Anti-Atom-Antikörper Screening mit HEp-2-Zellen

Das allgemeine Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe eines indirekten immunfluoreszenzchemischen Verfahrens auf antinukleäre Antikörper zu testen. Dazu wird das Serum des Patienten mit Hep-2-Substratpräparaten inkubiert. Das nicht gebundene Serum wird abgewaschen; die gebundenen Autoantikörper werden anschließend mit einem spezifischen, mit Fluorescein markierten Konjugat inkubiert, und das nicht gebundene Reagenz wird abgewaschen.

Wenn man sie durch ein Fluoreszenzmikroskop betrachtet, zeigen autoantikörperpositive Proben eine apfelgrüne Fluoreszenz, die den Bereichen der Zelle oder des Zellkerns entspricht, an denen der Autoantikörper gebunden hat, wobei das Fluoreszenzmuster auf das Vorhandensein des Antigens hinweist. Letztendlich kann das Vorhandensein von ARNA zur Unterstützung der Diagnose von Bindegewebserkrankungen herangezogen werden. Der Hauptvorteil der indirekten immunfluoreszenten Methode gegenüber anderen Methoden wie der festphasenbasierten ELISA-Methode liegt darin, dass das Hep-2-Zellsubstrat über 100 Antigene in ihrer nativen Konfiguration exprimiert.

Dies ermöglicht die Identifizierung fast aller klinisch relevanten O-Antikörper, was mit Festphasentechniken nicht möglich ist, da die indirekte immunfluoreszente Methode eine sehr spezialisierte Technik darstellt. Personen, die neu in dieser Methode sind, benötigen Zeit und Übung, um die Handhabung der Objektträger zu beherrschen. Auch die Interpretation der mikroskopischen Bilder und das Erlernen der Erkennung relevanter Muster sind Fähigkeiten, die Zeit erfordern, um sie zu meistern.

Mit den richtigen Reagenzien und Werkzeugen sind die Ergebnisse konsistenter und leichter zu interpretieren. Die Durchführung der Methode erfolgt durch Cassandra Bryant, eine Technologin aus dem Labor für Immunfluoreszenz-Assay-Entwicklung. Entfernen Sie die Reagenzien aus der Verpackung und lassen Sie jedes Material auf Raumtemperatur anwärmen, bereiten Sie die Reagenzien vor und verdünnen Sie das Patientenserum gemäß der beigefügten Anleitung. Die Objektträger sind mit Barcode versehen und können problemlos in automatisierte Systeme integriert werden.

Dieses Verfahren veranschaulicht die manuelle Objektträgerbearbeitung. Hochdurchsatz-Laboratorien können jedoch auf automatisierte Objektträgerbearbeitungsgeräte mit Barcode-Scanning-Funktion zurückgreifen. Inova-Geräte sind über ein zentrales intelligentes Netzwerk verbunden, das die Kontrolle über Workflow-Ergebnisse und Berichterstattung ermöglicht.

Für IFA. Dies führt zur positiven Identifizierung von Patienten durch die Verarbeitung und Eliminierung von Transkriptionsfehlern und verwandten Fehlern. Geben Sie einen Tropfen der positiven Kontrolle und einen Tropfen der negativen Kontrolle auf die entsprechende Probeplatte.

Pipettieren Sie 20 bis 25 Mikroliter verdünntes Patientenserum in die verbleibenden Vertiefungen. Bearbeiten Sie jeweils einen Objektträger. Stellen Sie den Objektträger in einen Färbebehälter mit einem angefeuchteten Papiertuch auf dem Boden, decken Sie den Behälter ab und inkubieren Sie den Objektträger 30 Minuten lang.

Die feuchten Bedingungen verhindern, dass das Substrat austrocknet, was zu artefaktbehafteter Färbung führen könnte. Während dieser Inkubationszeit binden die antinukleären Antikörper im Serum des Patienten an Antigene der Zellen, die in jeder Vertiefung fixiert sind. Nach der Inkubationszeit spülen Sie das Serum mit einem sanften Strom von Waschpuffer ab, um eine Beschädigung des Substrats zu vermeiden.

Neigen Sie die Objektträger leicht, sodass der Flüssigkeitsstrom nicht direkt auf das Substrat gerichtet ist. Diese Ausrichtung der Objektträger trägt außerdem dazu bei, eine Vermischung der Proben zwischen den Vertiefungen zu verhindern. Entfernen Sie überschüssiges Waschpuffer durch vorsichtiges Abklopfen und legen Sie den Objektträger in ein Copeland-Gefäß, das Waschpuffer enthält.

