Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die transiente Genexpression von A GFP-markiertem Reporter in Epidermiszellen von Tabakblättern zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst ein DNA-Konstrukt entworfen wird, das in den Chloroplasten und Peroxisomen exprimiert wird. Das Konstrukt wird dann mittels PCR-Amplifikation und Gibson-Assemblierung aufgebaut.

Als nächstes wird eine Genkanone verwendet, um das Konstrukt an die Epidermiszellen der Tabakblätter zu liefern. Letztendlich zeigt die Bildgebung des Tabakblattes durch konfokale Mikroskopie die GFP-Expression im Chloroplasten und Peroxisom. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der klassischen Klonierung, besteht darin, dass sie keine Restriktionsenzyme benötigt und somit jede Sequenz, die durch PCR amplifiziert werden kann, kloniert werden kann.

Aufgrund der Flexibilität des genetischen Designs erstrecken sich die Anwendungen dieser Techniken auf einen größeren Maßstab. Gentechnik von Nutzpflanzen Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie die Stellen innerhalb der Pflanzenzelle für die endgültige Proteinexpression bestimmen. Ziel dieser Arbeit ist es, die Expression auf den Chloroplasten, das Peroxisom und das Zytosol auszurichten.

Entwerfen Sie als Nächstes das Ausdruckskonstrukt. Das Konstrukt muss einen Promotor, ein nachweisbares Gen und einen Terminator in einem einzigen Plasmid enthalten. In diesem Fall treibt der konstitutive Promotor P Endbecher zwei die Expression von GFP an, woraufhin das Nolene Synthe, der Terminator oder nos t folgt.

Beachten Sie, dass wir in diesem Experiment eine Reihe von Tags, Trit-Tags, einem, zwei und drei exprimierten Endterminals an GFP für die Expression in Chloroplasten und Peroxisomen testen werden. Die Gibson-Assemblierungsmethode beruht auf der Wirkung mehrerer Enzyme in einer vorgefertigten Mischung, um die Enden der doppelsträngigen DNA teilweise zu verdauen und das Annealing komplementärer Basenpaare benachbarter DNA-Sequenzen zu erleichtern. Das endgültige Konstrukt besteht aus drei Teilen, die vor dem Zusammenbau von Gibson in vier PCR-Reaktionen amplifiziert werden müssen.

Die erste und zweite Reaktion amplifizieren einen Plasmidvektor mit 8.000 Basenpaaren, PORE, der GFP NOS T und einen cany-Resistenzmarker enthält. Der Resistenzmarker ist ein guter Ort, um diese große DNA in zwei kleinere Templates zu unterteilen, die leichter PCR-amplifiziert werden können. Die dritte Reaktion amplifiziert den Promotor P Endkelche zwei, und die vierte Reaktion verstärkt die Triag eins unter Verwendung einer In-silico-Designsoftware wie Ape Design, dem Konstrukt Basis für Basis, so dass es eine Überlappung von 50 Basenpaaren zwischen jedem Stück gibt.

Bei der Bestellung von Primern für die PCR ist es möglich, die Überlappung von 50 Basenpaaren zu verwenden, da die Primer 25 Basenpaare in jede Richtung aufweisen. Nachdem Sie die PCR zur Amplifikation jeder Komponente durchgeführt haben, reinigen Sie das PCR-Produkt separat und verdünnen Sie es in destilliertem deionisiertem Wasser. Wenn es sich bei dem PCR-Template um ein Mini-Prep aus einer E-Coli-Behandlung mit dem Restriktionsenzym DPN handelte, wird die kontaminierende Template-DNA entfernt. Messen Sie als Nächstes die Konzentrationen der einzelnen DNA-Stücke.

