Name: Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4 + T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines Ex-vivo- Co-Kultursystem. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Bewertung der angeborenen Erkennung von HIV-1-infizierten CD4+ T-Zellen durch plasmazytoide dendritische Zellen. Diese Methode quantifiziert die Typ-I-Interferon-Freisetzung und liefert Einblicke in frühe Immunantworten.

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Wir danken E. Massicotte und J. Herrn für kompetente technische Unterstützung während der Durchflusszytometrie und Zellsortierung Experimenten. Außerdem möchten wir Ihnen für die Bereitstellung von Blutproben danke dem IRCM Klinikpersonal und allen Spendern. Periphere Blutproben wurden von gesunden erwachsenen Spendern, die in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki im Rahmen der Forschungsprotokolle von der Forschungsethik Review Board des Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM) genehmigte schriftliche Einverständniserklärung gaben erhalten. Die folgenden Reagenzien wurden durch die NIH AIDS Reagent-Programm, Abteilung für AIDS, NIAID, NIH erhalten: MT4-Zellen von Dr. Douglas Richman; und Menschen rIL-2 von Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc. Dr. Cohen ist der Empfänger des Canada Research Chair in Menschen Retrovirology. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus CIHR (CIHR 111.226) um Dr. Cohen und aus dem Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) AIDS-Netzwerk, um Dr. Bego und Dr. Cohen unterstützt.

Allgemeine Hinweise Es ist wichtig zu Zellen in Kultur ohne Antibiotikum zu halten, da selbst gesteuert bakteriellen Infektionen kann durch PBMCs erfasst werden. Eine solche Erfassung von bakteriellen Komponenten wird eine Hintergrund Interferon-Produktion, die nicht von der durch spezifische HIV-1-Erfassungs ausgelöst unterschieden werden kann induzieren. Darüber hinaus haben alle Zellen, die routinemäßig für die Mycoplasmaverunreinigung getestet werden. Verwenden Sie immer Endotoxin-freie Lösungen, wann immer möglich. Durchflusszytometrische Charakterisierung der verschiedenen Zellen, die in den Co-Kulturen verwendet werden, (PBMCs, pDCs, MT4 und CD4 + T-Zellen) ist ein optionaler Schritt, der jedoch sehr zu empfehlen, da sie wertvolle Informationen für die richtige Interpretation einer gegebenen Experiment erforderlich ist. 1. Herstellung der infizierten Zielzellen <ol><li> Pflegen menschlichen CD4 + T-Zelllinie MT4 in RPMI 1640 medimit 10% fötalem Rinderserum (FBS), von nun an als RPMI-1640-Vollmedium bezeichnet eine ergänzt. </li><li> Isolierung von primären CD4 + T-Zellen. <ol><li> Mononukleäre Zellen aus menschlichem peripherem Blut durch Dichtegradientenzentrifugation. </li><li> Isolieren CD4 + T-Lymphozyten mit einem CD4 + T-Zellen negative Selektion Kit nach den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Aktivieren CD4 + T-Lymphozyten mit PHA-L (5 &amp; mgr; g / ml) für 48 Stunden und dann aufrechtzuerhalten Zellen in RPMI-1640 Komplettmedium mit rekombinantem IL-2 (100 U / ml) ergänzt. Infizieren primäre T-Zellen 5 Tage nach der Isolierung. </li></ol></li><li> Infektion von Zielzellen (T-Zelllinie MT4 oder heterolog primären CD4 + T-Zellen). <ol><li> Zwei Tage vor der Cokultur, infizieren T-Zellen mit HIV-1-Virus. In dem hier beschriebenen spezifischen Beispiel pNL4.3-GFP_ires_Nef Wildtyp (WT) oder pNL4.3-GFP_ires_Nef delta Vpu (dVpu) Viren verwendet. Diese Virusstämme stellen green Fluorescent Protein (GFP) -markierte isogenen infektiöse molekulare Klone, die nur in ihrer Fähigkeit, Vpu exprimieren abweichen. </li><li> Verwenden Sie unterschiedliche Infektionsmultiplizitäten (MOIs) und wählen Kulturen mit ähnlichen Niveaus der Infektion für Co-Kulturen. Der Tag der Co-Kultur, den Prozentsatz von GFP + -Zellen mittels Durchflusscytometrie als Marker der Infektion. Verwenden nur die Kulturen mit einem Bereich von 20-50% infizierte Zellen für die Co-Kulturen. </li></ol></li></ol> Optionale Schritte: Führen Sie durchflusszytometrische Färbung an dieser Stelle auf die Oberflächenexpression von Molekülen / Liganden von Interesse, wie BST2 und CD4 bewerten. Für Zeiloberflächenfärbung resuspendieren 0,5 x 10 6 T-Zellen in 100 ul Waschlösung wird mit 1 &amp; mgr; l anti-CD4_PerCP / Cy5.5 und 1 ul Anti BST2_A660. Röhrchen für 45 min Inkubation bei 4 ° C, vor dem Waschen mit Durchflusszytometrie Waschlösung. Wenn die Studien zur Bewertung der Rolle von Vpu-vermittelte BST2 Antagonismus abzielen, führen Sie eine HIV-1-PartikelFreisetzungsassay zu diesem Zeitpunkt, wie zuvor beschrieben 15. 