Zytotoxische Wirksamkeit von Photodynamische Therapie in Osteosarkomzellen In-vitro-

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die zytotoxische Wirksamkeit der photodynamischen Therapie in Osteosarkomzellen zu zeigen. Dies wird erreicht, indem zunächst die intrazelluläre Aufnahme des Photosensibilisators M-T-H-P-C durch Osteosarkomzellen gemessen wird. Im zweiten Schritt wird Laserlicht auf die Zellen aufgebracht, um das M-T-H-P-C zu aktivieren und zytotoxische Sauerstoffradikale zu produzieren.

Schließlich werden der Zellstoffwechsel und die Zellzahl mit einem wasserlöslichen Tetra Oleum One oder WST One Assay gemessen. Letztendlich kann der WST one Assay sowie die direkte Zellzählung verwendet werden, um die Zytotoxizität der photodynamischen Therapie an den Osteosarkomzellen zu messen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie des Osteosarkoms, da sie die Messung der Wirksamkeit der photodynamischen Therapie in vitro ermöglicht und der derzeit bei Patienten verwendeten Technik ähnelt.

Um die M-T-H-P-C-Aufnahme zwischen Osteosarkom-Zelllinien zu vergleichen, beginnen Sie mit der Plattierung von 0,2 mal 10 auf die sechste Hoss- und 143 B-Zellen pro Well. Lassen Sie die Zellen in dreifacher Ausfertigung in sechs Well-Platten über Nacht an einer Co-Flüssigkeit von 80 bis 90 % haften und inkubieren Sie die Zellen dann am nächsten Tag mit einer festen Konzentration von M-T-H-P-C für verschiedene Zeiträume im Dunkeln, um die zeitabhängige Aufnahme des Photosensibilisators durch die Zellen zu bewerten. Nach den Inkubationen aspirieren Sie das Medium und waschen die Zellen dreimal mit PBS, lösen Sie dann die Zellen mit 0,5 Millilitern Trips in EDTA ab und zählen Sie sie.

Als nächstes drehen Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 400-facher G-Temperatur und Raumtemperatur herunter. Das Medium wird aspiriert und das Pellet in PBS auf eine Enddichte von zweimal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter resuspendiert. Pipettieren Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung eines 96.

Die Well-Platte und Messung der Fluoreszenz der Zellen in einem Fluoreszenzspektrophotometer, das auf 417 Nanometer Anregung und 652 Nanometer Emission eingestellt ist. Bereiten Sie dann eine Standardkurve vor, indem Sie 100 Mikroliter mit Konzentrationen von M-T-H-P-C von null bis vier Milligramm pro Milliliter in dreifacher Ausfertigung plattieren. In einer 96-Well-Platte und messen Sie die Fluoreszenz, wie gerade gezeigt, um eine Standardkurve zur Berechnung der relativen Fluoreszenzeinheit jeder Zelle zu erzeugen, die eine Vertiefung aus der zuvor gemessenen Platte enthält.

Um die Phototoxizität des Photosensibilisators zu messen, säen Sie zunächst 3000 Zellen pro Well in dreifacher Ausfertigung pro M-T-H-P-C-Konzentration in einer 96-Well-Platte, einschließlich Kontrollzellen für dunkle Toxizität für jede PHOTOSENSITIZER-Konzentration. Lassen Sie die Zellen über Nacht an einer Flüssigkeit von 50 bis 60 % am nächsten Tag haften. Inkubieren Sie die Zellen nach der Inkubation fünf Stunden lang im Dunkeln mit einer Reihe von M-T-H-P-C-Konzentrationen.

Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und fügen Sie frisches Medium ohne M-T-H-P-C hinzu, das dann spezifisch für das M-T-H-P-C-Absorptionsspektrum ist, wobei Sie einen geeigneten Augenschutz tragen. Stellen Sie einen 652-Nanometer-Diodenlaser auf eine Leistung von 21,88 Milliwatt pro Quadratzentimeter in einer Höhe von 13,5 Zentimetern ein. Abstand zu den Zellen, um eine Energiedosis von fünf Joule pro Quadratzentimeter zu erhalten.

Beleuchten Sie dann die Zellen mit Ausnahme der dunklen Toxizitätskontrollzellen für 230 Sekunden nach der Beleuchtung. Halten Sie die Zellen 24 Stunden lang im Dunkeln bei 37 Grad Celsius. Anschließend werden 10 Mikroliter wst, ein Reagenz pro 100 Mikroliter Medium drei Stunden nach Zugabe des wst ein Reagenz zugegeben, die Absorption der einzelnen Wells bei 415 Nanometern gemessen.

Berechnen Sie abschließend die Anzahl der überlebenden Zellen zusätzlich zum WST one Assay. Die direkte Zählung der Zellen ist eine zweite Methode zur Messung der Zelltoxizität. Um den Prozentsatz lebensfähiger Zellen zu berechnen, säen Sie zwei mal 10 bis vierte Zellen pro Vertiefung in 2 24-Well-Platten aus und lassen Sie sie über Nacht anhaften.

Am nächsten Tag inkubieren Sie die Zellen fünf Stunden lang im Dunkeln mit M-T-H-P-C und beleuchten Sie sie wie gerade gezeigt. Halten Sie dunkle Kontrollzellen nach 24 Stunden im Dunkeln, sammeln Sie den Überstand, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und Trypsin-Augen, schleudern Sie die Zellen schließlich herunter und resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern frischem Medium zur Zählung. Die in dieser Grafik dargestellten Ergebnisse zeigen im oberen Feld die zeitabhängige Aufnahme von M-T-H-P-C mit einer Fluoreszenzintensität der Zellsuspension, die den intrazellulären Niveaus des M-T-H-P-C entspricht.

Im unteren Bereich. Die dosisabhängige M-T-H-P-C-Aufnahme kann durch Messung der Fluoreszenz von M-T-H-P-C mit einem Fluoreszenzspektrophotometer bestimmt werden. Dieses Diagramm veranschaulicht die Aufnahme einer festen Konzentration von M-T-H-P-C in einer zeitabhängigen Weise, wobei die Fluoreszenzintensität der Zellsuspension die intrazellulären Spiegel des M-T-H-P-C darstellt.

In dieser Grafik wird die dosisabhängige M-T-H-P-C-Aufnahme in Haass- und 143 B-Zellen nach einer fünfstündigen Inkubation gezeigt. Die Aufnahme in der hochmetastasierten Zelllinie 143 B war signifikant höher als in der niedrig metastasierten elterlichen Wirtszelllinie. Die dosisabhängige Dunkeltoxizität der Osteosarkomzellen wird nachgewiesen.

143 B-Zellen wurden mit unterschiedlichen M-T-H-P-C-Dosierungen behandelt und mit unbehandelten Zellen verglichen, und es wurde eine dosisabhängige Abnahme der Stoffwechselaktivität und der Zellzahl, gemessen mit einem Assay, beobachtet. Eine verminderte Zellviabilität wurde bei einer M-T-H-P-C-Konzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter und mehr festgestellt. In der unteren Grafik ist die dosisabhängige Toxizität von M-T-H-P-C dargestellt.

Die Zellen wurden mit unterschiedlichen M-T-H-P-C-Dosen und anschließender Beleuchtung bei fünf Joule pro Quadratzentimeter behandelt. Es wurde eine daraus resultierende Abnahme der metabolischen Aktivität der Zellen sowie eine Abnahme der Zellzahl beobachtet. Die Entwicklung dieser Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Krebsbiologie den Weg, diese Methoden auf In-vivo-Modelle des Osteosarkoms sowie für andere präklinische Untersuchungen anzuwenden.