Name: Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Lernen Sie die transienten Genexpression in Tabakblättern mit Gibson-Assembly und Genkanone zur Untersuchung von Chloroplasten und Peroxisomen. Diese Methode ermöglicht die schnelle Visualisierung durch konfokale Mikroskopie.

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Die Autoren bedanken sich bei Jen Sheen von Massachusetts General Hospital für die großzügige Spende von Nicotiana benthamiana Sämlinge danken. Jen Bush hat uns sehr geholfen in der Beratung in den Anbau von Pflanzen und die Einrichtung einer Wachstumskammer Region. Tom Ferrante des Wyss Institute angeboten entscheidende Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Die Autoren möchten besonders Don Ingber der Kinderklinik Boston und der Wyss-Institut für die großzügige Spende eines Gene Gun und die damit verbundenen Lieferungen danken. Die Finanzierung für dieses Projekt wurde durch eine Kooperation mit dem Department of Energy Advanced Research Projects Agency (ARPA-E-Award # DE-000079) für PAS, JCW und MdM durch Chimerion Biotechnology, Inc. für MJV vorgesehen ist, und.

1. Entwurf von Alternativ-gespleißt Sequenzen für mehrere Organelle Targeting <ol><li> Bestimmen Sie die Standorte für die endgültige Protein-Expression. Für diese Arbeit ist das Interesse an der Ausrichtung der Chloroplasten, Peroxisomen und Cytosol. </li><li> Verwenden Sie die Literatur, um Protein-und DNA-Sequenzen bekannt, dass Proteine, die Organellen von Interesse gezielt zu identifizieren. In diesem Fall wird ein Chloroplasten-Targeting-Sequenz aus Arabidopsis thaliana L-Methyltransferase isoaspartate 6,15 und eine Peroxisomen-Zielsequenz aus Arabidopsis thaliana-Transthyretin wie S-Synthase Allantoin 16,17 bestimmt. </li><li> Identifizieren Sie eine alternative Spleißen-Regime, die die Proteine ​​von Interesse für die richtige Zielorganellen sollten. Für diese Arbeit Spleißstellen wie in einem natürlichen System Arabidopsis 6 beobachtet. Die mRNA-Sequenz wurde neu gestaltet Verlassen der natürlichen Spleißstellen, sondern Sequenzen wurden Kodierung Chloroplasten-oder peroxis platziertome-Targeting-Tags innerhalb der alternativ gespleißten Introns (Abbildung 1). </li></ol> 2. Gibson Versammlung der DNA-Teile Siehe auch Abbildung 2. Die Gibson Montageverfahren ist abhängig von der Wirkung mehrerer Enzyme in einem vorgefertigten Mischung zu 1) teilweise verdauen die Enden des doppelsträngigen DNA-Einzelstränge auf und 2) Glühen kostenlose Basenpaare der benachbarten DNA-Teile. Dies ermöglicht die Klonierung der DNA-Fragmente ohne die Einschränkungen von Restriktionsstellen. <ol><li> Wähle einen Auftrag für die Elemente in der DNA-Plasmid-Konstrukt. Als Beispiel TriTag-1 Elemente: a) einen Plasmidvektor (Poren, enthaltend ein GFP-Konstrukt bekannt, in Pflanzen, ein Kanamycin-Resistenz-Marker zu arbeiten, und Replikationsursprünge für E. coli und Agrobacterium tumefaciens Hosts), b) ein Promotor-Sequenz, (P ENTCUP2 gezeigt konstitutiv zu sein in Pflanzen), C) einem Chloroplasten-Targeting-Sequenz (CTS), c) eine Peroxisomen-Zielsequenz (PTS), und d) eine Reihe von Spleißstellen wie zuvor 6 beschrieben. </li><li> Gestalten Sie das Konstrukt Basis-for-Basis mit in silico Design-Software. ApE ist ein Open-Source-Freeware-Paket, die für diese Arbeit. Hinweis: TriTag-1, hat die Reihenfolge: Plasmid-Vektor, einen Promotor, ATG, Splice-Donor-Stelle, Chloroplasten-Zielsequenz, Splice-Donor-Stelle, neutral, Spleiß-Akzeptor-Stelle, Peroxisomen-Zielsequenz, Splice-Akzeptor-Stelle, wie in GFP-Plasmid-Vektor enthalten ist . <ol><li> Entwerfen Sie die in silico DNA-Konstrukt, so dass eine 50-bp-Überlappung zwischen jedem Stück bei der Bestellung Primer für die PCR. Es ist möglich, die 50-bp-Überlappung als Primer verwendet: 25 bp in jeder Richtung. <ol><li> Achten Sie darauf, den Überblick über die Herkunft der einzelnen Stücke Reihenfolge halten. Ist es so: ein Plasmid gewachsen und miniprepped werden; eine lineare Sequenz, die als PCR-Matrize verwendet werden kann; oder eine Sequenz, die müssen seinkommerziell synthetisiert? Mehrere Firmen bieten Low-Cost-DNA-Synthese Dienstleistungen für Fragmente &lt;500 bp. In diesem Fall wird die TriTag selbst ist 437 bp, so ist es vorteilhaft, sie kommerziell Ordnung. </li><li> Die besten Ergebnisse werden kommen, wenn alle Fragmente mittels PCR amplifiziert und aus den Matrizen-DNA gereinigt. Die Resistenzmarker ist ein guter Ort, um dieses große DNA in zwei kleinere Vorlagen, die leichter sind PCR-amplifizierte teilen. </li><li> Beschränkung Restriktionsenzym DpnI schneidet methylierte DNA. Wenn die PCR-Vorlage war ein Miniprep von E. coli, Dpnl Behandlung wird die Template-DNA kontaminiert entfernen. </li></ol></li></ol></li><li> Reinige alle DNA-Sequenzen getrennt und Elution in Wasser, TE-oder EB-Puffer. <ol><li> Poren Vektor-Teil 1, ~ 3000 bp (grüne Pfeile). PCR amplifiziert und DpnI behandelt. </li><li> Poren Vektor-Teil 2, ~ 3000 bp (schwarze Pfeile). PCR amplifiziert und DpnI behandelt. </li><li> TriTag Einsatz, 437 bp (blaue Pfeile). Handel bestellt. Resuspend in ddH 2 O. </li><li> P ENTCUP-Promotor, ~ 750 bp (orange Pfeile). PCR-amplifiziert und DpnI behandelt. </li></ol></li><li> Messung der Konzentrationen von jedem der DNA-Stücke. Ziel für 150 ng / ul