Name: Anti-Atom-Antikörper Screening mit HEp-2-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-23T18:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Lernen Sie die indirekte Immunfluoreszenz zur ANA-Detektion in Patientenserum mit HEp-2-Zellen. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Diagnose systemischer Autoimmunerkrankungen.

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Wir danken Cassandra Bryant für die Durchführung der IIF Experiment und Carol Buchner für ihre kompetente technische Bewertung.

1. Probenvorbereitung und Substratauswahl <ol><li> Reagenzien aus der Verpackung und lassen Sie jedes Element auf Raumtemperatur kommen. Bereiten Reagenzien und Patientenproben entsprechend der Richtung Einsatz. Hinweis: NOVA Lite Folien werden mit Strichcode und kann leicht in automatisierte Systeme in Verbindung mit dem Laborinformationssystem LIS integriert werden. Dieses Verfahren zeigt Handschiebe Verarbeitung; Hochdurchsatzlabors, können jedoch für die automatisierte Verarbeitung Ausrüstung Rutsche entscheiden. </li></ol> 2. Zugabe von Kontrollen und Proben <ol><li> 1 Tropfen positive Kontrolle und 1 Tropfen Negativkontrolle zu den entsprechenden Schiebe Brunnen. Pipette 20-25 ul verdünnten Patientenserum an die übrigen Brunnen. Prozess einer Folie zu einer Zeit. </li><li> Setzen Sie den Schieber (s) in einer Färbung Behälter mit einem feuchten Papiertuch auf dem Boden. Decken Sie die Behälter und inkubieren Sie die Folie (n) für 30 min. Hinweis: Die feuchten Bedingungen wirdverhindern, dass das Substrat vor Austrocknung. Die Trocknung der Brunnen könnte Artefaktfärbung führen. Während dieser Inkubationszeit werden die anti-nukleäre Antikörper im Serum des Patienten auf die Antigene von den Zellen, die gut auf jede fixiert binden. </li><li> Nach der Inkubationszeit, spülen Sie das Serum mit einem sanften Strom von Waschpuffer. Um zu vermeiden, das Substrat zu beschädigen und Cross-over von Proben zwischen Brunnen, Winkel der Schieber verhindern, leicht zu vermeiden, die Leitung der Strom direkt auf den Brunnen. Tippen Sie überschüssiges Waschpuffer und legen Sie die Folie in eine Glasküvette mit Waschpuffer für ca. 5 min. </li></ol> 3. Zugabe von Leuchtstoff-Konjugat <ol><li> Einer nach dem anderen, entfernen Sie die Folien aus der Waschpuffer und klopfen Sie leicht, um das überschüssige Waschpuffer zu entfernen. 1 Tropfen fluoreszierendes Konjugat (FITC-markierten Anti-Human-IgG) auf jede Vertiefung. Die Objektträger 30 min in der Feuchtekammer, und sicher sein, um die Färbung zu ersetzenBehälterdeckel. Anmerkung: Für ANA-Test ist die Verwendung eines IgG-Fc-spezifischen Konjugat empfohlen. Das Konjugat ist lichtempfindlich, und der Deckel wird die Folien vor Licht neben der Erhaltung der befeuchteten Umwelt zu schützen. Während dieser Inkubationszeit wird das Konjugat des Patienten anti-nukleäre Antikörper, die an die Antigene gebunden haben, zu binden. Dieses Konjugat-Bindungsergebnisse in Gegenwart von Fluoreszenz in den Vertiefungen. </li><li> Spülen und waschen Sie die Folie wie oben beschrieben. </li><li> Legen Sie ein Deckglas auf einem Papiertuch und gelten Montagemedium in einer durchgehenden Linie bis zum unteren Rand des Deckglases. </li><li> Entfernen Sie jede Folie aus der Waschpuffer und tippen Sie die Folie vorsichtig, um den überschüssigen Waschpuffer zu entfernen. Berühren Sie den unteren Rand der Folie an den Rand des Deckglases. </li><li> Senken Sie den Schlitten auf dem Deckglas in einer Weise, dass das Einschlussmittel auf dem Deckglas fließt zu dem oberen Rand der Folie ohne Luftblasenbildung. Hinweis: Coverslipping, einschließlich der Verwendung der optimalen Menge an Eindeckmedium, ist eine Technik, Praxis nimmt zu perfektionieren. </li></ol> 4. Identifikation von positiven und negativen Ergebnissen Manuelle Interpretation <ol><li> Blick gleitet mit einem Fluoreszenz-Mikroskop, in einem dunklen Raum. Führen Abtasten der gesamten gut mit einem 20X oder 25X Ziel, Zellverteilung und Einheitlichkeit der Fluoreszenz beurteilen </li><li> Wechseln Sie zu einem 40X-Objektiv, um die endgültige Auslegung hinsichtlich Positivität und Muster zu machen. </li><li> Schauen Sie sich die positiven und negativen Kontrollen. Grade Positivität mit einer Reaktivität Notenskala von 1 + bis 4 +. Hinweis: Die Negativkontrolle nicht vollständig dunkel erscheinen, wird aber oft geringe unspezifische Fluoreszenz anzuzeigen. Die positive Kontrolle wird hell apfelgrüne Fluoreszenz im Zellkern (Abbildung 1) anzuzeigen. </li></ol> Automatische Interpretation Hinweis: In additiauf manuelle Interpretation, Last-und Scan-Folien von NOVA anzeigen Automatisierte Fluoreszenz-Mikroskop oder andere automatisierte digitale Bild Instrument; keine Dunkelkammer erforderlich. Nach dem Erstellen eines Projekts durch Auswahl der entsprechenden Folientyp, erwirbt das Gerät und speichert hochauflösende digitale Bilder von Zellen in jede Vertiefung. Zusätzlich misst NOVA anzeigen Fluoreszenzlichtintensität, und kategorisiert Ergebnisse als positiv oder negativ, und stellt Mustererkennung für die positiven Proben. Die Bilder werden durch den Betreiber auf einem hochauflösenden Computer-Monitor betrachtet, so dass für endgültige Interpretation, Revision und Bestätigung der Ergebnis NOVA View. Berichte können auf bestätigten Ergebnisse erzeugt werden. Digitale Mikroskopie sind in Verbindung mit einem erfahrenen Labortechniker verwendet werden, wie es beabsichtigt ist, bei der Interpretation der Ergebnisse zu unterstützen.

