Name: Kapsel Serotypisierung von Streptococcus pneumoniae Verwenden der Quellung Reaktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-24T15:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: Lernen Sie die Kapselserotypisierung von Streptococcus pneumoniae mit der Quellung-Reaktion. Diese Goldstandard-Methode ermöglicht schnelle und zuverlässige Ergebnisse für die mikrobiologische Diagnostik.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von der Bill-und-Melinda-Gates-Stiftung (PneuCarriage Projekt, Grant 52099) und operativen Infrastruktur-Support-Programm der Regierung von Victoria unterstützt. Dank Eileen Dunne, Janet Strachan, und Kim Hasen für die kritische Durchsicht des Manuskripts.

1. Herstellung von Zellsuspension Typing <ol><li> Mit einer sterilen Einweg-1 ul-Schleife, einen kleinen Schwung der frischen Übernachtreinkultur von Pneumokokken auf festen nichtselektiven Pferdeblut-Agar und impfen 100 ul Heart Infusion (HALLO) Brühe. Die Suspension sollte zu sein scheinen nur sichtbar trüb. Rühren Sie vorsichtig das Rohr zu emulgieren. Hinweis: Andere Medien, wie Hirn-Herz-Infusionsbrühe kann ebenfalls geeignet sein. Zugabe von Serum (z. B. eine Endkonzentration von 10% (v / v) Pferdeserum) und Inkubation bei 37 ° C für ungefähr 1 Stunde vor der Verwendung verwendet werden, um die Reaktion zu verbessern. </li></ol> 2. Überprüfen Dichte der Zellsuspension Die Zellsuspension in Schritt 1.1 hergestellten auch als negative Kontrolle verwendet werden, und sollte für die Zelldichte überprüft werden, bevor die Eingabe Seren. <ol><li> Mit einem 1 ul Schleife übertragen einen Tropfen des Inokulums in Schritt 1.1 vorbereitet auf ein Glass Objektträger. </li><li> Mit einer Pinzette, legen Sie einen kleinen kreisförmigen Deckglas auf der Suspension. </li><li> Mit Phasenkontrasteinstellung, beobachten die Vorbereitung mikroskopisch unter 400-facher Vergrößerung, um die Dichte der Suspension (Abbildung 1A) zu überprüfen. <ol><li> Wenn der Impfstoff ist zu schwer (2A), fügen Sie mehr Brühe zu der Zellsuspension in Schritt 1.1 zu verdünnen gemacht. Vorsichtig wieder mischen. </li><li> Wenn das Inokulum zu gering ist, gibt es beispielsweise bei &lt;50 Zellen sichtbar im mikroskopischen Bereich (2B), fügen mehr Bakterien zur Herstellung der Zellsuspension in Schritt 1.1 hergestellt und vorsichtig mischen. Hinweis: Mit der Erfahrung kann die Dichte der Zellsuspension durch Schütteln und hält sie gegen das Licht, wo es zu sein scheinen nur sichtbar trübe beurteilt werden. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.3, bis eine geeignete Anzahl von Zellen in der mikroskopischen Feld sichtbar sind. Hinweis: Glasdias und coverslips präsentieren eine scharfe Gegenstände Gefahr. Nach Gebrauch werden die Objektträger und Deckgläser mit infektiösem Material kontaminiert und muss in ein Biohazard scharfen Container entsorgt werden. </li></ol> 3. Typing <ol><li> Übertragen ~ 1 ul der vorbereiteten Inokulums (zB mit einem 1 ul-Schleife) auf die Glasobjektträger. Entsorgen Sie die Schleife in den Biohazard-Behälter für scharfe Gegenstände. </li><li> Gleiches Volumen (1 ul Öse) von Raumtemperatur-Antiserum auf den Objektträger und mischen beide fällt auch mit der Schleife. </li><li> Mit einer Pinzette, legen Sie einen kleinen kreisförmigen Deckglas auf die Suspension, kümmert das Drop nicht zu berühren. Platzieren des Deckglases auf die Suspension unmittelbar nach der Zugabe von Antiseren, um die Flüssigkeit auf der Folie vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Unter dem Mikroskop beobachten die Suspension unter Phasenkontrast mit 400-facher Vergrößerung. Eine negative Reaktion Quellung beobachtet wird, wenn wenig oder kein &quot;Schwellung&quot; der Pneumokokken-Zellen bei 40 gesehen werden0X Vergrößerung, ähnlich dem, was in der Pneumokokken-Zellsuspension ohne Antiseren beobachtet hinzugefügt (Negativkontrolle). Eine positive Reaktion Quellung wird beobachtet, wenn die Zellen im Vergleich zu den Zellen in der Negativkontrolle erscheint vergrößert oder &quot;geschwollen&quot; und mehr sichtbar. Hinweis: Nicht eindeutige Reaktionen sollten durch Untersuchen der Reaktion nach 5-10 min Inkubation bei Raumtemperatur, oder durch Wiederholen der Reaktion mit Antiserum, weiter untersucht werden, zum Beispiel. </li><li> Führen Pneumokokken Serotypisierung mit aufeinanderfolgenden Prüfung der einzelnen Antiseren Pools, bis eine positive Reaktion beobachtet. Alternativ können Pools in Abhängigkeit von lokalen Auftreten von Serotypen &quot;Runden&quot; angewendet werden. Hinweis: Die Prüfung in &quot;Runden&quot; sorgt dafür, dass die Pools mit Antikörpern gegen die häufigsten Serotypen werden zunächst getestet, minimiert Aufwand und Kosten. Gleichzeitige Prüfung von mehreren Pools bietet auch zusätzliche Negativkontrollen, die in interp nützlich sein kann,retation. Wenn alle Pools in einem bestimmten &quot;runde&quot; negativ sind, testen Sie das Isolat mit folgenden Runden der Schwimmbäder. </li><li> Testen Sie das Isolat mit der entsprechenden Muster-oder Gruppenantiserum innerhalb des reaktiven Pool enthalten. Verwenden Sie gegebenenfalls Faktor Antiseren gegen den Serotyp weiter zu differenzieren. Hinweis: Schlüssel zur Pneumokokken-Antiserum vom Hersteller geliefert werden, bei der Auswahl der entsprechenden Pool, Typ, Gruppe oder Faktor Antiseren und Interpretation der Ergebnisse (einschließlich Kreuzreaktionen) eingesetzt. </li><li> Wenn negative Ergebnisse werden mit allen Pools erhalten, testen Sie die Isolat mit Omniserum Reagenz (enthält Antikörper gegen 91 Serotypen 21). Wenn eine positive Reaktion Quellung noch nicht beobachtet, wenn die Prüfung ein Pneumokokken-Isolat mit der Omniserum Reagenz kann dies daran liegen, das Isolat exprimieren geringe oder keine Kapsel oder dass Antikörper gegen die Serotypen sind nicht im Omniserum dargestellt. Die letztere Kategorie können neue Serotypen enthalten. </li> &lt;/ Ol&gt;