der Vektor-Stücke. </li><li> Einen aliquoten der Gibson Montage-Mix aus dem Gefrierfach und tauen auf Eis. Dies ist im Handel erhältlich, sondern auch einfach zu machen im Labor 14.12. <ol><li> Es gibt zwei Schritte, um dieses Rezept: eine viskose 5x Master-Mix und 15 ul Reaktions-Größe 1,33 x Aliquots. Der 5x Mastermix enthält: 3 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 300 &amp;mgr; l 1 M MgCl 2, 600 &amp;mgr; l 10 mM von jedem dNTP, 300 &amp;mgr; l 1 M DTT, 1,5 g PEG-8000, 20 mg NAD und ddH 2 O 6 ml. Planen 320 ul Aliquots (18) und gefrier alle außer einer bei -20 ° C Die Lösung wird sehr viskos sein. Beschriften Sie diese &quot;5X Isotherme Puffer&quot; </li><li> Zum einen verbleibenden (320 ul), fügen Sie 1,2 ul T5 Exonuclease, 20 ul Phusion High-Fidelity DNA Polymerase, 160 ul Taq-DNA-Ligase und 700 ul ddH 2 O. Bereiten Sie 15 ul Aliquots (~ 80) auf Eis in PCR-Röhrchen und bei -20 ° C </li></ol></li><li> Bestimmen Volumina für äquimolare Mengen von jedem der Fragmente. Es gibt ein paar Online-Rechner, einschließlich Gibthon.org. Es sollten insgesamt 5 ul aller DNA-Stücke sein. Fügen Sie sie zu den 15 ul Aliquot Gibson mischen. Wenn dies erfordert Volumen zu klein, um Pipette verdünnen, die DNA-Fragmente und / oder mehr als einen aliquoten. <ol><li> Vergessen Sie nicht, eine Kontrolle der Vektor-DNA allein vorzubereiten (zB der DNA-Teil des Antibiotikaresistenz-Marker enthalten) und bis zur Marke mit Wasser. </li></ol></li><li> Die Rohre in einem Thermocycler bei 50-55 ° C für 30-60 Minuten inkubiert. Ersetzen auf Eis und verwandeln sich in E. coli durch Hitzeschock chemisch kompetente Zellen. Verwenden Sie keine elektroZellen. Die hohe Salzkonzentration und der relativ niedrigen DNA-Konzentrationkann dazu führen, dass die Zellen Bogens. <ol><li> Wenden Sie alle 20 ul einer kommerziellen Herstellung von 200 ul Calciumchlorid-kompetenten E. coli. Inkubation auf Eis 30 min und 60 sec Hitzeschock bei 42 ° C </li><li> Zurück zu Eis 2 min, gelten 750 ul SOC oder LB-Medium und erholen sich in einem Mikrozentrifugenröhrchen 30 min Schütteln bei 37 ° C Platte der Mischung und geeignete Verdünnungen auf LB + Kan (oder anderen geeigneten Antibiotikum). Dies kann zu höheren Hintergrund (und eine höhere Anzahl von Nicht-Ziel-Rekombination) als traditionelle Ligation-basierte Klonen führen, aber es lohnt sich, etwa 10 Kolonien zu screenen. </li></ol></li><li> Bestätigen Sie mit Klon-Sequenz und speichern ein Aliquot bei -80 ° C </li></ol> 3. Biolistic Transfektion von Tabak mit der Gene Gun Dies ist eine Technik, die in JoVE 18,19 hergestellt wird. Schlüsselschritte und die Unterschiede werden unten beschrieben. <ol><li> Wachsen 50-100 ml E. coLi oder 200 ml Agrobacterium. Maxi-prep die Kultur. Eine Konzentration von etwa 1.500 ng / &amp;mgr; l erforderlich, um fortzufahren. </li><li> Bereiten Gen Gewehrkugeln wie zuvor beschrieben. Legen Sie sie in die Gene Gun. </li><li> Für die Transfektion von Nicotiana benthamiana Tabakblatt epidermale Gewebe, wählen Sie ein großes Blatt in der Nähe der Basis eines 3 Monate alten Anlage. Sorgfältig schneiden Sie es und legen Sie es Unterseite nach oben auf nassen Papierhandtücher in einer 15 cm Petrischale. </li><li> Stellen Sie den Druck für die Er Gene Gun auf 200-250 psi. </li><li> Sorgfältig Ziel der Genkanone zwischen den Rippen auf der Unterseite eines Blattes, etwa 3-5 cm darüber. Lassen Sie die Sicherheit und liefern die Teilchen auf dem Blatt. Jede Kugel kann zweimal an der gleichen Stelle auf dem Blatt verwendet werden. Wenn die Blatt explodiert, verwerfen und beginnen ein neues Blatt-es gibt einige Varianz in Blatt Zähigkeit durch Wachstumsbedingungen wie Alter, Feuchtigkeit, etc. Für eine 12-cm-Blatt, erwarten, dass etwa 6 Aufnahmen passen. </li><li> Bewahren Sie die mit der Oberseite der eine überdachte Blatt,Petrischale für 2-3 Tage bei wenig Licht auf der Bank. </li><li> Untersuchen Sie das Blatt in einem Binokular mit UV-Fluoreszenz ausgestattet, und die Suche nach einzelnen Zellen, die GFP. Dissect 5-10 mm Abschnitte Blatt. </li><li> Tauchen Sie das Blatt in einem tiefen Brunnen Mikroskop-Objektträger unter ~ 200 ul 0,1% Triton X-100. Das Detergens verhindert Bildung von Luftblasen an der Oberfläche, und die Tiefbohrung Objektträger ermöglicht eine größere Gewebeabbildungsbereich. </li></ol> 4. Konfokale Mikroskopie transfizierter Tissue Diese Anweisungen variieren für jedes Instrument, so ist es wichtig, gut ausgebildet zu werden. <ol><li> Für die Fluoreszenzdetektion Experimente, stellen Sie die Anregungslaser bis 489 nm, und stellen Sie die Photomultiplier-Detektoren 500-569 nm für GFP-Fluoreszenz und 630-700 nm für Chlorophyll-Autofluoreszenz. Bild Zellen unter Verwendung eines 40x Wasserimmersionsobjektiv. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In dieser Studie werden einfache Strategien zur Lokalisierung eines einzelnen transgenen Proteins mehrere Zellkompartimente in Pflanzen beschrieben. Das Ziel war, ein Konstrukt, das Gen in mehr als einer Organelle in Nicotiana benthamiana ausdrücken würde entwerfen. Strategien sind rationale Design von GFP-basierten DNA-Konstrukte, Gibson Montage, Lieferung der Plasmide zu Blattzellen mit der Gene Gun und Beobachtung der Ergebnisse mit der konfokalen Mikroskopie. Drei verschiedene k...