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<li>Miyawaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+serological+heterogeneity+in+patients+with+anticentromere+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Clinical and serological heterogeneity in patients with anticentromere antibodies.</a> J Rheumatology. 32 (8), 1488-1494 (2005).</li>
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<li>Granito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+antibodies+as+ancillary+markers+in+primary+biliary+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren Gabriella Lakos, Cassandra Bryant, Carol Buchner, Anna und Eslami sind Mitarbeiter von INOVA Diagnostics.

Das Screening mit HEp-2-Zellen ist ein wichtiger erster Schritt bei der Diagnose von Patienten mit SARD. Den IIF-Methoden fehlt es jedoch an Harmonisierung. Zu den Quellen der Variabilität gehören die Vorbereitung der Objektträger, die Konjugatspezifität und die Effizienz des Fluoreszenzmikroskops sowie die Erfahrung des Lesegeräts. Trotz dieser Bedenken bleibt IIF der "Goldstandard" für ANA-Tests. HEp-2-Zellen enthalten eine Vielzahl von Autoantigenen und stellen das ideale Substrat für den Nachweis dieser Autoantikörper dar. In einigen Laboratorien wurde IIF durch Festphasen-Screening-Methoden wie Multiplex-Assay oder ELISA ersetzt. Der Nachteil solcher Tests besteht darin, dass sie nicht das gesamte Spektrum der Antigene anzeigen, um ausreichend empfindlich zu sein. Infolgedessen können wirklich positive Patienten übersehen werden, was schädliche Folgen haben kann. Zusätzlich zu den Problemen der Behandlungsverzögerung und der falschen Diagnose können zusätzliche Gesundheitskosten durch die Wiederholung von Bestätigungstests oder unnötige diagnostische Untersuchungen entstehen. Angesichts der inhärenten Herausforderungen für IIF ist es von größter Bedeutung, diese Technik richtig durchzuführen, um Subjektivität in den Ergebnissen zu vermeiden.
Um eine genaue Interpretation und Berichterstattung der Ergebnisse für das ANA-Screening zu gewährleisten, ist es wichtig, das hochwertigste Substrat zu verwenden. Bei der Auswahl eines HEp-2-Substrats ist es entscheidend, dass die Zellen so optimiert werden, dass sie klinisch relevante Epitope in ihrem nativen Proteinzustand exprimieren. Transfizierte oder anderweitig modifizierte HEp-2-Zelllinien ermöglichen möglicherweise keine ordnungsgemäße Antikörper-Antigen-Bindung. Wenn mehrere verschiedene Autoantikörper gleichzeitig vorhanden sind, können rekombinante Zellen ein oder mehrere Muster maskieren. Es sollte auch eine hohe Anzahl von mitotischen Zellen im Substrat vorhanden sein. Eine ausreichende Anzahl mitotischer Zellen ermöglicht eine schnelle und genaue Identifizierung von Mustern. 
Zusätzlich zu den Attributen des Substrats besteht das Ziel dieses Videoprotokolls darin, die IIF-Technik zu beschreiben, indem kritische Schritte wie die Zugabe der Probe, das Waschen des Objektträgers, die Zugabe von Konjugat, das Ausschieben des Umschlags und die Bestimmung positiver und negativer Ergebnisse gezeigt werden. Die Ergebnisse können beeinträchtigt werden, wenn nicht für jeden dieser Schritte die richtige Technik verwendet wird. Richtiges Waschen ist wichtig, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen. Einige Patienten weisen sehr hohe Mengen an Autoantikörpern auf, und in diesen Fällen ist es wichtig, das Serum aus den Vertiefungen zu waschen, damit es andere Vertiefungen nicht kontaminiert. 
Obwohl IIF traditionell eine sehr arbeitsintensive und subjektive Labormethode ist, können neue Technologien wie Objektträgerprozessoren, Barcode-Objektträger und automatisierte digitale Mikroskopie den Arbeitsablauf erheblich vereinfachen, die Konsistenz erhöhen und die Ursachen für Variabilität der Interpretation reduzieren.