<ol><li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years%3A+global+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li>
<li>Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+colonisation%3A+the+key+to+pneumococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease.</a> Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).</li>
<li>Henrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six+newly+recognized+types+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).</li>
<li>Calix, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical%2C+genetic%2C+and+serological+characterization+of+two+capsule+subtypes+among+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+20+strains%3A+discovery+of+a+new+pneumococcal+serotype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical, genetic, and serological characterization of two capsule subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 strains: discovery of a new pneumococcal serotype.</a> J. Biol. Chem. 287, 27885-27894 (2012).</li>
<li>Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+pneumococcal+serogroups+cause+the+most+invasive+disease%3A+implications+for+conjugate+vaccine+formulation+and+use%2C+part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I.</a> Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).</li>
<li>Johnson, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+serotypes+causing+invasive+pneumococcal+disease+among+children+under+five%3A+the+pneumococcal+global+serotype+project%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumococcal disease among children under five: the pneumococcal global serotype project.</a> PLoS Med. 8, (2010).</li>
<li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378, 1962-1973 (2011).</li>
<li>Obaro, S. K., Adegbola, R. A., Banya, W. A., Greenwood, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carriage+of+pneumococci+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Carriage of pneumococci after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 348, 271-272 (1996).</li>
<li>Mulholland, K., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 379, 1388-1389 (2012).</li>
<li>Austrian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quellung+reaction%2C+a+neglected+microbiologic+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Mt.+Sinai.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">The quellung reaction, a neglected microbiologic technique.</a> Mt. Sinai. J. Med. 43, 699-709 (1976).</li>
<li>Konradsen, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Validation of serotyping of Streptococcus pneumoniae in Europe.</a> Vaccine. 23, 1368-1373 (2005).</li>
<li>Lovgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+an+international+external+quality+assurance+model+to+support+laboratory+investigation+of+Streptococcus+pneumoniae%2C+developed+for+the+SIREVA+project+in+Latin+America%2C+from%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolution of an international external quality assurance model to support laboratory investigation of Streptococcus pneumoniae, developed for the SIREVA project in Latin America, from.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 3184-3190 (2007).</li>
<li>Reasonover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+International+Circumpolar+Surveillance+interlaboratory+quality+control+program+for+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The International Circumpolar Surveillance interlaboratory quality control program for Streptococcus pneumoniae.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 138-143 (2011).</li>
<li>Hare, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%2334%3BDodgy+6As%26%2334%3B%3A+differentiating+pneumococcal+serotype+6C+from+6A+by+use+of+the+Quellung+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">#34;Dodgy 6As&#34;: differentiating pneumococcal serotype 6C from 6A by use of the Quellung reaction.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1981-1982 (2009).</li>
<li>Kong, F., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+cpsA-cpsB+sequence+polymorphisms+and+serotype-%2Fgroup-specific+PCR+to+predict+51+Streptococcus+pneumoniae+capsular+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Using cpsA-cpsB sequence polymorphisms and serotype-/group-specific PCR to predict 51 Streptococcus pneumoniae capsular serotypes.</a> J. Med. Microbiol. 52, 1047-1058 (2003).</li>
<li>Castillo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Methods+for+the+Diagnosis+of+Meningitis+caused+by+Neisseria+meningitidis%2C+Streptococcus+pneumoniae%2C+and+Haemophilus+influenzae.+2nd+ed%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of Streptococcus pneumoniae.</a> Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. 2nd ed. , World Health Organization. 73-86 (2011).</li>
<li>Kaijalainen, T., Rintamaki, S., Herva, E., Leinonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+gene-technological+and+conventional+methods+in+the+identification+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of gene-technological and conventional methods in the identification of Streptococcus pneumoniae.</a> J. Microbiol. Methods. 51, 111-118 (2002).</li>
<li>SSIDiagnostica, Neufeld antisera. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a> (2013).</li>
