Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die proteomische Zusammensetzung funktionell unterschiedlicher Chromatindomänen zu charakterisieren, um zu verstehen, wie die verschiedenen Elemente synergetisch wirken, um den Transkriptionszustand zu bestimmen. Acht. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellkerne aus kultivierten Zellen präpariert und das Chromatin enzymatisch oder mechanisch in Fragmente optimaler Länge verdaut wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine vom Massenchromatin getrennte funktionelle Domäne durch Immunpräzipitation unter Verwendung von Köderantikörpern entweder gegen eine posttranslationale Histonmodifikation oder gegen ein Protein, von dem bekannt ist, dass es die interessierende Region spezifisch markiert, aufgereinigt wird.

Anschließend werden die immungereinigten Chromatinproteine durch SDS-Seite getrennt und vor der Massenspektrometrie ingel verdaut. Der nächste Schritt ist die flüssigkeitschromatographische Massenspektrometrie-Analyse auf einem hochauflösenden Gerät. Letztendlich werden die massenspektrometrischen Rohdaten mit Ad-hoc-Software analysiert, gefolgt von einer manuellen Inspektion der Spektren zur Identifizierung und Quantifizierung von Histonmodifikationen und Coen-Anreicherungsproteinen, die entweder auf der Berechnung der relativen Abundanz in immunpräzipitiertem Material relativ zum Input oder auf dem SLAC-Verhältnis und Konkurrenzexperimenten mit löslichem Peptid als Konkurrenz zum Köder basieren. Wir können Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen dem Histo-Modifikationsmuster und der Varianz gewinnen und zu den spezifischen Chromatinregionen und der von ihnen rekrutierten Kerninterac gelangen, die alle aufeinander abgestimmt wirken.

Die Definition einer spezifischen Chromatinlandschaft mit regulatorischer Wirkung auf die Genexpression, der Hauptvorteil der Ernte gegenüber der bestehenden Methode, die auf einem In-vitro-Screening auf lösliche Wechselwirkung oder Histo-Modifikation, wie z.B. Ass-Pull-Down, basiert. Die Verwendung von Histonpeptiden oder rekonstituierten Chromatin-Templates bietet die Möglichkeit, die locusspezifische Chromatinzusammensetzung unter nativeren, weniger künstlichen Bedingungen zu untersuchen. Die Anwendung von Kulturpflanzen kann auch auf andere Modellsysteme oder in zeitabhängigen Studien ausgeweitet werden.

Zum Beispiel können wir Pflanzen in einer Zelllinie verwenden, die auf eine bestimmte Störung reagieren und eine globale Transkriptionsreaktion hervorrufen. Dieses Verfahren wird von Monica Sodi demonstriert. Ein Postdoc in meinem Labor Zellkerne für das N-Chip-Verfahren werden aus unmarkierten hergestellt.

He A S3-Zellen verwenden ein- bis zweimal 10 bis acht Zellen pro Experiment. Um Zellen zu ernten, machen Sie vier Aliquots von fünf mal 10 zu den sieben Zellen in 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 340 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS, verwerfen Sie den Überstand und releben Sie.

Jedes Zellpellet in acht Millilitern suspendieren, lysieren, puffern und in 15-Milliliter-Röhrchen übertragen. Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad. Gießen Sie anschließend jedes zelluläre Lysat vorsichtig auf ein Saccharosekissen und zentrifugieren Sie es in einem Ausschwingrotor bei 3.270 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Zellkerne vom Zytoplasma zu trennen.

Entsorgen Sie die Überstände und waschen Sie die Nu-Kernkugeln zweimal in Eis. Kaltes PBS bei der zweiten Wäsche. Sammeln Sie die Zellkerne in einem 50-Milliliter-Röhrchen, nachdem Sie den Überstand aus der zweiten Wäsche verworfen haben.

Ein nukleares Pellet wird in einem Milliliter Aufschlusspuffer resuspendiert. Jede Probe in zwei Aliquots à 500 Mikroliter aufteilen und auf Eis legen. Zu jedem Aliquot werden fünf Mikroliter MNA hinzugefügt, was einer Endkonzentration von 0,005 Einheiten Enzym pro Mikroliter Zellkern entspricht.

