Name: Zytotoxische Wirksamkeit von Photodynamische Therapie in Osteosarkomzellen In-vitro- (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Erfahren Sie die zytotoxische Wirksamkeit der photodynamischen Therapie in Osteosarkomzellen. Diese Methode nutzt den Photosensibilisator M-T-H-P-C und Laserlicht zur Erzeugung zytotoxischer Sauerstoffradikale.

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Die Autoren möchten biolitec Research GmbH (Jena, Deutschland) für die freundliche Bereitstellung uns mit dem liposomalen mTHPC-Formulierung, mit besonderem Dank an Susanna Gräfe und Arno Wiehe für ihre Hilfe und technisches Know-how danken. Wir möchten auch an Kerstin Reidy, der einen großen Teil der Ergebnisse generiert und war mitverantwortlich für seine Veröffentlichung 11 danken. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Schweizerischer Verein Balgrist, der Universität Zürich, der Krebsliga Zürich sowie durch einen Zuschuss aus dem Walter L. und Johanna Wolf-Stiftung, Zürich, Schweiz und einen Zuschuss aus EuroNanoMed ERA-NET / SNF unterstützt Schweizer National Science Foundation 31NM30-131004/1. Diese Arbeit wurde auch von der HSM (Hochspezialisierte Medizin)-Programm für Muskuloskelettale Onkologie der Kanton Zürich unterstützt.

