Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4 + T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines Ex-vivo- Co-Kultursystem.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, die angeborene Wahrnehmung von HIV V eins, infizierten CD 4-positiven T-Zellen durch plasmazytoide dendritische Zellen oder PDCs zu bewerten. Dies geschieht zunächst durch die Infektion von Zöliakie, vier positiven T-Zellen mit H, HIV, V einer. Im zweiten Schritt werden die infizierten T-Zellen mit PDCs co-kultiviert.

Nach 18 bis 22 Stunden werden die Überstände aus den Co-Kulturen für die Quantifizierung der PDC-Typ-1-Interferonproduktion gewonnen. Letztendlich kann die Produktion von Typ-1-Interferon verwendet werden, um die Empfindlichkeit von menschlichem Blut zu beurteilen, isoliertes PDC zu CD vier positive T-Zell-H-HIV-Eins-Infektionen. Diese Methode könnte nützlich sein, um virale und Wirtsfaktoren zu untersuchen, die die frühe angeborene Immunantwort bei der Erkennung von Krankheitserregern steuern, wie z.B. die Erkennung von HIV, einer infizierten CD vier T-Zellen durch plasmazytoide lytische Zellen.

Obwohl diese Protokolle auf die Messung von Typ-1-Interferon abzielen, können sie leicht modifiziert werden, um andere bioaktive Moleküle nachzuweisen, die von PCs bei der Erkennung infizierter T-Zellen wie Interfer gamma, TNF alpha oder Kins freigesetzt werden. Für die Infektion von primären Zöliakie beginnen vier positive T-Zellen mit der Aktivierung des menschlichen peripheren Blutes, isolierte Zöliakie vier positive T-Zellen mit PHAL für 48 Stunden. Halten Sie die Zellen mindestens drei Tage vor der Infektion in vollständigem Medium, ergänzt mit rekombinantem IL zwei. Infizieren Sie dann in einem Labor der Biosicherheitsstufe drei die T-Zellen mit HIV-Eins-Viren unter Verwendung unterschiedlicher Infektionsvielfalt, zwei Tage nach der Infektion.

Bewerten Sie die Zellkulturen auf ihre Expression von GFP, BST zwei und CD vier. Verwenden Sie nur Kulturen mit einer GFP-Positivität von 20 bis 50 % für die Co-Kultur-Experimente in einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe zwei. Als nächstes isolieren Sie die mononukleären Zellen aus einer menschlichen peripheren Blutprobe durch Dichtegradientenzentrifugation innerhalb einer halben Stunde nach der Blutentnahme.

Färben Sie dann die Zellen mit den entsprechenden Antikörpern, um zu bestätigen, dass die gewünschten Zelllinien in physiologischen Verhältnissen isoliert wurden. Schnelles Arbeiten, um die Zellen kalt zu halten. Verwenden Sie ein PDC-Negativauswahlkit, um die PDCs innerhalb der isolierten PBMC gemäß den Empfehlungen des Herstellers anzureichern.

Bestätigen Sie dann den Reinheitsgrad der Anreicherung und die relativen Mengen an PDC-spezifischen Oberflächenmarkern wie I LT 7 und BDCA zwei durch Grippezytometrie. Angereicherte Proben sollten mindestens 40 % PDCs enthalten. Co-kultivieren Sie nun 220 Mikroliter der sensorischen Zellen mit 30 Mikrolitern infizierter T-Zellen pro Well in einer 96-Well-U-Bodenplatte. Schließen Sie Kontrollwells ein, die nur die sensorischen oder Zielzellen enthalten, und stellen Sie diese Wells auf ein Endvolumen von 250 Mikrolitern mit vollständigem Medium ein. Um die PDC-Reaktionen auf bekannte Toll-like-Rezeptor-Agonisten zu beurteilen, geben Sie einen TLR-Sieben- oder TLR-Neun-Agonisten in die entsprechenden Vertiefungen und inkubieren Sie die Platte 18 bis 22 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Am Ende der Co-Kultur werden die Zellen auf eine 96-Well-V-Bodenplatte umgefüllt und die Platte fünf Minuten lang bei 400 g und Raumtemperatur zentrifugiert. Übertragen Sie dann die Überstände auf eine 96-Well-Platte mit flachem Boden. Resus suspendiert die Zellpellets in 2%-Paraform-Aldehyd und analysiert sie mittels Durchflusszytometrie anhand ihrer Größe und Granulation, um die Zellen in einem Vorwärts- und Seitenstreudiagramm zu unterscheiden.