Vorsichtig mischen und 60 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Fügen Sie ein millimolares EDTA hinzu, um die Reaktion zu stoppen und auf Eis zu bleiben. Die verdauten Kerne werden durch Zentrifugation bei 7.800 mal G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten pelletiert.

Die Überstände werden in zwei Röhrchen umgefüllt und bei vier Grad Celsius gelagert. Dies ist die S-Eins-Fraktion, die die erste lösliche Fraktion des Chromatins enthält, die Mononukleo-Zonen umfasst, die Pellets sorgfältig in einem Milliliter Dialyse resuspendieren, puffern und über Nacht bei vier Grad Celsius in drei Litern Dialysepuffer mit konstantem leichtem Rühren am folgenden Tag dialysieren. Sammeln Sie das dialysierte Material und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 7.800 Mal G bei vier Grad Celsius.

Übertragen Sie das Super-Natin in ein neues Einor-Röhrchen. Dies ist die S zwei Fraktion, die je nach Ausmaß der Verdauung von M a an tta-Nukleosomen anfärbt. Vor der Immunpräzipitation bei vier Grad Celsius lagern.

Überprüfen Sie die Qualität und den Mangel des Aufschlusses von MN a durch Aros-Gelelektrophorese und visuelle Inspektion der Nukleosomenleiter, wie in diesem Beispiel dargestellt, wobei die Fraktion S eins in Mononukleozonen stark angereichert ist, während die Fraktion S zwei hauptsächlich Nukleosom für die Chromatin-Immunpräzipitation enthält. Zuerst wird ein Volumen Chip-Verdünnungspuffer zu Fraktion S eins gegeben. Fügen Sie dann den Antikörper gegen die posttranslationale Modifikation des Histons oder das Protein von Interesse hinzu und inkubieren Sie am nächsten Tag über Nacht auf einem rotierenden Rad bei vier Grad Celsius.

Isolieren Sie das Chromatin mit Hilfe von Protein-G-gekoppelten magnetischen Kügelchen. Geben Sie 100 Mikroliter blockierte Kügelchen in die Chromatinprobe S one und inkubieren Sie drei Stunden lang auf einem rotierenden Rad bei vier Grad Celsius. Nach drei Stunden.

Eine Minute lang bei 340-fachem G zentrifugieren. Legen Sie die Einor-Röhrchen in ein Magnetgestell, um die Kügelchen zu pelletieren. Bewahren Sie den Überstand auf, d. h. den Durchfluss, der das ungebundene Nukleosom enthält.

Geben Sie Waschpuffer zu den Kügelchen und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad, bevor Sie zentrifugieren. Waschen Sie die Kügelchen auf diese Weise insgesamt viermal mit steigender Salzkonzentration. Zwei Wäschen bei 75 Millimolar Natriumchlorid, gefolgt von einer Wäsche bei 125 Millimolar und eine weitere bei 175 Millimolar Natriumchlorid zur Eluierung.

Das Amino-präzipitierte Chromatin. Inkubieren Sie die Kügelchen in 30 Mikrolitern LDS-Probenpuffer, der mit 50 Millimolar Dihi ergänzt wird. Drei Etol für fünf Minuten bei 70 Grad Celsius.

Die angedeuteten Proteine werden anschließend durch die SDS-Seite getrennt, um dieses Verfahren zu beginnen und die Zellen mit Formaldehyd zu vernetzen. Fügen Sie 0,75 % Formaldehyd zu SLAC-markierten Zellen hinzu. Kurz mischen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Richten Sie das Formaldehyd aus, indem Sie 125 millimolares Glycin hinzufügen und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes teilen Sie die Zellen in zwei bis vier Aliquoten von etwa fünf mal 10 bis zu den sieben Zellen pro Aliquot. Spülen Sie die Zellen nach der letzten Wäsche dreimal mit eiskaltem PBS.

Entsorgen Sie die Überstände und bewahren Sie die Pellets auf, resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 10 Millilitern Lysepuffer. 10 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren, mit einer Rotationszentrifuge bei 430 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie die Überstände und bewahren Sie die Kernpellets auf.

Nach dem Waschen der nuklearen Pellets mit Waschpuffer Resus wird jedes nukleare Pellet in drei Millilitern Chip-Inkubationspuffer suspendiert und auf Eis gehalten, um das Chromatin in einem gekühlten Biobruch bei 200 Watt zu fragmentieren. Entfernen Sie 2 % des Chromatats und kehren Sie die Vernetzung durch Inkubation bei 65 Grad Celsius für mindestens eine Stunde um. Im Chip-Inkubationspuffer.