1. Vergleich der Aufnahme von mTHPC in den jeweiligen Nieder-und Hoch Metastatische HOS und 143B OS-Zelllinien <ol><li> Vorbereitung Zellkulturmedium, das DMEM, Ham F12 und hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum in einem Verhältnis 4.5:4.5:1. Hinweis: Die liposomale Formulierung der PS mTHPC wurde in Wasser in einer Endkonzentration von 1,5 mg / ml mTHPC gelöst. </li><li> Platte 0,2 x 10 6 HOS und 143B Zellen / Well in 6-Well-Platten (dreifacher Ausführung für jede Bedingung) und lassen die Zellen über Nacht halten. Hinweis: Die Nummer muss auf einzelne Zelllinien eingestellt werden. Eine Konfluenz von 80-90% am meisten zu der Zeit des Versuchs geeignet. </li><li> Am folgenden Tag, Inkubation der Zellen mit einer festen Konzentration von mTHPC für verschiedene Zeiträume (zeitabhängige Aufnahme) oder mit steigenden Konzentrationen von mTHPC während einer festen Zeitperiode (Dosis abhängige Aufnahme). </li><li> Die Zellen mit mTHPC inkubieren bestimmten Zeit punkte oder Konzentrationen von mTHPC. Anmerkung: In dieser Studie wurden sowohl die HOS und 143B Zelllinien mit 0,6 &amp;mgr; g / ml inkubiert mTHPC für 0, 2,5, 5 oder 10 Stunden, oder mit 0, 0,6, 2,5 und 10 ug / ml mTHPC 5 Stunden. Die angewandten Zeiträume und Dosierungen können in Abhängigkeit von der Zelllinie, die verwendet wird, variieren. </li><li> Denken Sie daran, immer im Dunkeln oder bei gedimmten Lichtverhältnissen arbeiten, um Licht Exposition der Zellen zu verhindern. </li><li> Nach Inkubation der Zellen bei den angegebenen Bedingungen absaugen Medium und die Zellen werden dreimal mit PBS. Als nächstes lösen Sie die Zellen mit 0,5 ml Trypsin / EDTA und zählen Sie die Zellen. </li><li> Nach dem Ablösen Zentrifugation der Zellen bei 400 × g für 5 min, saugt den mittleren und Resuspendieren der Zellen in PBS auf eine endgültige Dichte von 200.000 Zellen / ml. </li><li> Je 100 &amp;mgr; l der erhaltenen Zellsuspension (dh 20.000 Zellen) in einer 96-well-Platte und Messen der Fluoreszenz dieser Zellen in einem Fluoreszenz-Spektralphotometer. Die Einstellungs für mTHPC Fluoreszenzmessungen sind: 417 nm für die Anregung und 652 nm für die Emission. </li><li> Um die Menge des pro Zelle internalisierten mTHPC berechnen, normalisieren die relative Fluoreszenzeinheit (RFU) für die Zellzahl und Zellvolumen, wie folgt: </li><li> Bereiten Sie eine Standardkurve mit verschiedenen Konzentrationen von mTHPC in PBS von 0-4 pg / ml (Verwendung Dreifachmessungen). Je 100 ul jeder Verdünnung in eine 96-Well-Platte und messen die Fluoreszenz der Brunnen mit den unter Schritt 1.6 beschriebenen Einstellungen. </li><li> Teilen die RFU (20.000 Zellen) erhalten durch die Steigung der linearen Standardkurve von mTHPC, die die Konzentration von mTHPC (in ug / ml) in dem Schacht gibt. </li><li> Teilen diese mTHPC Konzentration von 10, um die Gesamtmenge der mTHPC in einer Vertiefung (in &amp;mgr; g, die 100 ul der Zellsuspension) erhalten und teilt diesen Wert durch das Volumen von 20.000 Zellen. </li><li> Berechnen Sie das Volumen mit der Formel für eine Kugel: (4/3 x π) xr 3. Erhalten des Radius r durch Messen des Durchmessers von 20 trypsiniert Zellen unter einem Mikroskop, und Dividieren dieses Werts durch 2. </li><li> Schließlich normalisieren alle Werte mit denen für HOS-Zellen nach 10 h Inkubation (dosisabhängige Aufnahme) oder mit 10 ug / ml mTHPC (Zeit abhängige Aufnahme), die auf 100% gesetzt wurden behandelt worden sind. </li></ol> 2. Die Messung der Phototoxizität von PS In-vitro- <ol><li> Seed 3.000 Zellen / Well in einer 96-Well-Platte (dreifacher Ausführung für jede Konzentration der mTHPC verwendet) und lassen Sie sie über Nacht zu halten. Ebenso bereiten eine zusätzliche 96-Well-Platte und Behandlung der Zellen, wie unten beschrieben, aber dann legte sie beiseite für Phasenkontrast-Bildgebung. Anmerkung: Die Anzahl muss für jede einzelne Zelllinie eingestellt werden. Eine Konfluenz von 50-60% zum Zeitpunkt des Experiments ist ideal. <ol><li> Denken Sie daran, die entsprechende Dunkeltoxizität Kontrolle von Zellen für jedes der mTHPC-Konzentrationen hinzufügen. Diese sind Zellen, die in Abwesenheit oder in Gegenwart von ausgewählten Konzentrationen mTHPC inkubiert werden, wird aber nicht ausgeleuchtet werden. </li></ol></li><li> Am folgenden Tag, Inkubation der Zellen mit je nach Zelllinien verschiedenen Konzentrationen von mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5 und 10 ug / ml) und halten sie in der Dunkelheit für 5 Stunden. <ol><li> Siehe Abschnitt 1.3.2 Hinweis: Die Inkubationszeit vor der Bestrahlung hängt von der Zelllinie und der PS verwendet, daher ist es ratsam, den verschiedenen Konzentrationen und zu verschiedenen Zeitpunkten in getrennten Experimenten getestet. </li></ol></li><li> Nach der Inkubation für den angegebenen Zeitraum, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und neue frisches Medium ohne mTHPC. </li><li> Beleuchten Sie die Zellen mit einem 652 nm Diodenlaser, die spezifisch für die mTHPC Absorptionsspektrum (siehe Abbildung 1). <ol><li> Stellen Sie den Laser, um 21.88 mW / cm 2 Leistung bei einer Höhe von 13,5 cm distaNOA aus den Zellen, um eine Energiedosis von 5 J / cm 2 erhalten. Beleuchten Sie die Zellen für 230 sek. Beleuchten Sie nicht die Dunkeltoxizität Kontrollzellen (mit und ohne mTHPC). Hinweis: Tragen Sie immer eine Brille, die Augen von der zur Anregung der PS verwendet Laserlicht zu schützen. </li></ol></li><li> Nach der Beleuchtung, halten die Zellen im Dunkeln bei 37 º C für 24 Stunden. Anschließend fügen wasserlösliche Tetrazoliumsalz (WST-1)-Reagenz (10 μl/100 ul Medium). </li><li> Drei Stunden nach der Zugabe des WST-1-Reagens wird die Extinktion der einzelnen Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen bei 415 nm auf. </li><li> Um den Prozentsatz der überlebenden Zellen zu berechnen, setzen Sie den Mittelwert der für die nicht behandelten Zellen mTHPC für jede Bedingung zu 100% (dh beleuchtet, ohne mTHPC und nonilluminated, ohne mTHPC) erhaltenen Werte. </li></ol> 3. Schätzung der Anzahl von Zellen durch Zellzählung <ol><li> Seed 20.000 Zellen / wirll in einer 24-Well-Platte und lassen Sie sie über Nacht zu halten. </li><li> Inkubieren der Zellen für 5 h mit mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6 und 1,25 ug / ml) und beleuchten sie wie oben beschrieben. </li><li> Sammeln Sie das Medium, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, trypsinize sie und sammeln sie durch Zentrifugation bei 400 g für 5 min. </li><li> Nach der Zentrifugation saugen Sie den mittel-und Resuspendieren der Zellen in 200 ml frisches Medium. </li><li> Zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Kammer. </li></ol>

