Imaging Durch die Puppenhülle von Drosophila melanogaster

Dieses Papier zeigt die Verwendung eines schnellen konfokalen Mikroskop, um Bildzelle Verhalten direkt durch die Puppenhülle. Nach dem Verlassen der Puppenhülle intakt ist, erlaubt dieses Verfahren die Beobachtung und Messung von dynamischen Zellprozesse im Stadium der Drosophila-Entwicklung, die schwer direkt zu studieren.

In diesem Video werden wir neuartige Techniken demonstrieren, die es uns ermöglichen, das Schamhaar von Drosophila Melanogaster abzubilden, ohne die strukturelle Integrität des Puers zu beeinträchtigen. Indem wir das Pupillengehäuse intakt halten, minimieren wir die Auswirkungen der Bildgebung auf die Entwicklung und Lebensfähigkeit der Puppe. Für die Bildgebung verwenden wir ein resonantes konfokales Rastermikroskop mit 8.000 Hertz.

Wichtig ist, dass die sehr hohe Scangeschwindigkeit und die hohe Empfindlichkeit dieses Mikroskops das Bleichen erheblich reduzieren und längere Beobachtungszeiten ermöglichen. Mit dieser Methode konnten wir eine Vielzahl von zellbiologischen Prozessen sichtbar machen, darunter das Verhalten, fop, Podien, Morphogenese, Phagozytose und Mitose. Mit dieser Technik können wir Ereignisse über längere Zeiträume in situ beobachten, ohne den Organismus zu schädigen.

Die Beobachtungen, die wir mit diesen Methoden gewonnen haben, können verwendet werden, um eine Vielzahl von biologischen Phänomenen in diesem relativ unzugänglichen Stadium der Drosophila-Entwicklung zu verstehen, die Cheese-Menschen, das geeignete Stadium, wir untersuchen sie, während wir noch im Fläschchen nach Schlüsselindikatoren im Entwicklungsstadium suchen, um Zellteilungen zu untersuchen, wir suchen nach Pipa, die ihren Kopf abgewandt haben, Zeigen aber immer noch keine grünen Päckchen und Mekonium und den Hinterbauch. Die Individuen werden gelöst, indem sie das Guckgehäuse mit einem feuchten Pinsel berühren und Wasser auftragen, um den Speichelkleber aufzulösen. Pipa werden dann sanft freigestupst, mit dem Pinsel aufgenommen und in eine mit Wasser gefüllte Petrischale gegeben.

Die Personen werden gründlich im Wasser gewaschen, um das Gehäuse von Lebensmitteln oder Schmutz zu reinigen. Dann richten wir sie mit der Rückenseite nach oben aus, um sicherzustellen, dass sie sich im richtigen Stadium befinden. Gehen Sie vorsichtig mit ihnen um.

Sie können leicht absterben, wenn auch nur ein kleines Loch in das Rohr gebohrt wird. Ausgewählte Personen werden sorgfältig platziert und mit Glasboden in die Petrischale gekleidet, so ausgerichtet, dass das interessierende Merkmal dem Deckglas am nächsten und so parallel wie möglich zur Oberfläche ist. Um den Pupillenflügel zu beobachten, stützen wir die Puppe gegen die Stütze, wie z.B. eine dünne Länge, die Modelliermasse oder das Zahnwachs, und stellen sicher, dass sie sich nach der Orientierung nicht bewegen.

Dann laden wir das Gericht ein, um sicherzustellen, dass das interessante Merkmal sichtbar und gut ausgerichtet ist. In der Regel schützen Sie sich mit mehreren Pipa auf einmal vor der Möglichkeit, dass eine das fluoreszierende Protein nicht exprimiert oder sich nicht in einem gewünschten Stadium befindet. Sobald die Pipa alle montiert und richtig ausgerichtet sind, berühren wir die Basis jeder Pipa mit einem Pinsel, der mit Dirod-Dilinglykol angefeuchtet ist, einem ungiftigen Berg, der dem Brechungsindex von reinem Öl oder einem Wasser von verdünntem Wasser entspricht.

Dies dient einem doppelten Zweck: Er reduziert die Beugung aus dem Pupillengehäuse und reduziert die Brechung der Immersion. Linsen werden verwendet. Sobald wir die Pupille richtig montiert und angeordnet haben. Wir gehen zum konfokalen Laserscanning-Mikroskop über. Wir verwenden einen invertierten wie einen SP five, der mit einem Resonanzscanner ausgestattet ist.

Die Schüssel wird auf das Mikroskop montiert und wir lokalisieren den Puput mit der Mikroskopoptik. Sobald die Puppe gefunden ist, passen Sie den Fokus so an, dass das in diesem Fall interessante Merkmal, der Flügel, sichtbar ist. Wir identifizieren den Flügel durch das Vorhandensein eines großen trachealen Elements, das durch die Mitte des Flügels verläuft.

Wenn der interessierende Bereich identifiziert und das Mikroskop fokussiert ist, wenden wir uns dem 20 x trockenen Objektiv zu. Nach erneuter Bestätigung der Fokussierung schalten wir das Mikroskop in den konfokalen Modus. Wir passen die Parameter der Konfokalen an, um die Lichteinwirkung zu minimieren.