Diese Arbeit ist eine Stoffwechseltechnik / synthetischen Biologie-Projekt, bei Pflanzenzellen werden ausgeführt, um ein Reporterprotein in mehreren Organellen ausdrücken, aber mit nur einem einzigen DNA-Konstrukt. Ein Ansatz, um Proteine ​​an mehr als einem Ort gezielt beinhaltet Klonen mehrere genetische Kopien, die jeweils eine unterschiedliche Lokalisation Peptid. Jede Kopie muss durch sukzessive Rücktransformation eingeführt werden oder alternativ durch Rückkreuzung einzelnen Transformationen ein. Dies beinhaltet zusätzliche Klonen, und wird von einem Lokalisierungs Tag pro Terminus begrenzt. Ein anderer Weg, um ein Protein zu mehreren Stellen lokalisiert ist, durch alternatives Splicing 2-5. RNA wird aus einem einzigen Gen transkribiert werden, aber verschiedene Kopien des Transkripts sind unterschiedlich in mehr als einen Weg pro Zelle verarbeitet wird, häufig. Dies kann in mehr als einer Boten-RNA in der Zelle von einem einzigen Gen transkribiert führen. Diese unterschiedlichen messenger RNAs können für verschiedene Isoformen des gleichen Proteins in dem Fall einer Leserahmen, einem anderen Protein vollständig zu kodieren, oder. Obwohl alternative Spleißen ist in der Literatur seit vielen Jahren beschrieben worden ist, die Wirkmechanismen und Donor-und Rezeptor konservierten Spleißstellen werden zur Zeit nur in jüngerer 6 erläutert. Da diese Standorte werden besser beschrieben, eröffnen sie Chancen für den Maschinenbau. Pflanzenstoffwechsel Ingenieure mit einer Herausforderung bei der Expression eines Proteins in mehreren Organellen konfrontiert. Ein Protein, das zu mehr als einer Organelle lokalisiert ist, muss der Ingenieur das gleiche Gen mit einer separaten Signalsequenz an die Organellen von Interesse zu klonieren mehrere Male, jedes. Für ein einzelnes Gen in drei Organellen, ist dies nur drei Gene. Aber für einen Sechs Gen Stoffwechselweg erweitert dies auf 18 Gene eine signifikante Klonen Aufwand. Die Kombination mehrerer Lokalisationssequenzen in einem einzigen, alternativ gespleißte Gen Zeichenificantly reduziert diese Anstrengung. Zum Beispiel, Re-Engineering Photorespiration 7,8 und 9,10 isoprenoiden Synthese betrifft sowohl die Chloroplasten und Peroxisomen. In unserem Fall nutzten wir Spleißstellen wie in einem natürlichen System Arabidopsis thaliana beobachtet zuvor beschriebenen 6. Wir rational gestaltete die mRNA-Sequenz, so dass die natürliche Spleißstellen allein, sondern platziert Sequenzen, die Chloroplasten oder Peroxisomen-Targeting-Tags innerhalb der alternativ gespleißten Introns (Abbildung 1) zu kodieren würde. Das exprimierte Protein kann oder kann nicht mit einem Tag, je nachdem, ob die prä-mRNA codiert, die es als ein Intron (Fig. 1g und 1h) ausgeschnitten. Für weitere Informationen über das Design der Konstrukte in dieser Arbeit vorgestellten, finden Sie im Artikel 11 Begleiter. Da dies immer noch eine signifikante Anstrengung Klonen, Gibson Anordnung, ein neues Verfahren zur Klonierung von DNA-Konstrukten, uim Aufbau sed. Gibson Verfahren kann für jede Sequenz verwendet werden, unabhängig von Restriktionsstellen (Fig. 2) 12-14. Die spezifische Kombination von Enzymen erlaubt eine Ein-Schritt-, Isothermischer Zusammenbau. In diesem Verfahren werden mehrere doppelsträngige lineare DNA Teile ausgebildet sind, daß sie überlappende Sequenzen von ~ 50 bp. Die Gibson Montage Enzym-Mix teilweise verdaut die lineare DNA-Teile, Belichten Einzelstränge von homologen Sequenzen. Diese Teil einzelsträngigen Sequenzen erneut geglüht in der Reaktionsmischung, was zu einer schnellen, einem Schritt, sequenzunabhängige Ligation freien Subklonierung Reaktion. Diese Arbeit beschreibt 1) rationale Design alternativ gespleißte Konstrukte für die Expression in Pflanzen Chloroplasten, Peroxisomen und Cytosol, 2), deren Klonierung mit dem neuen Ligation freie Methode von Gibson Montage, 3), deren Lieferung in Tabakblattzellen mit der Gene Gun und 4) Ergebnisse zeigen, Organellen-Targeting, als mit GFP beobachtetund konfokale Mikroskopie.