Die Inkubationszeit für den Waschschritt sollte ungefähr fünf Minuten betragen. Entfernen Sie die Objektträger aus dem Waschpuffer und klopfen Sie sie vorsichtig ab. Um den überschüssigen Waschpuffer zu entfernen, geben Sie einen Tropfen fluoreszierendes Konjugat in jedes Reaktionsfeld.

Für einen NA-Test wird die Verwendung eines IgG-Fc-spezifischen Konjugats empfohlen. Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang in einem befeuchteten Behälter und ersetzen Sie dabei unbedingt die Abdeckung. Das Konjugat ist lichtempfindlich, und die Abdeckung schützt die Objektträger vor Lichteinwirkung.

Während dieser Inkubationszeit bindet das Konjugat an die antinukleären Antikörper des Patienten, die sich bereits an die zellulären Antigene gebunden haben. Diese Konjugatbindung führt nach der Inkubation zur Anwesenheit von Fluoreszenz in den Vertiefungen. Spülen Sie den Objektträger mit Waschpuffer.

Wie zuvor wird ein Deckglas auf ein Papiertuch gelegt und ein Montagemedium in einer durchgehenden Linie auf die untere Kante des Deckglases aufgetragen. Jede Probe wird aus dem Waschpuffer entnommen und vorsichtig angeklopft. Um überschüssigen Waschpuffer zu entfernen, wird die untere Kante der Probe an die Kante des Deckglases angelegt.

Senken Sie die Objektträger vorsichtig auf die Deckglasabdeckung, sodass das Montagemedium auf dem Deckglas bis zum oberen Rand des Objektträgers fließt, ohne dass Luftblasen eingeschlossen werden. Das korrekte Auftragen der optimalen Menge an Montagemedium erfordert Übung, um eine optimale Ansicht zu erzielen. Untersuchen Sie die Objektträger mit einem fluoreszierenden Mikroskop in einem abgedunkelten Raum und scannen Sie das gesamte Objektträgerfeld mit einem 20x- oder 25x-Objektiv ab. Um die Zellverteilung und die Gleichmäßigkeit der Fluoreszenz zu beurteilen, wechseln Sie zu einem 40x-Objektiv.

Um die endgültige Interpretation bezüglich Positivität und Muster vorzunehmen, betrachten Sie die positiven und negativen Kontrollen. Die negative Kontrolle darf nicht vollständig dunkel erscheinen, zeigt jedoch oft eine schwache unspezifische Fluoreszenz. Die positive Kontrolle zeigt eine helle apfelgrüne Fluoreszenz im Zellkern.

Die Positivität kann anhand einer Reaktivitätsskala von einem Plus bis vier Plus eingestuft werden. Zusätzlich zur manuellen Auswertung können Objektträger in das automatisierte Fluoreszenzmikroskop eingelegt und gescannt werden. Ein Dunkelraum ist nicht erforderlich.

Nachdem ein Projekt durch Auswahl des geeigneten Objektträgertyps erstellt wurde, erfasst das Gerät hochauflösende digitale Bilder der Zellen in jedem Well und speichert diese. Zusätzlich misst der Nova View die Fluoreszenzlichtintensität, klassifiziert die Ergebnisse als positiv oder negativ und bietet eine Mustererkennung für positive Proben. Die Bilder werden vom Bediener auf einem hochauflösenden Computermonitor angezeigt, wodurch die endgültige Interpretation, Überarbeitung und Bestätigung der Nova-View-Ergebnisse ermöglicht wird.

Ergebnisberichte können für bestätigte Ergebnisse erstellt werden. Die Bindung von Autoantikörpern an die Bestandteile der nukleären Proteine führt zu fünf Hauptmustern im Zellkern, darunter homogen, gesprenkelt, Zentromer, nukleolär und nukleäre Punktstruktur. Um ein homogenes Muster wie hier dargestellt zu identifizieren, erkennen Sie mitotische oder sich teilende Zellen.

Mitotische Zellen weisen eine intensive, gleichmäßige Fluoreszenz auf, die oft stärker ausgeprägt ist als in ruhenden Zellen. Die Kerne ruhender Zellen sollten gleichmäßig mit diffuser Färbung erscheinen. Dieses charakteristische Muster ist höchstwahrscheinlich auf Autoantikörper gegen doppelsträngige DNA zurückzuführen.

