Name: Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T21:00:00.000+00:00
Duration: 24 min 2 s
Description: Erfahren Sie die ChroP-Methode zur Analyse lokusspezifischer Proteom-Landschaften von Chromatin mittels ChIP und Massenspektrometrie. Diese Technik ermöglicht die Charakterisierung funktional unterschiedlicher Chromatin-Domänen.

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Diese Arbeit wurde ursprünglich in Mol Cell Proteomics veröffentlicht. Soldi M. und T. Bonaldi Die Proteomik Untersuchung der Chromatin Funktions Domains enthüllt Novel Synergismen zwischen Distinct Heterochromatin-Komponenten MCP. 2013; 12: 64-80. © die amerikanische Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie. Wir danken Roberta Noberini (Italian Institute of Technology und IEO, Italien) für das kritische Lesen des Manuskripts. TB Arbeit wird durch Zuschüsse aus dem Giovanni Armenise Harvard-Stiftung Career Development Program, der italienischen Vereinigung für Krebsforschung und dem italienischen Gesundheitsministerium unterstützt. MS Arbeit wurde durch ein Stipendium FIRC unterstützt.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben kürzlich ChroP, eine quantitative Strategie für die großtechnische Charakterisierung der Proteinkomponenten von Chromatin. ChroP vereint zwei komplementäre Ansätze in der epigenetischen Bereich verwendet, Chip-und MS, profitieren von ihren Stärken und Überwindung ihrer jeweiligen Beschränkungen. ChIP tief Sequenzierung (ChIP-Seq) gekoppelt ermöglicht die genomweite Kartierung der Histon-Modifikationen bei der Auflösung von wenigen 35 Nukleosomen. Obwohl ihre Empfindlichkeit von Vorteil, sind Antikör...

Chromatin ist eine hoch dynamische Nukleoproteinkomplex, die als Vorlage für alle primären DNA-vermittelten Prozessen beteiligt ist. Das Nukleosom ist die Grundwiederholungseinheit des Chromatins und besteht aus einem proteinhaltigen oktameren Kern zwei Moleküle jeder kanonischen Histon H2A, H2B, H3 und H4, um die 147 bp DNA gewickelt 1,2 enthält. Alle Core-Histone sind als globuläre Domäne und eine flexible N-terminalen &quot;Schwanz&quot;, die außerhalb der Nukleosomen ragt strukturiert. Einer der Hauptmechanismen zur Regulierung Chromatin-Struktur und Dynamik auf kovalente post-translationale Modifikationen (PTM), die hauptsächlich auf den N-Termini von Histonen 3,4 auftreten basiert. Histon-Modifikationen kann entweder durch Änderung der Chromatinstruktur höherer Ordnung, indem die Kontakte zwischen Histon-DNA oder zwischen Nukleosomen, und steuert somit die Zugänglichkeit der DNA-bindenden Proteinen (cis-Mechanismen) funktionieren, oder als DockIn wirkendeng Stellen für regulatorische Proteine, entweder als Einzelgeräte oder in multimere Komplexe eingebettet. Wie regulierende Proteine ​​ihre Funktion in verschiedener Weise ausüben: durch Modulation direkt Genexpression (dh Proteine ​​TAF) oder durch Änderung der Nukleosomen Positionierung (dh Chromatin-Remodeling-Komplexe) oder durch Änderung anderer Histon-Reste (dh Proteine, die mit Methyl-oder Acetyl-Transferase Transferase-Aktivität) (trans-Mechanismen) 5. Die Beobachtung, dass unterschiedliche Muster PTM-Cluster zu bestimmten Chromatin Loci führte zur Ausarbeitung der Hypothese, dass verschiedene Modifikationen an bestimmten Stellen können Synergie, um einen molekularen Code der Vermittlung der Funktionszustand des zugrunde liegenden DNA zu erzeugen. Die &quot;Histon-Code-Hypothese&quot; hat großen Konsens in den Jahren gewonnen, aber seine experimentelle Überprüfung ist wieder durch technische Beschränkungen 6,7 statt. Massenspektrometrie (MS)-basierte Proteomik als ein hervorleistungsfähiges Werkzeug zur Histon-Modifikation Muster abzubilden und Chromatin-bindende Proteine ​​8 zu charakterisieren. MS detektiert eine Änderung als eine spezifische Δmass zwischen der experimentellen und theoretischen Masse eines Peptids. Auf der Ebene der einzelnen Histone, bietet MS eine unvoreingenommene und umfassende Methode zur Karte PTMs, so dass die Erkennung von neuen Modifikationen und aufschlussreiche Wechselspiel zwischen ihnen 9-14. In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Strategien entwickelt, um die proteomische Zusammensetzung von Chromatin zu sezieren, einschließlich der Charakterisierung von intakten mitotischen Chromosomen 15, die Identifizierung von löslichen HPTM-bindenden Proteinen 16-18 und die Isolierung und Analyse von spezifischen Chromatin-Bereiche (dh Telomere) 19,20. Allerdings ist die Ermittlung der Ortsspezifische Synergien zwischen Histon PTMs, Varianten und Chromatin-assoziierte Proteine ​​noch unvollständig. Hier beschreiben wir einen neuen Ansatz, mit dem Namen ChroP (Chro matin roteomics P) 21, die wir entwickelt haben, um effizient zu charakterisieren funktionell unterschiedlichen Chromatin-Domänen. Dieser Ansatz passt Chromatinimmunpräzipitation (Chip), eine gut etablierte Protokoll in der epigenetischen Forschung, für die effiziente MS-basierten Proteomanalyse der angereicherten Probe. Wir haben zwei verschiedene Protokolle entwickelt, abhängig von der Art des Chromatins als Eingabe und die Frage gerichtet MS verwendet wird; insbesondere: 1) ChIP von nicht fixierten nativen Chromatin mit MNase verdaut wird eingesetzt, um Mono-Nukleosomen zu reinigen und die Co-Zuordnung hPTMs (N-ChroP) sezieren; 2)-Chips aus vernetzten Chromatin durch Ultraschall fragmentiert wird in Kombination mit einem SILAC Basis Interactomics Strategie, um alle Co-Anreicherung Chromatin-Bindungsproteine ​​(X-ChroP) charakterisieren. Wir veranschaulichen hier die Kombination von N-und X-ChroP zur Anreicherung und Studieren Heterochromatin mit H3K9me3 als Köder für die Immunpräzipitation Schritte. Die Verwendung von ChroP verlängert werdenentweder verschiedene Regionen auf Chromatin, oder Änderungen in der Zusammensetzung des Chromatins innerhalb der gleichen Region während der Übergang zu einem anderen Funktionszustand zu untersuchen, um so den Weg für verschiedene Anwendungen in der Epigenetik.