<ol><li>Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+cancer.+Basic+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Transl.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications.</a> Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).</li>
<li>Agostinis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+cancer%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of cancer: an update.</a> CA Cancer. 61, 250-281 (2011).</li>
<li>D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appraising+the+current+role+of+chemotherapy+for+the+treatment+of+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma.</a> Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).</li>
<li>Allison, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meta-analysis+of+osteosarcoma+outcomes+in+the+modern+medical+era%5BTitle%5D)+AND+%22Sarcoma%22%5BJournal%5D)">A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era.</a> Sarcoma. , (2012).</li>
<li>Anninga, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapeutic+adjuvant+treatment+for+osteosarcoma%3A+where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand.</a> Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).</li>
<li>Bacci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+relapse+in+patients+with+osteosarcoma+of+the+extremities+treated+with+neoadjuvant+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy.</a> Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).</li>
<li>Briccoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resection+of+recurrent+pulmonary+metastases+in+patients+with+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma.</a> Cancer. 104, 1721-1725 (2005).</li>
<li>Milla Sanabria, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+photodynamic+therapy+effects+on+the+cellular+and+molecular+components+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).</li>
<li>Mitra, S., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysical+parameters%2C+photosensitizer+retention+and+tissue+optical+properties+completely+account+for+the+higher+photodynamic+efficacy+of+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin+vs+Photofrin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin.</a> Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).</li>
<li>Ma, L., Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+new+photosensitizer%2C+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin%2C+for+use+in+photodynamic+therapy%3A+a+comparison+of+its+photobiological+properties+with+those+of+two+other+photosensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers.</a> Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).</li>
<li>Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTHPC-mediated+photodynamic+therapy+is+effective+in+the+metastatic+human+143B+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells.</a> Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).</li>
<li>Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+sensitivity+of+microvascular+endothelial+cells%2C+fibroblasts+and+tumor+cells+after+in+vitro+photodynamic+therapy+with+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.</a> Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).</li>
<li>Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Oncologist%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy in oncology.</a> Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).</li>
<li>Burch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+canine+osseous+tumors+with+photodynamic+therapy%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder Interessenkonflikte.

Um eine optimale Zytotoxizität in Reaktion auf die PDT zu erreichen, ist es entscheidend, die richtigen Laser Lichteinstellungen und Inkubationszeiten zu wählen. Die hier beschriebenen Verfahren sind konsistent und effizient zu PS-Aufnahme zu bestimmen und PDT induzierte Zytotoxizität in vitro zu quantifizieren. Verwendung der spezifischen Absorptionswellenlängen der PS mTHPC kann die zelluläre Aufnahme PS in direkter Weise bestimmt werden, und die PS kann aktiviert werden, um zytotoxische reaktive Sauerstoffsp...