Dies ist das Eingangsmaterial. Anschließend wird die DNA mit einem PCR-Aufreinigungskit extrahiert und die Chromatinfragmentierung durch Aros-Gel-Elektropherese bewertet, um das vernetzte Chromatin immunauszufällen. Fügen Sie den Antikörper Ihrer Wahl zu leicht- und schwermarkiertem beschalltem Chromatin hinzu.

Geben Sie in den Lichtkanal eine überschüssige Falte des löslichen Peptids zusätzlich zum Antikörper-Aliquot sowohl leichte als auch schwere Proben in jeweils drei Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie am folgenden Tag über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem rotierenden Rad, geben Sie 100 Mikroliter blockierte Protein-G-gekoppelte magnetische Kügelchen zu jeder Chromatinprobe und inkubieren Sie auf einem rotierenden Rad drei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Eine Minute lang bei 340 mal G zentrifugieren. Legen Sie die Einor-Röhrchen in das Magnetgestell, um die Kügelchen zu pelletieren.

Der Überstand ist der Durchfluss mit ungebundenen Nukleosomen, der für spätere Kontrollen aufbewahrt wird. Waschen Sie die Kügelchen viermal in Waschpuffer mit steigender Salzkonzentration. Zwei Wäschen bei 150 Millimolar Natriumchlorid, gefolgt von zwei Wäschen bei 300 Millimolar Natriumchlorid.

Inkubieren Sie die Kügelchen 25 Minuten lang bei 95 Grad Celsius und 30 Mikrolitern SDS-Seite. Laden von Probenpuffer zur Eluierung und De-Vernetzung der immunpräzipitierten Proteine. Zuletzt poolen Sie die EITs und trennen die Proteine nach SDS-Seite vor der Massenspektrometrie.

Die mit NIP angereicherten Histone werden verdaut, um dieses Verfahren zu beginnen. Gelscheiben, die den Kern-Histonbanden aus dem kolloidalen Kumasi entsprechen, die mit vier bis 12%BIS CITRIS Acrylamid-Gradientengel gefärbt sind, werden ausgeschnitten und dann mit 50%Acetyl Nitril in und deionisiertem destilliertem Wasser abwechselnd mit 100% Aceto Nitril gefärbt, um das Gel zu schrumpfen, wenn die Gelstücke vollständig verfärbt sind. Trocknen Sie sie in einer Vakuumzentrifuge.

Geben Sie D, sechs Essigsäureanhydrid, ein bis neun Volumen pro Volumen in einem molaren Ammoniumbicarbonat und drei Mikroliter Natriumacetat als Katalysator zu den Gelstücken. Drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter starkem Schütteln inkubieren. Schrumpfen Sie die Gelstücke in 100% Acetylnitril und dehydrieren Sie sie dann etwa fünf Minuten lang in einer Vakuumzentrifuge, anschließend rehydrieren Sie die Gelstücke mit Eiskälte.

100 Nanogramm pro Mikroliter Tryinlösung in 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat über Nacht bei 37 Grad Celsius. Die Kombination der chemischen Modifikation von Lysinen mit deuteriertem Essigsäureanhydrid und Trypsinaufschluss erzeugt ein RC-ähnliches Aufschlussmuster wie im Gelaufschlussmuster, bei dem Histon lösliche verdaute Peptide in einem neuen Einor-Röhrchen sammelt und die Peptide etwa eine Stunde lang trocknet. Resuspendieren Sie lyophilisierte Peptide in 0,5 % Essigsäure und 0,1 % Trifluoressigsäure, entsalzen und konzentrieren Sie Peptide auf einem umgekehrten Phase-C-18-Kohlenstoffsandwich und Ionenaustauschchromatographie auf handgefertigten Mikrosäulen.

