Name: Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie ein Anoxie-Hungermodell in C. elegans nutzen, um Ischämie/Reperfusion zu simulieren. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Schäden und Verhaltensänderungen.

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Abbildungen 1 und 2 wurden früher in Free Radical Biology &amp; Medicine (Queliconi et al. 5) veröffentlicht und sind mit einem Kopierschutz von Elsevier statt. Diese Arbeit wurde durch die unterstützte Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), das Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Processos Redox em Biomedicina, die Núcleo de Apoio à Pesquisa de Processos Redox em Biomedicina, USPHS NS064945 (KN) und USPHS GM087483 (KN ). BBQ ist ein Doktorand von einem FAPESP Gemeinschaft unterstützt.

1. C elegans Wachstum <ol><li> Bereiten 35 mm Nematode Growth Medien (NGM)-Agar-Platten mit OP50 Bakterien geimpft, nach Norm Anbaumethoden ein. </li><li> Synchronisieren von C. elegans, indem 6 schwangeren Erwachsenen auf eine Platte ausgesät NGM. Entfernen Sie die Erwachsenen nach ~ 100 Eier gelegt (~ 3 h). </li><li> Die Inkubation für 3 Tage bei 20 ° C, an welchem ​​Punkt die Würmer zu jungen erwachsenen Stadium entwickelt und sind optimal für dieses Experiment. Alternative Protokolle C. synchronisieren elegans sind an anderer Stelle 10 beschrieben. </li></ol> 2. Materialien für AS <ol><li> M9-Puffer (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na 2 HPO 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO 4) sollte von Sauerstoff durch Äquilibrieren mit N 2 gespült werden vor dem Experiment (Argon können ebenfalls verwendet werden) während 30 min gehalten und umgeben von Eis. </li><li> Machen Sie ein kleines Loch (3 mmbreit) in dem Deckel von 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, in dem die Würmer während AS gelegt werden. Das Loch für den Gasaustausch ermöglicht, ohne den Deckel offen halten, da dies zu übermäßiger Verdunstung Medien führen. </li></ol> 3. Anoxia / Starvation <ol><li> Führen Sie alle Experimente mindestens in dreifacher Ausfertigung. </li><li> 1 ml der RT, sauerstoff M9-Puffer zu jedem 35 mm-Platte mit jungen erwachsenen Würmer gewachsen wie oben beschrieben. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, Entfernung von Bakterien von der Platte (Add M9 an den Rändern, wo Bakterien wurden nicht geimpft). Nach ca. 1 min sollte die Würmer schwimmen in der M9. </li><li> Mantel einer 1 ml Pipettenspitze mit BSA durch Pipettieren und Ausstoßen eines sterilen 1% BSA-Lösung. </li><li> Die Platte mit den Würmern in M9-Puffer vorsichtig neigen, entfernen Sie die M9 aus dem gleichen Ort, wo es aufgenommen wurde, und legen Sie die Suspension in die vorbereiteten Mikrozentrifugenröhrchen. Ruhen lassen, auf Eis bis die Würmer zu der Unterseite der Rohre fallen gelassen (~ 1-2 Min). </li><li> Entfernen Sie die maximale Höhe der M9 möglich, ohne die Würmer aus der Röhre zu stören (Abfahrt ca. 100 ul), 1 ml des Sauerstoff gespült und vereist M9 und das Reagenzglas auf Eis, bis die Würmer wieder setzen sich am Boden. Wiederholen Sie den letzten Schritt 3x. In der letzten Waschung, entfernen Sie die M9 bis ~ 100 ul in der Röhre bleibt. </li><li> Die Röhrchen mit den Würmern in sauerstoffarmes M9 innerhalb einer anoxischen / hypoxischen Kammer (siehe Anleitung unten, Abschnitt 3.6.1) oder alternativ in einem benutzerdefinierten verschlossenen Behälter (siehe unten Anleitungen, Abschnitt 3.6.2). <ol><li> Wenn ein Handels anoxischen / hypoxischen Kammer verwendet werden soll, verlassen einige gespült M9 in der Kammer, bevor Schritt 3.5 und 3.5 wiederholen Schritt, wenn die Würmer sind in der Kammer. </li><li> Wenn