Anti-Atom-Antikörper Screening mit HEp-2-Zellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, einen indirekten Immunfluoreszenz-Assay zu verwenden, um nach antinukleären Antikörpern zu suchen. Dies wird durch Inkubation des Patientenserums mit zwei Substratobjektträgern erreicht. Das ungebundene Patientenserum wird abgewaschen, die gebundenen Autoantikörper werden dann mit spezifischem Fluorescein-markiertem Konjugat inkubiert, und das ungebundene Reagenz wird abgewaschen.

Bei der Betrachtung durch ein Fluoreszenzmikroskop weisen autoantikörperpositive Proben eine apfelgrüne Fluoreszenz auf, die den Bereichen der Zelle oder des Zellkerns entspricht, in denen der Autoantikörper in einem Fluoreszenzmuster gebunden hat, das auf das Vorhandensein des Antigens hinweist. Letztendlich kann das Vorhandensein von Arna zur Unterstützung der Diagnose von Bindegewebserkrankungen verwendet werden. Der Hauptvorteil der indirekten Immunfluoreszenzmethode gegenüber anderen Methoden wie der Festphasen-Eliza besteht darin, dass das Hepatitis-Zwei-Zell-Substrat über 100 Antigene enthält, die in ihrer nativen Konfiguration exprimiert werden.

Dies ermöglicht die Identifizierung fast aller klinisch relevanten O-Antikörper, was mit Solid-Face-Techniken nicht möglich ist, da es sich bei der indirekten Immunfluoreszenzmethode um eine sehr spezialisierte Technik handelt. Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, brauchen Zeit und Übung, um sich mit dem Verfahren der Objektträgerverarbeitung vertraut zu machen. Die Interpretation der Mikroskopbilder und das Erlernen relevanter Muster ist ebenfalls eine Fähigkeit, die Zeit braucht, um sie zu beherrschen.

Mit den richtigen Reagenzien und Werkzeugen sind die Ergebnisse konsistenter und leichter zu interpretieren. Cassandra Bryant, eine Technologin des Immunfluoreszenz-Entwicklungslabors von Asay, wird das Verfahren vorführen. Entfernen Sie die Reagenzien aus der Verpackung und lassen Sie jeden Artikel auf Raumtemperatur kommen, bereiten Sie die Reagenzien vor und verdünnen Sie das Patientenserum entsprechend der Richtung. Die Objektträger sind mit einem Barcode versehen und können leicht in automatisierte Systeme integriert werden.

Dieses Verfahren veranschaulicht die manuelle Verarbeitung von Objektträgern. Labore mit hohem Durchsatz können sich jedoch für automatisierte Objektträgerverarbeitungsgeräte mit Barcode-Scanfunktionen entscheiden. Die Inova-Instrumente sind über ein zentralisiertes, intelligentes Netzwerk verbunden, das die Kontrolle über die Workflow-Ergebnisse und die Berichterstattung ermöglicht.

Für die IFA. Dies führt zu einer positiven Patientenidentifikation durch die Verarbeitung und Eliminierung von Transkriptions- und damit verbundenen Fehlern. Geben Sie einen Tropfen Positivkontrolle und einen Tropfen Negativkontrolle auf den entsprechenden Objektträger.

Pipettieren Sie 20 bis 25 Mikroliter verdünntes Patientenserum in die verbleibenden Vertiefungen. Bearbeiten Sie jeweils eine Folie. Legen Sie den Objektträger in einen Beizbehälter mit einem feuchten Papiertuch auf dem Boden, decken Sie den Behälter ab und inkubieren Sie den Objektträger 30 Minuten lang.

Die feuchten Bedingungen verhindern ein Austrocknen des Untergrundes, was zu künstlichen Flecken führen kann. Während dieser Inkubationszeit binden die antinukleären Antikörper im Serum des Patienten an Antigene der Zellen, die an jeder Vertiefung befestigt sind. Spülen Sie das Serum nach der Inkubationszeit mit einem sanften Strahl Waschpuffer ab, um eine Beschädigung des Substrats zu vermeiden.

Winkeln Sie den Objektträger leicht an, so dass der Strahl nicht direkt auf den Untergrund zeigt. Diese Ausrichtung der Objektträger trägt auch dazu bei, ein Überkreuzen der Proben zwischen den Vertiefungen zu verhindern. Klopfen Sie überschüssigen Waschpuffer ab und legen Sie den Objektträger in ein Copeland-Glas mit Waschpuffer.