Stellen Sie die Vektorkonzentration auf etwa 150 Nanogramm pro Mikroliter für jedes zu montierende Konstrukt ein, einschließlich einer Steuerung, nehmen Sie ein 15-Mikroliter-Aliquot der Gibson Assembly-Mischung aus dem Gefrierschrank und tauen Sie es auf Eis auf. Unter Verwendung der Online-Open-Source-tool@gibbon. org die Volumina für die äquimolaren Mengen jedes der Fragmente bestimmen.

Geben Sie das berechnete Volumen jedes der Fragmente in die 15-Mikroliter-Gibson-Mischung. Bereiten Sie auch eine Kontrolle nur der Vektor-DNA vor. Das Gesamtvolumen jeder Reaktion sollte 20 Mikroliter betragen.

Verwenden Sie Wasser, um die Lautstärke bei Bedarf anzupassen. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 50 bis 55 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten. Legen Sie die Röhrchen nach der Inkubation wieder auf Eis.

Nehmen Sie ein Mikrofuge-Röhrchen, das ein handelsübliches Präparat aus 200 Mikrolitern Calciumchlorid-kompetenten E-coli enthält, aus einem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius und erwärmen Sie es leicht von Hand. Geben Sie dann alle 20 Mikroliter der Reaktion zu den E-coli hinzu. Inkubieren Sie die Kulturen 30 Minuten lang auf Eis und geben Sie sie dann in ein Wasserbad bei 42 Grad Celsius und einen Hitzeschock für 60 Sekunden.

Verwenden Sie keine elektrokompetenten Zellen. Die relativ hohe Salzkonzentration und die niedrige DNA-Konzentration können dazu führen, dass die Zellen nach der Transformation bogenförmig werden. Setzen Sie die Kulturen für zwei Minuten wieder auf Eis, geben Sie dann 750 Mikroliter SOC- oder LB-Medium und lassen Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius erholen.

Nächste Platte, die Mischung auf LB-Platten mit Cany oder einem anderen geeigneten Antibiotikum inkubieren bei 37 Grad Celsius über Nacht 10 Kolonien durch Sequenzierung. Beachten Sie, dass diese Methode zu einem höheren Hintergrund und einer höheren Anzahl von Nicht-Ziel-Rekombinationsereignissen führen kann als herkömmliches ligationsbasiertes Klonen. Die biotische Transfektion von Tabak mit einer Genkanone wurde bereits in JoVE beschrieben.

Hier werden die wichtigsten Schritte und Unterschiede zu früheren Protokollen überprüft. Nach der Amplifikation und Isolierung der Konstrukte bereiten Sie Genpistolenkugeln vor, wie im JoVE-Artikel von Woods and Zeto beschrieben, und laden Sie sie in die Genkanone für die Transfektion von Nico Tania Benham Miana Tabakblatt-Epidermisgewebe. Wähle ein großes Blatt in der Nähe der Basis einer drei bis fünf Monate alten Pflanze.

Legen Sie es vorsichtig mit der unteren Seite nach oben auf nasse Papiertücher in eine 15 Zentimeter große Petrischale und tragen Sie einen geeigneten Augen- und Gehörschutz. Stellen Sie den Heliumdruck für die Genkanone auf 200 bis 250 PS ein. Vorsichtig ziele ich mit der Genkanone zwischen die Rippen auf der Unterseite eines Blattes, etwa drei bis fünf Zentimeter darüber. Lösen Sie die Sicherung und geben Sie die Partikel an das Blatt ab.

Verwende jede Kugel zweimal an der gleichen Stelle auf dem Blatt. Wechseln Sie an eine andere Position und wiederholen Sie den Vorgang, wenn das Blatt explodiert, verwerfen Sie es und beginnen Sie ein neues Blatt. Es gibt eine gewisse Varianz in der Zähigkeit der Blätter aufgrund von Wachstumsbedingungen wie Alter, Feuchtigkeit usw.