<li>Sorensen, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typing+of+pneumococci+by+using+12+pooled+antisera%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Typing of pneumococci by using 12 pooled antisera.</a> J. Clin. Microbiol. 31, 2097-2100 (1993).</li>
<li>Diagnostica SSI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+to+pneumococcal+factor+antisera%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Key to pneumococcal factor antisera.</a> , (2013).</li>
<li>Diagnostica SSI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+antisera+for+in+vitro+diagnostic+use%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal antisera for in vitro diagnostic use.</a> , (2011).</li>
<li>Lund, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+diagnosis+of+Pneumococcus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Laboratory diagnosis of Pneumococcus infections.</a> Bull. World Health Organ. 23, 5-13 (1960).</li>
<li>Satzke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae%3A+Updated+recommendations+from+the+World+Health+Organization+Pneumococcal+Carriage+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group.</a> Vaccine. 32, 165-179 (2013).</li>
<li>Vernet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory-based+diagnosis+of+pneumococcal+pneumonia%3A+state+of+the+art+and+unmet+needs%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Laboratory-based diagnosis of pneumococcal pneumonia: state of the art and unmet needs.</a> Clin. Microbiol. Infect. 17, 1-13 (2011).</li>
<li>Casewell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiences+in+the+use+of+commercial+antisera+for+the+capsular+typing+of+klebsiella+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Experiences in the use of commercial antisera for the capsular typing of klebsiella species.</a> J. Clin. Pathol. 25, 734-737 (1972).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Ein kritischer Schritt in diesem Verfahren ist eine reine Kultur sicherzustellen, wird die Suspension zusammen mit dem Hinzufügen einer geeigneten Anzahl von Bakterienzellen, in die Brühe herzustellen. Es sei darauf hingewiesen, dass das Wachstum und Koloniemorphologie auf Agarplatten variiert zwischen verschiedenen Pneumokokken-Isolaten werden. Einige produzieren trockene und raue Kolonien, die schwierig sein kann, zu holen mit einer Schleife und nicht gut in der Brühe zu emulgieren. Aus diesem Grund kann eine größere Schleife der Bakterien benötigt werden bei der Herstellung der Zellsuspension. In jedem Fall ist es unerlässlich, dass die einzelnen Zellen und keine Aggregate sind in der Negativkontrolle offensichtlich so ihre relative Größe der Zellen mit Antiseren verglichen werden zugegeben. Zusätzlich können zu viele Bakterienzellen in einem falsch-negativen Reaktion, in dem ein Überschuss von Kapsel-Antigen kann die Quellung Reaktion 10 hemmen führen. Aus diesem Grund ist es wichtig, eine Bakteriensuspension mit geeigneter Zelldichte (Fig. 1) zu schaffen. Die susRente kann für mehrere Monate durch die Zugabe von einigen Tropfen konzentrierter Formalin konserviert werden. Dies ermöglicht eine einfachere Chargenprüfung und sterilisiert die Brühe reduziert das Risiko von Laborinfektionen, obwohl dies muss vor dem Sicherheitsrisiko im Umgang mit Formalin, die giftig, ätzend, krebserzeugend, sensibilisierend und entflammbar ist abgewogen werden. Außerdem haben wir beobachtet, dass einige Isolate zeigen schwächere Reaktionen in Gegenwart von Formalin (Daten nicht gezeigt). Quellung Reaktionen werden unter Verwendung eines Mikroskops untersucht. Die Verwendung von Phasenkontrast verbessert die Sichtbarkeit der Kapsel. In einigen Labors wird die Reaktion unter Verwendung von Ölimmersions bei 1000-facher Vergrößerung 14, 16 betrachtet. Darüber hinaus sind einige Laboratorien eine Gegenfärbung (Methylenblau), um die Sichtbarkeit einer positiven Reaktion 10, 16, 22 weiter zu verbessern. Die hier vorgestellte Methode wird ohne Öl-i angesehenmmersion und unter 400-facher Vergrößerung 15, 17. Diese Methode ist schnell, einfach und relativ leicht zu lesen 23. Es ist wichtig, gute interne Qualitätskontrolle zu halten, um sicherzustellen, dass die Antisera und Testverfahren sind in Ordnung. Die Teilnahme an einer externen Qualitätssicherungsprogramm ist oft von Vorteil. Eine wesentliche Einschränkung der Quellung Reaktion zur Serotypisierung von Pneumokokken sind die hohen Kosten der benötigten Antiseren. Dies wird jedoch in dem obigen Protokoll aufgrund der geringen Menge von Antiserum für jede Reaktion verwendet wird, minimiert. Mehrere andere Verfahren wurden zur Serotypisierung Pneumokokken 23, 24 beschrieben. Allerdings bleibt Quellung der Goldstandard und die Entwicklung von neuen Methoden erfordert Standardisierung gegen die Quellung Reaktion 23. Mit entsprechenden Antiseren kann die Quellung Reaktion auch genutzt werden, um zu identifizieren, und geben Sie anderen Kappen werdenModul 25 produzierenden Bakterien. Die Quellung Reaktion ist maßgeblich an der Charakterisierung der aktuellen und zukünftigen Pneumokokken-Serotypen, sowie Bereitstellung von Informationen über die Wirksamkeit des Impfstoffes und die langfristigen Auswirkungen der Impfung auf Schlitten und Krankheit.

Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) ist für den Tod von schätzungsweise 800.000 Kinder unter fünf Jahren pro Jahr verantwortlich, wobei die Last der Krankheit vor allem in ressourcenarmen Ländern 1 fällt. Pneumokokken-Erkrankungen reichen im Schweregrad von lokalisierten Infektionen wie akute Mittelohrentzündung zu schweren lebensbedrohlichen Infektionen wie Sepsis, Meningitis und Lungenentzündung 2. Über 90 Serotypen von Pneumokokken-Kapselpolysaccharid beschrieben worden, 3, 4. Strom Pneumokokken-Impfstoffe einen Schutz gegen die Serotypen, die für die Mehrzahl der invasiven Erkrankung 5, 6 verantwortlich sind. Allerdings hat weit verbreiteten Einsatz von Impfstoffen mit dem Ersatz der Serotypen, die im Impfstoff enthaltenen Serotypen von nonvaccine in Verbindung gebracht, sowohl im Nasen-Rachen-Wagen und invasive Erkrankungen 7, 8. Dies unterstreicht die Bedeutung der Serotypisierung für epidemiologischeÜberwachungs-und langfristigen Auswirkungen Impfstoffstudien 9. Die Goldstandardmethode für die Pneumokokken-Typisierung ist der Kapselreaktionstest, da die Quellung Reaktion bekannt, die zuerst von Neufeld im Jahre 1902 beschrieben (siehe österreichischen 10). Ein hohes Maß an Übereinstimmung zwischen Laboratorien und zwischen der Quellung Reaktion und andere Methoden Serotypisierung 11-13 gefunden. Es gibt mehrere Varianten der Quellung Reaktion 10, 14-16. Das hier beschriebene Verfahren erfordert nicht die Verwendung einer Gegenfärbung oder der Ölimmersionslinse, sondern es wird ein Tropfen vorbereiteten Probe gemischt mit dem Eingabe-Serum untersucht und direkt unter 400-facher Vergrößerung. Die Quellung Reaktion wird üblicherweise unter Verwendung von handelsüblichen Antisera. Das hier beschriebene Verfahren verwendet weniger Antiseren verglichen mit anderen Methoden, 16, 17, so dass es kostengünstiger. Sobald ein isol.gegessen wird als Pneumokokken identifiziert, wird es nacheinander mit Antiseren Pools getestet, bis eine positive Reaktion beobachtet wird. Jeder Pool Antiserum enthält verschiedene Mischungen von Antiseren gegen 91 Pneumokokken-Serotypen 18 angehoben. Sobald der Pool aufgebaut ist, werden die einzelnen Muster und Gruppen Antiseren, die im reaktiven Pool aufgenommen werden einzeln nacheinander getestet. Typ Antiseren reagieren in der Regel mit einem einzigen Serotyp (zB Typ-1-Antiserum mit Serotyp 1 reagiert), während die Gruppe Antiseren reagieren mit allen Serotypen, die in einer bestimmten Gruppe (zB Gruppe 22 Antiserum reagiert mit Serotypen 22F und 22A). Einige Serotypen innerhalb der Gruppen werden weiter mit Faktor Antiseren (zB Serotyp 22F reagiert mit Faktor 22b, aber nicht 22c) unterschieden. In diesem Fall ist die Prüfung erfolgt mit allen relevanten Faktor Antiseren fortgesetzt, bis Serotyp bestimmt 19, 20. Die Quellung Reaktion ist einfach und schnell 14 und kann in jeder l durchgeführt werdenabor ist, dass mit einer guten Qualität Mikroskop und entsprechenden Satz von Antiseren ausgestattet.