2. Isolierung und Anreicherung von Sensorzellen (Whole PBMCs oder Enriched pDCs) Hinweis: Wenn PBMCs werden zum Abtasten verwendet wird, starten Isolation innerhalb einer halben Stunde nach der Blutentnahme und führen sie in einer fristgerechten Weise. Verwenden PBMCs sofort für Co-Kulturen oder pDC Bereicherung. <ol><li> Mononukleäre Zellen aus menschlichem peripherem Blut durch Dichtegradientenzentrifugation. Optionaler Schritt: Führen Sie multi-parametrische Durchflusszytometrie-Färbung, um zu bestätigen, dass die frisch isolierten PBMCs enthalten die verschiedenen Zelllinien bei physiologischen Verhältnissen. Für Zeiloberflächenfärbung resuspendieren 10 6 PBMC in 100 ul Blockierungslösung Fc, und Inkubieren für 15 min bei 4 ° C. Nach dem Blockieren wird mit 1 &amp; mgr; l anti-CD3_Pacific Blue (für T-Zellen), 1 &amp; mgr; l Anti-CD14-PE_Texas Rot (für Knochenmarkzellen), 4 &amp; mgr; l anti-BDCA2_APC und 1 ul Anti ILT7_PE (zum pDC). InkubierenRöhrchen für 45 min bei 4 ° C, vor dem Waschen mit Durchflusszytometrie Waschlösung. </li><li> Bereichern pDCs mit einem PDC negative Selektion Kit nach den Empfehlungen des Herstellers. Es empfiehlt sich, schnell zu arbeiten, halten Zellen kalt, und verwenden Sie vorgekühlte Lösungen. Dies wird die Begrenzung der Antikörper auf der Zelloberfläche und nicht-spezifische Markierung von Zellen verhindern sowie die Gewährleistung maximaler PDC-Aktivität. <ol><li> Zuführen multiparametrischer Durchflusszytometrieanalyse frisch isolierten pDCs auf Reinheit, Prozentsatz der Anreicherung, und die relativen Mengen pDC- spezifischen Oberflächenmarkern (wie ILT7 und BDCA2) bestätigen. Für Zeiloberflächenfärbung resuspendieren 10 4 pDCs in 100 ul Blockierungslösung Fc, und Inkubieren für 15 min bei 4 ° C. Nach dem Blockieren wird mit 1 &amp; mgr; l anti-CD3_Pacific Blau, 1 ul Anti CD14_PE_Texas Rot, 4 &amp; mgr; l anti-BDCA2_APC und 1 ul Anti ILT7_PE. Röhrchen für 45 min bei 4 ° C inkubieren, bevor sie mit Durchflusszytometrie Waschlösung (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS). Ein Minimum von 40% Reinheit pDC empfohlen (wenn das Ausgangsmaterial 0,4% pDC, wäre dies äquivalent zu einer 100-fachen Anreicherung). </li></ol></li></ol> 3. Co-Kultur von infizierten CD4 + T-Zellen und Sensorzellen (Whole PBMCs oder Enriched pDCs) <ol><li> Mischungs 220 ul PBMCs oder 220 ul pDCs (zu 850.000 Zellen / ml verdünnt) (bei ​​einer Konzentration im Bereich von 100.000 bis 500.000 Zellen / ml) mit 30 &amp; mgr; l der infizierten T-Zellen (10 6 Zellen / ml verdünnt) je Vertiefung in einen U-Boden 96-Well-Platte. <ol><li> Als Kontrollen Platte PBMCs oder pDCs und T-Zellen allein. Anpassen der Lautstärke in gut 250 ul mit RPMI 1640 Komplettmedium. </li><li> Beurteilen zellulären Reaktionen auf bekannte Agonisten der TLR7 und TLR9 Pfade. Zu diesem Zweck Platte 220 ul PBMCs oder 200 ul pDCs (bei einer Konzentration im Bereich von 100.000 bis 500.000 Zellen / ml) pro Vertiefung (bei 850.000 Zellen / ml verdünnt) in einer U-Boden-Platte mit 96 Vertiefungen und fügen TLR7 Agonisten ( Imiquimod, Endkonzentration: 2,5 ug / ml) oder TLR9-Agonisten (ODN 2216 CpG-A, Endkonzentration: 5 &amp; mgr; M). Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 18-22 h auf und verarbeiten sie in ähnlicher Weise wie in den nachfolgend beschriebenen Co-Kulturen. </li></ol></li><li> Co-Kulturen für 18-22 h bei 37 ° C und 5% CO 2 und dann Übertragung auf einen V-Boden Platte mit 96 Vertiefungen. Zentrifuge für 5 Minuten bei 400 x g. <ol><li> Übertragen Sie die Überstände auf eine Flachboden-96-Well-Platte. Überstände können bei -80 ° C gelagert oder bei Typ-I-IFN-Erfassungs sofort verwendet werden. </li><li> Resuspendieren Co-kultivierten Zellen in 2% Paraformaldehyd und Durchflusszytometer analysieren. Aufgrund von Unterschieden in Größe und Granulierung sind MT4-Zellen aus PBMCs oder pDCs basierend auf ihrer Seite Streuung (SS) gegen Vorwärtsstreu (FS) Profile leicht zu unterscheiden. Wenn die primäre T-Zellen als Ziel infizierten Zellen können diese mit beliebigen Zelle tracker Farbstoff angefärbt werden, beispielsweise CSFE vor Kokultur. </li></ol></li><li> Die Messung der bioaktiven Typ-I-IFN mit HEK-Blau IFN-α / β-Reporterzellen. Hinweis: Diese Zellen wurden durch stabile Transfektion von HEK293-Zellen mit den menschlichen STAT2 und IRF9 Genen erzeugt werden, um ein vollaktives Typ I IFN-Signalweg zu erhalten. Sie enthalten auch die sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) Reportergen unter der Kontrolle des IFN-α / ß induzierbaren ISG54 Promotors. Stimulation der Zellen mit Typ I-IFN aktiviert den JAK / STAT / ISGF3 Wegs und induziert die Produktion von SEAP. <ol><li> Aufrechtzuerhalten HEK-Blau IFN-α / β-Zellen in DMEM mit 10% FBS ergänzt. Platte sie in einer Dichte von 50.000 Zellen pro Vertiefung in einer Flachboden-96-Well-Platte in einem Endvolumen von 180 ul. </li><li> Mit 20 ul Kokultur Überstand in jeder Vertiefung in Duplikat. Jede Platte erfordert auch eine Reihe von internen Standardkontrollen (human IFN alpha, Endkonzentration von 100 U / ml bis 2.500 U / ml). Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C und 5% CO 2 für 18-22 H. </li><li> Bestimmen Ebenen der alkalischen Phosphatase-Aktivität unter Verwendung Quanti-Blau-Lösung, die von rosa nach violett / blau in der Gegenwart des Enzyms ändert. Bereiten QUANTI-Blau folgenden Empfehlungen des Herstellers. Fügen Sie 180 ul dieser Lösung zu jeder Vertiefung einer Flachboden-96-Well-Platte. Zu jeder Vertiefung auch 20 &amp; mgr; l der induzierten HEK-Blau IFN-α / β-Zellen-Überstände hinzuzufügen, und inkubieren Sie die Platte in einem 37 ° C Inkubator, bis Farbe entwickelt, in den Standard-IFN Kontrollvertiefungen. </li><li> Auszuwerten Ebenen SEAP Verwendung eines Spektrophotometers bei 620 bis 655 nm und bestimmt die Konzentration von Typ-I-IFN durch Extrapolation aus dem linearen Teil der IFN-Standardkurve. </li></ol></li></ol>

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Die hier beschriebenen Protokolle messen Erfassen von T-Zellen mit GFP-markierten HIV-1-Viren, die nur in ihrer Fähigkeit, Vpu exprimieren unterscheiden, wie in unserem aktuellen Bericht 18 beschrieben infiziert. Allerdings können diese Verfahren leicht modifiziert werden, um Erfassung von unmarkierte Viren sowie Viren, denen anderen viralen Genen, die potentiell modulieren können angeborene Sensor studieren. Wenn die verwendeten nicht GFP exprimieren Viren, sollte der Anteil der infizierten Zielzellen durch andere Mittel vor der Ko-Kultur, wie p24 (Kapsid) intrazelluläre Färbung und Durchflusszytometrie oder durch p24-ELISA bestimmt werden. Darüber hinaus können diese Protokolle mit unterschiedlichen Ziel T-Zellen, einschließlich einer Vielzahl von verfügbaren Zelllinien und primäre Zellen verwendet werden. Die in diesem Manuskript beschriebenen Verfahren weisen eine Reihe von Vorteilen im Vergleich zu den frühen Methoden zur Behandlung von HIV-1-Erfassung zu studieren. In erster Linie wurde von einer Reihe von Gruppen, die zellfreie HIV-1-p etabliertArtikel sind schlechte Induktoren von Typ-I-IFN 2,13,14. Weiterhin verlassen frühen Studien bei älteren IFN ELISA-basierten Verfahren, die Menge an Typ-I-IFN produziert quantifizieren. Eine Beschränkung dieser Detektionstechnik ist, dass die meisten älteren IFN alpha ELISA-Kits messen nur eine Art von IFN alpha, während mit Blick auf die anderen Arten von IFN alpha und IFN &amp; beta. Der Einsatz der beschriebenen Reporterzelllinien überwindet diese Einschränkung, da die Konzentration aller bioaktiven Formen des menschlichen Typ I-IFNs auf einmal gemessen werden. Die Technik ist sehr empfindlich, weniger teuer als die neue Generation von IFN-ELISA-Kits und für viele Spender große Mengen an Typ-I-IFN leicht erkannt werden können. Dennoch kann dieses Protokoll leicht zur Verwendung mit anderen Typ-I-IFN-Ausleseverfahren wie ELISAs angepasst werden. Kritischen Schritte: Es ist wichtig, dass die Qualität aller zellulären Komponenten (beide Ziele und Effektoren) streng kontrolliert werden. Mögliche Kontamination, auch wenn asymptischen, muss überwacht und gesteuert werden. Wie bereits erwähnt, Antibiotikum gesteuerten asymptomatischen bakteriellen Kontamination und möglicherweise andere intrazelluläre Pathogene, wie Mycoplasmen, können ähnliche Immunreaktionen gegen das nach dem HIV-1-Infektion, nämlich Produktion von Typ-I-IFN beobachtet Einsen erzeugen. Darüber hinaus müssen alle Reagenzien frei von LPS oder andere potenzielle Endotoxine zu sein. Ebenso ist die Überwachung der PBMCs und pDCs auch wichtig, da die menschliche Proben oft durch darunterliegenden laufenden Infektionen, die normalen Fühl beeinträchtigen kann grundiert werden. Wir empfehlen, immer einschließlich der vorgeschlagenen negativen Kontrollen, wie Fehlen von Zielzellen als auch Co-Kulturen mit mock-infizierten Zellen. Lebensfähigkeit infizierter Zellen ist auch wichtig für die richtige pDC Erkundung seit Typ-I-IFN haben noch keine Co-Kultur mit apoptotischen Zellen 2,14 hergestellt. Eine wichtige Einschränkung der Technik ist die Notwendigkeit für frisch isolierte primäre Zellen. Dieses Verfahren wurde nichtgetestet mit PBMCs oder pDCs, die entweder zuvor eingefroren oder in Kultur gehalten wurden. Die Isolierung von PBMCs ist arbeitsintensiv und diese Zellen haben eine sehr begrenzte Lebensdauer. Darüber hinaus sollten Standardprotokolle zum Schutz vor durch Blut übertragbaren Erreger verwendet werden, während der Arbeit mit menschlichem Blut. Oft gibt es mehrere Quellen der Variabilität mit Arbeit verbunden mit frisch isolierten menschlichen Zellen. Unter ihnen sind die verschiedenen Verfahren durchgeführt, um diese Zellen zu isolieren und die geerbte Variabilität vom Spender zu Spender aufgetreten. Während es unmöglich ist, um die Variabilität unter den Spender zu