eine benutzerdefinierte Kammer verwendet werden soll, ist eine detaillierte Beschreibung, wie man eine Low-Cost-Gerät zu erstellen am Ende dieses Protokolls vorgestellt und wurde von einer anderen Gruppe zuvor 11 beschrieben. Kurz: <ol&gt; <li> Machen Sie zwei Löcher in einem 250 ml Tupperware-Typ Behälterdeckel und fügen Rohrverbinder zu ihnen. Einer wird verwendet, um das Gasgemisch zu injizieren, während die andere wird der Gasaustritt in ein Wasserbad sein. </li><li> Zeigen die Würmer in die Kammer und Abdichten der Kammer mit dem Deckel. </li><li> Gas mit konstantem N 2 Fluss (100 ml / min). </li><li> Stellen Sie den Behälter in einem Wasserbad bei 26 ° C Sicherzustellen, dass das Ausgangsrohr ist in Wasser eingetaucht, so dass keine Luft zurückkehrt und dass keine Lecks in dem System (scheinbare durch Blasen aus der Kammer selbst). </li></ol></li></ol></li><li> Die Würmer Inkubieren bei 26 ° C für 20 Stunden. </li></ol> 4. Simulierte Reperfusion <ol><li> Nach 20 Stunden unter AS Bedingungen in der Raumluft entfernen Sie die Rohre aus dem Brutraum. </li><li> Pipette C. elegans mit einer BSA-beschichtete Spitze (wie in Schritt 3.3) auf ein OP50 ausgesät 35 mm NGM Platte. Die Inkubation bei 20 ° C für 24 Stunden.Danach werden die Würmer bereit, erzielt werden kann. </li></ol> 5. Identifizieren Toten Versus Live-Worms <ol><li> Mit einem Platin-Pick, leicht berühren, die oben auf dem Kopf des Wurms. Live-Würmer werden nach berührt rückwärts bewegen. Wenn die Würmer nicht reagierender, zu zählen, wie tot ist. Gelegentlich wird ein Wurm nicht rückwärts bewegen, aber eine leichte Seite-an-Seite Kopfbewegung zu zeigen. Obwohl technisch nicht tot ist, sind diese Würmer fast sicher, innerhalb von Stunden ablaufen und sollte als tot gewertet. Wenn man zu lange, um die Würmer Tor wartet, können interne Schlüpfen der Nachkommen auftreten und diese &quot;Taschen-of-Würmer&quot; reißen können, was Erfassung der Tierkörper sehr schwierig. </li><li> Entfernen Sie die beiden lebenden und toten Würmer von der Platte, wie sie gezählt werden, um doppelte Zählungen zu vermeiden. Die Live-Würmer können auf einer separaten Platte bewegt, um Verhaltenstests durchzuführen. Die Menge an lebenden Würmer bezogen auf das Gesamt als% der überlebenden Schnecken dargestellt (Figur 1A </strong&gt;). </li></ol> 6. Touch Response Assay <ol><li> Eine ausführliche Beschreibung dieses Protokolls ist in Hart, Anne C., Hrsg. vorgestellt. Verhalten (3. Juli 2006), WormBook, hrsg. Die C. elegans Forschungsgemeinschaft, WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org. <ol><li> Um Touch-Reaktion zählen, identifizieren Würmer, die sich bewegen und berühren Sie leicht die Seite der Kopf des Wurms (in der Nähe des mittleren Teil des Rachens) mit einem Wimpern Pick (Abbildung 3). </li><li> Wenn der Wurm sich rückwärts bewegt, Partitur so reagieren, wenn nicht, schieße so nonresponsive (Abbildung 1B). Wiederholen Sie diesen Schritt 10-15x für jeden Wurm mit 10 Sekunden-Intervallen. Sonde mindestens 10 Würmer in jeder Gruppe, um genaue Daten haben. Der gleiche Test kann verwendet folgende leichte Berührung mit der hinteren Körperwand nach vorne zu beurteilen Bewegungs Veränderungen werden. Achten Sie darauf, den Kopf oder Schwanz der Wurm nicht zu berühren, da dies einen deutlichen Verhalten stimuliert. </li><li> Schließlich wird inUnternehmens genetische Kontrollstämme [N2 Bristol-Wildtyp-positiv, mec (mechanosensorischen) für negative Mutante - zB CB1338 mec-3 (e1338) IV], um die Kraft, mit der die Würmer berühren kalibrieren. Zu hart eines Stimulations eine Verhaltensreaktion in mec Mutanten zu entlocken, zu wenig wird eine Wirkung in Wildtyp N2 Kontrollen nicht