Name: Hirnschnitt Biotinylierung: Eine Ex Vivo Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Lernen Sie die Hirnschnitt-Biotinylierung zur Quantifizierung akuter Veränderungen neuronaler Oberflächenproteine in adulten Neuronen. Diese ex-vivo-Methode ermöglicht präzise Analysen des Proteinhandels für Neurowissenschaft und Neuropharmakologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse DA15169 und DA035224 zu HEM finanziert

Alle Tierbehandlung und Gewebe Ernte wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der University of Massachusetts Medical School Institutional Animal Care Use Committee (IACUC) durchgeführt, nach dem genehmigten Protokoll # A1506 (Melikian, PI). Benötigte Lösungen Künstliche Liquor (ACSF) - Machen Sie täglich frisch 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl 2, 2,4 mM CaCl 2, 26 mM NaHCO 3 und 11 mM Glucose Hinweis: Bereiten ACSF als 10x Stammlösung, ohne NaHCO 3 und Glucose. Machen 1x Arbeitslösungen täglich aus dem 10fach, in Ergänzung mit frischen NaHCO 3 und Glucose. Saccharose-ergänzt ACSF (SACSF) - Stellen täglich frisch 250 mM ErfolgRose, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl 2, 2,4 mM CaCl 2, 26 mM NaHCO 3 und 11 mM Glucose Hinweis: Bereiten SACSF als 10x Stammlösung, ohne NaHCO 3 und Glucose. Machen 1x Arbeitslösungen täglich aus dem 10fach, in Ergänzung mit frischen NaHCO 3 und Glucose. Sulfo-N-Hydroxysuccinyl-SS-Biotin (Sulfo-NHS-SS-Biotin, Pierce Chemical Company) Auf Lösungen sollten 200 mg / ml in DMSO und sind resistent gegen mehrere Einfrieren / Auftauen. Aliquots werden bei -20 ° C gelagert Die Succinylester schnell in wässriger Lösung hydrolysiert, so Arbeits Lösungen sollten unmittelbar vor dem Aufbringen auf Scheiben hergestellt werden. Scheibe Quench-Lösung ACSF mit 100 mM Glycin supplementiert RIPA Lyse Buffer 10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 1% Triton-X-100, 0,1% SDS, 1% Na-Desoxycholat RIPA mit Protease-Inhibitoren (RIPA / PI) - Machen Sie täglich frisch RIPA ergänzt mit 1 &amp;mgr; M Leupeptin, 1 &amp;mgr; M Pepstatin, 1 &amp;mgr; M Aprotinin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid. 1. Bereiten Hirnschnitten <ol><li> Stellen Sie frische 1x SACSF und 1x ACSF </li><li> Chill-SACSF auf Eis in einem kleinen Becherglas. Dies wird verwendet, um die frisch geernteten Gehirn der Maus zu halten. </li><li> Tränken Sie das ACSF und SACSF mit Sauerstoff durch Blasenbildung mit 95% / 5% O 2 / CO 2, 20 min auf Eis. </li><li> P30-38-Mäuse sollten für eine optimale Gewebelebensfähigkeit verwendet werden. Sacrifice Tiere durch Genickbruch und Enthauptung, und das Gehirn wird rasch zu entfernen, in vorgekühlte, sauerstoff SACSF. </li><li> Mit Hilfe eines vibrierenden Mikrotom, stellen 300 um Gehirnschnitte in der Region von Interesse. </li><li> Falls gewünscht, können weitere Scheiben vor der Verwertung zerlegt werden, um für bestimmte Hirnregionen oder separaten rechten und linken Hemisphäre als Kontroll-und Versuchsscheiben zu verwenden, bzw. zu bereichern. </li><li> Mit einem feuerpolierten Pasteur Pipette Scheiben Kammern in 24-Well-Platten gesetzt Boden eingreifen. </li><li> Lassen Scheiben für 40 min in Sauerstoff angereichert ACSF erholen, 31 ° C, mit ständigen, sanfte Blubbern. </li></ol> 2. Drug Treatment (falls zutreffend) und Scheibe Biotinylierung <ol><li> Nach der Erholung, waschen Scheiben 3x in vorgewärmten (37 ° C), sauerstoff ACSF sprudelnden ständig mit 95% / 5% O 2 / CO 2. </li><li> In Testverbindungen und Inkubation mit kontinuierlicher Sauerstoffversorgung. <ol><li> Für die Bequemlichkeit, einen 1/10 Volumen 10x konzentrierter Droge, und mischen durch vorsichtiges Umdrehen. </li><li> Schütteln Platten vorsichtig in einem Wasserbad bei der gewünschten Temperatur. </li></ol></li><li> Nach der medikamentösen Behandlung, schnellChill-Scheiben durch Waschen 3x in eiskalter ACSF. </li></ol> 3. Biotinylieren Oberflächenproteine <ol><li> Planen 1,0 mg / ml Sulfo-NHS-SS-Biotin in eiskaltem ACSF unmittelbar vor der Etikettierung. </li><li> In 0,75 ml Sulfo-NHS-SS-Biotin an Scheiben Scheiben und Inkubation auf Eis, 45 min. </li><li> Dreimal waschen Scheiben schnell mit eiskaltem