Der Begriff antinukleäre Antikörper (ANA) beschreibt eine Vielzahl von Autoantikörpern, die mit Bestandteilen der Zellkerne, einschließlich DNA, Proteinen und Ribonukleoproteine ​​1, 2 reagieren. Die HEp-2-Zelle, ein natives Protein-Array mit Hunderten von Antigenen, stellt ein ideales Substrat für die Detektion von ANA 1. Der Nachweis von ANA im menschlichen Serum ist ein wichtiger Screening-Tool für Erkrankungen des Bindegewebes, und IIF ist die Referenzmethode für ANA Testen ein. Kürzlich IIF auf HEp-2-Zellen wurde in einigen Laboratorien mit Antigen-spezifischen Immunassays und Multiplex-Verfahren ersetzt. Aus Sorge um falsch-negative Ergebnisse und der fehlenden Transparenz für Kliniker, das American College of Rheumatology bildeten eine Task Force, die dem Schluss, dass IIF mit HEp-2-Zellen sollte der &quot;Goldstandard&quot; für die ANA-Screening 1 sein. Durch die subjektive Natur der ANA-Screening, ist die Qualität der HEp-2-Zellen inintegraler, genaue und vertrauliche Meldung der Ergebnisse. Die Anwesenheit einer hohen Anzahl von mitotischen Zellen, optimale Zellmorphologie ausreichend Konfluenz und Expression der entsprechenden Antigene sind besonders wichtig. IIF Mustererkennung dient als ein wichtiges Instrument, um in der Patientendiagnose zu unterstützen. Das Verständnis der Bedeutung der verschiedenen Muster ermöglicht es, die Ärzte und Laborpersonal, um die entsprechende Follow-up-Tests durchführen, um die Diagnose zu bestätigen. Zum Beispiel können homogene ANA Muster in der Gegenwart von Anti-dsDNA-Antikörpern auftreten oder Chromatin und kann mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) 3 zugeordnet werden. Von der anderen Seite wurde kürzlich beschrieben, dass das so genannte dichte feine Fleckenmuster (DFS), die üblicherweise bis zu 12% der anfallenden Proben zu sehen ist, hat sich vor allem mit Anti-DFS70 Antikörpern assoziiert. Diese Autoantikörper, wenn sie isoliert (ohne andere krankheitsspezifische ANA) vorhanden sind, nicht mit systemischen Autoimmunrheumatischen Erkrankungen &lt;sup&gt; 9.4. Dabei Bestätigungstests für Anti-DFS70 Antikörper kann dazu beitragen, unnötige Reflextests, bieten erhebliche Kosteneinsparungen und erleichtern Patienten Angst. Da IIF ist die erste Zeile Screening Methode für Autoantikörper erkennen, ist es wichtig, dass der Anwender weiß, wie die Auswahl der Reagenzien und Gewebesubstrate können die Ergebnisse beeinflussen. Da die IIF-Technik ist von Natur aus subjektiv, ist es wichtig, dass die verwendeten Reagenzien bieten die höchste Qualität der Ergebnisse. Das Ziel dieses Video-Protokoll ist, den Benutzer mit den richtigen Schritte, um das IIF-Methode, die gemeinsamen Muster mit ANA, verknüpften Aufgaben vertraut zu machen und neue Entwicklungen, die die Arbeitsabläufe im Labor zu rationalisieren und zu standardisieren, Ergebnisse vorzustellen.

<table><tbody><tr><td>NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI-Konjugat)</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>708102</td><td></td></tr><tr><td>NOVA View Instrument</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>NV2000</td><td></td></tr><tr><td>QUANTA Link Workstation</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>LINK010</td><td></td></tr><tr><td>QUANTA Link Workstation Lizenz</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>LINK001</td><td></td></tr><tr><td>Barcodescanner</td><td>INOVA Diagnostics</td><td>LINK019</td><td></td></tr></tbody></table>

anti-atom-antikörper screening mit hep-2-zellen

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

Das American College of Rheumatology Positionspapier auf ANA-Test sieht vor, die Verwendung von IIF als Goldstandard-Methode für ANA-Screening ein. Obwohl IIF ist ein ausgezeichneter Screening-Test in erfahrenen Händen, die technischen Schwierigkeiten bei der Verarbeitung und Lese IIF gleitet - wie die arbeitsintensive Dia Verarbeitung, manuelle Lesen, die Notwendigkeit für erfahrene, geschulte Techniker und die Verwendung von dunklen Raum - machen das IIF-Methode schwierig, in den Workflow des modernen, automatisierten Labors passen. Der erste und entscheidende Schritt in Richtung hohe Qualität ANA-Screening ist eine sorgfältige Dia-Verarbeitung. Dieses Verfahren ist arbeitsintensiv und erfordert volle Verständnis des Prozesses, sowie die Liebe zum Detail und Erfahrung. Schieber Lesen wird durch Fluoreszenzmikroskopie in dunklen Räumen durchgeführt wird, und wird durch geschulte Techniker, die mit den verschiedenen Mustern vertraut sind, im Rahmen der Zellzyklus getanund die Morphologie der Interphase und teilende Zellen. Vorausgesetzt, dass IIF ist die erste Zeile Screening-Tool für SARD, das Verständnis der Schritte, um diese Technik korrekt durchzuführen, ist kritisch. Vor kurzem haben Digital-Imaging-Systemen für die automatisierte Lesen von IIF Folien entwickelt. Diese Systeme, wie dem NOVA anzeigen Automatische Fluoreszenzmikroskop, sind entworfen, um die Routine IIF Arbeitsabläufe zu optimieren. NOVA anzeigen erwirbt und speichert hochauflösende digitale Bilder von den Brunnen, damit die Bildaufnahme der Trennung von Interpretation; Bilder werden auf eine hochauflösende Computer-Monitore ausgelegt angesehen. Es speichert Bilder für die Zukunft und unterstützt Interpretation des Betreibers durch Fluoreszenzlichtintensität Daten auf die Bilder. Es ist auch vorläufig kategorisiert Ergebnisse als positiv oder negativ, und stellt Mustererkennung für die positiven Proben. Zusammenfassend, beseitigt die Notwendigkeit für die Dunkelkammer, automatisiert und rationalisiert die IIF-Bereitschaftng / Interpretation Workflow. Am wichtigsten ist, erhöht es die Konsistenz zwischen Leser und Lesungen. Darüber hinaus mit dem Einsatz von Barcode-Dias, Übertragungsfehler werden durch die Bereitstellung Probe Rückverfolgbarkeit und positive Patientenidentifikation eliminiert. Dies führt zu erhöhten Patientendatenintegrität und Sicherheit. Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, die IIF Verfahren demonstrieren, einschließlich Rutsche Verarbeitung, Identifizierung gemeinsamer IIF Muster und die Einführung von neuen Entwicklungen zu vereinfachen und zu vereinheitlichen diese Technik.