Die Inkubationszeit für den Waschschritt sollte etwa fünf Minuten betragen. Nehmen Sie die Objektträger aus dem Waschpuffer und klopfen Sie vorsichtig darauf. Um den überschüssigen Waschpuffer zu entfernen, tragen Sie einen Tropfen fluoreszierendes Konjugat auf jede Vertiefung auf.

Für eine NA-Testung wird die Verwendung eines IgG FC-spezifischen Konjugats empfohlen. Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang im befeuchteten Behälter und achten Sie darauf, die Fleckenabdeckung wieder aufzusetzen. Das Konjugat ist lichtempfindlich und die Abdeckung schützt die Dias vor Lichteinwirkung.

Während dieser Inkubationszeit bindet das Konjugat an die antinukleären Antikörper des Patienten, die an die Zellantigene gebunden haben. Diese konjugierte Bindung führt dazu, dass nach der Inkubation Fluoreszenz in den Vertiefungen vorhanden ist. Waschen Sie den Objektträger mit Waschpuffer.

Legen Sie wie zuvor einen Deckglas auf ein Papiertuch und tragen Sie das Eindeckmedium in einer durchgehenden Linie auf die Unterkante des Deckglases auf. Nehmen Sie jeden Objektträger aus dem Waschpuffer und klopfen Sie vorsichtig auf den Objektträger. Um den überschüssigen Waschpuffer zu entfernen, berühren Sie die Unterkante des Objektträgers mit dem Rand des Deckglases.

Senken Sie das Objektträger vorsichtig so auf den Deckglas, dass das Montagemedium auf dem Deckglas zur Oberkante des Objektträgers fließt, ohne dass die Luftblase des Deckblatts verrutscht. Objektträger mit einem Fluoreszenzmikroskop, das sich in einem dunklen Raum befindet, sollte das Scannen der gesamten Vertiefung mit einem 20 x oder 25 x Objektiv durchgeführt werden. Um die Zellverteilung und die Gleichmäßigkeit der Fluoreszenz zu beurteilen, wechseln Sie zu einem 40-fach-Objektiv.

Um die endgültige Interpretation in Bezug auf Positivität und Muster zu treffen, schauen Sie sich die Positiv- und Negativkontrollen an. Die Negativkontrolle erscheint möglicherweise nicht vollständig dunkel, zeigt aber oft eine unspezifische Fluoreszenz mit geringem Pegel an. Die Positivkontrolle zeigt eine helle apfelgrüne Fluoreszenz im Zellkern.

Die Positivität kann mit einer Reaktivitätsskala von eins plus bis vier plus bewertet werden. Neben der manuellen Interpretation können Objektträger mit dem automatisierten Fluoreszenzmikroskop geladen und gescannt werden. Es ist keine Dunkelkammer notwendig.

Nach dem Erstellen eines Projekts durch Auswahl des entsprechenden Objektträgertyps erfasst und speichert das Gerät hochauflösende digitale Bilder der Zellen in jeder Vertiefung. Darüber hinaus misst Nova View die Intensität des Fluoreszenzlichts, kategorisiert die Ergebnisse als positiv oder negativ und bietet Mustererkennung für positive Proben. Die Bilder werden vom Bediener auf einem hochauflösenden Computermonitor angezeigt, was eine endgültige Interpretation, Überarbeitung und Bestätigung von Nova View ermöglicht.

Ergebnisberichte können über bestätigte Ergebnisse erstellt werden. Die Bindung von Autoantikörpern an die konstituierenden Proteinstrukturen im Zellkern führt zu fünf Hauptkernmustern, darunter homogenes, gesprenkeltes Zentromer, Nukleolär und Kernpunkt. Um ein homogenes Muster zu identifizieren, wie hier gezeigt, identifizieren Sie mitotische oder sich teilende Zellen.

Mitotische Zellen zeigen eine solide, gleichmäßige Fluoreszenz, die oft stärker ausgeprägt ist als bei ruhenden Zellen. Die ruhenden Zellkerne sollten einheitlich mit diffuser Färbung sein. Dieses charakteristische Muster ist höchstwahrscheinlich das Ergebnis von Autoantikörpern gegen doppelsträngige DNA.