ACSF, dann Inkubation für 10 min in eiskaltem ACSF auf Eis. </li><li> Scheiben waschen dreimal mit eiskaltem Scheibe Quenchpuffer und Inkubation mit 0,75 ml Scheibe Quenchpuffer zwei Mal, 25 min, auf Eis, freie Sulfo-NHS-SS-Biotin zu stillen. </li></ol> 4. Bereiten Gewebelysaten <ol><li> Dreimal waschen Scheiben in eiskalter ACSF und übertragen jede Scheibe zu einem Mikrozentrifugenröhrchen mit einer feuerpolierten Pasteurpipette. </li><li> Pellet vorsichtig Scheibe durch Zentrifugation 200 g, 1 min und sorgfältig absaugen restlichen ACSF. </li><li> In 400 ul eiskaltem RIPA / PI und brechen Gewebe durch Auf-und Abpipettieren einmal durch eine P200 pipette. </li><li> Über dissoziiert Slice / RIPA in ein frisches Röhrchen und Inkubation 30 min, 4 ° C, Drehen, um die Lyse zu vervollständigen. </li><li> Pelletierung von Zelltrümmern durch Zentrifugation, 18.000 x g, 15 min, 4 ° C </li><li> Proteinkonzentrationen bestimmen Lysat unter Verwendung des BCA-Proteinassay mit Rinderserumalbumin (BSA) als Standard. </li></ol> 5. Isolieren biotinylierter Proteine <ol><li> Optimieren Bead / Gesamtprotein-Verhältnis. Hinweis: Einzelne Proteinexpressionsniveaus kann weit in den verschiedenen Hirnregionen unterschiedlich. Wenn nicht alle der biotinylierten Proteinen in einer gegebenen Menge von Gewebelysat erfasst, ist es nicht möglich, alle möglichen Veränderungen in der Oberflächenexpression genau zu erfassen. Daher ist es zwingend notwendig, um empirisch bestimmen die optimale Perlen / Gesamtproteinverhältnis für ein bestimmtes Protein / Hirnregion vor der Einschiffung auf eine neue Scheibe Biotinylierung Studie. <ol><li> Inkubation 25 ul Streptavidin-Agarose-Beads mit zunehmender Menges Gewebelysat (ungefähren Bereich von 25 bis 200 ug) und dann gehen Sie wie folgt für die Bindung, Waschen und Elution Schritten beschrieben. </li><li> Quantifizierung der resultierenden immunreaktiven Banden und wählen Sie eine Perle / Lysat-Verhältnis im linearen Bereich der Bindung, die genaue Quantifizierung von entweder erhöht oder verringert Protein-Oberflächenexpression ermöglichen. </li></ol></li><li> Bereiten Streptavidin-Agarose Beads <ol><li> Bestimmen Sie die Gesamt Wulst Volumen für alle Proben notwendig. Eine ausreichende Schweißnahtvolumen für diesen Betrag plus ein zusätzliches (dh 4 Proben bei 25 ul / Probe = 100 ul Perlen + ein extra = 125 ul Perlen. </li><li> Vortex Streptavidin Wulst Lager und Pipette heraus gewünschte Lautstärke. Bei Verwendung eines P200 Pipette, schneiden Sie das Ende der Spitze zu einer Verstopfung oder Wulst Schäden zu verhindern. </li><li> Waschen Sie Perlen 3-mal in 0,5 bis 1,0 ml RIPA / PI Konservierungsmittel, Verwirbelung nach jedem RIPA hinaus und sammeln Perlen zwischen den Waschgängen durch Zentrifugation 18.000 xg, 1 min zu entfernen, bei Raumtemperaturratur. </li><li> Absaugen Puffer zwischen den Waschgängen mit einem Glas-Pasteur-Pipette auf eine Vakuumflasche angebracht. Ein Kunststoff-P200 Spitze bis zum Ende der Glaspasteurpipette befestigt bietet feinere Kontrolle beim Ansaugen. Es ist nicht unbedingt notwendig, alle Puffer für die ersten zwei Waschungen entfernen, da es Risiken Ansaugen Kügelchen in die Pipette. Nach dem letzten Waschen, zu entfernen, so viel überschüssigen Puffer wie möglich ohne Absaugen der Perlen. </li><li> In RIPA / PI, um Perlen wieder in ihre ursprüngliche Volumen zu bringen, und Abpipettieren zu resuspendieren. Vermeiden Verwirbelung an dieser Stelle, als Perlen werden an der Rohrwand haften. </li><li> Aliquot Perlen in Mikrozentrifugenröhrchen mit einem P200 mit der Spitze abgeschnitten. Pipette nach oben und unten mehrmals zwischen der Probenahme zu gewährleisten, Perlen bleiben gleichmäßig suspendiert und unter den Röhrchen verteilt. </li></ol></li><li> Bind biotinylierten Proteine ​​Streptavidin-Perlen <ol><li> Verteilen Zelllysate auf die Rohre, die die Agarose-Perlen. Für Experimente whe<html> re mehrere Proben verglichen werden, stellen Sie sicher, um die gleiche Menge an Protein für jede Probe für genaue Vergleiche zu verwenden. </li><li> Fügen Sie zusätzliche RIPA / PI, um Proben zu einem minimalen Volumen 200 ul zu bringen. Dies