Bei der Bewertung der Zellfärbung Ergebnisse für HEp-2, sind fünf großen Kernmuster am häufigsten berichteten: homogen, gesprenkelt, Zentromer, nukleolären und Kernpunkten. Diese Muster sind das Ergebnis der Autoantikörper-Bindung an spezifische Bestandteile des Kerns. Obwohl ANA-Test ist spezifisch für Kernstrukturen können cytoplasmatischen Muster mit Autoantikörpern gegen cytoplasmatische Strukturen verbunden zu beachten. In einigen Fällen können mehrere Autoantikörpern in einer Probe vorhanden sein, und das Bild kann als ein gemischtes Muster. Es gibt auch andere, weniger häufig beobachtet, und oft Zellzyklus spezifische Muster, die von der IIF Verfahren nachgewiesen werden kann; zuletzt wurde eine so genannte dichte feine Fleckenmuster mit besonderen klinischen Bedeutung in einigen ANA-positiven Seren beschrieben. Homogene Muster Um eine homogene Muster zu identifizieren, scannen Sie die gut und identifizieren mitotischen oder TrennZellen. Der kondensierte Chromatin der mitotischen Zellen (Abbildung 2, orange Pfeil) weist festen, einheitlichen Fluoreszenz, die oft stärker ausgeprägt als in der Ruhezelle nuclei.In homogenen Muster, die ruhenden Zellen zeigen einheitlich, diffuse Fluoreszenz des gesamten Zellkern (Abbildung 2, weißer Pfeil). Dieses charakteristische Muster ist häufig die Folge von anti-dsDNA-Antikörper 10. Fleckenmuster In der Grobfleckenmuster, die mitotischen Zellen zeigen keine Färbung des verkürzten Chromosomenregionen (Abbildung 3, orange Pfeil). Die ruhenden Zellen zeigen körnige Fluoreszenz über den gesamten Kern. Die Atomrauschen kann als grob oder fein definiert werden. Die Grob Sprenkeln Muster ist oft das Ergebnis von Anti-Sm-und Anti-RNP-11. Bei der Feinfleckenmuster, die ruhenden Zellen zeigen feine oder diffuse Rauschen in den Kernen, in der Regel in Uniform distribution (Abbildung 4, weißer Pfeil). Die feine Fleckenmuster ist oft das Ergebnis von Anti-Anti-SSAand SSB 12. Dichtes fein gefleckte Muster Es wird nun erkannt, dass die dichte fein gefleckte Muster (DFS) ist häufig bei Routineuntersuchungen, und so viel wie 12% der Proben positiv für anti-DFS70 Autoantikörper. Allerdings sind diese Autoantikörper, wenn sie in Isolation gefunden werden, werden nicht mit systemischen Autoimmunrheumatischen Erkrankungen 4 -6 verbunden. Diese Antikörper sind bei gesunden Personen und Patienten, die nicht mit Lagerkrankheiten SARD 6 weit verbreitet. Bestätigungstests für Anti-DFS70 Antikörper kann dazu beitragen, unnötige Reflex-Tests, ermöglichen erhebliche Kosteneinsparungen und erleichtern Patienten Angst. Da die DFS-Muster ist schwer zu identifizieren und ANA-Positivität kann Angst um Patienten und Ärzte zu verursachen, ist es sehr empfehlenswert, um ein Bestätigungstest durchführen, nachdem identifiziert<html> fying ein Muster hindeuten DFS70 Anti-Antikörper, um die klinische Bedeutung von ANA klären positivty 5,6. In diesem Muster mitotischen Zellen (Abbildung 5, orange Pfeil) zeigen positive fleckige Verfärbung des Metaphase Chromatin, während Ruhe Zellkerne (Abbildung 5, weißer Pfeil) weisen gleichmäßig verteilt feine Flecken in der gesamten Kern. Zentromer-Muster Um das Zentromer-Muster zu identifizieren, scannen die Brunnen und identifizieren mitotischen oder teilenden Zellen. In mitotischen Zellen (Abbildung 6, orange Pfeil), diese diskrete Flecken eng geworden in dem, was oft als &quot;Metaphase bar&quot; beschrieben verbunden. In der Zentromer-Muster, ruhenden Zellen (Abbildung 6, weißer Pfeil) zeigen etwa 40-60 diskrete Flecken in den Kernen verteilt. Zentromer-Muster ist das Ergebnis der anti-CENP A, B, C 13-Antikörper. Schritt &quot;&gt; Nucleolar Muster Einige nukleolären Muster werden mit einer diffusen zytoplasmatischen Färbung in mitotischen Zellen (Abbildung 7, orange Pfeil) und negativen chromosomalen Region zugeordnet sind, während andere nucleolear Muster zeigen positive Färbung der chromosomalen Region. Die nukleolären Muster mit homogener oder gesprenkelt Färbung der Kernkörperchen (Abbildung 7, weißer Pfeil) verbunden sind, zusammen mit schwachen gesprenkelt oder homogene Färbung der Kernplasma. Diese Muster werden mit anti-RNA-Polymerase-III verbunden sind, anti-Fibrillarin, anti-Th/To und anti-PM/Scl Antikörper 14,15. Nuclear-Punkt-Muster Die Kernpunktmuster mit negativen mitotischen Metaphase-Zellen (Abbildung 8, orange Pfeil) und mit wenigen diskrete Flecken in den Ruhezellkerne (Abbildung 8, weißer Pfeil) verbunden. Diese charakteristische Muster ist häufig die Folge von sp-100, PML oder p80-Autoantikörper colin. Diese Antikörper sind als<html> mit primär biliäre Zirrhose und Autoimmunhepatitis 16 sociated. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig1highres.jpg" width="500" /> . Abbildung 1 Negativkontrolle (links): Die Zellen zeigen geringe unspezifische Fluoreszenz, aber keine spezifische Kernfärbung Positive Kontrolle (rechts):. Cells anzuzeigen Apfelgrün Kernfluoreszenz. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Homogene Muster. Mitotische Zellen (orangearrow) zeigen feste Fluoreszenz. Ruhende Zellen zeigen auch, diffuse Färbung (whitearrow). &quot;Breite =&quot; 500 &quot;/&gt; Abbildung 3. Grobfleckige Muster. Mitotische Zellen (orange Pfeil) zeigen eine negative Färbung. Ruhende Zellen zeigen eine deutliche Flecken gesprenkelt (weißer Pfeil). <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. Feine Fleckenmuster. Mitotische Zellen (orange Pfeil) zeigen eine negative Färbung. Ruhende Zellen zeigen eine deutliche fein gefleckte Färbung (weißer Pfeil). <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. Dense fein gefleckte Muster. Mitotische Zellen (orange Pfeil) zeigen eine feinkörnige Fest Färbung. Ruhende Zellen zeigen eine sehr feine, diffuse Flecken gesprenkelt (whitearrow). Abbildung 6. Zentromer-Muster. Mitotische Zellen (orangearrow) zeigen einheitlich, diskrete Flecken. Ruhende Zellen (whitearrow) zeigt 40-60 diskrete Flecken pro Zellkern. <img alt="Fig. 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig7highres.jpg" width="500" /> Abbildung 7. Nucleolar Muster. Mitotische Zellen (orangearrow) erscheinen als große Cluster von körnigen Färbung. Ruhen Zelle nucleishows Fluoreszenz in den Kernkörperchen (whitearrow). <img alt="Fig. 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51211/51211fig8highres.jpg" width="500" /> Abbildung 8. Nuclear Punktmuster. Mitotische Zellen (orangearrow) negativ erscheinen. Ruhende Zellen zeigen ein paar discrete Flecken im Nukleus (whitearrow). Zusätzlich wird die Nucelar Punktmuster mit Zytoplasma-Färbung mit Autoantikörpern gegen mitochondriale Antigene (roter Pfeil) verbunden nebeneinander existieren.