<table><tbody><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>SILAC DMEM</td><td>M-Medical</td><td>FA30E15086</td><td></td></tr><tr><td>dialysiertes FBS</td><td>Invitrogen</td><td>26400-044</td><td></td></tr><tr><td>Lysin 0 (12C6 14N2 L-Lysin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8662</td><td></td></tr><tr><td>Arginin 0 (12C6 14N4 L-Arginin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6969</td><td></td></tr><tr><td>Lysin 8 (13C6 15N2 L-Lysin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68041</td><td></td></tr><tr><td>Arginin 10 (13C6 15N4 L-Arginin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokokken-Nuklease</td><td>Roche</td><td>10 107 921 001</td><td></td></tr><tr><td>Vollständige, EDTA-freie Proteasehemmer-Cocktailtabletten</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 3 Dialyseschlauch, 3,5K MWCO, 18 mm flache Breite, 50 Fuß Länge</td><td>Spectrumlabs</td><td>132720</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histon-H3-Trimethyl K9-ChIP-Qualität</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>Histon-H3-Peptid-Trimethyl K9&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab1773</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12%&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Bis-Tris Gel&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>Kolloidalblau-Färbekit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>LDS-Probenpuffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Formaldheyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Acetianhydrid-d6</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175641-1G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Iodacetamid > 99% (HPLC), kristallin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Modifiziertes Trypsin in Sequenzierqualität, gefroren 100 &mu; g (5 & mal; 20 &mu; g)</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>Nanospray OD 360&mu; m x ID 75&mu; m, Spitzen ID 8 &mu; m ungestrichen Pk 5</td><td>Microcolumn Srl</td><td>FS360-75-8-N-5-C15</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 & Mikro; M&nbsp; &nbsp; 15% C</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.aq.</td><td></td></tr><tr><td>Kohle-Extraktionsscheibe, 47 mm</td><td>Agilent Technologies</td><td>12145040</td><td></td></tr><tr><td>Kationen-Extraktionsscheibe</td><td>Agilent Technologies</td><td>66889-U</td><td></td></tr></tbody></table>

der ansatz kombiniert chrop chip und massenspektrometrie zu sezieren locus-spezifische proteomik landschaften des chromatin