vermeiden, ist die Verwendung der vorgeschlagenen positive Kontrollen, wie Mess Reaktion auf bekannte Agonisten des TLR7 und TLR9 Wege, einen wichtigen internen Kontrolle für diese Experimente zu schaffen. Wir haben beobachtet, dass eine robuste Reaktion auf Agonisten des TLR9-Weg konnte ein gesundes pDC Antwort korreliert werden, während ein reaktions TLR7 Weg wird für eine richtige Antwort gegen HIV-1 3 erforderlich. und andere 2, Anreicherung von pDCs aus PBMCs ist häufig nicht erforderlich. Wenn die Versuchsplanung erfordert (zum Beispiel im Kontext, in dem Verarmungs spezifischer pDC Oberflächenmarker ist erforderlich) negative Selektion ist aber über die positive Selektion bevorzugt, als Zellen frei von Antikörper bleiben nach der Auswahl. Isolated pDCs laufen schnelle Apoptose in Kultur. Für Experimente, die diese Zellen benötigen für längere Zeit kultiviert werden können Kulturmedien, die mit IL-3 ergänzt werden. Dieses Zytokin induziert pDC Proliferation und hemmt deren Apoptose 16. Streng kontrolliert werden muss jedoch IL-3 Nutzung, da es zu pDC Reifung oder Differenzierung führen. Die hier beschriebene Methode kombiniert Ziel HIV-1-infizierten Zellen mit frisch isolierten PBMCs oder pDCs, um die ersten Schritte bei der angeborenen Erkundung beteiligt neu zu erstellen. Diese Methode wird zweifellos sinnvoll, explor seine frühen angeborenen Immun Veranstaltungen mit HIV-Infektion assoziiert. Obwohl die damit verbundenen Protokolle werden am Mess Typ-I-IFN richtet, könnten sie leicht modifiziert werden, um andere bioaktive Moleküle aus pDCs bei Erkennung von infizierten Zellen freigesetzt zu messen. Diese können umfassen: Typ-III-IFN (IFN-λ), pro-inflammatorischen Zytokinen (wie TNF-α und IL-6) und der Chemokine CXCL10 CCL4 und CCL5 17.

Typ-I-IFN-Herstellung pDCs stellen die erste Verteidigungslinie gegen virale Infektionen, und als solche dienen als wichtiges Bindeglied zwischen angeborener und adaptiver Immun 1. Während zellfreien HIV-1-Partikeln nur schlecht durch das angeborene Immunsystem erkannt werden HIV-1-infizierten CD4 + T-Zellen wirksam durch pDCs 2 abgetastet. Der Sensormechanismus erfordert einen anfänglichen Kontakt zwischen dem viralen Hüllglycoprotein (gp120) an der Oberfläche der infizierten T-Zellen und CD4-Moleküle auf dem PDC, das dann durch Viruserfassung und Internalisierung durch das PDC gefolgt. Nachfolgende Erkennung der übertragenen HIV-1-RNA durch TLR7 löst die Aktivierung der Myd88 / IRF7 Weges und führt den Typ-I-IFN-Produktion 3 letztendlich. Wichtig ist, dass die zweite Erfassungswegs in pDCs vorhanden, die von TLR9 vermittelt wird, wird durch die Interaktion des viralen Glycoproteins gp120 inhibiert wird, mit dem PDC-spezifische Oberflächenmarker BDCA2 4. <p class="jove_content"&gt; Die TLR7 und TLR9 Erfassungswege von pDC potenziell negativ durch den Eingriff der BST2 (auch Tetherin oder CD317 bezeichnet) mit einer anderen pDC-spezifische Oberfläche inhibitorischen Rezeptor genannt ILT7 5 moduliert werden. BST2 in hohem Ausmaß an der Oberfläche der pDCs und einige Krebszellen exprimiert wird, aber bei relativ niedrigen Konzentrationen in anderen Zelltypen, wie B-Zellen, Makrophagen und T-Zellen. Wichtiger ist, kann BST2 von Typ-I-IFN in einer Reihe von transformierten Zelllinien als auch in primären Zellkulturen von humanen und murinen Ursprungs 6 induziert werden. Abgesehen von ihrer immunregulatorische Funktion, wurde vor kurzem festgestellt BST2 um die Freisetzung von HIV-1 hemmen und anderen umhüllten Viruspartikel durch Vernetzen naszierenden Viruspartikel auf den infizierten Zelloberfläche 7. Im Fall von HIV-1, wurde die viruskodierte akzessorisches Protein U (Vpu) gezeigt, als BST2 Antagonist fungieren. Es wird angenommen, dass Vpu downregulates BST2 von der Zelloberfläche von HIV-1-infizierten Zellen, die Seite der Leineing Aktivität und als Ergebnis verbessert Virusfreisetzung und verbreiten 7, auch wenn dieser Begriff wurde in Frage gestellt 8,9. In Abwesenheit von Vpu, eine große Anzahl von voll ausgebildet und ausgereifte Nachkommen HIV-1-Partikel werden an der Zelloberfläche zurückgehalten wird. Ob diese tethered Partikel könnten wirksame Ziele für Immunsensor stellen nach wie vor eine offene Frage. Außerdem ist unklar, ob Vpu könnte Typ-I-IFN-Produktion von pDCs dysregulate durch Modulation Oberfläche BST2 Ebenen. Frühe Studien zur HIV-1-Erfassung zu beurteilen wurden unter Verwendung von zellfreien HIV-1-Partikeln, die im allgemeinen schlechte Induktoren von Typ-I-IFN 3,10-12 betrachtet werden durchgeführt. Da die bisherigen Untersuchungen zeigen, dass PBMCs und pDCs HIV-infizierte CD4 + T-Lymphozyten 2,13,14 effizient zu erfassen, beschreiben wir hier eine einfache Methode, um angeborenen Antworten durch pDCs bei Erkennung von HIV-1-infizierten Zellen in vitro ausgelöst messen.