Ein wesentliches Merkmal des gesprenkelten Musters ist das Aussehen der mitotischen Zellen in der Metaphase. Die Chromosomenregion dieser Zellen ist negativ. Die ruhenden Zellen zeigen ein Fleckenmuster in den Zellkernen.

Die Sprenkelung kann als grob oder fein definiert werden. Das Course Speckling ist das Ergebnis von Autoantikörpern gegen SM und RNP. Feinsprenbildung kann auf Autoantikörper gegen S-S-A-S-S-B sowie RNA-Polymerase zurückzuführen sein.

Das DFS-Muster wird als dicht, fein gesprenkelt bezeichnet und ist ein Hinweis auf Autoantikörper gegen DFS 70. Mitotische Zellen zeigen gesprenkelte Färbungen, während ruhende Zellen gleichmäßig verteilte feine Flecken im Zellkern aufweisen. In diesen Fällen sollten Bestätigungstests durchgeführt werden, da DFS 70-Autoantikörper bei gesunden Personen im Vergleich zu Patienten mit Bindegewebserkrankungen vorherrschen.

Um das Zentromermuster zu identifizieren, scannen Sie die Vertiefungen und identifizieren Sie mitotische oder sich teilende Zellen. Die sich teilenden Zellen haben zahlreiche diskrete Flecken, die in enger Verbindung miteinander stehen und oft als Metaphasenbalken bezeichnet werden. Die ruhenden Zellen zeigen etwa 40 bis 60 diskrete Flecken, die über den Zellkern verteilt sind.

Das Zentromermuster ist mit Autoantikörpern gegen Zentromerproteine mit dem nukleolären Muster assoziiert. Die Färbung der Chromosomenregion in mitotischen Zellen ist variabel. Das nukleoläre Muster ist mit einer homogenen oder gesprenkelten Färbung der Zellkerne assoziiert, zusammen mit einer schwachen, gesprenkelten oder homogenen Färbung des Nukleoplasmas der ruhenden Zellkerne.

Dieses Muster ist mit Autoantikörpern gegen RNA-Polymerase, Drei-Fibrillin und PM SCL-Antikörpern assoziiert. Das Kernpunktmuster ist mit einer negativen Metaphase, mitotischen Zellen und wenigen diskreten Punkten in den ruhenden Zellkernen assoziiert. Dieses charakteristische Muster ist häufig das Ergebnis von Autoantikörpern gegen SP 100 PML oder P 80 Colan.

Diese Antikörper sind mit primärer biliärer Zirrhose und Autoimmunhepatitis assoziiert. In der gezeigten Abbildung zeigt das nukleäre Punktmuster eine zytoplasmatische Färbung aufgrund von Autoantikörpern gegen mitochondriale Antigene. Der Nachweis und die Mustererkennung von antinukleären Antikörpern dienen als wichtiges Instrument zur Unterstützung der Patientendiagnose.

Das Verständnis der Bedeutung verschiedener Muster ermöglicht es Ärzten und Laborpersonal, geeignete Nachuntersuchungen durchzuführen. Die wichtigsten Faktoren für die korrekte Identifizierung von antinukleären Antikörpermustern sind die Auswahl eines hochwertigen Zellsubstrats und die Verarbeitung der Objektträger mit gleichbleibend guter Technik. Das Dialesen wird traditionell durch Fluoreszenzmikroskopie in Dunkelkammern durchgeführt und wird von ausgebildeten Technologen durchgeführt, die mit den verschiedenen Mustern im Kontext des Zellzyklus und der Zellmorphologie vertraut sind.

In den letzten Jahren wurden digitale Bildgebungssysteme für das automatisierte Lesen der Objektträger entwickelt, die den Arbeitsablauf automatisieren und die Konsistenz des Lesens und Interpretierens erhöhen. Darüber hinaus wird durch die Verwendung von Objektträgern mit Barcodes durch die Rückverfolgbarkeit der Proben während des gesamten Prozesses potenzielle Transkriptionsfehler vermieden und die Datenintegrität und Patientensicherheit erhöht. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie jeden Schritt des indirekten Immunfluoreszenzverfahrens durchführen und wie Sie klinisch relevante antinukleäre Antikörpermuster identifizieren können.