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin ist ein hochdynamisches Nukleoprotein-Komplex von DNA und Proteinen, die verschiedene DNA-abhängige Prozesse kontrolliert werden. Chromatin-Struktur und Funktion in bestimmten Bereichen durch die lokale Anreicherung von Histon post-translationale Modifikationen (hPTMs) und Varianten, Chromatin-bindende Proteine, einschließlich Transkriptionsfaktoren und DNA-Methylierung reguliert. Die Proteom-Charakterisierung von Chromatin Zusammensetzung an unterschiedlichen Funktionsbereiche wurde bisher durch das Fehlen effizienter Protokolle, um solche Domänen an der entsprechenden Reinheit und Menge für die anschließende eingehende Analyse durch Massenspektrometrie (MS) bereichern behindert. Wir beschreiben hier eine neu gestaltete Chromatin Proteomik Strategie, genannt ChroP (Chro matin roteomics P), wobei ein Präparat Chromatinimmunpräzipitation wird verwendet, um verschiedene Chromatin-Regionen, deren Merkmale in Bezug auf hPTMs, Varianten und Co-assoziierte Nicht-Histon-Proteine ​​zu isolieren, sind MS analysiert. Wir veranschaulichen, erre die Einrichtung von ChroP zur Anreicherung und Analyse von transkriptionell stillen heterochromatischen Regionen, durch die Anwesenheit von Tri-Methylierung von Lysin 9 am Histon H3 markiert. Die erzielten Ergebnisse zeigen das Potenzial der ChroP gründlich Charakterisierung des Proteoms Heterochromatin und beweisen Sie es als ein leistungsfähiges Analyse-Strategie zu verstehen, wie die unterschiedlichen Protein Determinanten von Chromatin interagieren und Synergie zu Locus-spezifischen strukturellen und funktionalen Konfigurationen zu etablieren.

Chromatinimmunpräzipitation ist eine leistungsfähige Technik verwendet, um die Lokalisation eines Proteins oder eines Histonmodifikation entlang des Genoms Profil. In einem Äquivalent Proteomik ist der Chip von MS-basierte Proteomik gefolgt, um qualitativ und quantitativ die hPTMs, Histonvarianten und Chromatin-bindende Proteine, die mit der Modifikation oder Protein von Interesse immunpräzipitiert werden, als &quot;Köder&quot; verwendet, zu identifizieren. In der N-ChroP Ansatz in 1A Amerikaner Chip, i...

Durch die Kombination von nativen und Vernetzungs Chromatinimmunpräzipitation mit hochauflösender Massenspektrometrie ermöglicht ChroP Ansatz, um die Verbund Proteom-Architektur der Histon-Modifikationen, Varianten und Nicht-Histon-Proteine ​​synergizing bei funktionell unterschiedlichen Chromatindomänen sezieren.

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die proteomische Zusammensetzung funktionell unterschiedlicher Chromatinbereiche zu charakterisieren, um zu verstehen, wie die verschiedenen Elemente synergistisch zusammenwirken, um den transkriptionellen Zustand zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst Kerne aus kultivierten Zellen gewonnen und das Chromatin durch enzymatische oder mechanische Methoden in Fragmente optimaler Länge verdaut wird. Der zweite Schritt besteht darin, einen spezifischen funktionellen Bereich aus dem Gesamtchromatin mittels Immunpräzipitation zu reinigen, wobei als Köder Antikörper gegen eine histonische posttranslationale Modifikation oder ein Protein verwendet werden, das bekanntermaßen die Region von Interesse spezifisch markiert.Anschließend werden die immunpräzipitierten Chromatinproteine mittels SDS-Page getrennt und vor der Massenspektrometrie in-Gel digeriert. Der folgende Schritt ist die Analyse mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie an einem hochauflösenden Gerät. Abschließend werden die Rohdaten der Massenspektrometrie mit spezieller Software ausgewertet, gefolgt von einer manuellen Überprüfung der Spektren, um Hi

the-chrop-approach-combines-chip-mass-spectrometry-to-dissect-locus

Research

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JoVE Journal

Biology

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Chromatin Interaction Analysis von Paired-End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) ist eine Methode...

Chromatin Interaction Analysis gepaart mit End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) zur Abbildung von Chromatin-Wechselwirkungen zu verstehen und Transkriptionsregulation

Advances in Massenspektrometrie haben die Hochdurchsatz-Analyse der Proteinexpression und Modifikation in einer Vielzahl von Geweben erlaubt. Kombiniert mit subzelluläre Fraktionierung und Krankheitsmodelle, quantitative Massenspektrometrie und der Bioinformatik neue Eigenschaften in biologischen Systemen offenbaren kann. Das hierin beschriebene Verfahren analysiert Chromatin-assoziierten Proteinen in der Einstellung von Herzerkrankungen und ist ohne weiteres auch auf...