<table><tbody><tr><td>MT4-Zellen</td><td>NIH AIDS Reagenzprogramm</td><td>120</td><td>Dieses Reagenz wurde durch das NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: MT-4 von Dr. Douglas Richman bezogen.</td></tr><tr><td>HEK-Blu IFN-&alpha;/&beta; Reporterzellen&nbsp;</td><td>Invivogen</td><td>HKB-IFNAB</td><td>;</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Wisent</td><td>350-000-CL</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ficoll-P&acirc; que Plus</td><td>Myltenyi</td><td>17-1440-03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CD4+ T-Zell-Isolationskit II</td><td>Myltenyi</td><td>130-091-155</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Diamant-Plasmazytoid-Isolationskit für dendritische Zellen II&nbsp;</td><td>Myltenyi</td><td>130-097-240</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PHA-L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O2769</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Humanes rIL-2</td><td>NIH AIDS Reagenzprogramm</td><td>136</td><td>Dieses Reagenz wurde durch das NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: Human rIL-2 von Dr. Maurice Gately, Hoffmann - La Roche Inc. bezogen.</td></tr><tr><td>Imiquimod</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-IMQS</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ODN 2216 CpG-A</td><td>Hycult Biotec</td><td>HC4037</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Menschliches IFN&alpha;</td><td>PBL-Interferonquelle</td><td>11100-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>QUANTI-Blau&nbsp;</td><td>Cedarlane</td><td>REP-QB2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Durchflusszytometrie (Antikörper/Reagenzien)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fc-Blockierungslösung (Zusammensetzung unten):</td><td></td><td></td><td>Hinweis: Waschlösung herstellen (PBS, 5mM EDTA, 5% FBS)</td></tr><tr><td>10% Ziegenserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G 9023</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>10% Kaninchenserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R 9133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>10% Mausserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M 5909</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2,5 mg/ml humanes IgG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I 4506</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD3_Pacific Blue</td><td>Biolegend</td><td>300417</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD14_PE-TxRed</td><td>Life Technologie</td><td>MHCD1417</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-BDCA2_APC</td><td>Myltenyi</td><td>130-090-905</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-ILT7_PE</td><td>Biolegend</td><td>326408</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-CD4_PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>317427</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-BST2_Alexa 660</td><td>eBioscience</td><td>50-3179</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P 6148</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zellensieb</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cyan ADP Instrument&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>CY20030</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

beurteilung der innate sensing von hiv-1-infizierten cd4<sup&gt; +</sup&gt; t-zellen durch plasmazytoide dendritische zellen unter verwendung eines<em&gt; ex-vivo-</em&gt; co-kultursystem.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 angeborenen Erfassungs erfordert direkten Kontakt der infizierten CD4 + T-Zellen mit dendritischen Zellen plasmacytoid (pDC). Um diesen Vorgang zu untersuchen, können die hier beschriebenen Protokolle verwenden Frisch isolierte humane periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) oder plasmacytoid dendritischen Zellen (pDC), um Infektionen in entweder T-Zelllinie (MT4) oder heterolog primären CD4 + -T-Zellen zu erfassen. Um eine einwandfreie Sensor gewährleisten, ist es wesentlich, dass PBMC werden sofort nach der Blutentnahme und dass eine optimale Prozentsatz von infizierten T-Zellen verwendet werden, isoliert. Weiterhin kann multiparametrischer durchflusszytometrische Färbung verwendet werden, um zu bestätigen, dass PBMC-Proben enthalten, die verschiedenen Zelllinien bei physiologischen Verhältnissen. Eine Reihe von Kontrollen können auch enthalten sein, um die Lebensfähigkeit und Funktionalität pDCs bewerten. Diese umfassen das Vorhandensein spezifischer Oberflächenmarker, die Beurteilung zellulären Reaktionen auf bekannte Agonist des Toll-like Rezeptoren (TLR) Wege und Bestätigen eines fehlenden sponzeitigen Typ-I-Interferon (IFN) Produktion. In diesem System sind frisch isolierte PBMC oder pDCs kokultiviert mit HIV-1 infizierten Zellen in 96-Well-Platten für 18-22 Std. Überstände dieser Co-Kulturen werden dann verwendet, um den Gehalt an bioaktiven Typ-I-IFNs durch die Überwachung der Aktivierung des ISGF3 Wegs in HEK-Blau IFN-α / β-Zellen zu bestimmen. Vor und während der Cokultur Bedingungen können Zielzellen unterzogen werden, um durchflusszytometrische Analyse, um eine Anzahl von Parametern, einschließlich der Anteil der infizierten Zellen, Werte spezifischer Oberflächenmarker, und Differenz Töten von infizierten Zellen zu bestimmen. Obwohl diese Protokolle wurden ursprünglich entwickelt, um Typ-I-IFN-Produktion folgen, könnten sie möglicherweise verwendet, um andere Imuno-modulatorische Moleküle aus pDCs veröffentlicht zu untersuchen und weitere Einblicke in die molekularen Mechanismen, die HIV-1 angeborenen Erkundung gewinnen werden.