zu entlocken. </li></ol></li></ol> 7. Neuronale Änderungen <ol><li> Um nach AS neuronalen Veränderungen sichtbar zu machen, verwenden Sie einen Stamm, der GFP in den Touch-Neuronen reagieren mec 4,5 ausdrückt. Diese Neuronen haben lange Prozesse, die an der Körperwand laufen und sind leicht für morphologische Auffälligkeiten erzielt. Darüber hinaus kann die morphologische Information mit Verhaltensmaßnahmen der neuronalen Funktion integriert werden, wie oben beschrieben. Ein Stamm, der für diesen Zweck verwendet werden kann, ist TU2583, die erhältlich ist von der C elegans Genetics Center und enthält die uIs25 integrierte Transgen exprimieren GFP herm die mec-18-Promotor, oder alternativ TU2562, die eine integrierte mec-3 :: GFP-Fusions enthält. </li><li> Bereiten Sie eine Agarose-Pad. <ol><li> Melt 2% Agarose in Wasser, bringen M9 mit einem 10fach-1x und Wartung der Lösung bei 70 ° C </li><li> Einen Tropfen (~ 20 &amp;mgr; l) dieser Lösung auf einen Objektträger (25 mm x 75 mm), die zwischen zwei anderen Folien, von denen jede ein einziges Stück Klebeband auf ihrer Unterseite platziert ist. </li><li> Legen Sie eine abschließende Glasobjektträger senkrecht zu der ersten auf dem 2% igen Lösung, und lassen Sie es bei Raumtemperatur abkühlen. Dies sollte eine Unterlage, die die Dicke des Bandes zu bilden. </li><li> Entfernen Sie die obere Folie und fügen Sie 10 ul der M9 mit 0,1% Tetramisol, die die Würmer zu immobilisieren wird. </li></ol></li><li> Bewegen Sie einige (~ 10) leben Würmer auf den 2% igen Rutsche. Legen Sie ein Deckglas über sie und visualisieren GFP mit einem Fluoreszenzmikroskop unter einem 100X Ziel mit der entsprechenden Beleuchtung. </li><li> BeschädigtNeuronen eine cytosolische Membranperlenmuster in den Prozessen von mehreren punctum (2A) besteht, und / oder Anomalien, wo die Prozesse scheinen gebrochen zu werden (2B) zu zeigen. Zählen Punctum und Anomalien in beiden Neuronen für jede Schnecke, unter Verwendung von insgesamt mindestens 10 Würmer. </li></ol> 8. Lab hergestellt Hypoxic Kammer <ol><li> Eine Tupperware-Stil, siegelfähige, luftdichten Behälter kann als anoxischen Kammer nachgerüstet werden. Achten Sie darauf, einen Behälter, der so klein wie möglich ist, zu wählen. Ein kleiner Behälter erzeugt eine hypoxische Umgebung schneller und einfacher ist, im Wasserbad (Abbildung 4) passen. </li><li> Machen Sie zwei Löcher auf dem Deckel (kann mit einem Schraubendreher oder durch Erhitzen Pinzette und zwingt in den Deckel gemacht werden) und legen Sie eine Kunststoff-oder Metallstecker, die den Schlauch (5A) passt. Benutzen Sie Klebstoff, die unter Wasser gesetzt werden kann, und wird hart nach dem Trocknen zu vermeiden Bewegung auchder Stecker und damit die Möglichkeit einer Leckage (Fig. 5B) verringert wird. </li><li> Der Behälter sollte in das Wasserbad gestellt werden, so dass sie vollständig (Fig. 4) eingetaucht. Um den Behälter eintauchen, mit einem Flaschengewicht oder ein Tauchgewicht. </li><li> Einer der Rohrverbindungen werden verwendet, um eine Gasmischung einzuführen und die andere Röhre wird als Überdruck wirken, daher sollte es unter Wasser gelassen, so dass der Behälter von der äußeren Umgebung (4) abgedichtet werden. </li><li> Die Luftzusammensetzung kann durch maßgeschneiderte Gas, Massendurchflussregler oder ein Gerät, das die gewünschten Gase mischt moduliert werden. Der Gasfluss sollte kontrolliert werden, da hohe Strömungs können übermäßige Verdunstung erstellen. Beispielsweise in einem 250 ml-Behälter mit 100 ml / min Gas gute Raum für die Würmer und einen geeigneten Fluß bereitzustellen. </li><li> Die Länge der Rohrleitung auf einem Minimum gehalten werden, da sie durchlässig für Gas, eine sein kann,llowing der Eingang von O 2. Es ist wichtig, zu vermeiden, mit Silikon, Tygon-Röhren als diese Materialien sind durchlässig für den Gasaustausch. Wir bevorzugen Polypropylen oder Nylon Rohre. Glas-oder Metallrohre halten die Gase gut, sind aber auch schwieriger zu verarbeiten. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

