. Die Balken werden entsprechend dem Temperaturbereich, dem sie entsprechen, eingefärbt.

Es wurde beobachtet, dass KINLIN drei bei hohen Natriumchloridkonzentrationen im PA-Bereich von 7,0 bis 9,0 bei einer konstanten Sprungtemperatur von 55 Grad Celsius stabil ist. Es wurde auch beobachtet, dass die Sprungtemperatur von Kinlin drei etwa 55 Grad Celsius im PA-Bereich von 7,0 bis 7,5 betrug. Unabhängig von der Natriumchlorid-Konzentration.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hochreines funktionelles rekombinantes Anzündholz herstellt. Drei für eine eingehende biophysikalische Charakterisierung und weitere Untersuchung. Ähnliche Ansätze können auch bei anderen schwer herzustellenden Proteinproben verwendet werden, und wir empfehlen in solchen Fällen die Anwendung.