Indirekte Immunfluoreszenz (IIF)-Assays wurden traditionell für den Nachweis von antinukleären Antikörpern (ANA) in Humanserum verwendet. Das Vorhandensein dieser Antikörper können bei der Diagnose von rheumatischen systemischen Autoimmunerkrankungen (SARD) unterstützen. Dieses Protokoll zeigt, wie die IIF-Technik effektiv durchzuführen, um diese Autoantikörper genau zu erfassen.

Anti-Atom-Antikörper Screening mit HEp-2-Zellen

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

Das allgemeine Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe eines indirekten immunfluoreszenzchemischen Verfahrens auf antinukleäre Antikörper zu testen. Dazu wird das Serum des Patienten mit Hep-2-Substratpräparaten inkubiert. Das nicht gebundene Serum wird abgewaschen; die gebundenen Autoantikörper werden anschließend mit einem spezifischen, mit Fluorescein markierten Konjugat inkubiert, und das nicht gebundene Reagenz wird abgewaschen.Wenn man sie durch ein Fluoreszenzmikroskop betrachtet, zeigen autoantikörperpositive Proben eine apfelgrüne Fluoreszenz, die den Bereichen der Zelle oder des Zellkerns entspricht, an denen der Autoantikörper gebunden hat, wobei das Fluoreszenzmuster auf das Vorhandensein des Antigens hinweist. Letztendlich kann das Vorhandensein von ARNA zur Unterstützung der Diagnose von Bindegewebserkrankungen herangezogen werden. Der Hauptvorteil der indirekten immunfluoreszenten Methode gegenüber anderen Methoden wie der festphasenbasierten ELISA-Methode liegt darin, dass das Hep-2-Zellsubstrat über 100 Antigene in ihrer nativen Konfiguration exprimiert.Dies ermöglicht die Identifizierung fast aller klinisch relevanten O-Antikörper, was mit Festphasentechniken nicht möglich ist, da die indirekte immunfluoreszente Methode eine sehr spezialisierte Technik darstellt. Personen, die neu in dieser Methode sind, benötigen Zeit und Übung, um die Handhabung der Objektträger zu beherrschen. Auch die Interpretation der mikroskopischen Bilder und das Erlernen der Erkennung relevanter Muster sind Fähigkeiten, die Zeit erfordern, um sie zu meistern.Mit den richtigen Reagenzien und Werkzeugen sind die Ergebnisse konsistenter und leichter zu interpretieren. Die Durchführung der Methode erfolgt durch Cassandra Bryant, eine Technologin aus dem Labor für Immunfluoreszenz-Assay-Entwicklung. Entfernen Sie die Reagenzien aus der Verpackung und lassen Sie jedes Material auf Raumtemperatur anwärmen, bereiten Sie die Reagenzien vor und verdünnen Sie das Patientenserum gemäß der beigefügten Anleitung. Die Objektträger sind mit Barcode versehen und können problemlos in automatisierte Systeme integriert werden.Dieses Verfahren veranschaulicht die manuelle Objektträgerbearbeitung. Hochdurchsatz-Laboratorien können jedoch auf automatisierte Objektträgerbearbeitungsgeräte mit Barcode-Scanning-Funktion zurückgreifen. Inova-Geräte sind über ein zentrales intelligentes Netzwerk verbunden, das die Kontrolle über Workflow-Ergebnisse und Berichterstattung ermöglicht.Für IFA. Dies führt zur positiven Identifizierung von Patienten durch die Verarbeitung und Eliminierung von Transkriptionsfehlern und verwandten Fehlern. Geben Sie einen Tropfen der positiven Kontrolle und einen Tropfen der negativen Kontrolle auf die entsprechende Probeplatte.Pipettieren Sie 20 bis 25 Mikroliter verdünntes Patientenserum in die verbleibenden Vertiefungen. Bearbeiten Sie jeweils einen Objektträger. Stellen Sie den Objektträger in einen Färbebehälter mit einem angefeuchteten Papiertuch auf dem Boden, decken Sie den Behälter ab und inkubieren Sie den Objektträger 30 Minuten lang.Die feuchten Bedingungen verhindern, dass das Substrat austrocknet, was zu artefaktbehafteter Färbung führen könnte. Während dieser Inkubationszeit binden die antinukleären Antikörper im Serum des Patienten an Antigene der Zellen, die in jeder Vertiefung fixiert sind. Nach der Inkubationszeit spülen Sie das Serum mit einem sanften Strom von Waschpuffer