Name: Ein cGMP-Verfahren zur Erweiterung anwendbar Aggregate von humanen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen oder fetalen Hirngewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Lernen Sie ein mechanisches Zerkleinerungsverfahren zur Expansion humaner neuraler Stamm- und Vorläuferzellen unter Erhaltung der Zell-Zell-Kontakte. Diese Methode ermöglicht stabiles Wachstum über 40 Passagen hinweg.

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Wir danken Dr. Soshana Svendsen für kritische Überprüfung und Bearbeitung des vorliegenden Berichts. Diese Arbeit wurde durch das NIH / NINDS 1U24NS078370-01 und CIRM DR2A-05320 zu beigetragen.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

<img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig6highres.jpg" width="500" /> Abbildung 6. Chopping Schema. Erweiterung Sphäroid Stammzellen / Vorläuferzellen in Kultur mit Hilfe der mechanischen Hackmethode. Kritische Schritte Eine Übersicht des Hackexpansions Paradigma ist in Fig. 6 gezeigt. HNPC Kugelgröße ist einer der wichtigen Kriterien, die bei Passage...

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Brandon C. Shelley 
to:
Clive Svendsen

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Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Es gibt eine lange Geschichte der Erweiterung Nagetier neuralen Stammzellen in Kultur entweder als Monoschicht oder allgemeiner Neurosphären 1-3 4-7. Zusätzlich wurden menschliche neurale Vorläuferzellen (hNPCs) aus verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems zu entwickeln 8-17 isoliert in vitro expandiert wurden. Diese Zellen sind bi-potent, und zur Differenzierung zu beiden Astrozyten und Neuronen und haben ein sehr nützliches Werkzeug bei der Untersuchung der neuralen Entwicklung 18,19 und 20,21 Krankheitsmechanismus. hNPCs sind auch in vielen verschiedenen Tiermodellen der Krankheit des zentralen Nervensystems mit unterschiedlichen Stufen der Integration, das Überleben und die funktionalen Wirkungen 22-24 verpflanzt worden. Oft epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und / oder Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2) 25-28 - - und beide haft 29 und drei Traditionell Nagetier oder menschliche fötale NSC an Wachstumsfaktoren ausgesetztSphäroid-dimensionalen Systemen werden typischerweise unter Verwendung der enzymatischen Spaltung in eine Einzelzellsuspension 30-34 agiert. Die Standard-Methode, um Zellen für die Forschung oder die klinische Anwendung zu erweitern ist als Anhänger Monoschicht durch einfache Manipulation. Wir haben jedoch gezeigt, dass die Passage Mono und Neurosphäre hNPCs mit enzymatische oder chemische Lösungen, führte im frühen Seneszenz 35. Darüber hinaus kann die enzymatische Spaltung bei erhöhten Differenzierung und karyotypischen Anomalien anhand von Daten mit embryonalen Stammzellen 36-38 gezeigt, führen. Obwohl die Standardmethode der Passage hat hNPCs aktuellen guten Herstellungspraxis (cGMP) hochwertige Produkte, die in Phase 1 der klinischen Studien (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.) gegangen produziert, erlaubt die Methode nur ein paar Runden Zellamplifikation, die Begrenzung der Bank Potenzial. Natürlich könnte große Forschungsexperimente und zukünftigen klinischen Studien von der Möglichkeit profitierenpropagieren Zellen in der Masse und mit verzögerter Seneszenz zu großen Wachstums-und Zellbanken zu ermöglichen. Um diesem Bedarf zu begegnen, haben wir ein neues und automatisierten Weise mechanisch Passage intakter Neurosphären durch &quot;Zerhacken&quot; sie in kleinen Clustern auf Zell-Zell-Kontakt. Dieses Verfahren stark erhöht deren Lebensdauer 39 und Suspensionskultur ermöglicht eine effizientere Nutzung der Inkubator Platz im Vergleich zu Monolayer-Kulturen, wie bei einem alternativen 3D-Bioreaktor-Kultur-Methode 40 gesehen. Die zur Verfügung gestellten Hack-Protokoll ermöglicht die Produktion von großen Banken von einem fetalen Probe größer als Durchgang 10, eine unwahrscheinliche Leistung mit Standard-Methoden Passagieren. Während diese Methode für das Passagieren hNPCs ist unkonventionell, wird er immer beliebter, und wurde vor kurzem mit anderen Zelltypen wie neuronale Stammzellen aus menschlichen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen, so dass groß angelegte Erweiterung für verschiedene Anwendungen, einschließlich in v veröffentlichtitro Krankheit Modellierung 41-46. Wichtig ist, dass ein cGMP-grade hNPC Zellbank bereits mit dem Schneideverfahren hergestellt wurde, zeigt, dass die Technik zur zukünftigen klinischen Anwendungen verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Becherglas, 50 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-100-50</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Bio-Sicherheitswerkbank, Klasse II</td><td>Baker</td><td>SG-603A</td><td>4 Fuß oder 6 Fuß Modell.&nbsp; 6 Fuß Modell empfohlen; mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Klingen, Doppelschneidig Prep</td><td>Personna</td><td>74-0002</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten.&nbsp; ACHTUNG: Sharp</td></tr><tr><td>Cell Freezing Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6295-50ML</td><td>DMSO, serumfreie</td></tr><tr><td>Zentrifuge, Schwenkeimer mit 15 ml Einsätzen</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Konische Röhrchen, 15 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>S50712</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Konische Röhrchen, 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352074</td><td>mehrere Hersteller/ Lieferanten</td></tr><tr><td>Controlled Rate Freezer</td><td>Planer</td><td>Kryo 750</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Kryofläschchen, 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Kulturflasche, belüftet, T12.5</td><td>BD Falcon</td><td>353107</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Kulturflasche, belüftet, T25</td><td>BD Falcon</td><td>353081</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Kulturflasche, belüftet, T175</td><td>BD Falcon</td><td>353045</td><td>mehreren Herstellern/Lieferanten</td></tr><tr><td>Kulturflasche, belüftet, T75&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353110</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Filter, 0,22 & Mikro; m, angebauter Becher, 1 L</td><td>Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td>verschiedenen Herstellern/Lieferanten</td></tr><tr><td>Filter, 0,22 & micro; m, Aufsatzbecher, 150 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGVU01RE</td><td>verschiedenen Herstellern/Lieferanten</td></tr><tr><td>Filter, 0,22 & Mikro; m, Aufsatzbecher, 500 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>diverse Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Filter, 0,22 & Mikro; m, beigefügter Becher, 50 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>diverse Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Filterpapier, 8,5 cm Kreise</td><td>Whatman/GE</td><td>1001-085</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette, Standardmuster - gezahnt/gebogen/18 cm</td><td>Fine Science</td> Tools <td>11001-18</td><td></td></tr><tr><td>Gefrierkammer, Isopropylalkohol</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>"Mr. Frosty"</td></tr><tr><td>Inkubator, 37 > C/5% CO2</td><td>Forma</td><td>370 Serie</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Hemazytometer, Phase</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Lafayette Instruments</td><td>TC752-PD&</td><td>nbsp; Modifikation der Petrischale erforderlich. &nbsp; VORSICHT:&nbsp; Bewegliche, scharfe Klinge.</td></tr><tr><td>Mikropipette, 1-10 &mu; l</td><td>Gilson</td><td>F144562</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Mikropipettor, 100-1.000 &mu; l (Starterkit)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Mikropipettor, 2-20 &mu; l (Starterkit)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Mikropipettor, 20-200 &mu; l (Starterkit)</td><td>Gilson</td><td>F167700</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Steckschlüssel, autoklavierbar, 5/16"</td><td>Steritool</td><td>10302</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten, mit Baumwollstecker</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-8B</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Petrischale, Glas, autoklavierbar</td><td>Corning</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipettierhilfe</td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Unterlegscheibe</td><td>McMaster-Carr</td><td>VARIABLE</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit Sterilbarriere, 10 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV10R-H</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit Sterilbarriere, 1.000 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV1000</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit Sterilbarriere, 20 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV20-H</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Sterilbarriere Pipettenspitzen, 200 &mu; l</td><td>AvantGuard</td><td>AV200-H</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Sterile Einwegpipetten, Vollkunststofffolie, 10 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10J</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Sterile Einwegpipetten, Vollkunststofffolie, 2 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-675-3C</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Sterile Einwegpipetten, Vollkunststofffolie, 25 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10K</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Sterile Einwegpipetten, Vollkunststofffolie, 5 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-676-10H</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Sterilisationsbeutel, 19 x 33 cm</td><td>Crosstex</td><td>SCL</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Sieb, 40 & micro; m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturschalen, 60 mm</td><td>BD Falcon 351007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Röhrchengestelle, ineinandergreifende Vierwege</td><td>Fisherbrand</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Fisherbrand</td><td>S52602Q</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Neuronale Vorläuferzellen Zellspezifische Verarbeitungsreagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neuronale Stammzelle Expansion Medium (Stemline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3194-500ML</td><td>Wichtig für die Verwendung der Marke Stemline</td></tr><tr><td>Rekombinanter humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF)</td><td>Millipore</td><td>GF316</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Rekombinanter humaner Leukämie-Hemmfaktor (LIF)</td><td>Millipore</td><td>LIF1010</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>Trypan Blue (0,4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td>mehrere Hersteller/Lieferanten</td></tr><tr><td>TrypLE Select (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12563-011</td><td></td></tr></tbody></table>

ein cgmp-verfahren zur erweiterung anwendbar aggregate von humanen neuralen stamm-und vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten stammzellen oder fetalen hirngewebe

