Ein cGMP-Verfahren zur Erweiterung anwendbar Aggregate von humanen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen oder fetalen Hirngewebe

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Neurosphären effizient zu passagen, so dass der Zell-zu-Zell-Kontakt während der gesamten Lebensdauer der kultivierten Zellen aufrechterhalten wird. Diese Technik schafft Expansionsbedingungen, die für menschliche neurale Vorläuferzellen erforderlich sind. Dies wird erreicht, indem bis zu zwei T 1 75-Kolben derselben Zellen kombiniert und in ein konisches Röhrchen überführt werden, was die Übertragung der Kugeln in eine Petrischale als zweiten Schritt ermöglicht, die zu suspendierten Neurosphären zu einer handhabbaren Masse auf der Petrischale kondensiert werden, was es der Klinge ermöglicht, die H-NPCs in kleine Cluster zu schneiden.

Als nächstes werden die passageierten oder gehackten Neurosphären resuspendiert, um die Zellen aus der Petrischale zu entfernen und in die neuen Kolben zu geben. Es werden Ergebnisse erzielt, die zeigen, dass die Chopping-Technik eine langfristige Wachstumsstrategie bietet, die auf den Expansionskurven basiert, die langfristige logarithmische Wachstumsraten im Vergleich zu Zellen zeigen, die über den standardmäßigen enzymatischen Ansatz passageiert wurden. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist als Kugel von entscheidender Bedeutung.

Kondensationsschritte lassen sich nur schwer schriftlich beschreiben. Es gibt auch einige Tricks, die dabei helfen. Wenn überschüssiges Medium nicht vollständig aus der Petrischale entfernt wird, werden die Kugeln einfach in den Medien herumgeschoben, anstatt in kleinere Cluster aufgeteilt zu werden.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Medienfarbe des Kolbens von H-NPCs ansprechen. Scannen Sie den Kolben unter einem Mikroskop, um die Zellen zu beobachten. Wenn möglich, verwenden Sie ein Radikal, um die Größe mehrerer Kugeln zu untersuchen.

Wenn viele Kugeln einen Durchmesser von 300 Mikrometern oder mehr haben, fahren Sie mit dem Zerkleinerungsprozess fort und hacken Sie die Zellen alle sieben bis 10 Tage. Setzen Sie dann den Kolben wieder in den Inkubator ein und stellen Sie den Zerkleinerer auf. Schalten Sie den Netzschalter des Hubschraubers ein.

Stellen Sie in der BSC die Schnittdicke auf 200 Mikrometer und die Messerkraft auf 180 Grad oder die Neun-Uhr-Position ein. Vergewissern Sie sich anschließend, dass der automatische Geschwindigkeitsregler so weit wie möglich gegen den Uhrzeigersinn gedreht ist. Bewegen Sie dann den Entriegelungsknopf des Tisches so weit wie möglich nach rechts und vergewissern Sie sich, dass der Plattenhalter stabil ist.

Drehen Sie den manuellen Armmanipulator im Uhrzeigersinn, um den Arm auf die maximale Höhe anzuheben. Übertragen Sie danach ein steriles zweischneidiges Hackmesser aseptisch auf die Schraube des Häckslerarms. Lege den Verschluss mit einer Pinzette mit der Pinzette über die Klinge.

Der gebogene Teil des Verschlusses muss sich über der Oberkante des Armes befinden. Halten Sie dann den Verschluss am Arm fest und befestigen Sie die Mutter an der Schraube. Lassen Sie die Mutter mit dem sterilen Steckschlüssel eine Vierteldrehung locker.

Bei diesem Verfahren wird die vorgeschlagene Menge an Wartungsmedien in den neuen Kolben übertragen. Danach werden die Zellen aseptisch aus dem Inkubator in den BSC überführt. Lehnen Sie den Kolben auf ein Röhrchengestell und lassen Sie die Kugeln im Kolben absetzen.

Man hat sich geeinigt. Aspiriert bis zu 12 Milliliter Überstand. Spülen Sie mit einer serologischen 10-Liter-Pipette alle lose anhaftenden Kügelchen von der Oberfläche des Kolbens ab.

Wiederholen Sie dies bei Bedarf und lassen Sie die Kugeln zwischen den Rens absetzen. Anschließend wird das vorgeschlagene Volumen des konditionierten Mediums in den neuen Kolben übertragen. Übertragen Sie dann alle restlichen konditionierten Medien und Kugeln in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Lassen Sie die Kugeln sich absetzen und entsorgen Sie den gebrauchten Kolben. Danach übertragen Sie die Zellen langsam aus dem konischen 15-Milliliter-Röhrchen auf die 60-Millimeter-Petrischale oder -scheibe im geringstmöglichen Volumen. Bewahren Sie das restliche konditionierte Medium auf, da es nach dem Zerkleinern zum Spülen der Zellen aus der Schüssel verwendet wird.