ab, um eine Beschädigung des Substrats zu vermeiden.Neigen Sie die Objektträger leicht, sodass der Flüssigkeitsstrom nicht direkt auf das Substrat gerichtet ist. Diese Ausrichtung der Objektträger trägt außerdem dazu bei, eine Vermischung der Proben zwischen den Vertiefungen zu verhindern. Entfernen Sie überschüssiges Waschpuffer durch vorsichtiges Abklopfen und legen Sie den Objektträger in ein Copeland-Gefäß, das Waschpuffer enthält. Die Inkubationszeit für den Waschschritt sollte ungefähr fünf Minuten betragen. Entfernen Sie die Objektträger aus dem Waschpuffer und klopfen Sie sie vorsichtig ab. Um den überschüssigen Waschpuffer zu entfernen, geben Sie einen Tropfen fluoreszierendes Konjugat in jedes Reaktionsfeld.Für einen NA-Test wird die Verwendung eines IgG-Fc-spezifischen Konjugats empfohlen. Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang in einem befeuchteten Behälter und ersetzen Sie dabei unbedingt die Abdeckung. Das Konjugat ist lichtempfindlich, und die Abdeckung schützt die Objektträger vor Lichteinwirkung.Während dieser Inkubationszeit bindet das Konjugat an die antinukleären Antikörper des Patienten, die sich bereits an die zellulären Antigene gebunden haben. Diese Konjugatbindung führt nach der Inkubation zur Anwesenheit von Fluoreszenz in den Vertiefungen. Spülen Sie den Objektträger mit Waschpuffer.Wie zuvor wird ein Deckglas auf ein Papiertuch gelegt und ein Montagemedium in einer durchgehenden Linie auf die untere Kante des Deckglases aufgetragen. Jede Probe wird aus dem Waschpuffer entnommen und vorsichtig angeklopft. Um überschüssigen Waschpuffer zu entfernen, wird die untere Kante der Probe an die Kante des Deckglases angelegt.Senken Sie die Objektträger vorsichtig auf die Deckglasabdeckung, sodass das Montagemedium auf dem Deckglas bis zum oberen Rand des Objektträgers fließt, ohne dass Luftblasen eingeschlossen werden. Das korrekte Auftragen der optimalen Menge an Montagemedium erfordert Übung, um eine optimale Ansicht zu erzielen. Untersuchen Sie die Objektträger mit einem fluoreszierenden Mikroskop in einem abgedunkelten Raum und scannen Sie das gesamte Objektträgerfeld mit einem 20x- oder 25x-Objektiv ab. Um die Zellverteilung und die Gleichmäßigkeit der Fluoreszenz zu beurteilen, wechseln Sie zu einem 40x-Objektiv.Um die endgültige Interpretation bezüglich Positivität und Muster vorzunehmen, betrachten Sie die positiven und negativen Kontrollen. Die negative Kontrolle darf nicht vollständig dunkel erscheinen, zeigt jedoch oft eine schwache unspezifische Fluoreszenz. Die positive Kontrolle zeigt eine helle apfelgrüne Fluoreszenz im Zellkern.Die Positivität kann anhand einer Reaktivitätsskala von einem Plus bis vier Plus eingestuft werden. Zusätzlich zur manuellen Auswertung können Objektträger in das automatisierte Fluoreszenzmikroskop eingelegt und gescannt werden. Ein Dunkelraum ist nicht erforderlich.Nachdem ein Projekt durch Auswahl des geeigneten Objektträgertyps erstellt wurde, erfasst das Gerät hochauflösende digitale Bilder der Zellen in jedem Well und speichert diese. Zusätzlich misst der Nova View die Fluoreszenzlichtintensität, klassifiziert die Ergebnisse als positiv oder negativ und bietet eine Mustererkennung für positive Proben. Die Bilder werden vom Bediener auf einem hochauflösenden Computermonitor angezeigt, wodurch die endgültige Interpretation, Überarbeitung und Bestätigung der Nova-View-Ergebnisse ermöglicht wird.Ergebnisberichte können für bestätigte Ergebnisse erstellt werden. Die Bindung von Autoantikörpern an die Bestandteile der nukleären Proteine führt zu fünf Hauptmustern im Zellkern, darunter homogen, gesprenkelt, Zentromer, nukleolär und nukleäre Punktstruktur. Um ein homogenes Muster wie hier dargestellt zu identifizieren, erkennen Sie mitotische oder sich teilende Zellen.Mitotische Zellen weisen eine intensive, gleichmäßige Fluoreszenz auf, die oft stärker ausgeprägt ist als in ruhenden Zellen. Die Kerne ruhender