<table><tbody><tr><td>Pneumococcus (Neufeld) Antiseren</td><td>SSI Diagnostica</td><td></td><td><a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a> Alle Antiseren vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen</td></tr><tr><td>Pneumococcus (Omni) Antiserum</td><td>SSI Diagnostica</td><td>2438</td><td>Alle Antiseren vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen</td></tr><tr><td>Optisches Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica DML</td><td></td></tr><tr><td>kalibrierte Einweg-Impfösen 1 & micro; l</td><td>Copan</td><td>CD175S01</td><td></td></tr><tr><td>Horse Blood Agar (HBA) Platten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PP2001<</td><td>a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au/</a> Vor Gebrauch auf Raumtemperatur bringen</td></tr><tr><td>Herzinfusionsbrühe (HI</td>) Media <td>Preparation Unit (MPU), The University of Melbourne</td><td>40HIN</td> Vor <td>Gebrauch</td></tr> <tr><td>auf Raumtemperatur bringenObjektträger aus Glas 76 mm x 26 mm</td><td>Lomb Scientific</td><td>7101</td><td>Gefahr für scharfe Gegenstände: In einem Behälter für biologisch gefährdungsvolle scharfe Gegenstände entsorgen</td></tr><tr><td>Runde Glasdeckgläser</td><td>NeuVitro</td><td>GG-5</td><td></td></tr><tr><td>*Mit Ausnahme der Antiseren können alle anderen Materialien von alternativen Lieferanten</td><td></td><td></td><td></td> bezogen werden*Platten,</tr> die <tr><td>aus defibraniertem Schafsblut hergestellt wurden, sind geeignet, Blutplatten, die aus Citratblut oder menschlichem Blut hergestellt wurden, sind jedoch nicht geeignet</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kapsel serotypisierung von<em&gt; streptococcus pneumoniae</em&gt; verwenden der quellung reaktion