Laden Sie 50 % der Peptide auf die C 18-Kohlenstoff-Sandwich-Spitze und 50 % auf die SCX-Tischspitze. Eluieren Sie Peptide aus den SCX-Spitzen mit 5 % Ammoniumhydroxid, 30 % Methanol und aus den C 18-Kohlenstoffspitzen mit 80 % Acetonitril, 0,5 % Essigsäure. Schließlich lyophilisieren Sie die entgangenen Peptide und suspendieren sie in 0,1 %-Ameisensäure in der nativen Chromatin-Immunpräzipitation und dem Pflanzenansatz. Chromatin wird in einem ersten Schritt mit MNA verdaut, um eine vom Bulk-Chromatin getrennte funktionelle Domäne zu reinigen.

Das Panel auf der linken Seite zeigt einen kleinen MNA-Test, bei dem die DNA nach dem Chromatinverdau mit MNA in verschiedenen Zeitraffern auf einem 1%aros-Gel aufgelöst wird. Auf der rechten Seite ist ein großflächiger MNA-Aufschluss dargestellt. Die DNA wird auf einem 1%aros-Gel nach 60-minütigem Chromatinverdau der MNAs aufgelöst und nach Trennung der S-Fraktion, die Mononukleo-Zonen enthält, und der S-Fraktion, die Polynukleosomen enthält.

Das verdaute und an Mononukleosomen angereicherte Chromatin wird mit einem Antikörper inkubiert, der eine spezifische posttranslationale Hisonmodifikation erkennt. Zum Beispiel die Trimethylierung von Lysin neun auf Histon H drei K neun ME drei, einem Marker für stilles Chromatin. Die immungereinigten Proteine sowie der Chromatin-Input werden dann durch SDS-Seite getrennt, und die kolloidale Kumasi-Färbung zeigt die Kern-Histone H drei, H vier, H zwei A und H zwei B um und unterhalb der 17-Kilodalton-Bande, wobei H drei und H zwei B gemeinsam migrieren. Der Vergleich zwischen der Menge an methyliertem Trimm-Glycin neun auf H drei im Durchfluss und im Eingang zeigt, dass etwa 50 % der Die Region of Interest ist immungereinigt, wodurch das Risiko einer Verzerrung aufgrund der Anreicherung einer geringfügigen Subpopulation von Chromatin ausgeschlossen wird.

Dieses Histogramm stellt den Durchschnitt plus minus SEM aus drei unabhängigen Experimenten für jede Modifikation dar. Die Massenspektrometrie MS wird dann eingesetzt, um die posttranslationalen Modifikationen zu charakterisieren, die mit den angereicherten Nukleosomen assoziiert sind. Alle posttranslationalen Modifikationen des Histons werden durch manuelle Inspektion der entsprechenden ms Spektren in diesem repräsentativen Ms m Ms Spektren mittels CID-Fragmentierung verifiziert. Die B-Ionen- und Y-Ionen-Reihen ermöglichen die Definition der Sequenz des H-, Drei-, Neun- bis 17-Peptids und die Lokalisierung der Trimethylierung auf dem Lysin-Neun-Rest: Die markierungsfreie Quantifizierung wird erreicht, indem zunächst das extrahierte Ionenchromatogramm oder XIC für jedes Peptid entsprechend jedem modifizierten Peptid auf der Grundlage des Massenladungswerts konstruiert und die Fläche unter der Kurve oder ein UC für jeden Peak berechnet wird.

Als nächstes wird die relative Häufigkeit der verschiedenen Methylierungsgrade an Lysinneun in dem Peptid H drei neun bis 17 geschätzt, indem das A UC jedes modifizierten Peptids durch die Summe der Flächen dividiert wird, die allen beobachteten unmodifizierten und modifizierten Formen dieses Peptids entsprechen. Drittens wird die relative Anreicherung jeder Modifikation in dem gechipten Material als logarithmisches Zwei-Verhältnis zwischen der relativen Häufigkeit jeder Methylierung in dem gechippten Peptid über der Eingabe ausgedrückt. Die Analyse des Peptids H drei neun bis 17 zeigt die Anreicherung von D und TRIMM methyliertem Lysinneun mit der entsprechenden Depletion der unmodifizierten und Monomethylformen.