AS wurde häufig in C verwendet elegans IR Verletzungen zu modellieren. Einige wichtige Punkte sollten für dieses Protokoll hervorgehoben werden: C. elegans sind beständig gegen eine Vielzahl von Verletzungen, die die Notwendigkeit für 3 gleichzeitige Beleidigungen (Hitze, Hunger und Sauerstoffmangel) zu Tode mit diesem System zu erreichen. Anoxia allein nicht den Würmern in diesem Zeitfenster 14 zu töten. Darüber hinaus ist ein zusätzlicher Temperaturanstieg Stress, so ist es wichtig, genau zu überwachen. Streng genommen ist Hunger nicht signifikant den Grad der Mortalität beobachtet 7, per se, aber es scheint, um die Variabilität unter den Experimentwiederholungen zu verringern. Da es können erhebliche Variabilität von Tag zu Tag, ist es äußerst wichtig, die Vergleichsproben laufen direkt parallel und Experimente über mehrere Tage wiederholt. Im Allgemeinen sind die Ergebnisse für drei getrennte Platten von 50-100 Würmer / experimentellen Bedingungen gemessen und das sind dien gemittelt und als eine einzige Versuchs Replikat betrachtet. Im Allgemeinen scheinen zwischen sieben und neun Wiederholungen aus, um zu erreichen oder auszuschließen statistische Signifikanz zu sein. Das Entwicklungsstadium der in dem Experiment verwendet Würmer muss auch sorgfältig wie die Anfälligkeit der verschiedenen Stufen zu überwachenden Schäden erheblich variiert 15,16. Der Einsatz von jungen Erwachsenen ist Standard, und Larvenstadium (L3 und L4) Würmer zu sein scheinen resistent gegen die schädlichen Auswirkungen von AS (unveröffentlichte Daten). Dieses Protokoll stellt zwei Möglichkeiten, um die Experimente durchzuführen, eine mit einer im Labor hergestellten Geräten (mit Tupperware-Behälter Typ-und Gaseingang 11) und andere mit einer handelsüblichen 4,6 hypoxischen Kammer. Anoxie durch andere Mittel, die den Sauerstoffverbrauch erzielt werden, wie an anderer Stelle beschrieben 13,17. Der Einsatz von alternativen Techniken, um eine hypoxische Umgebung erstellen kann den AS Inkubationszeit Bedarf ändernum die gewünschte Menge des Todes zu erstellen. Targeting ~ 20% Überlebensrate ist ein idealer Ausgangspunkt für die Untersuchung Schutzmaßnahmen, während 80% ist ebenso ideal für Interventionen, die die nachteiligen Wirkungen von AS verschärfen. Eine weitere wichtige Einschränkung ist, der Zeitpunkt, zu dem die Beobachter Partituren tot / lebendig Würmer. Wenn die Zeit für die Analyse wird über 24 h verlängert, können die Daten irreführend sein, da tote Würmer zunehmend schwieriger zu identifizieren. Dies kann aufgrund Wurm Kadaver immer über die Zeit relativ transparent, dass befruchtete Embryonen können innerhalb der Schlachtkörper in Post-mortem-Nachkommen zu entwickeln und zu stören, wie sie entstehen, aber auch. Die Analyse der neuronalen Morphologie kann modifiziert werden, um Proteinexpressionsmuster 18, Kernfragmentierung 4 und andere Parameter 19 durch ein Wurmstamm, der die entsprechende genetisch codierten Markierung exprimiert Substitution aussehen. Eine letzte Einschränkung ist, dass die Visualisierung derneuronale Prozesse sollte weniger als 30 min nach Einsetzen der Würmer auf der Folie durchgeführt werden. Tiere unter Narkose gehalten auf Objektträger für längere Zeit kann AS-unabhängigen Schäden aufweisen. Passen Sie die Menge der Tiere pro Folie nach der benötigten Zeit zu verfolgen und zu analysieren.

