Ein cGMP-Verfahren zur Erweiterung anwendbar Aggregate von humanen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen oder fetalen Hirngewebe

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Neurosphären effizient weiterzupassagieren, sodass während der gesamten Lebensdauer der kultivierten Zellen der Zell-zu-Zell-Kontakt erhalten bleibt. Diese Technik schafft die Expansionsbedingungen, die für humane neurale Vorläuferzellen erforderlich sind. Dies wird erreicht, indem bis zu zwei T175-Flaschen mit denselben Zellen kombiniert und in ein kegelförmiges Reagenzglas überführt werden, wodurch in einem zweiten Schritt die Übertragung der Sphären in eine Petrischale ermöglicht wird. Dadurch werden die suspendierten Neurosphären in der Petrischale zu einer überschaubaren Masse zusammengefasst, was es ermöglicht, die hNPCs mit einem Messer in kleine Zellverbände zu zerschneiden.

Anschließend werden die passagierten oder zerkleinerten Neurosphären resuspendiert, um die Zellen aus der Petrischale zu lösen und in die neuen Kolben zu überführen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zerkleinerungstechnik eine langfristige Wachstumsstrategie darstellt, basierend auf Expansionskurven, die im Vergleich zu Zellen, die mittels der standardmäßigen enzymatischen Methode passagiert wurden, langfristige logarithmische Wachstumsraten aufweisen. Die visuelle Darstellung dieser Technik ist entscheidend als eine Sphäre.

Kondensationsschritte sind schriftlich schwer zu beschreiben. Es gibt jedoch mehrere Tricks, die den Prozess erleichtern. Wenn überschüssiges Medium nicht vollständig aus der Petrischale entfernt wird, werden die Sphäroide im Medium lediglich verschoben, anstatt in kleinere Cluster aufgeteilt zu werden.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Beurteilung der Farbe des Kulturmediums im Kolben mit H NPCs. Untersuchen Sie den Kolben unter dem Mikroskop, um die Zellen zu beobachten. Falls möglich, verwenden Sie einen Zirkel, um die Größe mehrerer Zellkugeln zu messen.

Wenn viele Sphäroide einen Durchmesser von 300 Mikrometern oder größer aufweisen, fahren Sie mit dem Zerkleinerungsprozess fort und zerkleinern die Zellen alle sieben bis zehn Tage. Danach stellen Sie das Kolben wieder in den Inkubator und richten Sie den Zerkleinerer ein. Schalten Sie den Netzschalter des Zerkleinerers ein.

Stellen Sie im BSC die Schnittdicke auf 200 Mikrometer und die Messerkraft auf 180 Grad oder auf die Position neun Uhr ein. Danach vergewissern Sie sich, dass der automatische Geschwindigkeitsregler so weit wie möglich entgegen dem Uhrzeigersinn gedreht ist. Bewegen Sie anschließend den Tischentriegelungsknopf so weit wie möglich nach rechts und vergewissern Sie sich, dass der Plattenhalter stabil steht.

Drehen Sie den manuellen Arm-Manipulator im Uhrzeigersinn, um den Arm auf die maximale Höhe zu heben. Danach übertragen Sie aseptisch eine sterile beidseitig geschliffene Hackklinge auf den Schraubbolzen des Hackarms. Platzieren Sie mithilfe einer Pinzette die Verriegelung über der Klinge.

Der gebogene Teil der Klammer muss über der oberen Kante des Arms liegen. Halten Sie danach die Klammer am Arm fest und befestigen Sie die Mutter an dem Bolzen. Mit dem sterilen Schraubendreher die Mutter um eine Viertelumdrehung locker lassen.

Übertragen Sie bei diesem Verfahren die empfohlene Menge an Erhaltungsmedium in die neue Flasche. Danach überführen Sie die Zellen aseptisch vom Inkubator in den Sicherheitswerkbank. Stellen Sie die Flasche schräg in ein Reagenzglasgestell und lassen Sie die Sphären in der Flasche absetzen.

Eine Kolonie. Aspirieren Sie bis zu 12 Milliliter Überstand. Spülen Sie mit einer 10-Milliliter-Serologischen Pipette alle locker anhaftenden Sphären von der Oberfläche des Kolbens ab.

Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf und lassen Sie die Sphären zwischen den Zentrifugierungen absetzen. Übertragen Sie anschließend das empfohlene Volumen des konditionierten Mediums in die neue Flasche. Danach überführen Sie das gesamte verbleibende konditionierte Medium zusammen mit den Sphären in ein neues 15-Milliliter-Konischgefäß.

Lassen Sie die Kugeln absetzen und entsorgen Sie das verwendete Kolbengefäß. Danach überführen Sie die Zellen langsam aus dem 15-Milliliter-Konikalröhrchen in die 60-Millimeter-Petri-Schale oder auf die Scheibenform mit dem geringstmöglichen Volumen. Bewahren Sie das restliche konditionierte Medium auf, da es später zum Spülen der Zellen von der Schale nach dem Zerkleinern verwendet wird.