Mit diesen Ergebnissen als Positivkontrolle für die Antikörperspezifität kann die cos-Assoziation oder -Depletion aller anderen Modifikationen sowohl auf intramolekularer Ebene auf demselben H drei als auch auf intermolekularer Ebene auf anderen Coen-angereicherten Histonen innerhalb desselben Nukleosoms beurteilt werden. Diese repräsentative Heatmap fasst die Anreicherung aller cos-assoziierten H ptms zusammen, die auf Histon H drei, H vier und H zwei A identifiziert wurden. Jede Zeile entspricht einer anderen Modifikation und ND zeigt nicht nachgewiesene Modifikationen an, um auf alle Proteine zu screenen. Die Co-Assoziation innerhalb des Heterochromatin-Chips von vernetztem Chromatin, das durch Ultraschall fragmentiert wurde, wird in Kombination mit der Markierung stabiler Isotope durch Aminosäuren in Zellkultur oder lac verwendet.

Zunächst wird die Markierungseffizienz bewertet, indem der Einbau von schwerem Lysin und schwerem Arginin in Proteine berechnet wird. Für eine genaue Proteinquantifizierung ist ein Einbau von mehr als 95 % für beide schweren Aminosäuren erforderlich, wie hier beobachtet, beträgt der Median der Lysin- und Arginin-Peptiddichteverteilung 0,974 bzw. 0,964. Zweitens muss das Verhältnis von löslichem Peptid zu Antikörper optimiert werden.

Diese Abbildung zeigt ein vergrößertes Massenspektren bei dem entsprechenden Massenladungswert der zwei plus Ladung trimm methyliertes Lysin neun K neun ME drei im H drei neun bis 17 Peptid, sowohl für leichte als auch schwere Formen in Eingabe- und gechipptem Oktr. Während der Eingabe liegen die Intensitäten von schwerem und leichtem Peptid nahe bei eins im vorderen SLAC-Chip. Die Intensität des leichten Peptids ist viel geringer als die des schweren Gegenstücks, was auf eine effiziente Konkurrenz hindeutet.

Ein repräsentatives Ergebnis der SDS-Seite von leichtem L- und schwerem H-markiertem Chromatineingang und Co-Amino-gefälltem Materialchip ist hier dargestellt. Die Bahn, die dem zerkleinerten Material entspricht, wurde in 10 Scheiben geschnitten, während nur zwei Schichten, die eingegeben wurden, analysiert wurden. Für die Inkorporationstestanalyse werden Slac-Konkurrenzexperimente typischerweise in Duplikaten durchgeführt, in sogenannten Forward- und Reverse-Formaten, bei denen die Konkurrenz mit dem überschüssigen löslichen Peptid von den schweren H- auf die leichten L-Chromatinproben umgeschaltet wird.

Diese repräsentative Vollspektren zeigt das SLAC-Paar, das den Peptiden von HP-Eins- und Makro-Zwei-A-Proteinen entspricht, einem Verhältnis von schwerem zu leichtem Protein größer als eins. Im Vorwärtsexperiment, das durch ein Verhältnis von weniger als eins in der umgekehrten Replik gespiegelt wird, zeigen Sie die spezifische Anreicherung dieser Proteine in Heterochromatinproteinen, deren Intensität in der schweren und leichten Form sowohl in Vorwärts- als auch in Rückwärtsexperimenten ähnlich ist, erzeugen ein konstantes Verhältnis nahe eins und werden als Hintergrund klassifiziert. Die Überschneidung der Vorwärts- und Rückwärts-X-Chipp-Experimente führt zur Identifizierung von 635 Proteinen, die in beiden Experimenten vorhanden waren und mit mindestens zwei Verhältniszählungen quantifiziert wurden.

Das log zwei Diagramm ihres Verhältnisses von schwer zu leicht stellt das sogenannte Hetero-Chromosom dar. Die rot gestrichelten Linien in diesem Streudiagramm stellen die oberen 40 % und 30 % der Proteinverhältnisse dar. Wie angedeutet, werden die echten Trimm-methylierten Lysin-Neun-Interaktoren eindeutig als die Proteine identifiziert, die innerhalb der oberen 40 % der Proteinverhältnisverteilungen vorhanden sind.

Hier sind die Proteinverhältnisverteilungen aus Input-Forward- und Reverse-X-Ernteexperimenten in Schwarz, Blau bzw. Orange dargestellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Chromatin für E und Endfrucht vorbereiten, um die monogefällten Proteine vor der Massenspektrometrie-Analyse zu verarbeiten. Wie man die Histonmodifikation in Massenspektren identifiziert und quantifiziert und wie man eine spezifische Wechselwirkung auf ihre Proteinverhältnisse definiert.