Ein wesentliches Merkmal des gesprenkelten Musters ist das münzschlitzartige Erscheinungsbild der metaphasenständigen Mitosezellen. Der chromosomale Bereich dieser Zellen ist negativ. Die ruhenden Zellen zeigen ein Sprengelpattern im gesamten Zellkern.

Die Fleckung kann als grob oder fein definiert werden. Grobe Fleckung ist das Ergebnis von Autoantikörpern gegen SM und RNP. Feine Fleckung kann durch Autoantikörper gegen S-S-A-S-S-B sowie gegen RNA-Polymerase verursacht sein.

Das DFS-Muster wird als dichtes, feines Fleckenmuster bezeichnet und weist auf Autoantikörper gegen DFS 70 hin. In mitotischen Zellen zeigt sich eine fleckige Färbung, während ruhende Zellen gleichmäßig verteilte feine Flecken im gesamten Zellkern aufweisen. In diesen Fällen sollten Bestätigungstests durchgeführt werden, da Autoantikörper gegen DFS 70 bei gesunden Individuen im Vergleich zu Patienten mit Bindegewebserkrankungen häufig vorkommen.

Um das Zentromer-Muster zu identifizieren, scannen Sie die Vertiefungen und erkennen Sie mitotische oder teilende Zellen. Die teilenden Zellen weisen zahlreiche diskrete Flecken auf, die eng beieinanderliegen und oft als Metaphase-Balken bezeichnet werden. Die ruhenden Zellen zeigen etwa 40 bis 60 diskrete Flecken, die im gesamten Zellkern verteilt sind.

Das Zentromerenmuster steht in Zusammenhang mit Autoantikörpern gegen Zentromerenproteine mit dem nukleolaren Muster. Die Färbung des chromosomalen Bereichs in mitotischen Zellen ist variabel. Das nukleolare Muster ist mit einer homogenen oder fleckigen Färbung der Kerne sowie einer schwachen, fleckigen oder homogenen Färbung des Nukleoplasmas der ruhenden Zellkerne assoziiert.

Dieses Muster steht in Zusammenhang mit Autoantikörpern gegen RNA-Polymerase-III-Fibrillin und PM-Scl-Antikörpern. Das nukleäre Punkt-Muster ist mit negativen Metaphasen, mitotischen Zellen und wenigen diskreten Punkten in den Kernen ruhender Zellen assoziiert. Dieses charakteristische Muster ist oft auf Autoantikörper gegen SP-100, PML oder P-80-Coilin zurückzuführen.

Diese Antikörper sind mit der primären biliären Zirrhose und der autoimmunen Hepatitis assoziiert. In der dargestellten Abbildung zeigt das nukleäre Punkt-Muster eine zytoplasmatische Färbung aufgrund von Autoantikörpern gegen mitochondriale Antigene. Der Nachweis von Antinukleären Antikörpern und die Erkennung ihres Musters dienen als wichtiges Hilfsmittel zur Unterstützung der Patientendiagnose.

Das Verständnis der Bedeutung verschiedener Muster ermöglicht es Ärzten und Laborpersonal, geeignete Nachuntersuchungen durchzuführen. Die wichtigsten Faktoren zur korrekten Identifizierung von Antinukleären Antikörpermustern sind die Auswahl eines hochwertigen Zellsubstrats und die konsistente, sorgfältige Aufarbeitung der Objektträger. Die Beurteilung der Objektträger erfolgt traditionell mittels Fluoreszenzmikroskopie in dunklen Räumen und wird von geschulten Technologen durchgeführt, die mit den verschiedenen Mustern im Kontext des Zellzyklus und der Zellmorphologie vertraut sind.

In den letzten Jahren wurden digitale Bildgebungssysteme zur automatisierten Auswertung der Objektträger entwickelt, die den Arbeitsablauf automatisieren und die Konsistenz von Auswertung und Interpretation erhöhen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Objektträgern mit Barcode eine vollständige Rückverfolgbarkeit der Proben während des gesamten Prozesses, wodurch mögliche Übertragungsfehler vermieden sowie Datenintegrität und Patientensicherheit verbessert werden. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie jeder Schritt des indirekten immunfluoreszenten Verfahrens durchgeführt wird und wie klinisch relevante antinukleäre Antikörpermuster identifiziert werden können.