gewährleistet, dass die Proben während der Inkubation ausreichend zu mischen und auch vereinheitlicht die Proteinkonzentrationen in Proben. </li><li> Die Röhrchen in ein Rohr Rotator und über Nacht mischen bei 4 ° C </li><li> In getrennten Röhrchen, verzichtet werden ein Äquivalent des gesamten Lysats Volumen für jede Probe verwendet. Alternativ, wenn die Probenmengen hoch sind, ein Bruchteil des gesamten Lysats Volumen anstelle reserviert werden, um die maximale Ladevolumen auf SDS-PAGE-Gelen unterzubringen. Diese werden verwendet, um die Oberflächenexpression auf die Gesamtproteinmenge zu normalisieren. </li><li> Fügen Sie entweder das gleiche Volumen 2x oder 1/5 Vol. 6x SDS-PAGE-Probenpuffer und Inkubation entweder bei 4 ° C, parallel zu Wulst Proben oder bei -20 ° C bis Proben analysiert. </li></ol></li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Elute und Analysieren von Proben <ol><li> Beads durch Zentrifugation pelle 18.000 × g, 2 min bei Raumtemperatur. </li><li> Überstand wird abgesaugt und Waschperlen dreimal mit 0,75 ml RIPA. Um Wulst Verlust zu minimieren, lassen einen kleinen Kopf Volumen Puffer oben Perlen zwischen Wäschen. Nach dem letzten Waschen, zu entfernen, so viel wie möglich RIPA, ohne dass der Wulst Pellets. </li><li> Eluiere biotinylierten Proteine ​​aus Streptavidin-Kügelchen durch die Reduzierung der Disulfidbrücke. In 25 ul 2x SDS-PAGE-Probenpuffer reduziert, Vortex gut und drehen Proben 30 min, Raumtemperatur. Anmerkung: Viele Membranproteine ​​haben eine hohe Tendenz zu aggregieren, wenn sie in SDS-PAGE-Probenpuffer gekocht, deren elektrophoretische Mobilität stark beeinträchtigen. Wenn dies der Fall für das Protein untersucht wird, zu vermeiden Erhitzen von Proben und stattdessen eluieren bei Raumtemperatur langsam. Wenn kochendem absolut notwendig ist (zB wenn ein anderes Protein parallel beurteilt erfordert Sieden), samplE-Puffer mit 2 M Harnstoff (Endkonzentration) ergänzt werden, um die Aggregation zu minimieren. Während bei der Verringerung Aggregation in einigen Fällen Harnstoff oft Kompromisse Band Auftritte. </li><li> Analysieren Sie die Proben durch Immunoblot. </li><li> Auftauen Gesamt Lysatproben und drehen parallel Wulst Proben, 30 min, Raumtemperatur. </li><li> Getrennte Proteine ​​auf SDS-PAGE-Gelen. </li><li> Identifizieren Protein (e) von Interesse durch Immunoblotting. <ol><li> Seien Sie sicher, dass die Bänder im linearen Bereich der Detektion für die richtige Quantifizierung detektiert. </li><li> Um sicherzustellen, daß das Biotinylierungsreagenz hat keinen Zugang zu intrazellulären Proteinen durch beschädigte / gefährdeten Zellen gewonnen. Dies wird am besten durch Immunoblotting parallel zu einem intrazellulären Protein spezifisch für den Zelltyp untersucht erreicht. </li><li> Quantifizieren Band Dichten und berechnen relative Proteinoberflächendichte in Prozent des Gesamtproteinexpressionsniveau. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Conner, S. D., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+portals+of+entry+into+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated portals of entry into the cell.</a> Nature. 422, 37-44 (2003).</li>
<li>Zastrow, M., Williams, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+neuromodulation+by+receptor+membrane+traffic+in+the+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway.</a> Neuron. 76, 22-32 (2012).</li>
<li>Leto, D., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+transport+by+insulin%3A+traffic+control+of+GLUT4%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).</li>
<li>Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+membrane+trafficking+defects+of+disease-associated+dynamin+2+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations.</a> Traffic. 12, 1620-1633 (2011).</li>
<li>Li, X., DiFiglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recycling+endosome+and+its+role+in+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The recycling endosome and its role in neurological disorders.</a> Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).</li>
<li>Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-independent+endocytosis%3A+mechanisms+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).</li>