Die Lichtintensität wird unter 10% Transmission gehalten. Um die Helligkeit zu maximieren, öffnen wir bei der 20-fach-Linse mit azuma four die Lochblende auf 130 Mikrometer und stellen den Gain auf 900 Volt ein. Mit diesen Einstellungen können wir stundenlang Bilder machen, ohne die Länge des mitotischen Intervalls oder die Gesundheit des Tieres zu beeinträchtigen.

Als nächstes stellen wir die Anzahl der Z-Abschnitte und die Häufigkeit der Bildaufnahme so ein, dass sie den Eigenschaften des biologischen Phänomens entsprechen, das wir zu beobachten versuchen, z. B. einminütige Bildgebungsintervalle, um alle wichtigen Merkmale der Zellteilung ausreichend zu erfassen. Aber drei Sekunden-Intervalle sind wichtig, um die Dynamik der Phylo Podia zu beobachten. Fokussiere dich durch das Epithel nach oben und unten, bis du das gewünschte Merkmal gefunden hast.

Verwenden Sie bei Bedarf das Mikroskop und den XYZT-Modus, um Z-Stapel im Zeitverlauf zu erfassen. Auch die Dauer von Filmen ist ein wichtiger Parameter. Wir haben Videos mit einer Länge von bis zu 10 Stunden gemacht.

Wenn wir mehrere fluoreszierende Moleküle gleichzeitig abbilden, versuchen wir, die Gesamtdauer der Bildgebung zu verkürzen. Im Prinzip bewirkt jede fluoreszierende Markierung eine größere Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies. In der Praxis haben wir keine Letalität im Zusammenhang mit der Abbildung von dreifach markierten Linien für eine Stunde oder weniger beobachtet.

Wenn das Zielgewebe oder der Prozess kleiner als etwa fünf Mikrometer ist, müssen Sie wahrscheinlich eine Immersionslinse verwenden. Denken Sie daran, dass diese Objektive den Laser auf einen feineren Punkt fokussieren, wodurch die Lichtintensität erhöht wird, und Sie müssen die Bildparameter entsprechend anpassen. Filme werden vom Konfokalmikroskop auf einen Computer übertragen, auf dem das Bildanalyseprogramm Freeway Fidschi ausgeführt wird. Mit Fidschi können wir Merkmale in den mehrdimensionalen Bildern, die vom Konfokal erzeugt werden, öffnen, messen und manipulieren.

Diese Methode der Bildgebung hat es uns ermöglicht, die Position der Zellkerne in Bezug auf den Zellzyklus zu untersuchen. Im Pupillenflügel sammelten wir im Abstand von einer Minute einen Z-Stapel von der Oberseite des Epithels bis zu den untersten beobachtbaren Kernen. In diesen Filmen haben wir nur Teilungen in den apikalen konfokalen Schnitten beobachtet, die hier links gezeigten basalen Schnitte zeigen die Rückkehr neu geteilter Kerne aus der oberflächlichen Schicht, enthalten aber keine anderen Merkmale der Mitose.

Diese Daten zeigen, dass das sich schnell teilende Pupillenflügelepithel der Flügellarvenscheibe und anderen MedOne ähnelt. Das Epithel in diesen Kernen wandert während der Mitose zur apikalen Oberfläche des Epithels. Trotz dieser Gemeinsamkeit ist das Pupillenflügelepithel relativ unstampifiziert, wobei die meisten Kerne sehr nahe an der obersten Schicht liegen.

Bisherige Methoden zur Bildgebung von Drosophila in den frühen Stadien der Pupillenentwicklung wurden behindert, vor allem durch Versuche, die Pupille zu entfernen oder zu durchdringen. Wir beschreiben hier einen neuartigen Ansatz, der es uns ermöglicht, adulte Zellen während der Entwicklung sichtbar zu machen, ohne die Lebensfähigkeit des Organismus zu beeinträchtigen. Unsere Methode unterscheidet sich qualitativ von anderen dadurch, dass sie das Pupillengehäuse vollständig intakt hält.

Die Kombination von konfokaler Mikroskopie mit resonanter Abtastung ermöglicht es uns, sich entwickelndes Gewebe innerhalb von 20 Mikrometern um das Pupillengehäuse sichtbar zu machen. Die Haupteinschränkungen bei der Auflösungstiefe sind der Arbeitsabstand der Linse und die Streuung aus dem Gehäuse im Gewebe. Unsere Methode ermöglicht es uns jedoch, Merkmale der Epithelzellen von der Spitze bis zur Basis aufzuklären.

Wir haben diese Technik verwendet, um Mitose, Phylo, Podia, Morphogenese und Phagozytose zu beobachten. Darüber hinaus haben wir bis zu drei verschiedene fluoreszierende Tags in einer Probe untersucht. Wir gehen davon aus, dass die hier beschriebenen Ansätze die frühe Phase der Pupillenentwicklung bis hin zur Erforschung der äußersten Epithelschichten geöffnet haben.

In Kombination mit der Kraft der geologischen Genetik kann diese Zugänglichkeit unser Verständnis der Entwicklung von Erwachsenen weiter verbessern.