<table><tbody><tr><td>Oligonukleotid-Primer</td><td>IDT</td><td>(kundenspezifisch)</td><td>Design speziell für das Konstrukt</td></tr><tr><td>GeneBlocks</td><td>IDT</td><td>(benutzerdefiniert)</td><td>500 bp Oligonukleotide</td></tr><tr><td>ApE-Software</td><td>U Utah</td><td>(Download)</td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td></tr> <tr><td>MinElute kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Wird zur Aufreinigung von PCR-Produkten</td></tr><tr><td>verwendet QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Zur Herstellung von Klonierungs-geeigneten Mengen an</td></tr><tr><td>Plasmid Phusion Master Mix mit GC-Puffer</td><td>NEB</td><td>M0532S</td><td>Wird zur PCR-Amplifikation des interessierenden</td></tr><tr><td>Gens verwendet Gibson Assemblierung Reaktionsmischung</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Mastermix aus den folgenden 9 Bestandteilen</td></tr>: <tr><td>1 M Tris-HCl pH7,5</td><td>Teknova</td><td>T1075</td><td>Gibson Assemblierungsmischung</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>G Biowissenschaften</td><td>82023-086</td><td>Gibson Montagemischung</td></tr><tr><td>dNTP Mischung</td><td>Fermentas</td><td>R0192</td><td>Gibson Montagemischung</td></tr><tr><td>1 M DTT</td><td>Fermentas</td><td>R0861</td><td>Gibson Montagemischung</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Affymetrix</td><td>19966</td><td>Gibson Montagemischung</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Applichem</td><td>A1124,0005</td><td>Gibson Montagemischung</td></tr><tr><td>T5 Exonuklease</td><td>Epizentrum</td><td>T5E4111K</td><td>Gibson Montagemischung</td></tr><tr><td>Phusion-Polymerase</td><td>NEB</td><td>F530S</td><td>Gibson-Assemblierungsmischung</td></tr><tr><td>Taq-DNA-Ligase</td><td>NEB</td><td>M0208L</td><td>Gibson-Assemblierungsmischung</td></tr><tr><td>Gibthon.org</td><td></td><td></td><td>Website zur Vereinfachung von Berechnungen Plasmid</td></tr><tr><td>PLUS Maxi-Kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td>Wird zur Vorbereitung von DNA für Gen-Gun-Kugeln verwendet</td></tr><tr><td>Gene Gun-System</td><td>BioRad</td><td>165-2451</td><td>Enthält alle notwendigen Teile</td></tr><tr><td>Nicotania benthamiana</td><td>(n/a)</td><td>(n/a)</td><td>Geschenk von Jen Sheen, MGH</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Leica</td><td>SP5 X MP</td><td>Bildgebung von resultierenden Zellen</td></tr><tr><td>Deep-Well-Objektträger</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>71561-01</td><td>Wird für die konfokale Bildgebung</td></tr><tr><td>verwendet Ein Plasmid Editor (ApE) </td><td>University of Utah </td><td></td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td></tr><tr><td>Gibthon:Ligation Rechner</td><td></td><td></td><td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td></tr></tbody></table>