C. elegans ist ein Fadenwurm, die weithin als eines vielzelligen eukaryontischen Modellorganismus seit der Einführung von Brenner 1 angenommen. Es ist eine billige, einfache und vielseitiges Modell, das einfach Verbindungen zwischen genetischen Veränderungen und phänotypische ändert 2 ermöglicht. Ischämie wird durch einen Mangel an Nährstoffen und Sauerstoffversorgung eines Gewebes, gefolgt von Reperfusion, wenn ein Burst von reaktiven Sauerstoffspezies erzeugt wird, 3 und das meiste Schaden entsteht dadurch. Im Jahr 2002, ein Modell der Ischämie / Reperfusion (IR) in C. elegans entwickelt 4 mit der Abgabe der ganze Wurm zu Sauerstoffmangel, Nährstoffmangel und Hitzestress für ca. 20 Stunden, gefolgt von 24 Stunden unter normalen Bedingungen. Obwohl dieses Modell ist technisch eine Sauerstoffmangel-Hunger (AS) Zustand tritt Zelltod durch Mechanismen, die bei Säugetieren konserviert sind, einschließlich der Schäden durch Oxidationsmittel während der Reperfusion induzierte &lt;sup&gt; 5. Außerdem ähnlich Säugetier IR, Schäden, die durch AS in C induziert elegans kann durch ischämische Präkonditionierung 6,7 oder 8,9 Betäubung Vorbehandlung verhindert werden. Die folgenden Protokolle zeigen, wie man in C IR imitieren elegans mit dem AS-Modell, wie man morphologische und Verhaltensauffälligkeiten, die von AS führen punkten, und wie das Protokoll in einer Weise, die das Experiment mit einer niedrigeren Anfangsinvestitionen mit einem maßgeschneiderten, leicht konstruiert Kammer Alternative durchgeführt werden können anpassen .

<table><tbody><tr><td>N2&nbsp; Stamm</td><td>CGC</td><td></td><td>Wildtyp-Stamm. http://www.cbs.umn.edu/CGC/</td></tr><tr><td>TU2583 uIs25 (Pmec-18::GFP)</td><td>CGC</td><td>TU2583</td><td>integriertes Fluoreszenztransgen zur Markierung von Berührungsneuronen.
http://www.cbs.umn.edu/CGC/</S></td></tr><tr><td>CB1338 mec-3 (e1338)IV</td><td>CGC</td><td>CB1338</td><td>kanonische mec-3-Mutante, die berührungsunempfindlich ist.
http://www.cbs.umn.edu/CGC/</S></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U Mikroskop&nbsp;</td><td>Nikon USA</td><td>TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>Niedertemperatur-Inkubator</td><td>Sheldon Manufacturing Inc.</td><td>Modell 2005</td><td></td></tr><tr><td>Wimpernstocher</td><td></td><td></td><td>Ein Wimpernstocher kann vorbereitet werden, indem eine Wimper an einem hölzernen Zahnstocher befestigt wird und dann der Zahnstocher in einer Pasteur-Glaspipette befestigt wird (Abbildung 3).</td></tr><tr><td>Hypoxic Chamber</td><td>Coy</td><td>8307030</td><td>Hypoxic Glove Box, ausgestattet mit Paladium-Katalysator und CO2Controller.</td></tr></tbody></table>

ein anoxia-hunger-modell für ischämie / reperfusion in<em&gt; c. elegans</em

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protokolle für Anoxie / Hunger in der genetischen Modellorganismus C. elegans simulieren Ischämie / Reperfusion. Würmer sind aus Bakterien Nahrung für 20 Stunden (simulierten Ischämie) abgetrennt und unter Sauerstoffmangel angeordnet ist, und anschließend zu einer normalen Atmosphäre mit Lebensmitteln (simulierte Reperfusion) bewegt. Diese experimentelle Paradigma führt zu einer erhöhten neuronalen Schäden und Tod und Techniken werden vorgestellt, um die Lebensfähigkeit der Organismen, Änderungen der Morphologie von Touch-Neuron Prozesse sowie Berührungsempfindlichkeit, die die Verhaltensleistung von neuronalen Funktion stellt beurteilen. Schließlich wird ein Verfahren zur Konstruktion hypoxischen Inkubatoren mit Gemeinschaftsküche Lagerbehälter beschrieben. Der Zusatz eines Massenstrom-Steuereinheit ermöglicht Änderungen an dem Gasgemisch in den benutzerdefinierten Inkubatoren hergestellt werden, und ein zirkulierendes Wasserbad ermöglicht sowohl Temperatursteuerung und macht es leicht, Lecks zu identifizieren. Dieses Verfahren stellt eine kostengünstige Alternative handelsverfügbaren Einheiten.