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

Es gibt über 90 verschiedene Kapsel Serotypen von Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken). Abgesehen davon, dass ein Werkzeug für das Verständnis Pneumokokken-Epidemiologie, können Kapsel Serotypisierung nützliche Informationen für die Impfstoff-Wirksamkeit und Wirkungsstudien liefern. Die Quellung Reaktion ist der Goldstandard-Methode für Pneumokokken-Kapsel Serotypisierung. Das Verfahren beinhaltet das Testen einer Pneumokokken-Zellsuspension mit gepoolten und spezifische Antiseren gegen die Kapsel-Polysaccharid gerichtet. Die Antigen-Antikörper-Reaktionen werden mikroskopisch beobachtet. Das Protokoll besteht aus drei Schritten: 1) Herstellung einer Bakterienzellsuspension, 2) Mischen der Zellen und Antiseren auf einem Glasträger, und 3) das Lesen der Quellung Reaktion unter Verwendung eines Mikroskops. Die Quellung Reaktion ist relativ einfach durchzuführen und kann angewendet werden, wo ein geeignetes Mikroskop und Antiseren zur Verfügung.

<html> Eine positive Reaktion tritt auf, wenn Quellung typspezifischen Antikörper bindet an die Kapsel der Pneumokokken, die zu einer Änderung seines Brechungsindex 10. Wenn unter einem Mikroskop betrachtet, erscheinen die Bakterien &quot;geschwollen&quot; und mehr sichtbar 14. 1A zeigt Pneumokokken-Zellen in HALLO Brühe. Bei Typ-spezifische Antiserum wird in die Bakteriensuspension hinzugefügt, Pneumokokken erscheinen &quot;geschwollen&quot;, refraktive und mehr abgerundet (Abbildung 1B). Zu viele Bakterienzellen in die Brühe zugegeben wird, kann in Aggregation von Zellen oder einem falsch-negativen Reaktion führen. Abbildung 2 zeigt Inokula der Pneumokokken-Zellen in HALLO Brühe, die &quot;zu schwer&quot; (2A) oder &quot;zu leicht&quot; (2B) sind. 08fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51208/51208fig1.jpg &quot;/&gt; Fig. 1 ist. Negative und positive Quellung Reaktion. Zubereitungen von der Serotyp 9V Pneumokokken isolieren, ohne Antiserum (1A) und mit der Gruppe 9-Antiserum (1B), wurden unter 400-facher Vergrößerung betrachtet. Letzteres zeigt die &quot;Schwellung&quot; und Runden von Bakterienzellen in der Regel in einem positiven Quellung Reaktion gesehen. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51208/51208fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51208/51208fig2.jpg" /> 2. Zu schwer und zu leicht Inokula. Zubereitungen von der Pneumokokken-Zellsuspensionen, die zu schwer (2A) oder zu hell (2B) sind, wenn sie unter 400-facher Vergrößerung betrachtet.

Die Quellung Reaktion ist der Gold-Standard-Technik für Serotypisierung Streptococcus pneumoniae. Diese Technik nutzt ein Mikroskop und Pneumokokken-spezifische Antiseren und wird häufig in Referenz-und Forschungslaboren weltweit eingesetzt.

Kapsel Serotypisierung von<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Verwenden der Quellung Reaktion