<li>Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+unplugged%3A+multiple+ways+to+enter+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell.</a> Cell Res. 20, 256-275 (2010).</li>
<li>Barry, M. F., Ziff, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+trafficking+and+the+plasticity+of+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).</li>
<li>Bredt, D. S., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+trafficking+at+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor trafficking at excitatory synapses.</a> Neuron. 40, 361-379 (2003).</li>
<li>Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+synapses+and+the+emergence+of+a+postsynaptic+mechanism+for+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP.</a> Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).</li>
<li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).</li>
<li>Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+cocaine-induced+potentiation+of+synaptic+strength+in+the+ventral+tegmental+area%3A+electrophysiological+and+behavioral+correlates+in+individual+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats.</a> J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).</li>
<li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine-induced+potentiation+of+synaptic+strength+in+dopamine+neurons%3A+Behavioral+correlates+in+GluRA%28-%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice.</a> PNAS. 101, 14282-14287 (2004).</li>
<li>Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+mechanisms+of+addiction%3A+the+role+of+reward-related+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory.</a> Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).</li>
<li>Thomas, M. J., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+in+the+mesolimbic+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).</li>
<li>Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+and+protein+kinase+C-induced+internalization+of+the+dopamine+transporter+is+mediated+by+a+clathrin-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism.</a> Traffic. 6, 157-170 (2005).</li>
<li>Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical%2C+distinct+endocytic+signals+dictate+constitutive+and+PKC-regulated+neurotransmitter+transporter+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization.</a> Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).</li>
<li>Loder, M. K., Melikian, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopamine+transporter+constitutively+internalizes+and+recycles+in+a+protein+kinase+C-regulated+manner+in+stably+transfected+PC12+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines.</a> J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).</li>
<li>Melikian, H. E., Buckley, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+trafficking+regulates+the+activity+of+the+human+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter.</a> J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).</li>
<li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+trafficking+of+the+human+dopamine+transporter.+Clathrin-mediated+internalization+and+lysosomal+degradation+in+response+to+phorbol+esters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters.</a> J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).</li>
<li>Sorkina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+screen+reveals+an+essential+role+of+Nedd4-2+in+dopamine+transporter+ubiquitination+and+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis.</a> J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).</li>
<li>Eriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+dopamine+transporter+trafficking+in+live+neurons+by+use+of+fluorescent+cocaine+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs.</a> J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).</li>
<li>Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+subcellular+distribution+of+endosomal+compartments+and+the+dopamine+transporter+in+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons.</a> Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen, dass Konflikte mit dieser Arbeit.