transient gene expression in tabak mit gibson versammlung und die gene gun

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Um ein einzelnes Protein, mehrere subzelluläre Organellen Ziel, Pflanzen in der Regel duplizieren die relevanten Genen und Express jedes Gen einzeln mit Hilfe komplexer Regulierungsstrategien einschließlich Differentialpromotoren und / oder Signalsequenzen. Metabolische Ingenieure und synthetische Biologen interessiert Zielenzyme zu einer bestimmten Organelle mit einer Herausforderung: ein Protein, das zu mehr als einer Organelle lokalisiert ist, muss der Ingenieur das gleiche Gen mehrfach klonen. Diese Arbeit stellt eine Lösung für diese Strategie: Nutzung alternatives Spleißen der mRNA. Diese Technologie nutzt die Vorteile der etablierten Chloroplasten und Peroxisomen-Targeting-Sequenzen und kombiniert sie zu einem einzigen mRNA, die alternativ gespleißt wird. Einige Splice-Varianten sind mit der Chloroplasten geschickt, um einige der Peroxisomen, und einige in das Cytosol. Hier wird das System für mehrere Targeting-Organellen mit alternativem Spleißen ausgebildet. In dieser Arbeit wurde GFP erwartet werden exprEssed in den Chloroplasten, Cytosol und Peroxisomen durch eine Reihe von rational entworfenen 5 &#39;mRNA-Tags. Diese Tags haben das Potential, die Menge der Klonierung heterologer Gene erforderlich, wenn benötigt, in mehreren subzellulären Organellen ausgedrückt reduzieren. Die Konstrukte wurden in früheren Arbeiten 11 ausgelegt und wurden mit Gibson Anordnung, eine Ligation unabhängigen Klonen Methode, die nicht Restriktionsenzyme erfordert geklont. Die resultierenden Plasmide wurden in Nicotiana benthamiana epidermale Blattzellen mit einem modifizierten Gene Gun-Protokoll eingeführt. Schließlich wurden umgewandelte Blätter mit der konfokalen Mikroskopie beobachtet.

Der konstruktive Aufwand war eine Folge der erheblichen Planung. Neuartige an diesem Projekt ist der Einsatz von alternativen Spleißen, eine pre-mRNA, die in differentiell exprimierten Proteine ​​übersetzt wird, zu erstellen. Diese Proteine ​​werden in verschiedenen Organellen ausgedrückt, in diesem Fall die Chloroplasten, Peroxisomen und / oder Cytosol. Wir passten natürliche Arabidopsis-Gen, das alternativ gespleißte ist 6 und platziert bekannt Chloroplasten 6 und 17 Peroxisom...

Diese Arbeit beschreibt ein neues Verfahren zur selektiven Targeting subzellulären Organellen in Pflanzen untersucht, mit dem BioRad Gene Gun.