Nachdem alle Schüsse abgegeben wurden, decken Sie das Blatt ab und lagern Sie es zwei bis drei Tage bei schwachem Licht auf der Bank. Untersuchen Sie das Blatt in einem Präpariermikroskop, das mit UV-Fluoreszenz ausgestattet ist, und suchen Sie nach einzelnen Zellen, die GFP exprimieren. Wenn Zellen gefunden werden, die GFP exprimieren, verwenden Sie eine Präparierschere, um vorsichtig fünf bis 10 Millimeter große Blattabschnitte zu extrahieren.

Tauchen Sie jedes einzelne Blattfragment sofort in die Vertiefung eines Deep-Well-Objektträgers, der etwa 200 Mikroliter Triton X 100 enthält. Das Reinigungsmittel verhindert, dass sich Luftblasen auf der Oberfläche bilden, und der Deep-Well-Objektträger ermöglicht die Bildgebung von Zellen im größeren Gewebebildgebungsbereich mit einem konfokalen Mikroskop, das mit den entsprechenden Filtern und einem 40-fach-Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet ist. In dieser Studie wurden die drei verschiedenen GFP-Organellen-Targeting-Konstrukte mit untags GFP und a rubis verglichen. Coag.

konfokale GFP-Mikroskopie wurde verwendet, um die GFP-Fluoreszenz in den transient transformierten Einzelzellen in Kontrollexperimenten zu detektieren, in denen nicht markiertes GFP exprimiert wurde. Fluoreszenz wird nur im Zellkern und im Zytosol beobachtet, nicht aber im Chloroplasten, die durch die rote Autofluoreszenz des Chlorophylls gekennzeichnet sind, wie in diesem Beispiel einer Zelle zu sehen ist, die nur mit einem Chloroplasten (Rubis Oag) transfiziert wurde. GFP-Konstrukt GFP wurde in den großen Organellen exprimiert.

Die Zelle ist weiß umrandet. Das Gelb zeigt Bereiche mit Kolokalisation des Konstrukts mit Chlorophyll, was darauf hindeutet, dass das Konstrukt auf den Chloroplasten ausgerichtet ist, wie in diesem Bild eines Triags einer transfizierten Zelle zu sehen ist. Die GFP-Expression einer Triag-Zelle ist im Chloroplasten, in den Peripherien, im Zytosol und in kleinen punktförmigen Organellen zu sehen, von denen angenommen wird, dass es sich um Peroxisomen handelt. Ebenso exprimieren triag zwei transfizierte Zellen auch GFP im Chloroplasten-Zytosol und Peroxisomen triag drei, das aus einem Peroxisomsignal besteht, das in einen Bereich der Chloroplastensequenz mit geringer Komplexität eingebettet ist, der nur an den Chloroplasten und das Peroxisom lokalisiert ist.

Beachten Sie, dass sich diese Zelle in einer anderen Blattschicht befindet. Diese Abbildung fasst die Expression zusammen, die in den Kompartimenten einer typischen Epidermiszelle eines Tabakblatts beobachtet wird. Die relativen Größen und Orte innerhalb der Zelle werden gezeigt und die relativen Expressionsniveaus mittels Gen-Gun-Transfektion und konfokaler Mikroskopie beobachtet.

Beachten Sie, dass das untag-GFP an das Zytosol und den Zellkern lokalisiert ist, die PIMT-Zwei-GFP-Steuerung an den Chloroplasten und Triag an GFP, Triag zwei GFP und Triag 3G FP an den Chloroplasten und das Peroxisom, wie vorhergesagt, lokalisiert ist. Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Plasma mit Gibson-Assemblierung konstruiert. Geben Sie es bally an Tabakblätter ab und beobachten Sie die GFP-Expression innerhalb von drei Tagen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, 150 Nanogramm pro Mikroliter Vektor-DNA für die Gibson-Assemblierung und 1500 Nanogramm pro Mikroliter Ihres endgültigen DNA-Konstrukts zu verwenden, um Ihre Genkanonenkugeln herzustellen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Agrobacterium-Transfektion durchgeführt werden, um eine stabile Genexpression zu erhalten, anstatt sie zu vergänglich.