Der heutige Stand der Technik Behandlung von Osteosarkom (OS), eine primäre Knochentumor, umfasst eine Kombination von neo adjuvante Chemotherapie und Chirurgie. Dieses Behandlungsschema ergab eine Erhöhung der Überlebensrate von Patienten mit lokalisierter Erkrankung von etwa 20% vor der Verwendung der Chemotherapie zu Zeit zwischen 60-70% 3, 4. Doch in den letzten zwei Jahrzehnten hat sich die Gesamtüberlebenszeit von Patienten mit OS lokale Erkrankung Plateau 4, 5. Außerdem 30-40% dieser Patienten einen Rückfall innerhalb von 3 Jahren nach der Diagnose und bei Patienten mit metastatischen Erkrankung weiterhin eine schlechte Überleben von 20-30% 4, 6, 7 aufweisen. Um die Ergebnisse dieser Patienten zu verbessern, müssen neue therapeutische Strategien entwickelt werden. Photodynamische Therapie (PDT), eine ziemlich neuartige Antikrebstherapie verwendet Licht einer bestimmten Wellenlänge zur Anregung eines phototizer (PS), die nach der Injektion in den Blutstrom in den Tumorzellen akkumuliert. Laserlichtanregung der PS erzeugt Sauerstoffradikale in Gegenwart von Sauerstoff, die zytotoxische Reaktion in Tumorzellen und Zelltod induzieren. Neben dieser Hauptmechanismus, zwei zusätzliche PDT hervorgerufen biologische Prozesse tragen zu reduziertem Tumorwachstum: PDT verursacht Vasokonstriktion und Thrombosebildung des Tumors Mikrovaskulatur und damit lokale Hypoxie und Anoxie im Tumor, was zu Tumorinfarkt. Schließlich verletzt PDT und sterbenden Tumorzellen auslösen, eine lokale Immunantwort, eine ziemlich einzigartige Merkmal der PDT. Dies beinhaltet das Komplementsystem und die Aktivierung von Antigen-präsentierenden dendritischen Zellen 8. Somit sind die Bedingungen für die Präsentation von Tumorantigenen mit anschließender Aktivierung lymphoider Zellen erzeugt, was zu tumorspezifischen Immunität. So weit, PDT wurde verwendet, um verschiedene Arten von Weichteiltumoren und hyperpl behandelnAsiens, wie aktinische Keratose, Barrett-Ösophagus, Endobronchialtumor, Blasenkrebs, Basaliome und palliative Behandlung von Kopf-und Halskrebs 2. Die Behandlung ist bekannt, lokal, Groß Nekrose mit wenig Nebenwirkungen zu induzieren, und hat damit das Potenzial, Tumorgewebe selektiv zu beseitigen. Trotz dieser Vorteile bleibt die Anwendung der PDT technisch anspruchsvoller als die Verabreichung von Chemotherapeutika. Um die maximale Wirksamkeit, die PS-Konzentration, Belichtungszeit und Gesamtlichtenergieübertragung zu erreichen müssen optimiert werden. Dies kann in in vivo-Experimenten gemacht werden, aber aufgrund der relativ großen Anzahl von Parametern, die optimiert werden müssen, ist es effizienter, um optimale Bedingungen in vitro zunächst bestimmen. In den unten beschriebenen Experimenten testeten wir die in vitro Wirksamkeit der PDT mit der PS 5,10,15,20-Tetrakis-(meta-hydroxyphenyl)-chlOrin, abgekürzt mTHPC (Abbildung 1A). mTHPC ist der Wirkstoff in dem Arzneimittel Foscan, die derzeit in der Klinik für die palliative Behandlung von Kopf-und Halstumoren eingesetzt wird. Es ist eines der stärksten PS, Induktion massiven Zellschäden bereits bei niedrigen Konzentrationen, und es wurde gezeigt, besser als andere zu sein PS in Bezug auf Gewebepenetration 9, 10. Die Lichtabsorptionsspektrum (Abbildung 1B) zeigt zwei prominente Peaks, einen bei 417 nm und eine zweite bei 652 nm, die für die Gewebe Lokalisierung der anfall PS und für die PDT Induktion verwendet werden, auf. Derzeit ist eine liposomale Formulierung für mTHPC in der Entwicklung. Hier beschreiben wir die Verfahren für die Aufnahme von diesem liposomale Formulierung zu quantifizieren und PDT in zwei menschlichen Zelllinien OS durchzuführen; die niedrige metastasierendem HOS und die hohen metastatischen 143B-Zellen. Einige der hier vorgestellten Daten wurden zuvor 11 gemeldet. Thhier beschriebenen e-Ansatz ermöglicht es uns, die Wirkung einer metastatischen Phänotyp PDT Wirksamkeit zu untersuchen. 143B-Zellen, orthotop in die Hinterbeine von immundefizienten SCID-Mäusen injiziert verursachen intratibial metastasierenden Primärtumoren, ein Modell genau imitiert die menschliche metastasierende Erkrankung. So sind die vorgeschlagenen in vitro Experimente perfekt geeignet zur Beurteilung der optimalen Einstellungen PDT später in in vivo-Experimenten verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>PAA GmbH, Freiburg, Deutschland</td><td>E15-883</td><td></td></tr><tr><td>HAM F12</td><td>PAA GmbH, Freiburg, Deutschland</td><td>E15-817</td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum</td><td>GIBCO, Basel, Schweiz</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>mTHPC</td><td>biolitec Research GmbH, Jena, Deutschland</td><td></td><td>Da diese liposomale Formulierung aus dem Hause R& D Zur Zeit ist keine Katalognummer verfügbar. Bestand: 1,5 mg/ml; Geliefert in einer 9:1 Mischung aus Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% Reinheit)</td></tr><tr><td>Spectramax Gemini XS Plate Reader</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale,</td><td>CA ID# 861</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Zeiss Observer.Z1</td><td>Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deutschland Ceralas PDT 652 nm Laser</td><td>biolitec AG, Jena, Deutschland</td><td>LD652nm2W400u</td><td></td></tr><tr><td>Wasserlösliches Tetrazolium (WST)-Reagenz</td><td>Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Schweiz</td><td>1644807</td><td></td></tr></tbody></table>