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die transiente Genexpression eines mit GFP markierten Reporters in Epidermiszellen von Tabakblättern zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst ein DNA-Konstrukt entworfen wird, das in Chloroplasten und Peroxisomen exprimiert wird. Anschließend wird der Konstrukt mithilfe von PCR-Amplifikation und Gibson-Assembly hergestellt.Anschließend wird ein Genkanon verwendet, um den Konstrukt in Tabakblatt-Epidermiszellen einzubringen. Letztendlich zeigt die Bildgebung des Tabakblatts mittels konfokaler Mikroskopie die Expression von GFP im Chloroplasten und Peroxisom. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie dem klassischen Klonieren besteht darin, dass keine Restriktionsenzyme benötigt werden und somit jede Sequenz, die per PCR amplifiziert werden kann, geklont werden kann.Aufgrund der Flexibilität des genetischen Designs reichen die Anwendungen dieser Techniken bis hin zu einer größeren Skala. Die Gentechnik landwirtschaftlicher Pflanzen beginnt mit der Bestimmung der Stellen innerhalb der Pflanzenzelle für die endgültige Proteink表达. Bei dieser Arbeit liegt das Ziel in der gezielten Expression im Chloroplasten, Peroxisom und Cytosol.Als Nächstes entwerfen Sie den Expressionskonstrukt. Der Konstrukt muss einen Promotor, ein nachweisbares Gen und einen Terminator in einem einzigen Plasmid enthalten. In diesem Fall steuert der konstitutive Promotor P end cup zwei die Expression von GFP, gefolgt vom Nolene Synthe-Terminator oder nos t.Beachten Sie, dass in diesem Experiment eine Reihe von Tags, den sogenannten Trit-Tags eins, zwei und drei, getestet wird, die jeweils endständig an GFP fusioniert sind, um deren Expression in Chloroplasten und Peroxisomen zu untersuchen. Die Gibson-Assemblierungsmethode beruht auf der Wirkung mehrerer Enzyme in einer vorgefertigten Mischung, die die Enden doppelsträngiger DNA teilweise abbauen und dadurch das Anlagern komplementärer Basenpaare benachbarter DNA-Sequenzen ermöglichen. Der endgültige Konstrukt besteht aus drei Teilen, die vor der Gibson-Assemblierung in vier PCR-Reaktionen amplifiziert werden müssen.Die erste und zweite Reaktion amplifizieren einen 8.000 Basenpaare langen Plasmidvektor, PORE, der GFP NOS T und einen Kanamycinresistenzmarker enthält. Der Resistenzmarker ist eine geeignete Stelle, um diese große DNA in zwei kleinere Vorlagen aufzuteilen, die leichter per PCR amplifiziert werden können. Die dritte Reaktion amplifiziert den Promotor P end cup zwei, und die vierte Reaktion amplifiziert triag eins unter Verwendung von In-silico-Design-Software wie ape design, wobei der Konstrukt basenpaarweise entworfen wird, sodass zwischen den einzelnen Fragmenten eine Überlappung von 50 Basenpaaren besteht.Beim Bestellen von Primern für die PCR kann der 50 Basenpaare lange Überlappungsbereich verwendet werden, wobei die Primer jeweils 25 Basenpaare in jede Richtung abdecken. Nach der Durchführung der PCR zur Amplifikation der einzelnen Komponenten werden die PCR-Produkte getrennt voneinander gereinigt und in destilliertem, deionisiertem Wasser verdünnt. Wenn die PCR-Vorlage eine Mini-Präparation aus E. coli war, die mit dem Restriktionsenzym DpnI behandelt wurde, wird die kontaminierende Template-DNA entfernt. Anschließend werden die Konzentrationen der einzelnen DNA-Stücke gemessen.Stellen Sie die Vektor-Konzentration für jeden zu konstruierenden Konstrukt, einschließlich einer Kontrolle, auf etwa 150 Nanogramm pro Mikroliter ein, entnehmen Sie eine 15-Mikroliter-Aliquot der Gibson-Assemblierungsmischung aus dem Gefrierschrank und tauchen Sie sie auf Eis auf. Bestimmen Sie mithilfe des Online-Open-Source-Tools@gibbon. org die Volumina für äquimolare Mengen der einzelnen Fragmente.Geben Sie das berechnete Volumen jedes Fragments zur 15 µL Gibson-Mischung hinzu. Bereiten Sie außerdem eine Kontrolle mit der alleinigen Verwendung der Vektor-DNA vor. Das Gesamtvolumen jeder Reaktion sollte 20 µL betragen.Bei Bedarf Wasser verwenden, um das Volumen anzupassen. Die Röhrchen 30 bis 60 Minuten bei 50 bis 55 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die Röhrchen erneut auf Eis stellen.Entnehmen Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen mit einer kommerziellen Zubereitung von 200 µL kalziumchloridkompetenten E. coli aus einem Gefrierschrank bei minus 80 °C und erwärmen Sie es leicht mit der Hand. Geben Sie dann die gesamten 20 µL der Reaktion zu dem E. coli. Inkubieren Sie die Kulturen 30 Minuten auf Eis, anschließend überführen Sie sie in ein Wasserbad bei 42 °C und führen einen Hitzeschock für 60 Sekunden durch.Verwenden Sie keine elektrokompetenten Zellen. Die relativ hohe Salzkonzentration und niedrige DNA-Konzentration können dazu führen, dass die Zellen nach der Transformation einen Lichtbogen schlagen. Stellen Sie die Kulturen für zwei Minuten auf Eis zurück, geben Sie dann 750 Mikroliter SOC- oder LB-Medium hinzu und lassen Sie sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius regenerieren.Nächste Platte, das Gemisch auf LB-Platten mit Kanamycin oder einem anderen geeigneten Antibiotikum bei 37 Grad Celsius über Nacht inkubieren und 10 Kolonien durch Sequenzierung