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Kapselstereotypisierung von Streptococcus pneumoniae oder des Pneumokokkus mithilfe der Quellungreaktion durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst Herzinfusionsbrühe mit einer frischen, über Nacht gezüchteten Reinkultur von Pneumokokken beimpft wird. Im zweiten Schritt wird ein Tropfen der Inokulation auf einen Glasobjektträger übertragen.Anschließend wird auf dem Objektträger Antiserum in gleichem Volumen zugegeben. Im letzten Schritt werden beide Tropfen vermischt und ein Deckglas über die Suspension gelegt. Abschließend kann die Suspension im Phasenkontrast untersucht werden, um die positive oder negative Quell-Lungen-Reaktion zu beobachten.Diese Methode zeigt die Goldstandard-Methode zur Pneumokokken-Syp. Die Methode ist einfach, leicht durchzuführen und einfach zu interpretieren. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da Personen, die neu in dieser Technik sind, möglicherweise Schwierigkeiten haben, eine geeignete Zelldichte für die Durchführung des Qualm-Tests zu erkennen.Beginnen Sie damit, mit einer sterilen, Einweg-Ein-Mikroliter-Schleife einen kleinen Abstrich einer frischen, über Nacht gezüchteten Reinkultur von Pneumokokken zu entnehmen, die auf einer festen, nicht-selektiven Pferdeblut-Agarplatte gezüchtet wurde, und impfen Sie die Pneumokokken in 100 Mikroliter Herzinfusionsbrühe an. Die Suspension sollte gerade sichtbar trüb erscheinen; schütteln Sie das Reagenzglas vorsichtig, um die Zellsuspension zu emulgieren. Verwenden Sie eine neue Ein-Mikroliter-Schleife, um einen Tropfen des Inokulums auf einen Glasobjektträger zu übertragen.Schieben Sie als Nächstes einen kleinen runden Deckel auf die Suspension und überprüfen Sie die Dichte der Suspension unter Phasenkontrast bei 400-facher Vergrößerung. Wenn das Inokulum zu dicht ist, verdünnen Sie die Zellsuspension mit mehr Brühe und mischen Sie die Zellen erneut vorsichtig. Wenn das Inokulum zu schwach ist, fügen Sie beispielsweise weitere Bakterien zur Zellsuspension hinzu, falls weniger als 50 Zellen sichtbar sind, und mischen Sie erneut vorsichtig.Bei Erfahrung kann die Dichte der Zellsuspension beurteilt werden, indem man die Suspension schüttelt und gegen das Licht hält, wobei sie gerade sichtbar trüb erscheinen sollte. Unter dem Mikroskop betrachtet sollte die Zelllösung etwa diese Dichte aufweisen.Nachdem die optimale Verdünnung der Bakterienzellen erreicht wurde, übertragen Sie etwa einen Mikroliter des Inokulums auf das Glasobjektträger. Fügen Sie anschließend mit einer neuen Öse ein gleiches Volumen von Raumtemperatur hinzu.Antiserum auf den Objektträger geben und beide Tropfen gut vermischen. Sofort mit dem Schleifen ein kleines Deckglas auf die Suspension legen, wobei darauf geachtet werden muss, den Tropfen nicht mit der Pinzette zu berühren. Anschließend die Suspension wie gerade gezeigt im Phasenkontrast mikroskopieren.Eine negative Quellungslungenreaktion wird beobachtet, wenn kaum oder keine Schwellung der Pneumokokkenzellen festgestellt wird, ähnlich wie bei der negativen Kontrolle, bei der eine Pneumokokkenzellsuspension ohne Zugabe von Antiseren verwendet wird. Eine positive Quellungslungenreaktion tritt auf, wenn typspezifische Antikörper an die Kapsel des Pneumokokkus binden und dadurch den Brechungsindex verändern.Unter Phasenkontrast erscheinen die Bakterien geschwollen und deutlicher sichtbar. Vergessen Sie nicht, dass Sie bei diesem Verfahren tatsächlich mit lebenden Mikroorganismen arbeiten. Aus diesem Grund müssen Sie vorsichtig sein und gute Laborpraktiken befolgen, Schutzkleidung tragen, die geeignete Laborausrüstung verwenden und am Ende des Prozesses sämtliche Geräte und Reagenzien sicher entsorgen.Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in etwa 10 Minuten durchgeführt werden. Nach der Betrachtung dieses Verfahrens sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man das Pneumokokken-Serotypisierung unter Verwendung der Quellung-Reaktion durchführt. Diese Technik ist wichtig für das Verständnis der Pneumokokken-Epidemiologie, sowohl bei nasopharyngealer Besiedlung als auch bei invasiven Erkrankungen.

capsular-serotyping-streptococcus-pneumoniae-using-quellung

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine effiziente Methode, um Oberflächen-Exposition von Leptospira-Proteine ​​zu beurteilen ist beschrieben. Die Methode ist speziell für die Störung des empfindlichen äußeren Membran von Leptospira-Zellen zu vermeiden. Diese Technik erfordert Beschäftigung von mehreren negativen Kontrollen, um die Integrität der äußeren Membran und eine Spezifität von Antikörper-Reaktion zu beurteilen.

Immuno-Fluoreszenz-Assay von Leptospira-Surface-exponierten Proteine

Wir beschreiben eine Multiplex-PCR zum schnellen Nachweis von Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium. Spezifische Salmonella-Serovare können, indem sie auf einer Multiplex-PCR, um Gene und Sequenzen einzigartig für die O-Antigen-Biosynthese-Cluster und Flagellin eines bestimmten Serovar identifiziert werden. Serovar wird dann auf eine Salmonellen zugeordnet isolieren über das Auftreten von bestimmten, Größe Amplikons (PCR-Produkt), entsprechend dem Ziel...