Trotz langjährige Wissen, dass endozytischen Handel kritisch Auswirkungen synaptischen Signal im Gehirn, hat es schwierig, quantitativ Veränderungen in der Proteinoberflächen-Expression in adulten Neuronen messen bewährt. In dieser Arbeit, einen zuverlässigen Ansatz zur Oberflächenprotein ex vivo in akuten Hirnschnitten beschriften berichten wir. Hirnschnittpräparate haben eine langjährige Geschichte der Nutzen für elektrophysiologischen Ableitungen, wie sie synaptischen Verbindungen und die Lebensfähigkeit der...

Endozytischen Handel ist ein allgegenwärtiges zellulären Mechanismus, der die Feinabstimmung des Plasmamembran Präsentation einer Vielzahl von integralen Membranproteinen. Endozytose liefert lebenswichtige Nährstoffe, um die intrazelluläre Milieu 1 und desensibilisiert-Rezeptor-Signal als Reaktion auf 2-Rezeptor-Aktivierung. Endocytotischen Recycling zurück in die Plasmamembran erhöhen zusätzlich zelluläre Signalgebung durch Erhöhung der Proteinexpressionsniveaus an der Zelloberfläche 3. Darüber hinaus sind Membrantransport Störungen in zahlreichen Krankheiten und pathologischen Bedingungen 4,5 verwickelt, und betonte die Notwendigkeit, die molekularen Mechanismen, die Protein endozytischen Handel regieren zu untersuchen. Während viele Proteine ​​nutzen klassische Clathrin-abhängigen Internalisierung Mechanismen, Anzeichen dafür in den vergangenen Jahren zeigt, dass mehrere Clathrin-unabhängige Mechanismen endozytischen regeln die endozytischen Potential einer wachsenden Palette vonProteine ​​6,7. So hat die Notwendigkeit, endozytischen Mechanismen für Menschenhandel in physiologisch relevanten Systemen zu untersuchen stark gewachsen. Im Gehirn hat endozytischen Handel von Rezeptoren, Ionenkanäle und Neurotransmitter-Transporter eine primäre Rolle bei der Gründung der synaptischen Plastizität 8-11 und der Reaktion auf Drogen 12-15, letztlich Auswirkungen auf die neuronale Erregbarkeit und synaptischen Antworten. Bis heute hat die Mehrheit der neuronalen Handel Studien entweder heterologen Expressionssystemen oder kultivierten primären Nervenzellen verlassen können, von denen weder zuverlässig reflektieren Mechanismen eine Rolle spielen bei erwachsenen Neuronen. Hier ein Ansatz, der Biotinylierung Oberfläche verwendet, um quantitativ Oberflächenproteinspiegel in akuten Hirnschnitten von erwachsenen Nagern abgeleitet messen berichten wir. Mit diesem Ansatz können Daten, die zeigen, dass die Maus striatale Dopamin-Transporter schnell verinnerlicht in re präsentieren wirReaktion auf Phorbolester-vermittelte Protein-Kinase C (PKC).