Unterziehen C. elegans zu 20 Stunden von AS bei 26 ° C in einem benutzerdefinierten Labor hergestellten Brutraum, wie beschrieben (Abschnitt 3.6.2) führte zu einer signifikanten Mortalität (Abbildung 1A) 5. Anschließende Fluoreszenzabbildung von Punctum und Brüche in den GFP-markierten neuronalen Prozesse von Überlebenden bestätigte die Anwesenheit von morphologischen Veränderungen (Abbildung 2). Die Überlebenden reagiert auch schlecht auf die Lichtkörperwand touch (Abbildung 1B). Dieses Modell wurde von mehreren Gruppen verwendet worden, um zu untersuchen, wie genetische Veranlagung, pharmazeutische Interventionen und metabolische Plastizität betrifft AS abhängig Ergebnisse 4-6,8,9,12,13. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig1.jpg" /> 1. C elegans Überleben und die Touch-Reaktion nachAS. A) Prozentualer Anteil der Würmer, die 24 Stunden nach der AS Überleben zeigen. Die N2-Stamm der Wildtyp genetischen Hintergrund und KWN85 enthält eine integrierte Transgen, das mec Neuronen mit GFP. B-Etiketten) Reaktion auf Reize des Lebens berühren C. elegans (N2-Stamm) nach AS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51231/51231fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig2.jpg" /> 2. Berühren Neuron Änderungen, die nach AS. Touch-Neuron (PLML und PLMR) Anomalien wie verschlungenen Prozesse und Pausen (A) oder die Ansammlung von GFP-Aggregate in den Prozessen (B) wurden in überlebenden überwacht betäubt C. eleg<html> ans nach AS. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig3.jpg" /> 3. Wimper-Pick. Eine montierte Wimpern Pick. Der Einschub, ein Detail der Wimper geklebt, um die Zahnstocher Holz. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51231/51231fig4.jpg" /> 4. Lab hergestellt hypoxischen Kammer im Inneren des Wasserbades. Ein geschlossener Behälter bereit, das Experiment zu starten. Die Pfeile zeigen die Gas-und Ausfahrt und die Flasche Gewicht verwendet, um es von schwimm halten. 231fig5.jpg &quot;/&gt; 5. Details der inneren und äußeren Seite des Behälterdeckels. A) Außenseite der Behälterdeckel, die die Röhre und dem Anschluss an die bisherigen Loch. B) Außenseite des Behälterdeckels, auf der der Rohrstutzen auf die bisherigen Loch befestigt.

Ein Protokoll beschrieben, das Anoxie / Hunger in C verwendet elegans zu modellieren Ischämie / Reperfusion. Funktionelle Ergebnisse sind eine erhöhte Sterblichkeit, sichtbare Veränderungen in GFP-markierten neuronalen Prozesse und die Beeinträchtigung der Verhaltensreaktionen, die neuronale Funktion benötigen.

Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Ischämie-Reperfusion bei C. elegans zu simulieren. Dies wird erreicht, indem C. elegans in ein Mikroröhrchen überführt und die Bakterien ausgewaschen werden. Der zweite Schritt besteht darin, eine anoxische Umgebung zu erzeugen.Mithilfe einer im Labor hergestellten hypoxischen Kammer werden die Tiere 20 Stunden lang Anoxie ausgesetzt und anschließend nach 24 Stunden in aerobe Bedingungen gebracht. Im letzten Schritt erfolgt die Auswertung toter Tiere sowie die Bewertung der Berührungsreaktion. Neuronale Veränderungen werden außerdem mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet.Letztlich wird die Anoxie-Verhungernung bei C. elegans verwendet, um dieselben Bedingungen zu erzeugen, die bei Ischämie bei höheren Eukaryoten auftreten, jedoch in einem einfacheren und flexibleren genetischen Modell. Der Vorteil dieser Techniken gegenüber herkömmlichen Methoden zur ischämischen Wiederbelebung in isolierten Zellen oder Herzen liegt darin, dass C. elegans ein äußerst leistungsfähiges genetisches Modell ist und zudem ein Transportorganismus darstellt. Organismen ermöglichen die Anwendung verschiedener Flüssigkeiten und Techniken. Darüber hinaus zeigen wir Ihnen, wie Sie anstelle einer teuren Hypoxie- oder Umweltkammer eine im Labor hergestellte Hypoxie- und Umweltkammer verwenden können, die nur wenige Dollar kostet.Im Allgemeinen müssen Einzelpersonen, die mit dieser Angelegenheit befasst sind, einige wichtige Punkte beachten, wie beispielsweise das Spülen der Puffer, äußerste Sorgfalt bei der Zählung der Würmer sowie eine konstante Temperatur- und Sauerstoffzufuhr. Alle diese Faktoren können das Versuchsergebnis beeinflussen. Um eine individuell angefertigte hypoxische Kammer vorzubereiten, kann ein luftdicht verschließbarer Behälter im Stil eines Tupperware-Behälters zu einer anoxischen Kammer umfunktioniert werden. Wählen Sie den möglichst kleinsten Behälter aus, da ein kleiner Behälter schneller eine hypoxische Umgebung erzeugt und leichter in das Wasserbad passt.Bohren Sie zwei Löcher in den Deckel, die groß genug sind, um einen Kunststoff- oder Metallverbinder aufzunehmen, der die Schlauchleitung sicher hält. Befestigen Sie den Verbinder mit einem unter Wasser anwendbaren Kleber, der nach dem Trocknen aushärtet, um eine Bewegung des Verbinders und damit ein Leck zu vermeiden. Alternativ kann eine Neopren-Dichtscheibe verwendet werden, um den Verbinder dicht am Behälter zu befestigen. Stellen Sie den Behälter in das Wasserbad, sodass er vollständig untergetaucht ist.Den Behälter eintauchen. Verwenden Sie ein Flaschengewicht oder ein Tauchgewicht. Eine der Schlauchverbindungen dient zur Einführung eines Gasgemischs, während die andere als Druckentlastung fungiert.Daher sollte es unter Wasser gelassen werden, damit der Behälter von der äußeren Umgebung abgeschlossen ist. Um mit dem Anzüchten von C. elegans wie im Textprotokoll beschrieben zu beginnen, bereiten Sie M9-Puffer vor und entfernen Sie den Sauerstoff, indem Sie ihn 30 Minuten vor dem Experiment mit Stickstoff äquilibrieren und ihn dabei in Eis gehüllt halten. Bohren Sie ein kleines Loch in den Deckel von 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, in denen die Würmer während der Anoxie-Verhungernung platziert werden.Das Loch ermöglicht den Gasaustausch, ohne den Deckel geöffnet halten zu müssen, was zu einer übermäßigen Verdunstung des Mediums führen könnte. Geben Sie ein Milliliter mit Sauerstoff angereicherte M-neun-Pufferlösung mit Raumtemperatur in jede 35-Millimeter-Platte, die erwachsene Jungwürmer enthält. Achten Sie darauf, dass keine Bakterien von der Platte entfernt werden.Nach ungefähr einer Minute sollten die Würmer im M-neun-Puffer schwimmen. Anschließend beschichten Sie eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze mit Rinderserumalbumin oder BSA, indem Sie eine sterile 1 %ige BSA-Lösung aufsaugen und wieder abgeben. Neigen Sie vorsichtig die Platte mit den Würmern im M-neun-Puffer und entfernen Sie den M-neun-Puffer an derselben Stelle, an der er hinzugegeben wurde.Dann die Suspension in die vorbereiteten Mikrozentrifugenröhrchen geben. Die Proben so lange auf Eis ruhen lassen, bis die Würmer auf den Boden