Versuchen Sie, die Oberfläche, die von den Medien und Kugeln auf der Schale bedeckt wird, zu minimieren. Beginnen Sie als Nächstes mit der Kondensation des Kugelpools, indem Sie das Super Natin zurück in das konische 15-Milliliter-Röhrchen übertragen. Entfernen Sie so viel Medium wie möglich von der Oberseite des Medienzellenpools mit einer Mikropipette mit Aerosolbarriere.

Bis es nicht mehr möglich ist, Medien ohne Kugeln zu entfernen, dann breiten Sie das Becken aus. Verwenden Sie die Seite der Pipettenspitze, um die Oberfläche zu vergrößern, kippen Sie die Petrischale leicht und schieben Sie mit der Seite der Pipettenspitze alle Kugeln vorsichtig auf eine Seite des Beckens. Nachdem alle Zellen umgelagert wurden, kippen Sie die Petrischale langsam in die entgegengesetzte Richtung, damit sich das Medium von den Kugeln trennen kann.

Übertragen Sie anschließend das gereinigte Medium zurück in das konische 15-Milliliter-Röhrchen. Schieben Sie alle Kugeln vorsichtig mit der Seite der Pipettenspitze zurück in die Mitte der Petrischale. So hat der Pool einen Durchmesser von 0,5 bis 2,4 Zentimetern.

Es ist wichtig, die Tiefe des Sphärenpools gering zu halten. Ist das Becken zu tief, werden die Kugeln beim Hacken zur Seite geschoben. Übertragen Sie nun die Petrischale auf den Tellerhalter und befestigen Sie sie unter den Tellerhalterhaken.

Schieben Sie den Plattenhalter mit dem Entriegelungsknopf nach links, sodass die Klinge frei von den Kugeln ist und im Gang einrastet. Senken Sie dann den Häckslerarm ab, indem Sie den manuellen Manipulatorknopf im Uhrzeigersinn drehen, bis die Klinge flach auf der Petrischale einrastet. Drücken Sie die Armhalterung nach unten, während Sie die Mutter festziehen.

Drücken Sie dann die Reset-Taste. Halten Sie die Petrischale einmal mit einer Hand fest, während Sie den Knopf des automatischen Armmanipulators im Uhrzeigersinn in die 90-Grad- oder 12-Uhr-Position drehen, und beginnen Sie mit dem Hacken, wenn alle Kugeln gehackt wurden. Drehen Sie den Plattenhalter um 90 Grad.

Lösen Sie dann die Schraube, senken Sie den Arm ab und ziehen Sie die Mutter wieder fest. Wiederholen Sie den Hackvorgang. Übertragen Sie danach die Petrischale aseptisch aus dem Plattenhalter auf einen Arbeitsraum in der BSC.

Übertragen Sie einen Milliliter konditioniertes Medium auf die zerkleinerten Kugeln. Dann die gehackten Kugeln vorsichtig resuspendieren und in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen geben. Versuchen Sie, Blasenbildung zu vermeiden und wiederholen Sie den Vorgang so oft wie nötig, um die gehackten Kugeln aufzufangen.

Messen Sie das Volumen des konditionierten Mediums und der zerkleinerten Kugeln. Fügen Sie die entsprechende Menge an Erhaltungsmedien hinzu, um das in Tabelle zwei Spalte E empfohlene Volumen zu erreichen. Danach wird die Kugelaufhängung in jeden neuen Kolben mit Eloqua gefüllt, die Kugelaufhängung jeweils in einen Kolben übertragen und die Kugeln zwischen den Übertragungen wieder aufgehängt. Das endgültige Volumen in jedem Kolben sollte dem in Tabelle zwei Spalte F empfohlenen Volumen entsprechen.Lege die gehackten h NPCs in den Inkubator.

Diese Abbildung zeigt die projizierten Zellzahlen von H-NPCs, die bei Passage 19 eingefroren und dann aufgetaut und als adhärente Monoschicht mittels enzymatischer Dissoziation expandiert wurden, verglichen mit Neurosphären, die mit der Chopping-Methode passageiert wurden. Hier sind die repräsentativen Bilder von vorgehackten und nachgehackten Kugeln bei 10-facher Vergrößerung. Dieses Bild zeigt die NPCs der Auftaupassage 29 H, die einen Tag lang plattiert und für Nest und Expression gefärbt wurden, während dieses Bild die NPCs der Auftaupassage 29 H zeigt, die sieben Tage lang in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren plattiert und auf GFAP und Beta-3-Tubulin gefärbt wurden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die automatisierte Hacktechnik zur Passage von HBCs verwenden können, die den Zell-zu-Zell-Kontakt während der gesamten Lebensdauer der Zellen und der Kultur aufrechterhält. Dieses Verfahren kann an eine Vielzahl von Zelltypen angepasst werden, wie z. B. Neurostammzellen, die aus pluripotenten Zellen gewonnen werden, oder Kardiosphären.