Ein Allelotyping PCR zur Identifizierung Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium

Die Kolonisation des murinen Nasopharynx mit Streptococcus pneumoniae und die anschließende Extraktion von anhaftenden oder rekrutierten Zellen wird beschrieben. Diese Technik beinhaltet das Spülen des Nasopharynx und die Sammlung der Flüssigkeit durch die Nares und ist anpassungsfähig für verschiedene Auslesungen, einschließlich Differentialzellquantifizierung und Analyse der mRNA-Expression in situ.

Charakterisierung von Entzündungsreaktionen während der intranasalen Kolonisation mit Streptococcus pneumoniae

Wir demonstrieren einen einfachen Multiplex-PCR-Assay für das schnelle Screening und die Typisierung von Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) Typ I-V auf Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus und stellen einige der wichtigen Schritte und Verfahrensnuancen bereit, die ihn für die Anpassung dieses Assays an einzelne Labore erfolgreich machen.

Multiplex PCR Assay f

Latex-Agglutinations-Test ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Serotypisierung Streptococcus pneumoniae, und auch weit verbreitet in diagnostischen Mikrobiologie aufgebracht. Dieses Manuskript beschreibt die in-house Produktion von Latexagglutination Reagenzien, Qualitätskontrollverfahren und die Anwendung dieser Technik auf den Pneumokokken-Serotyp.

Kapsel Serotypisierung<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Durch Latexagglutination

Streptococcus pneumoniae bildet diskrete, nicht eitrige mikroskopische Läsionen im Herzen. Dargestellt ist das Protokoll für ein Mausmodell der kardialen Mikroläsionsbildung. Es werden Anweisungen zur Visualisierung von Mikroläsionen mittels Mikroskopie, zur Unterscheidung zwischen frühen und späten Mikroläsionen und Methoden zum Nachweis des kardialen Umbaus im Herzen von Rekonvaleszenten gegeben.

Visualisierung<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Innerhalb Cardiac Mikroläsionen und anschließende Herz Remodeling

Dieser Opsonophagocytic Tötung Assay wird verwendet, um die Fähigkeit der phagocytic Immunzellen zur Beantwortung und töten Bakterien basierend auf verschiedene Behandlungen und/oder Bedingungen zu vergleichen. Klassisch, dient dieser Assay als der Goldstandard für die Beurteilung der Effektor-Funktionen von Antikörpern gegen ein Bakterium als Opsonin erhoben.

Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten

Die genetische Codeerweiterung wird für die Einführung einer unnatürlichen Aminosäure angewendet, die eine biorthogonale funktionelle Gruppe auf einem Trägerprotein an einem definierten Ort trägt. Die biorthogonale Funktion wird weiter für die standortselektive Kopplung eines Kohlenhydratantigens verwendet, um einen homogenen Glykonokjugate-Impfstoff bereitzustellen.

Homogenes Glycoconjugate hergestellt durch kombinierte unnatürliche Aminosäure-Inkorporation und Click-Chemie für Impfstoffzwecke

Hier beschreiben wir einen S. pneumoniae Serotyp 1 Stamm 519/43, der genetisch verändert werden kann, indem er seine Fähigkeit nutzt, DNA und ein Suizid-Plasmid auf natürliche Weise zu erwerben. Als Prinzipienbeweis wurde eine isogene Mutante im Pneumolysin-Gen (Ply) hergestellt.

Konstruktion von Mutanten im Serotyp 1 Streptococcus pneumoniae Stamm 519/43

Bei einer Infektion mit Mycoplasma pneumoniae können serologische Tests gute Ergebnisse liefern, jedoch aufgrund einer immunologischen Kreuzreaktion mit geringer Spezifität. Der hauseigene Antigen-Capture-ELISA, der in diesem Artikel beschrieben wird, garantiert eine hohe Speziesspezifität und hat sich als zuverlässiger Screening-Test für die genaue Diagnose von M. pneumoniae erwiesen.

Antigen-Capture Enzyme-linked Immunosorbent Assay zum spezifischen Nachweis von Mycoplasma pneumoniae

Lernen Sie die Kapselserotypisierung von Streptococcus pneumoniae mit der Quellung-Reaktion. Diese Goldstandard-Methode ermöglicht schnelle und zuverlässige Ergebnisse für die mikrobiologische Diagnostik.

Kapsel Serotypisierung von

Weitere Videos entdecken