analysieren. Beachten Sie, dass diese Methode zu einer höheren Hintergrundaktivität und einer größeren Anzahl von Nicht-Ziel-Rekombinationsereignissen führen kann als der traditionelle, auf Ligierung basierende Klonierungsansatz. Die biotische Transfektion von Tabak mit einer Genkanone wurde bereits in JoVE beschrieben.Hier werden wichtige Schritte und Unterschiede zu früheren Protokollen erläutert. Nach der Amplifikation und Isolierung der Konstrukte bereiten Sie die Genkanonen-Pellets wie in dem JoVE-Artikel von Woods und Zeto beschrieben vor und laden Sie in die Genkanone, um epidermales Gewebe von Nico Tania Benham Miana-Tabakblättern zu transfizieren. Wählen Sie ein großes Blatt nahe der Basis einer drei bis fünf Monate alten Pflanze aus.Platzieren Sie es vorsichtig mit der Unterseite nach oben auf feuchte Papiertücher in eine 15 cm große Petrischale, wobei geeigneter Augen- und Gehörschutz getragen werden muss. Stellen Sie den Heliumdruck für die Genkanone auf 200 bis 250 PS.I ein und zielen Sie die Genkanone sorgfältig zwischen die Rippen auf der Unterseite eines Blattes, etwa drei bis fünf Zentimeter darüber. Nehmen Sie die Sicherung zurück und geben Sie die Teilchen auf das Blatt ab.Verwenden Sie jedes Projektil zweimal an derselben Stelle auf dem Blatt. Wechseln Sie bei einer Explosion des Blattes die Position und wiederholen Sie den Vorgang; falls erforderlich, entsorgen Sie das Blatt und beginnen Sie mit einem neuen. Aufgrund von Wachstumsbedingungen wie Alter, Feuchtigkeit usw. kann die Blattfestigkeit variieren.Nach der Applikation aller Partikel die Blätter abdecken und zwei bis drei Tage bei schwachem Licht auf dem Pult lagern. Die Blätter unter einem Stereomikroskop mit UV-Fluoreszenz untersuchen und nach einzelnen Zellen mit GFP-Expression suchen. Sobald Zellen mit GFP-Expression gefunden wurden, mit einer Schere vorsichtig Abschnitte von fünf bis zehn Millimeter Länge aus dem Blatt entfernen.Die einzelnen Blattfragmente sofort in der Vertiefung einer Tiefbrunnen-Mikroskopierkammer versenken, die etwa 200 µL 0,1 % Triton X-100 enthält. Das Detergens hilft dabei, Luftblasen auf der Oberfläche zu verhindern, und die Tiefbrunnen-Mikroskopierkammer ermöglicht eine größere Gewebebildfläche. Zellen werden mit einem konfokalen Mikroskop, ausgestattet mit den geeigneten Filtern und einer 40x-Wasser-Immersionsoptik, abgebildet. In dieser Studie wurden die drei verschiedenen GFP-Organelle-Targeting-Konstrukte mit untag-GFP und einem rubis.Coag. verglichen.Die GFP-Konfokalmikroskopie wurde verwendet, um die GFP-Fluoreszenz in transient transformierten Einzelzellen in Kontrollexperimenten nachzuweisen, in denen unmarkiertes GFP exprimiert wurde. Die Fluoreszenz ist ausschließlich im Kern und im Cytosol zu beobachten, nicht jedoch in den Chloroplasten, die durch die rote Autofluoreszenz des Chlorophylls identifiziert werden, wie in diesem Beispiel einer Zelle, die mit einem nur für Chloroplasten bestimmten Rubis-Oag-GFP-Konstrukt transfiziert wurde. Der GFP-Konstrukt GFP wurde in den großen Organellen exprimiert.Die Zelle ist in Weiß hervorgehoben. Das Gelb zeigt Bereiche der Kolokalisation des Konstrukts mit Chlorophyll an, was darauf hinweist, dass das Konstrukt, wie in diesem Bild einer mit Triag eins transfizierten Zelle gezeigt, in den Chloroplasten lokalisiert ist. Die GFP-Expression ist in den Chloroplasten, an den Rändern, im Cytosol und in kleinen punktförmigen Organellen, die als Peroxisomen vermutet werden, sichtbar. Ebenso exprimieren mit Triag zwei transfizierte Zellen GFP in den Chloroplasten, im Cytosol und in Peroxisomen. Triag drei, das ein Peroxisomensignal enthält, das in einen Bereich geringer Komplexität der Chloroplastensequenz eingebettet ist, lokalisiert sich ausschließlich in den Chloroplasten und Peroxisomen.Beachten Sie, dass sich diese Zelle in einer anderen Blattschicht befindet. Diese Abbildung fasst die Expression zusammen, die in den Kompartimenten einer typischen epidermalen Tabakblattzelle beobachtet wurde. Die relativen Größen und Positionen innerhalb der Zelle sind dargestellt sowie die relativen Expressionsniveaus, die mittels Genkanüchen-Transfektion und konfokaler Mikroskopie beobachtet wurden.Beachten Sie, dass das nicht markierte GFP im Zytoplasma und im Zellkern lokalisiert ist, die PIMT-2-GFP-Kontrolle im Chloroplasten, und Triag-1-GFP, Triag-2-GFP sowie Triag-3G-FP wie vorhergesagt im Chloroplasten und im Peroxisom lokalisiert sind. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Plasmid mittels Gibson-Assembly konstruiert, es ballistisch in Tabakblätter einführt und innerhalb von drei Tagen die GFP-Expression beobachtet. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, 150 Nanogramm pro Mikroliter Vektor-DNA für die Gibson-Assembly und 1500 Nanogramm pro Mikroliter der endgültigen DNA-Konstrukte zur Herstellung der Genkanonen-Patronen zu verwenden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Agrobakterium-Transfektion durchgeführt werden, um eine stabile statt einer transienten Genexpression zu erzielen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Beschreibung eines Virus-induzierte Gen-Silencing (VIGS)-Methode für knock-down der Genexpression...