Quantitative Analyse von Chromatin Proteome in Disease

Die Identifizierung von Molekülen, die mit spezifischen genomischen Regionen von Interesse assoziiert sind, ist erforderlich, um die Mechanismen der Regulation der Funktionen dieser Regionen zu verstehen. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Durchführung einer technischen DNA-bindenden Molekül-vermittelten Chromatin-Imunopräzipitation (enChIP) zur Identifizierung von Proteinen und RNAs, die mit einer bestimmten genomischen Region assoziiert sind.

Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

Hier beschreiben wir eine optimierte Hochdurchsatz-ChIP-Sequenzierung Protokoll und rechnerische Analysen Pipeline für die Bestimmung der genomweiten Chromatin Zustand Muster von gefrorenen Tumorgewebe und Zell-Linien.

Eine integrierte Plattform für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten mit hohem Durchsatz ChIP-Sequenzierung im Tumorgewebe

Dies ist eine Methode, um neuartige DNA-Interaktion Proteine an zielgruppenspezifischen Loci, unter Berufung auf Sequenz-spezifische Erfassung von querverbunden Chromatin für nachfolgende Proteomic Analysen zu identifizieren. Keine Vorkenntnisse über potenzielle Bindeproteine noch Zelle Änderungen sind erforderlich. Ursprünglich entwickelt für die Hefe, wurde die Technologie jetzt für Säugerzellen angepasst.

Anpassung der Hybridisierung erfassen der Chromatin-assoziierte Proteine für Proteomics für Säugerzellen

Chromatin looping spielt eine bedeutende Rolle in der Genregulation; Allerdings gab es keine technologische Fortschritte, die eine selektive und reversible Änderung des Chromatins Schleifen ermöglichen. Hier beschreiben wir ein leistungsfähiges System für Chromatin Schleife Reorganisation Loci gezielt mit CRISPR-dCas9 (CLOuD9) gezeigt, um selektiv und reversibel Genexpression zu modulieren.

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

Dieser Artikel beschreibt ein halbautomatisches, mikroskaliertes ChIP-Seq-Protokoll von DNA-Regionen, die mit einer spezifischen Histonmodifikation (H3K27ac) unter Verwendung einer ChIP-Liquid-Handler-Plattform assoziiert sind, gefolgt von der Bibliotheksvorbereitung mittels Tagmentation. Das Verfahren umfasst eine Kontrollbewertung für Qualitäts- und Quantitätszwecke und kann auf andere Histonmodifikationen oder Transkriptionsfaktoren angewendet werden.

Ein halbautomatisches ChIP-Seq-Verfahren für groß angelegte epigenetische Studien

CUT&amp;RUN und seine Varianten können verwendet werden, um die Proteinbelegung auf Chromatin zu bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Proteinlokalisation auf Chromatin mit Hilfe von einzelligem uliCUT&amp;RUN bestimmt werden kann.

Einzelzellfaktorlokalisierung auf Chromatin unter Verwendung von Ultra-Low Input Cleavage Under Targets und Freisetzung mit Nuclease

Dieses Protokoll beschreibt die Capture Hi-C-Methode, die verwendet wird, um die 3D-Organisation von megabasierten Zielgenomregionen mit hoher Auflösung zu charakterisieren, einschließlich der Grenzen topologisch assoziierender Domänen (TADs) und langreichweitiger Chromatininteraktionen zwischen regulatorischen und anderen DNA-Sequenzelementen.

Entschlüsselung der hochauflösenden 3D-Chromatinorganisation über Capture Hi-C

Wir präsentieren ein dreifarbiges Chromatin-Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie-(SMLM)-Färbungs- und Analyseverfahren, das eine reproduzierbare Abbildung von Euchromatin, Heterochromatin und RNAP II für die räumliche Analyse ermöglicht. Dieses Protokoll ermöglicht eine effiziente mehrfarbige Markierung in dichten nuklearen Umgebungen, einschließlich chromatinassoziierter Ziele, und ermöglicht eine zuverlässige gleichzeitige Erkennung.

Ein mehrschichtiges Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopieprotokoll zur Untersuchung von Chromatin in der dichten Kernumgebung

Erfahren Sie die ChroP-Methode zur Analyse lokusspezifischer Proteom-Landschaften von Chromatin mittels ChIP und Massenspektrometrie. Diese Technik ermöglicht die Charakterisierung funktional unterschiedlicher Chromatin-Domänen.

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

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