Die in Figur 1 beschriebene Co-Kultursystem ermöglicht eine kontrollierte Studie mit HIV-1 angeborenen Erkundung. Durch die variable Natur der primären Zellen ist es wichtig, dass die normalen Verhältnisse von myeloiden und T-Zellen (CD14 +, und CD3 + jeweils) beobachtet werden, wie in dem in 2A gezeigten Beispiel. Ferner ist nur eine geringe Anzahl von aktivierten T-Zellen (höhere FS und höhere CD3 Ebenen im Vergleich zu nicht-aktivierten T-Zellen) in den frisch isolierten PBMC Kulturen wünschenswert. PBMCs mit abnormalen Verhältnisse zwischen den verschiedenen Zelltypen sind oft nicht in der Lage einen geeigneten Montage angeborene Immunantwort in vitro, wahrscheinlich aufgrund einer bereits aktivierten Phänotyp als Folge einer laufenden Infektion. Am wichtigsten ist, der relative Anteil der pDCs muss, wie in 2B gezeigt, ausgewertet werden. Obwohl dieser Anteil kann 0,2 bis 1,2% variieren kann, ist ein anormaler Sensor Phänotyp auch sowohl mit extre beobachtetmes dieses Bereichs. Anreicherung pDCs Verwendung negativer Selektion ergibt oft 50-95% pDC Reinheit, wie es in den zwei Beispielen von in 2B (92% bzw. 72%) ersichtlich. Ein prototypisches Beispiel für die gesamte Experiment ist in den 3 und 4 gezeigt. In diesem Beispiel wurden MT4-Zellen mit pNL4.3-GFP_ires_Nef WT oder Delta Vpu infiziert zu 30% Befall bei der Co-Kultur (3A) zu erzielen. Wie zuvor beschrieben, werden nur die Infektionen mit wt-Virus zu einer signifikanten Herunterregulierung der Oberflächen BST2 (3B). Aufgrund ihrer Unterschiede in Größe und Granularität kann MT4-Zellen aus PBMCs durch Durchflusszytometrie (4A) leicht unterschieden werden. Nach der Co-Kultivierung Inkubation nur PBMCs in Kontakt mit bekannten TLR7 oder TLR9-Agonisten und PBMCs in Kontakt mit HIV-1 infizierten Zellen freigesetzt werden erhebliche Mengen an Typ-I-IFN (4B). Kein IFN wurden in PBMCs allein erkannt, in PBMCs Co-Cu-ltured mit scheininfizierten MT4-Zellen, oder allein in infizierten MT4-Zellen (4B). In dem hier dargestellten Beispiel wurde angeborenen Erfassen von HIV-1-infizierten MT4-Zellen durch PBMCs insgesamt bedeutend in Gegenwart von Vpu reduziert werden. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig1.jpg" width="500px" /> Abb. 1: Schematische Darstellung des experimentellen Design SUP: Überstand <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig2.jpg" width="500px" /> Abbildung 2: Die phänotypische Charakterisierung der frisch isolierten PBMCs und enriched pDCs. (A) Die Normalverteilung von myeloiden Zellen und in PBMC eines gesunden Spenders isoliert beobachteten T-Zellen (Prozentsatz der myeloischen Zellen sollte zwischen 10-20% und T-Zellen 55-65% liegen). PBMCs Probe wurden unter Verwendung von Fluorophor-konjugierten Antikörpern, die Oberfläche CD14 (myeloider Abstammung Marker) und CD3 (T-Zellmarker) erkennen gefärbt. (B) Die phänotypische Charakterisierung von pDCs. Vor der Anreicherung pDCs repräsentieren zwischen 0,2-1,2% der Gesamtzahl der Zellen in den PBMCs (0,99% in dem Beispiel gezeigt). Basierend auf Expression von spezifischen Markern wie BDCA2 und ILT7, an der Zelloberfläche vorhanden sind, können diese Zellen identifiziert werden. Negative Selektion verwendet werden, um die Anzahl der pDCs deutlich bereichern und zu eliminieren potenziell schädlichen Verunreinigungen, wie beispielsweise CD14 + myeloiden Zellen (Anreicherung erreicht 92% und 72% in den zwei Beispielen gezeigt). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig2highres.jpg" target="_blank">Cli</a>ck Sie hier für eine größere Ansicht. <img alt="Figur 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig3.jpg" width="500px" /> Abb. 3: Charakterisierung von HIV-1-infizierte Ziel MT4-Zellen (A) Prozentsatz der infizierten Zellen in den Kulturen bei MT4 pNL4.3-GFP_ires_Nef WT oder dVpu infiziert, wie durch den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen bestimmt. (B) BST2 Zelloberflächenexpression in den infizierten Zellen wurde nach Oberflächenfärbung ausgewertet. Die grauen gefüllt Histogramme stellen mock-infizierten Zellen mit dem Prä-Immun-Kaninchenserum (ungefärbten Kontrolle) angefärbt; die verbleibenden Histogramme repräsentieren Zellen, die mit anti-BST2 polyklonalen Kaninchenserum angefärbt. Histogramme mit durchgezogenen Linien stellen Steuer GFP negativ (neg) Zellen; während Histogramme mit gestrichelten Linien entsprechen den infizierten GFP positive (pos) Zellen. Meine GrippeFluoreszenz-Intensitätswerte (MFI) sind für jede Probe angegeben. Durchflusszytometrie durchgeführt und analysiert, wie in Abbildung 2 