Virus-induzierten Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana Und Tomaten

Pflanzen bieten ein neuartiges System für die Produktion von pharmazeutischen Proteinen in einem kommerziellen Maßstab, die besser skalierbare, kosteneffiziente und sichere als aktuellen Ausdruck Paradigmen ist. In dieser Studie berichten wir über eine einfache und bequeme, aber skalierbaren Ansatz zur Ziel-Gen enthält,...

Effiziente Agroinfiltration von Pflanzen für High-Level-Transient Expression von rekombinanten Proteinen

Virus-induzierte Gen-Silencing ist ein nützliches Instrument zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz von Pflanzen beteiligt. Wir demonstrieren die Verwendung von bakteriellen Erregern exprimieren GFPuv identifizieren Gen stumm Pflanzen anfällig Nichtwirt Krankheitserreger. Dieser Ansatz ist einfach, schnell und erleichtert groß angelegte Screening und ähnliches Protokoll zu studieren verschiedene andere Pflanzen-Mikroben-Interaktionen angewendet werden kann.

VIGS-vermittelte Stürmer Genetics Screening zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz Beteiligte

Transient Proteinproduktion in Pflanzen Nicotiana basierend auf Vakuum-Infiltration mit Agrobakterien Buchstart-Vektoren (Tabak-Mosaik-Virus-basierten) ist ein schneller und wirtschaftlicher Ansatz für Impfstoff-Antigene und therapeutische Proteine ​​zu produzieren. Wir vereinfacht das Verfahren und die verbesserte Ziel Akkumulation durch die Optimierung der Bedingungen von Bakterien Anbau, Auswahl Wirtsarten, und Co-Einführung von RNA-Silencing Unterdrücker.

Optimierung und Nutzung von<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transient-vermittelte Proteinproduktion in<em&gt; Nicotiana</em

Wir beschreiben eine Anordnung von Experimenten Ansatz, der verwendet werden kann, um festzustellen und das Modell des Einflusses der Transregulationselemente, Pflanzenwachstum und Entwicklung Parameter und Inkubationsbedingungen für die vorübergehende Expression von monoklonalen Antikörpern und Reporter-Proteine ​​in Pflanzen auf.

Charakterisierung komplexer Systeme Mit dem Design of Experiments Ansatz: Transient Protein Expression in Tabak als Case Study

Tabakpflanzen wurden verwendet, um eine Pilz-Cellulase, TrCel5A erzeugen, über einen transienten Expressionssystem. Die Expression kann unter Verwendung eines fluoreszierenden Fusionsproteins überwacht werden, und die Proteinaktivität wurde nach der Expression charakterisiert.

Expression von rekombinanten Cellulase aus Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In Tabakpflanzen

Die Synthese von benutzerdefinierten Plasmiden ist arbeits- und zeitaufwendig. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Gibson-Assemblierungsklonierung, um den Aufwand und die Dauer des individuellen DNA-Klonierungsverfahrens zu reduzieren. Das beschriebene Protokoll produziert auch zuverlässige getaggte Proteinkonstrukte für die Expression von Säugetieren zu ähnlichen Kosten wie die traditionelle Cut-and-Paste-DNA-Klonierung.

Erzeugung von Plasmid-Vektoren, die FLAG-markierten Proteine ​​Nach der Verordnung der Menschen Elongation Factor-1α Promoter Mit Gibson Assembly

In dieser Studie wurde die Expression eines humanen rekombinanten Zielproteins in verschiedenen Produktionsplattformen verglichen. Wir konzentrierten uns auf traditionelle fermenterbasierte Kulturen und auf Pflanzen, beschrieben den Aufbau jedes Systems und hoben auf der Grundlage der berichteten Ergebnisse die inhärenten Grenzen und Vorteile für jede Plattform hervor.

Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine ​​in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme

Auf subzellulärer Ebene werden Signalereignisse dynamisch durch Entwicklungs- und Umwelteinflüsse moduliert. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das das transiente Expressionssystem Tabak verwendet, um die dynamische Protein-Protein-Interaktion zu überwachen und die räumliche Organisation der Signaltransduktion in Pflanzenzellen aufzudecken.

Imaging Räumliche Reorganisation eines MAPK Signalweg Verwendung des Tabak Transient Expression System

Mit einem pBIBAC-GW binären Vektor macht Erzeugung transgene Pflanzen mit intakten Single Copy Einfügungen, ein einfacher Vorgang. Hier präsentiert eine Reihe von Protokollen, die führen des Lesers durch den Prozess der Generierung von transgenen Pflanzen in Arabidopsis und Versuchsanlagen für Unversehrtheit und Anzahl der Einsätze zu kopieren.

Generierung von transgenen Pflanzen mit Single-Copy-Einschübe mit binären Vektor BIBAC-GW

Transiente heterologen Expression von biosynthetischen Enzymen in Nicotiana Benthamiana Blätter kann endogene Lieferungen von 2,3-Oxidosqualene auf die Herstellung von qualitativ hochwertigen Triterpene Neuheiten abzulenken. Hierin ist ein detailliertes Protokoll für Rapid (5 Tage) präparative angelegte Produktion von TRITERPENE und Analoga, die unter Verwendung dieser leistungsstarken pflanzlichen Plattform beschrieben.

Transiente Expression in Nicotiana Benthamiana Blätter für Triterpene Produktion im präparativen Maßstab

Lernen Sie die transienten Genexpression in Tabakblättern mit Gibson-Assembly und Genkanone zur Untersuchung von Chloroplasten und Peroxisomen. Diese Methode ermöglicht die schnelle Visualisierung durch konfokale Mikroskopie.

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

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