zytotoxische wirksamkeit von photodynamische therapie in osteosarkomzellen<em&gt; in-vitro-</em

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

In den letzten Jahren gab es die Schwierigkeit, wirksamer Therapien gegen Krebs mit weniger systemische Nebenwirkungen. Daher Photodynamische Therapie ist ein neuer Ansatz für eine Tumor selektive Behandlung. Photodynamische Therapie (PDT), die Verwendung eines nicht-toxischen macht Photosensibilisators (PS), die bei Aktivierung mit Licht einer spezifischen Wellenlänge in Gegenwart von Sauerstoff, Sauerstoff-Radikale erzeugt, die eine zytotoxische Reaktion 1 hervorzurufen. Trotz seiner Zustimmung vor fast zwanzig Jahren von der FDA wird PDT heute nur noch verwendet, um eine begrenzte Anzahl von Krebsarten (Haut, Blase) und nononcological Erkrankungen (Psoriasis, aktinische Keratose) 2 zu behandeln. Der Hauptvorteil der Anwendung der PDT ist die Fähigkeit, eine lokale Behandlung, die systemischen Nebenwirkungen verhindert zuführen. Darüber hinaus ermöglicht es die Behandlung von Tumoren an empfindlichen Stellen (zB um Nerven oder Blutgefäße). Hier wird ein intraoperative Anwendung der PDT wird als in Osteosarkom (OS), einem Tumor des Knochens, um Primärtumor Satelliten gezielt in Tumor umgebende Gewebe nach chirurgischer Tumorentfernung hinter sich gelassen. Die Behandlung zielt auf die Verringerung der Anzahl von Wiederholungen und zur Verringerung der Gefahr für die (postoperativ) Metastasierung. In der vorliegenden Studie, in vitro PDT präsentieren wir Verfahren, um die optimalen Einstellungen für die PDT effektive Behandlung der weit verbreiteten OS-Zelllinien, die verwendet werden, um die menschliche Krankheit in etablierten intratibial OS Mausmodelle reproduzieren zu etablieren. Die Aufnahme des PS mTHPC wurde mit einem Spektrophotometer und Phototoxizität wurde mit Laserlichtanregung bei 652 nm mTHPC provoziert Zelltod mit einem WST-1-Assay und durch das Zählen der überlebenden Zellen beurteilt induzieren sucht. Die etablierten Techniken ermöglichen es uns, die optimalen Einstellungen PDT für zukünftige Studien in Tiermodellen zu definieren. Sie sind eine einfache und schnelle Werkzeug für die Bewertung der Wirksamkeit der PDT <em&gt; In vitro vor einer Anwendung in vivo.