beschrieben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51207/51207fig4.jpg" width="500px" /> Abb. 4: Co-Kultur von frisch isolierten PBMCs und infizierten MT4-T-Zellen (A) Vergleich der Durchflusszytometrie allein für MT4-T-Zellen beobachtet FS / SS-Profile, PBMCs allein oder Co-Kulturen von PBMCs und MT4-T-Zellen. Aufgrund von Unterschieden in Größe und Granularität kann MT4 T-Zellen aus PBMCs in Co-Kulturen unter Verwendung von Durchflusszytometrie leicht unterschieden werden. (B) repräsentatives Beispiel für die Menge an Typ-I-IFN nach Stimulation von PBMCs mit TLR-Freigabe7 oder TLR9-Agonisten (vor), oder nach dem Co-Kulturen mit gespielter oder den angegebenen MT4-Zellen mit pNL4.3-GFP_ires_Nef WT oder dVpu infiziert. Rohdaten als OD 650 Werte dargestellt und ihre entsprechenden converseion zu Typ-I-IFN-Konzentration in U / ml ausgedrückt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51207/51207fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a>

Anders als zellfreie HIV-1-Partikeln infiziert sind CD4 + -T-Zellen wirksam durch plasmacytoid dendritischen Zellen (pDC) abgetastet. Diese Handschrift beschreibt ein Verfahren, bei peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) oder isolierten pDCs co-kultiviert, das mit HIV-1 infizierte T-Zellen, um angeborene Erfassung durch pDCs bewerten, wie durch Freisetzung von Typ-I-IFN beurteilt.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, die angeborene Wahrnehmung von HIV V1-infizierten CD4-positiven T-Zellen durch plasmazytoide dendritische Zellen, oder PDCs, zu bewerten. Dies wird zunächst erreicht, indem CD4-positive T-Zellen mit HIV V1 infiziert werden. Im zweiten Schritt werden die infizierten T-Zellen gemeinsam mit PDCs kultiviert. Nach 18 bis 22 Stunden werden die Überstände der Koinkubationen zur Quantifizierung der Typ-I-Interferonproduktion durch pDC gewonnen. Letztendlich kann die Produktion von Typ-I-Interferon verwendet werden, um die Empfindlichkeit von menschlichem Blut oder isolierten pDC gegenüber einer HIV-1-Infektion CD4-positiver T-Zellen zu beurteilen. Diese Methode könnte nützlich sein, um virale und Wirtsfaktoren zu untersuchen, die bei der Erkennung von Pathogenen, wie beispielsweise der Erkennung HIV-1-infizierter CD4-T-Zellen durch plasmazytoide dendritische Zellen, die frühe angeborene Immunantwort steuern.Obwohl diese Protokolle auf die Messung von Typ-I-Interferon ausgerichtet sind, können sie leicht modifiziert werden, um andere bioaktive Moleküle nachzuweisen, die von PCs bei der Erkennung infizierter T-Zellen freigesetzt werden, wie zum Beispiel Interferon-gamma, TNF-alpha oder Zytokine. Für die Infektion primärer CD4-positiver T-Zellen beginnen Sie mit der Aktivierung menschlichen peripheren Blutes, isolierten CD4-positiven T-Zellen mit PHA für 48 Stunden. Kultivieren Sie die Zellen mindestens drei Tage vor der Infektion in komplettem Medium, ergänzt mit rekombinantem IL-2. Anschließend infizieren Sie im Biosicherheitslabor der Stufe drei die T-Zellen mit HIV-1-Viren unter Verwendung unterschiedlicher Multiplizitäten der Infektion, zwei Tage nach der Infektion.Beurteilen Sie die Zellkulturen hinsichtlich ihrer Expression von GFP BST zwei und CD vier. Verwenden Sie nur Kulturen mit 20 bis 50 % GFP-Positivität für die Co-Kultur-Experimente in einer Sicherheitsstufe-zwei-Einrichtung. Isolieren Sie danach die mononukleären Zellen aus einer menschlichen peripheren Blutprobe mittels Dichtegradientenzentrifugation innerhalb einer halben Stunde nach der Blutentnahme.Färben Sie dann die Zellen mit den geeigneten Antikörpern, um zu bestätigen, dass die gewünschten Zelllinien in physiologischen Verhältnissen isoliert wurden. Arbeiten Sie schnell, um die Zellen kühl zu halten. Verwenden Sie ein PDC-Negativselektionskit, um die PDCs innerhalb der isolierten PBMC gemäß den Empfehlungen des Herstellers anzureichern.Bestimmen Sie anschließend den Reinheitsgrad der Anreicherung und die relativen Mengen pDC-spezifischer Oberflächenmarker wie ILT7 und BDCA2 mittels Durchflusszytometrie. Die angereicherten Proben sollten mindestens 40 % pDCs enthalten. Koinkubieren Sie nun 220 Mikroliter der Sensorzellen mit 30 Mikrolitern infizierter T-Zellen pro Vertiefung in einer 96-Loch-U-Boden-Platte. Führen Sie Kontrollvertiefungen mit ausschließlich Sensor- oder Zielzellen durch und stellen Sie das Endvolumen dieser Vertiefungen durch Zugabe von komplettem Medium auf 250 Mikroliter ein. Um die Reaktionen der pDCs auf bekannte Toll-like-Rezeptor-Agonisten zu untersuchen, geben Sie einen TLR7- oder TLR9-Agonisten in die entsprechenden Vertiefungen und inkubieren Sie die Platte 18 bis 22 Stunden bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid.Am Ende der Kokultur überführen Sie die Zellen in eine 96-Well-V-Boden-Platte und zentrifugieren die Platte fünf Minuten bei 400 ×g und Raumtemperatur. Anschließend überführen Sie die Überstände in eine 96-Well-Flachboden-Platte. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 2 % Paraformaldehyd und analysieren Sie sie per Durchflusszytometrie, wobei Sie anhand ihrer Größe und Granulation die Zellen in einem Vorwärts- versus Seitenstreuungsdiagramm unterscheiden.Um bioaktives Typ-I-Interferon mittels hcbl-Interferon-alpha-beta-Reportezellen zu messen, pipettieren Sie zunächst die Reportezellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Vertiefung in eine 96-Loch-Flachbodenplatte bei einem Endvolumen von 180 µL. Geben Sie anschließend 20 µL des frisch gewonnenen Kokultur-Überstandes in jede Vertiefung im Duplikat hinzu, fügen Sie einen Satz interner Standardkontrollen hinzu und inkubieren Sie die Platte 18 bis 22 Stunden bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid, um die Menge des von den Reportezellen freigesetzten alkalischen Phosphatases zu bestimmen. Geben Sie 180 µL Quantum-Blue-Lösung zu jeder Vertiefung einer neuen Flachbodenplatte hinzu. Danach pipettieren Sie 20 µL der induzierten HEC-PLU-Interferon-alpha-beta-Zell-Überstände in jede Vertiefung und inkubieren die Platte bei 37 °C, bis in den Standard-Interferon-Kontrollvertiefungen eine Farbreaktion sichtbar wird.Die Quantenblaue Lösung wechselt in Gegenwart des Enzyms von Rosa zu Purpurblau. Abschließend verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Konzentrationen des sezernierten alkalischen Phosphatase bei 620 bis 655 Nanometern zu bestimmen und die Konzentration von Typ-I-Interferon durch Extrapolation aus dem linearen Bereich der Interferon-Standardkurve zu ermitteln. Aufgrund der variablen Natur primärer Zellen ist es wichtig, dass normale Verhältnisse von CD14-positiven myeloischen und CD3-positiven T-Zellen beobachtet werden, wie in diesen repräsentativen Punktdiagrammen dargestellt.Außerdem sind in den frisch isolierten PBMC-Kulturen nur eine geringe Anzahl aktivierter T-Zellen, die anhand ihres höheren Forward Scatter und der CD3-Niveaus identifiziert werden, erwünscht. Am wichtigsten ist die Bestimmung des relativen Prozentsatzes der pDCs, obwohl dieser Prozentsatz zwischen 0,2 und 1,2 % variieren kann. Ein abnormales Sensitivitätsphänotyp wird ebenfalls bei beiden Extremen dieses Bereichs beobachtet. Die Anreicherung der pDCs mittels negativer Selektion führt häufig zu einer Reinheit von 50 bis 95 %, wie in diesen beiden repräsentativen Punktdiagrammen von verschiedenen Spendern zu sehen ist.Ein prototypisches Beispiel des gesamten Experiments wird in den nächsten Abbildungen gezeigt. In dieser repräsentativen Studie wurden MT4-Zellen mit P und l 4.3 GFP, IRIS NF Wildtyp oder delta VPU infiziert, um zum Zeitpunkt der Co-Kultur eine Infektionsrate von 30 % zu erreichen.Wie zuvor beschrieben, führten nur Infektionen mit dem Wildtyp-Virus zu einer signifikanten Herunterregulation von Oberflächen-BST-2. Aufgrund ihrer Unterschiede in Größe und Granularität können MT-4-Zellen nach der Co-Kultur mithilfe der Durchflusszytometrie leicht von PBMCs unterschieden werden. Nur PBMCs in Anwesenheit bekannter TLR7- oder TLR9-Agonisten oder PBMCs in Kontakt mit HIV-1-infizierten Zellen setzten signifikante Mengen an Typ-I-Interferon frei. Kein Interferon wurde in PBMCs allein, in PBMC-Co-Kultur mit mock-infizierten MT-4-Zellen oder in infizierten MT-4-Zellen allein nachgewiesen. In dem hier dargestellten Beispiel erwies sich die angeborene Erkennung von HIV-1-infizierten MT-4-Zellen durch PBMCs in Gegenwart von Vpu als signifikant vermindert.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Kontaminationsquellen zu vermeiden. Verwenden Sie stets endotoxinfreie Lösungen. Denken Sie daran, regelmäßig auf Mykoplasmen-Kontaminationen zu prüfen, und kultivieren Sie Ihre Zellen ohne Antibiotika, da selbst kontrollierte bakterielle Infektionen von PBMs erkannt werden können.Vergessen Sie nicht, dass PCs sehr empfindliche Zellen sind. Sie haben eine begrenzte Lebensdauer, und ihre Reaktionsfähigkeit kann beeinträchtigt werden, wenn das Verfahren nicht zeitnah durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4 + T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines Ex-vivo- Co-Kultursystem. (Video) | JoVE Journal

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