Zellen sollten gleichmäßig mit diffuser Färbung erscheinen. Dieses charakteristische Muster ist höchstwahrscheinlich auf Autoantikörper gegen doppelsträngige DNA zurückzuführen.Ein wesentliches Merkmal des gesprenkelten Musters ist das münzschlitzartige Erscheinungsbild der metaphasenständigen Mitosezellen. Der chromosomale Bereich dieser Zellen ist negativ. Die ruhenden Zellen zeigen ein Sprengelpattern im gesamten Zellkern. Die Fleckung kann als grob oder fein definiert werden. Grobe Fleckung ist das Ergebnis von Autoantikörpern gegen SM und RNP. Feine Fleckung kann durch Autoantikörper gegen S-S-A-S-S-B sowie gegen RNA-Polymerase verursacht sein.Das DFS-Muster wird als dichtes, feines Fleckenmuster bezeichnet und weist auf Autoantikörper gegen DFS 70 hin. In mitotischen Zellen zeigt sich eine fleckige Färbung, während ruhende Zellen gleichmäßig verteilte feine Flecken im gesamten Zellkern aufweisen. In diesen Fällen sollten Bestätigungstests durchgeführt werden, da Autoantikörper gegen DFS 70 bei gesunden Individuen im Vergleich zu Patienten mit Bindegewebserkrankungen häufig vorkommen.Um das Zentromer-Muster zu identifizieren, scannen Sie die Vertiefungen und erkennen Sie mitotische oder teilende Zellen. Die teilenden Zellen weisen zahlreiche diskrete Flecken auf, die eng beieinanderliegen und oft als Metaphase-Balken bezeichnet werden. Die ruhenden Zellen zeigen etwa 40 bis 60 diskrete Flecken, die im gesamten Zellkern verteilt sind.Das Zentromerenmuster steht in Zusammenhang mit Autoantikörpern gegen Zentromerenproteine mit dem nukleolaren Muster. Die Färbung des chromosomalen Bereichs in mitotischen Zellen ist variabel. Das nukleolare Muster ist mit einer homogenen oder fleckigen Färbung der Kerne sowie einer schwachen, fleckigen oder homogenen Färbung des Nukleoplasmas der ruhenden Zellkerne assoziiert.Dieses Muster steht in Zusammenhang mit Autoantikörpern gegen RNA-Polymerase-III-Fibrillin und PM-Scl-Antikörpern. Das nukleäre Punkt-Muster ist mit negativen Metaphasen, mitotischen Zellen und wenigen diskreten Punkten in den Kernen ruhender Zellen assoziiert. Dieses charakteristische Muster ist oft auf Autoantikörper gegen SP-100, PML oder P-80-Coilin zurückzuführen.Diese Antikörper sind mit der primären biliären Zirrhose und der autoimmunen Hepatitis assoziiert. In der dargestellten Abbildung zeigt das nukleäre Punkt-Muster eine zytoplasmatische Färbung aufgrund von Autoantikörpern gegen mitochondriale Antigene. Der Nachweis von Antinukleären Antikörpern und die Erkennung ihres Musters dienen als wichtiges Hilfsmittel zur Unterstützung der Patientendiagnose.Das Verständnis der Bedeutung verschiedener Muster ermöglicht es Ärzten und Laborpersonal, geeignete Nachuntersuchungen durchzuführen. Die wichtigsten Faktoren zur korrekten Identifizierung von Antinukleären Antikörpermustern sind die Auswahl eines hochwertigen Zellsubstrats und die konsistente, sorgfältige Aufarbeitung der Objektträger. Die Beurteilung der Objektträger erfolgt traditionell mittels Fluoreszenzmikroskopie in dunklen Räumen und wird von geschulten Technologen durchgeführt, die mit den verschiedenen Mustern im Kontext des Zellzyklus und der Zellmorphologie vertraut sind.In den letzten Jahren wurden digitale Bildgebungssysteme zur automatisierten Auswertung der Objektträger entwickelt, die den Arbeitsablauf automatisieren und die Konsistenz von Auswertung und Interpretation erhöhen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Objektträgern mit Barcode eine vollständige Rückverfolgbarkeit der Proben während des gesamten Prozesses, wodurch mögliche Übertragungsfehler vermieden sowie Datenintegrität und Patientensicherheit verbessert werden. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie jeder Schritt des indirekten immunfluoreszenten Verfahrens durchgeführt wird und wie klinisch relevante antinukleäre Antikörpermuster identifiziert werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