der Röhrchen gesunken sind. Entfernen Sie die maximale Menge an M-neun, die möglich ist, ohne die Würmer im Röhrchen zu stören.Dann fügen Sie ein Milliliter des mit Sauerstoff gespülten und gekühlten M9 hinzu und stellen Sie das Röhrchen auf Eis, bis sich die Würmer am Boden abgesetzt haben. Wiederholen Sie diesen Waschschritt insgesamt dreimal. Bei der letzten Waschung entfernen Sie das M9, bis etwa 100 Mikroliter im Röhrchen verbleiben.Stellen Sie anschließend die Röhrchen mit den Würmern in deoxygeniertem M-neun-Puffer in die Kammer und verschließen Sie die Kammer mit dem Deckel, wobei ein konstanter Stickstofffluss von 100 Millilitern pro Minute eingeleitet wird. Stellen Sie das Gefäß in ein Wasserbad bei 26 Grad Celsius. Achten Sie darauf, dass das Auslassrohr gut unter Wasser eingetaucht ist, damit keine Luft zurückströmt, und dass keine Lecks im System vorhanden sind.Die Würmer anschließend 20 Stunden bei 26 Grad Celsius inkubieren; danach mit einer mit BSA beschichteten Pipettenspitze Sea Elegance auf eine 35-Millimeter-Nematoden-Wachstumsmedium-Platte übertragen. Die Platten 24 Stunden bei 20 Grad Celsius inkubieren. Danach sind die Würmer zur Auswertung bereit.Das lebende Tier mit einem Platindraht leicht am Kopf berühren. Wenn sich die Würmer nach der Berührung rückwärts bewegen, sind sie lebendig. Wenn die Würmer nicht reagieren, als tot werten. Gelegentlich bewegt sich ein Wurm nicht rückwärts, zeigt aber eine leichte seitliche Kopfbewegung; obwohl er technisch gesehen nicht tot ist, wird er mit großer Sicherheit innerhalb weniger Stunden sterben und sollte daher als tot gewertet werden.Wiederholen Sie diesen Schritt 10 bis 15 Mal für jeden Wurm mit Intervallen von zehn Sekunden. Untersuchen Sie mindestens 10 Würmer pro Gruppe, um genaue Daten zur Visualisierung von neuronalen Veränderungen nach anoxischer Hungersnot zu erhalten. Verwenden Sie einen Stamm, der grün fluoreszierendes Protein oder GFP in den berührungsempfindlichen mechano-sensorischen Neuronen exprimiert.Geben Sie einen Tropfen der 2 %igen ARO-Lösung auf einen Objektträger, der zwischen zwei weitere Objektträger gelegt wurde, deren Unterseite jeweils ein Stück Klebeband aufweist. Legen Sie einen weiteren Objektträger senkrecht auf die 2 %ige ARO-Lösung und lassen Sie ihn bei Raumtemperatur abkühlen. Dadurch sollte ein Polster entstehen, das die Dicke des Klebebands aufweist.Entfernen Sie dann die obere Objektplatte und geben Sie 10 Mikroliter M-neun mit 0,1 % Tetraaol hinzu, um die Würmer zu immobilisieren. Übertragen Sie etwa 10 lebende Würmer auf die 2 %-Aro-Platte und legen Sie einen Deckglaser über sie. Visualisieren Sie GFP mit einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung eines 100×-Objektivs bei geeigneter Beleuchtung.Beschädigte Neuronen zeigen ein zytoplasmatisches Membranmuster der Art „Perlenkette“ in den Fortsätzen, das aus mehreren Pünktchen und/oder Anomalien besteht, wobei die Fortsätze unterbrochen erscheinen. Zählen Sie Pünktchen und Anomalien in beiden Neuronen für jeden Wurm, wobei insgesamt mindestens 10 Würmer verwendet werden. Die Exposition von Caenorhabditis elegans gegenüber 20 Stunden Anoxie und Nahrungsentzug bei 26 Grad Celsius in einer speziell im Labor hergestellten Inkubationskammer führte zu einer signifikanten Mortalität.Die Überlebenden reagierten außerdem schlecht auf leichte Berührung der Körperwand. Nachfolgende fluoreszierende Aufnahmen von Puncta und Brüchen in den GFP-markierten neuronalen Fortsätzen der Überlebenden bestätigten das Vorhandensein morphologischer Anomalien. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Ischämie fördern kann.Eine Beobachtung im Labor machte hypoxische Kammern erforderlich, und außerdem sollten Sie in der Lage sein, den Tod sowie neurologische Veränderungen in Seattle Elegance zu messen. Dieses Modell wurde bereits von mehreren Arbeitsgruppen genutzt, um zu untersuchen, wie natürliche Ionen aus zahlreichen Interventionen und dem Stoffwechsel das Überleben und den Tod unter hypoxischen Bedingungen beeinflussen können.

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Forschung

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Biology

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