Um bioaktives Typ-1-Interferon unter Verwendung von HCBL-Interferon-Alpha-Beta-Reporterzellen zu messen, werden die Reporterzellen zunächst mit einer Dichte von 50.000 Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden auf ein Endvolumen von 180 Mikrolitern plattiert. Geben Sie dann 20 Mikroliter des gerade geernteten Co-Kultur-Überstands in zweifacher Ausfertigung in jede Vertiefung, fügen Sie eine Reihe interner Standardkontrollen hinzu und inkubieren Sie die Platte 18 bis 22 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um den Gehalt an alkalischer Phosphatase zu bestimmen, der von den Reporterzellen bei 180 Mikrolitern Quantenblaulösung in jede Vertiefung einer neuen flachen Bodenplatte freigesetzt wird. Geben Sie dann 20 Mikroliter der induzierten HEC-PLU-Interferon-Alpha-Beta-Zellüberstände in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, bis sich in den Standard-Interferon-Kontrollwells eine Farbe entwickelt.

Die Quantenblau-Lösung wechselt in Gegenwart des Enzyms von rosa zu violettblau. Verwenden Sie schließlich ein Spektralphotometer, um die Konzentrationen der sekretierten alkalischen Phosphatase bei 620 bis 655 Nanometern zu bewerten, und bestimmen Sie die Konzentration von Typ-1-Interferon durch Extrapolation aus dem linearen Teil der Interferon-Standardkurve. Aufgrund der variablen Natur der Primärzellen ist es wichtig, dass normale Verhältnisse von CD 14-positiven myeloischen und CD 3-positiven T-Zellen beobachtet werden, wie in diesen repräsentativen Punktdiagrammen gezeigt.

Darüber hinaus ist in den frisch isolierten PBMC-Kulturen nur eine geringe Anzahl aktivierter T-Zellen, die durch ihre höhere Vorwärtsstreuung und CD-3-Spiegel gekennzeichnet sind, wünschenswert. Am wichtigsten ist, dass der relative Prozentsatz der PDCs bestimmt werden muss, obwohl dieser Prozentsatz zwischen 0,2 und 1,2 % variieren kann. Ein abnormaler Wahrnehmungsphänotyp wird auch bei beiden Extremen dieses Bereichs beobachtet. Die Anreicherung der PDCs mittels negativer Selektion ergibt oft eine PDC-Reinheit von 50 bis 95 %, wie in diesen beiden repräsentativen Punktdiagrammen verschiedener Donatoren zu sehen ist.

Ein prototypisches Beispiel für das Gesamtexperiment ist in den nächsten Abbildungen dargestellt. In dieser repräsentativen Studie. MT vier Zellen wurden mit P und l 4,3 GFP, IRIS NF Wildtyp oder Delta VPU infiziert, um zum Zeitpunkt der Co-Kultur eine 30%ige Infektion zu erreichen.

Wie bereits beschrieben, führten nur die Infektionen mit Wildtyp-Viren zu einer signifikanten Herunterregulierung von Oberflächen-BST zwei. Aufgrund ihrer Unterschiede in Größe und Granularität können MT-4-Zellen durch Durchflusszytometrie leicht von p-BMCs unterschieden werden, nachdem nur pbmc in Gegenwart bekannter TLR-Sieben- oder TLR-Neun-Agonisten oder pbmc in Kontakt mit HIV-1-infizierten Zellen signifikante Mengen an Typ-1-Interferon freigesetzt haben. In pbmc allein in Pbmc-Co-Kultur mit Schein-infizierten MT-Vier-Zellen oder einem infizierten MT mit vier Zellen allein wurde kein Interferon nachgewiesen. In dem hier vorgestellten Beispiel wurde festgestellt, dass die angeborene Wahrnehmung von HIV, einer infizierten MT vier Zellen durch pbmc, in Gegenwart von VPU signifikant reduziert war.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, alle Kontaminationsquellen zu vermeiden. Verwenden Sie immer endotoxinfreie Lösungen. Denken Sie daran, routinemäßig auf Mykoplasmenkontaminationen zu prüfen und Ihre Zellen ohne Antibiotika in Kultur zu halten, da selbst kontrollierte bakterielle Infektionen von PBMs erkannt werden können.

Vergessen Sie nicht, dass PCs sehr zerbrechliche Zellen sind. Sie haben eine begrenzte Lebensdauer und ihre Reaktionsfähigkeit kann beeinträchtigt werden, wenn der Eingriff nicht rechtzeitig durchgeführt wird.