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

Ein Zellexpansion Technik, um eine große Zahl von Zellen, die aus einer einzelnen Probe für Forschungsexperimente und klinische Studien sammeln würde die Stammzell Gemeinschaft profitieren. Viele aktuelle Erweiterung Methoden sind aufwendig und teuer, und solche, die vollständige Dissoziation kann dazu führen, mehrere Stamm-und Vorläuferzelltypen, die Differenzierung oder frühen Seneszenz. Um diese Probleme zu überwinden, haben wir einen automatisierten mechanischen Passagieren Verfahren als &quot;Hacken&quot;, das einfach und kostengünstig ist bezeichnet entwickelt. Diese Technik vermeidet chemische oder enzymatische Dissoziation in Einzelzellen und ermöglicht die großflächige Erweiterung des suspendiert, Sphäroid-Kulturen, die konstant Zell / Zell-Kontakt zu halten, statt. Die Schneideverfahren hat sich vor allem für fötale Gehirn-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen oder Neurosphären verwendet wurden, und wurde kürzlich für die Verwendung mit neuronalen Stammzellen aus embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen veröffentlicht. Das Verfahren involves Aussaat Neurosphären auf einer Gewebekultur Petrischale und anschließend vorbei einen scharfen, sterilen Messer durch die Zellen effektiv die Automatisierung der mühsame Prozess der manuell mechanisch distanziert jede Kugel. Suspendieren der Zellen in der Kultur ein günstiges Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis; wie mehr als 500.000 Zellen können in einer einzelnen Neuro von weniger als 0,5 mm im Durchmesser wachsen. In einem Kolben T175 kann über 50 Millionen Zellen in Suspensionskulturen wachsen im Vergleich zu nur 15 Millionen in adhärenten Kulturen. Wichtig ist, dass das Hackverfahren gemäß der aktuellen guten Herstellungspraxis (cGMP) eingesetzt, wodurch Massenmenge Produktion von klinischem Zellprodukte.

<img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51219/51219fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. Repräsentative Daten. A) Projizierte Zellzahlen von hNPCs an p19 eingefroren, aufgetaut und dann als Anhänger Monolayer mit enzymatischen Dissoziation im Vergleich zu Neurosphären über den Hack Verfahren agiert erweitert. Tag 0 stellt, wenn die Zellen aufgetaut p20 bei B.) Repräsentative Bilder von Kugeln vor, hacken, 10X. <s...

Dieses Protokoll beschreibt einen neuartigen mechanischen Schneideverfahren, das die Erweiterung der sphärischen neuralen Stamm-und Vorläuferzellaggregate ohne Dissoziation zu einer Einzelzellsuspension ermöglicht. Die Aufrechterhaltung Zell / Zell-Kontakt ermöglicht eine schnelle und stabile Wachstum seit über 40 Passagen.

Ein cGMP-Verfahren zur Erweiterung anwendbar Aggregate von humanen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen oder fetalen Hirngewebe

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Neurosphären effizient weiterzupassagieren, sodass während der gesamten Lebensdauer der kultivierten Zellen der Zell-zu-Zell-Kontakt erhalten bleibt. Diese Technik schafft die Expansionsbedingungen, die für humane neurale Vorläuferzellen erforderlich sind. Dies wird erreicht, indem bis zu zwei T175-Flaschen mit denselben Zellen kombiniert und in ein kegelförmiges Reagenzglas überführt werden, wodurch in einem zweiten Schritt die Übertragung der Sphären in eine Petrischale ermöglicht wird. Dadurch werden die suspendierten Neurosphären in der Petrischale zu einer überschaubaren Masse zusammengefasst, was es ermöglicht, die hNPCs mit einem Messer in kleine Zellverbände zu zerschneiden.Anschließend werden die passagierten oder zerkleinerten Neurosphären resuspendiert, um die Zellen aus der Petrischale zu lösen und in die neuen Kolben zu überführen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zerkleinerungstechnik eine langfristige Wachstumsstrategie darstellt, basierend auf Expansionskurven, die im Vergleich zu Zellen, die mittels der standardmäßigen enzymatischen Methode passagiert wurden, langfristige logarithmische Wachstumsrat

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Die Fähigkeit, menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) in vitro zu manipulieren, um ihre Eignung als Zelltransplantaten für therapeutische Zwecke zu untersuchen und für die menschliche Entwicklung des Nervensystems zu erforschen. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Kultivierung und Passagierung hNSPCs in der Hoffnung, steigende Reproduzierbarkeit der Forschung mit menschlichen Stammzellen.

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Protokolle für die neuronale Differenzierung von pluripotenten menschlichen Stammzellen (hPSCs) sind oft zeitaufwendig und erfordern erhebliche Zellkultur Fähigkeiten. Hier haben wir ein kleines Molekül-basierte Differenzierung Verfahren zu einem multititre Plattenformat angepasst, die eine einfache, schnelle und effiziente Erzeugung von menschlichen Nervenzellen in einer kontrollierten Art und Weise.

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