Mit den hier berichteten Techniken untersuchten wir mTHPC-basierte PDT in menschlichen Zellen OS. Zuerst wurde die Zeit-und Dosis-abhängige Aufnahme von mTHPC im niedrigen metastatischen HOS und in den hoch metastatischen 143B OS Zelllinien untersucht. mTHPC Aufnahme kann durch Messung der Fluoreszenz des mTHPC mit einem Fluoreszenz-Spektrophotometer (Abbildung 2, mit freundlicher Genehmigung von Reidy et al. 11 wiedergegeben) beurteilt werden. 2A veranschaulicht die...

Das Protokoll ermöglicht die hier berichteten Bewertung der Wirksamkeit der photodynamischen Therapie (PDT) in Zelllinien und der Optimierung der PDT Einstellungen, bevor die Therapie in Tiermodellen.

Zytotoxische Wirksamkeit von Photodynamische Therapie in Osteosarkomzellen<em&gt; In-vitro-</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die zytotoxische Wirksamkeit der photodynamischen Therapie in Osteosarkomzellen zu zeigen. Dies wird erreicht, indem zunächst die intrazelluläre Aufnahme des Photosensibilisators M-T-H-P-C durch Osteosarkomzellen gemessen wird. Im zweiten Schritt wird Laserlicht auf die Zellen aufgebracht, um das M-T-H-P-C zu aktivieren und zytotoxische Sauerstoffradikale zu produzieren.Schließlich werden der Zellstoffwechsel und die Zellzahl mit einem wasserlöslichen Tetra Oleum One oder WST One Assay gemessen. Letztendlich kann der WST one Assay sowie die direkte Zellzählung verwendet werden, um die Zytotoxizität der photodynamischen Therapie an den Osteosarkomzellen zu messen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie des Osteosarkoms, da sie die Messung der Wirksamkeit der photodynamischen Therapie in vitro ermöglicht und der derzeit bei Patienten verwendeten Technik ähnelt.Um die M-T-H-P-C-Aufnahme zwischen Osteosarkom-Zelllinien zu vergleichen, beginnen Sie mit der Plattierung von 0,2 mal 10 auf die sechste Hoss- und 143 B-Zellen pro Well. Lassen Sie die Zellen in dreifacher Ausfertigung in sechs Well-Platten über Nacht an einer Co-Flüssigkeit von 80 bis 90 % haften und inkubieren Sie die Zellen dann am nächsten Tag mit einer festen Konzentration von M-T-H-P-C für verschiedene Zeiträume im Dunkeln, um die zeitabhängige Aufnahme des Photosensibilisators durch die Zellen zu bewerten. Nach den Inkubationen aspirieren Sie das Medium und waschen die Zellen dreimal mit PBS, lösen Sie dann die Zellen mit 0,5 Millilitern Trips in EDTA ab und zählen Sie sie.Als nächstes drehen Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 400-facher G-Temperatur und Raumtemperatur herunter. Das Medium wird aspiriert und das Pellet in PBS auf eine Enddichte von zweimal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter resuspendiert. Pipettieren Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung eines 96.Die Well-Platte und Messung der Fluoreszenz der Zellen in einem Fluoreszenzspektrophotometer, das auf 417 Nanometer Anregung und 652 Nanometer Emission eingestellt ist. Bereiten Sie dann eine Standardkurve vor, indem Sie 100 Mikroliter mit Konzentrationen von M-T-H-P-C von null bis vier Milligramm pro Milliliter in dreifacher Ausfertigung plattieren. In einer 96-Well-Platte und messen Sie die Fluoreszenz, wie gerade gezeigt, um eine Standardkurve zur Berechnung der relativen Fluoreszenzeinheit jeder Zelle zu erzeugen, die eine Vertiefung aus der zuvor gemessenen Platte enthält.Um die Phototoxizität des Photosensibilisators zu messen, säen Sie zunächst 3000 Zellen pro Well in dreifacher Ausfertigung pro M-T-H-P-C-Konzentration in einer 96-Well-Platte, einschließlich Kontrollzellen für dunkle Toxizität für jede PHOTOSENSITIZER-Konzentration. Lassen Sie die Zellen über Nacht an einer Flüssigkeit von 50 bis 60 % am nächsten Tag haften. Inkubieren Sie die Zellen nach der Inkubation fünf Stunden lang im Dunkeln mit einer Reihe von M-T-H-P-C-Konzentrationen.Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und fügen Sie frisches Medium ohne M-T-H-P-C hinzu, das dann spezifisch für das M-T-H-P-C-Absorptionsspektrum ist, wobei Sie einen geeigneten Augenschutz tragen. Stellen Sie einen 652-Nanometer-Diodenlaser auf eine Leistung von 21,88 Milliwatt pro Quadratzentimeter in einer Höhe von 13,5 Zentimetern ein. Abstand zu den Zellen, um eine Energiedosis von fünf Joule pro Quadratzentimeter zu erhalten.Beleuchten Sie dann die Zellen mit Ausnahme der dunklen Toxizitätskontrollzellen für 230 Sekunden nach der Beleuchtung. Halten Sie die Zellen 24 Stunden lang im Dunkeln bei 37 Grad Celsius. Anschließend werden 10 Mikroliter wst, ein Reagenz pro 100 Mikroliter Medium drei Stunden nach Zugabe des wst ein Reagenz zugegeben, die Absorption der einzelnen Wells bei 415 Nanometern gemessen.Berechnen Sie abschließend die Anzahl der überlebenden Zellen zusätzlich zum WST one Assay. Die direkte Zählung der Zellen ist eine zweite Methode zur Messung der Zelltoxizität. Um den Prozentsatz lebensfähiger Zellen zu berechnen, säen Sie zwei mal 10 bis vierte Zellen pro Vertiefung in 2 24-Well-Platten aus und lassen Sie sie über Nacht anhaften.Am nächsten Tag inkubieren Sie die Zellen fünf Stunden lang im Dunkeln mit M-T-H-P-C und beleuchten Sie sie wie gerade gezeigt. Halten Sie dunkle Kontrollzellen nach 24 Stunden im Dunkeln, sammeln Sie den Überstand, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und Trypsin-Augen, schleudern Sie die Zellen schließlich herunter und resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern frischem Medium zur Zählung. Die in dieser Grafik dargestellten Ergebnisse zeigen im oberen Feld die zeitabhängige Aufnahme von M-T-H-P-C mit einer Fluoreszenzintensität der Zellsuspension, die den intrazellulären Niveaus des M-T-H-P-C entspricht.Im unteren Bereich. Die dosisabhängige M-T-H-P-C-Aufnahme kann durch Messung der Fluoreszenz von M-T-H-P-C mit einem Fluoreszenzspektrophotometer bestimmt werden. Dieses Diagramm veranschaulicht die Aufnahme einer festen Konzentration von M-T-H-P-C in einer zeitabhängigen Weise, wobei die Fluoreszenzintensität der Zellsuspension die intrazellulären Spiegel des M-T-H-P-C darstellt.In dieser Grafik wird die dosisabhängige M-T-H-P-C-Aufnahme in Haass- und 143 B-Zellen nach einer fünfstündigen Inkubation gezeigt. Die Aufnahme in der hochmetastasierten Zelllinie 143 B war signifikant höher als in der niedrig metastasierten elterlichen Wirtszelllinie. Die dosisabhängige Dunkeltoxizität der Osteosarkomzellen wird nachgewiesen.143 B-Zellen wurden mit unterschiedlichen M-T-H-P-C-Dosierungen behandelt und mit unbehandelten Zellen verglichen, und es wurde eine dosisabhängige Abnahme der Stoffwechselaktivität und der Zellzahl, gemessen mit einem Assay, beobachtet. Eine verminderte Zellviabilität wurde bei einer M-T-H-P-C-Konzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter und mehr festgestellt. In der unteren Grafik ist die dosisabhängige Toxizität von M-T-H-P-C dargestellt.Die Zellen wurden mit unterschiedlichen M-T-H-P-C-Dosen und anschließender Beleuchtung bei fünf Joule pro Quadratzentimeter behandelt. Es wurde eine daraus resultierende Abnahme der metabolischen Aktivität der Zellen sowie eine Abnahme der Zellzahl beobachtet. Die Entwicklung dieser Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Krebsbiologie den Weg, diese Methoden auf In-vivo-Modelle des Osteosarkoms sowie für andere präklinische Untersuchungen anzuwenden.