DFS70 Autoantikörper imitieren üblichen krankheitsassoziierten Antinukleäre Antikörper-Muster machen genaue Interpretation herausfordernde Verwendung konventioneller HEp-2-Substrate. Das Protokoll beschreibt die Vorteile der neuartigen technischen HEp-2-Substrat über konventionelle HEp-2 in ANA screening und DFS70 Muster mit hohem Vertrauen in Konkurrenzsituation und gemischte ANA positive Fälle zu unterscheiden.

Gleichzeitige Unterscheidung der Konkurrenzsituation und gemischte DFS70 Muster bei ANA-Screening mit einem neuartigen HEp-2 ELITE/DFS70 Ko-Substrat

Hier präsentieren wir eine zellbasierte Flow-zytometrie-Methode zur Erkennung neutralisierende Antikörper oder andere Faktoren, die die zelluläre Aufnahme von Enzym-Ersatz-Therapien in einer menschlichen Matrix wie zerebralen spinalen Flüssigkeit (CSF) oder Humanserum stören.

Nachweis von Antikörpern, die die zelluläre Aufnahme von Enzym-Ersatz-Therapien mit einem zellbasierte Assays neutralisieren

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine schrittweise Anleitung zur 3-d "Leber-on-a-Chip" Infektion mit dem Hepatitis B-Virus Experimente zur Verfügung stellen.

"Leber-on-a-Chip" Kulturen der primäre Hepatozyten und Kupffer Zellen für Hepatitis B-Virus-Infektion

Die BSelex-Methode zur Identifizierung und Wiederherstellung einzelner antigenspezifischer Antikörper aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen kombiniert Durchflusszytometrie mit einzelliger PCR und Klonen.

Einzellige Screening-Methode zur Auswahl und Wiederherstellung von Antikörpern mit gewünschten Besonderheiten aus angereicherten menschlichen Gedächtnis B-Zellpopulationen

Wir präsentieren eine robuste, kostengünstige und flexible Methode zur Messung von Veränderungen der Hepatozytenzahl und der Kernploidie in festen/kryokonservierten Gewebeproben, die keine Durchflusszytometrie erfordern. Unser Ansatz bietet eine leistungsstarke probenweite Signatur der Leberzytologie, ideal für die Verfolgung des Fortschreitens von Leberverletzungen und Krankheiten.

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Hepatitis-B-Virus-Infektion (HBV) in neuartigen 293T-Zellen (293T-NE-3NRs, die menschliche NTCP, HNF4, RXR und PPAR) und traditionelle Leberzellen (HepG2-NE, exzessizierenden menschlichen NTCP) exdrücken.

Modellierung der Hepatitis-B-Virusinfektion in nicht-hepatischen 293T-NE-3NRs-Zellen

Wir präsentieren ein Protokoll zum Screening von Anti-Hepatitis-B-Virus-Verbindungen (HBV), die auf prä- und postvirale Eintrittsphasen abzielen, wobei die isotherme Titrationskalorimetrie verwendet wird, um die Bindungsaffinität (KD) mit dem Wirtsnatriumtaurocholat-Cotransport-Polypeptid zu messen. Die antivirale Wirksamkeit wurde durch die Unterdrückung viraler Lebenszyklusmarker (cccDNA-Bildung, Transkription und virale Assemblierung) bestimmt.

Ein kompetentes Hepatozytenmodell, das den Eintritt von Hepatitis-B-Viren durch Natriumtaurocholat cotransportierendes Polypeptid als therapeutisches Ziel untersucht

Dieses Protokoll stellt eine automatisierte, bildbasierte Hochdurchsatztechnik vor, um Verbindungen zu identifizieren, die die natürliche Killerzell-vermittelte Abtötung von Brustkrebszellen in Gegenwart eines therapeutischen Anti-HER2-Antikörpers modulieren.

High-Content-Screening-Assay zur Identifizierung von Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizitäts-modifizierenden Verbindungen

Hepatozyten, die aus pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, können durch Zellsortierung aufgereinigt werden, wobei eine Kombination aus mitochondrialer und aktivierter Leukozytenzelladhäsionsmolekülfärbung (ALCAM, auch bekannt als CD166) verwendet wird.

Anwendung der Färbung lebender Mitochondrien bei der Zellsortierung zur Aufreinigung von Hepatozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden

Es gibt keinen standardisierten Virusneutralisationstest für das Hepatitis-E-Virus (HEV), ein nicht-zytopathisches Positivsträng-RNA-Virus. Hier wird ein Fluoreszenzreduktionsneutralisationstest (FRNT) auf Basis der Quantifizierung des fluoreszierend markierten viralen Kapsidproteins beschrieben, um die Wirksamkeit von Anti-HEV-Antikörpern zu bewerten.

Hepatitis-E-Virus-Fluoreszenzreduktions-Neutralisationstest zur Messung neutralisierender Antikörper-Titer

Lernen Sie die indirekte Immunfluoreszenz zur ANA-Detektion in Patientenserum mit HEp-2-Zellen. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Diagnose systemischer Autoimmunerkrankungen.

Anti-Atom-Antikörper Screening mit HEp-2-Zellen

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