Versuchen Sie, die von dem Medium und den Sphären bedeckte Fläche in der Petrischale zu minimieren. Danach beginnen Sie damit, den Sphären-Pool zusammenzukonzentrieren, indem Sie das Überstandmedium zurück in das 15-Milliliter-Konischglas überführen. Entfernen Sie so viel Medium wie möglich von der Oberfläche des Zellpools mit einer Mikropipette, die mit einer Aerosol-Barriere ausgestattet ist.

Solange es nicht möglich ist, das Medium ohne die Sphären zu entfernen, verteilen Sie den Pool gleichmäßig. Nutzen Sie die Seite der Pipettenspitze, um die Oberfläche zu vergrößern, kippen Sie die Petrischale leicht und schieben Sie mit der Seite der Pipettenspitze vorsichtig alle Sphären an eine Seite des Mediums. Nachdem alle Zellen umpositioniert wurden, kippen Sie die Petrischale langsam in die entgegengesetzte Richtung, um eine Trennung des Mediums von den Sphären zu ermöglichen.

Anschließend das geklärte Medium wieder in den 15-Milliliter-Konustropfen überführen. Mit der Seite der Pipettenspitze alle Sphären vorsichtig zurück in die Mitte der Petrischale schieben, sodass die Flüssigkeit einen Durchmesser von 0,5 bis 2,4 Zentimetern hat.

Es ist wichtig, die Tiefe des Sphären-Pools gering zu halten. Wenn der Pool zu tief ist, werden die Sphären beim Zerkleinern zur Seite gedrückt. Übertragen Sie nun die Petrischale auf den Plattenhalter und befestigen Sie sie unter den Halterungsclips des Plattenhalters.

Verwenden Sie den Tisch-Freigabeknopf, um den Plattenhalter nach links zu schieben, sodass die Klinge frei über den Kugeln ist und im Zahnrad eingerastet ist. Senken Sie anschließend den Schneidearm, indem Sie den manuellen Bedienungsknopf im Uhrzeigersinn drehen, bis die Klinge flach auf die Petrischale einschnappt. Drücken Sie auf die Armhalterung, während Sie die Mutter festziehen.

Drücken Sie dann die Reset-Taste. Stabilisieren Sie die Petrischale mit einer Hand, während Sie den Knopf des automatischen Arm-Manipulators im Uhrzeigersinn in die Position von 90 Grad oder 12 Uhr drehen, und beginnen Sie mit dem Zerkleinern, sobald alle Sphären zerkleinert wurden. Drehen Sie den Plattenhalter um 90 Grad.

Lösen Sie dann die Schraube, senken Sie den Arm ab und ziehen Sie die Mutter erneut fest. Wiederholen Sie den Zerkleinerungsvorgang. Danach übertragen Sie die Petrischale aseptisch vom Plattenträger auf einen Arbeitsbereich im Sicherheitswerkbank (BSC).

Ein Milliliter des konditionierten Mediums auf die zerkleinerten Sphären überführen. Anschließend die zerkleinerten Sphären vorsichtig resuspendieren und in ein neues kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen übertragen. Dabei versuchen, die Bildung von Blasen zu vermeiden, und den Vorgang so oft wie nötig wiederholen, um alle zerkleinerten Sphären zu sammeln.

Messen Sie das Volumen der konditionierten Medien und der zerkleinerten Sphäroide. Geben Sie die entsprechende Menge an Erhaltungsmedium hinzu, um das in Spalte E der Tabelle zwei angegebene Volumen zu erreichen. Danach überführen Sie die Sphäroid-Suspension in jedes neue Kolbenfläschchen, wobei Sie die Sphäroid-Suspension jeweils nur in ein Fläschchen übertragen und die Sphäroide zwischen den Übertragungen erneut suspendieren. Das Endvolumen in jedem Fläschchen sollte dem in Spalte F der Tabelle zwei angegebenen Volumen entsprechen. Stellen Sie die zerkleinerten h NPCs in den Inkubator.

Diese Abbildung zeigt die projizierten Zellzahlen von H-NPCs, die im 19. Durchgang eingefroren, anschließend aufgetaut und als adhärente Monoschicht mittels enzymatischer Dissoziation expandiert wurden, verglichen mit Neurophären, die über die Schnittmethode weitergezüchtet wurden. Hier sind repräsentative Bilder von vor und nach dem Zerhacken von Sphären bei 10-facher Vergrößerung dargestellt. Dieses Bild zeigt aufgetaute H-NPCs des 29. Passagen, die einen Tag lang kultiviert und auf Nestin-Expression gefärbt wurden, während dieses Bild die aufgetauten H-NPCs des 29. Passagen zeigt, die sieben Tage lang ohne Wachstumsfaktoren kultiviert und auf GFAP sowie Beta-III-Tubulin gefärbt wurden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die automatisierte Zerkleinerungstechnik verwendet wird, um HBCs zu passagieren, wobei der Zell-Zell-Kontakt während der gesamten Lebensdauer der Zellen und der Kultur erhalten bleibt. Dieses Verfahren kann an eine Vielzahl von Zelltypen angepasst werden, beispielsweise an neurogene Stammzellen, die aus pluripotenten Zellen stammen, oder an Cardio-Sphären.