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Medizin

Photodynamische Therapie (PDT) ist eine nicht-invasive und nicht-chirurgische Methode zur Behandlung von Lungenkrebs. Photosensibilisatoren reichern sich selektiv im Tumorgewebe an und führen in Gegenwart von Sauerstoff und der richtigen Wellenlänge des Lichts zum Absterben von Tumorzellen. In diesem Protokollvideo wird eine PDT-basierte Methode verwendet, um das phototoxische Potenzial eines potenziellen Photosensibilisators in Lungenkrebszellen zu bewerten.

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Photodynamische Therapie (PDT) ist eine nicht-invasive und nicht-chirurgische Methode zur Behandlung von Lungenkrebs. Photosensibilisatoren reichern sich selektiv im Tumorgewebe an und führen in Gegenwart von Sauerstoff und der richtigen Wellenlänge des Lichts zum Absterben von Tumorzellen. Dieses Video beschreibt die in vivo Anti-Tumor-Wirksamkeitsanalyse mit Hilfe von Photosensibilisatoren, die Nanopartikel enthalten, in einer tumortragenden Maus, um das phototoxische Potenzial des...

In vivo Antitumor-Wirksamkeitsanalyse der PDT: Eine Technik zur Bestimmung des phototoxischen Potenzials eines Photosensibilisators bei tumortragenden Mäusen

Hier wird die Echtzeitüberwachung des Tumorzellstoffwechsels, kombiniert mit einem in vivo Modell der Chorio-Allantoismembran (CAM) der Metastasierung von Hühnerembryonen, verwendet, um neuartige Anti-Krebs-Ziele/Wirkstoffe auf ihre Fähigkeit hin zu bewerten, Tumorzellen für DNA-schädigende Chemotherapeutika zu sensibilisieren.

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Photodynamische Therapie (PDT) ist eine alternative Wahl zur Behandlung von Lungenkrebs. Um die therapeutische Wirkung der PDT zu erhöhen, wurden Nanopartikel entwickelt, die auf Lungenkrebs abzielen und mit einer Chemotherapie kombiniert werden. Sowohl in vitro als auch in vivo wurde die Wirksamkeit der PDT mit präparierten Nanopartikeln gegen Krebs untersucht.

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Photodynamische Therapie (PDT) ist ein medizinisches Verfahren, Inkubation von einer exogen angewandte Photosensitizer (PS) gefolgt von sichtbaren Licht photoaktivierungen Apoptose induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine in-vitro- PDT-Protokoll PDT zu simulieren, die verwendet werden, um Unterschiede in PS Inkubation und Lichtbehandlung Parameter untersuchen soll.

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Hier beschreiben wir ein neuartiges, einfaches und kostengünstiges Gerät zur erfolgreichen Durchführung von In-vitro-Tests der photodynamischen Therapie (PDT) unter Verwendung zweidimensionaler HeLa-Zellkultur und Verteporfin als Photosensibilisator.

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Dieses Protokoll stellt eine Reihe von Experimenten vor, die für die Evaluierung von photoschaltbaren Antikrebspeptiden verwendet wurden, die für das präklinische Screening solcher Verbindungen verwendet werden können. Dazu gehören die Bewertung der Zytotoxizität in 2D- und 3D-Zellkulturen, die Bewertung der Ex-vivo-Photoisomerisierungseffizienz (Modellgewebe) und der In-vivo-Wirksamkeit.

In-vitro - und In-vivo-Evaluierung photokontrollierter biologisch aktiver Substanzen - potenzielle Wirkstoffkandidaten für die Krebspharmakologie

Das vorliegende Protokoll beschreibt das Verfahren zur Etablierung eines patientenabgeleiteten Xenotransplantat-Mausmodells (PDX) unter Verwendung von humanem Osteosarkomgewebe.

Etablierung eines patienteneigenen Xenotransplantat-Mausmodells mit humanem Osteosarkomgewebe

Erfahren Sie die zytotoxische Wirksamkeit der photodynamischen Therapie in Osteosarkomzellen. Diese Methode nutzt den Photosensibilisator M-T-H-P-C und Laserlicht zur Erzeugung zytotoxischer Sauerstoffradikale.

Zytotoxische Wirksamkeit von Photodynamische Therapie in Osteosarkomzellen

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