<table><tbody><tr><td>Sulfo NHS-SS-Biotin</td><td>Pierce</td><td>21331</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Agarose</td><td>Pierce</td><td>20347</td><td></td></tr><tr><td>IgG-freies, Proteasefreies Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Vibrierender Mikrotom-Schnitter</td><td>diverse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schüttelwasserbad</td><td>diverse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell Mesh-Bodeneinsätze (8 & Mikro; m Porengröße)</td><td>Millipore</td><td>PI8P 012 50</td><td>Diese können von Hand gewaschen und wiederverwendet werden</td></tr></tbody></table>

hirnschnitt biotinylierung: eine<em&gt; ex vivo</em&gt; ansatz zur region spezifische plasma membrane protein handel erwachsene neuronen messen

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Geregelte endozytischen Handel ist der zentrale Mechanismus erleichtert eine Vielzahl von neuromodulatorischen Veranstaltungen, die von dynamischen Steuerung Rezeptor-Ionenkanal und Transporter Zelloberfläche Präsentation auf einem Minuten-Zeitskala. Es gibt eine breite Vielfalt von Mechanismen, die endozytischen Handel einzelner Proteine ​​steuern. Studien zur Untersuchung der molekularen Grundlagen von Menschenhandel wurden in erster Linie auf die Oberfläche Biotinylierung verlassen, um quantitativ Veränderungen in der Membranproteinoberfläche messen Ausdruck als Reaktion auf exogene Reize und Gen-Manipulation. Allerdings wurde dieser Ansatz vor allem auf kultivierten Zellen, die nicht treu die physiologisch relevanten Mechanismen im Spiel bei erwachsenen Neuronen spiegeln kann begrenzt. Darüber hinaus kann kultivierten Zell Ansätze regionsspezifische Unterschiede in Handel Mechanismen unterschätzen. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der Zelloberfläche Biotinylierung der akuten Hirnschnittpräparat erstreckt. Wirzeigen, dass diese Methode bietet eine High-Fidelity-Ansatz zur schnellen Veränderungen in der Membranproteinoberfläche Ebenen bei erwachsenen Nervenzellen messen. Dieser Ansatz dürfte eine breite Dienstprogramm auf dem Gebiet der neuronalen endozytischen Handel zu haben.

Die neuronale Dopamintransporter wird in Reaktion auf PKC-Aktivierung in Zelllinien 16-20 internalisiert. Obwohl viele Berichte zeigen PKC-induzierte DAT Oberflächenverluste in einer Vielzahl von Zelllinien und Expressionssystemen ist es schwierig gewesen, diese Feststellung in kultivierten dopaminergen Neuronen 21-23 bestätigen. Wir verwendeten Maus Striatum Scheiben direkt zu testen, ob DAT verinnerlicht als Reaktion auf PKC-Aktivierung in der Erwachsenen dopaminergen Neuronen. Folgende Schnittpr...

Neuronale Membrantransport steuert dynamisch die Plasmamembran Protein Verfügbarkeit und wirkt sich deutlich auf die Neurotransmission. Bis heute hat es sich herausfordern, um neuronale endozytischen Handel bei erwachsenen Nervenzellen messen. Hier beschreiben wir eine hochwirksame, quantitative Methode, um schnelle Veränderungen in der Oberflächenproteinexpression ex vivo in akuten Hirnschnitten messen.

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, akute Veränderungen von neuronalen Oberflächenproteinen zu quantifizieren. Bei ex vivo Gehirnschnittpräparationen wird dies erreicht, indem zunächst lebensfähige akute Gehirnschnitte hergestellt werden. Anschließend werden die Schnitte mit Wirkstoffen der gewünschten Art behandelt.Dann werden die Zelloberflächenproteine mithilfe von membranimpermeablen Markierungreagenzien markiert. Schließlich werden biotinylierte Oberflächenproteine mittels Streptavidin-Affinitätschromatographie isoliert. Letztendlich wird die Immunoblotanalyse verwendet, um Veränderungen in der Proteinoberflächenexpression nach Behandlung mit Wirkstoffen zu quantifizieren.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie zellbasierten Expressionssystemen, liegt darin, dass der neuronale Proteinentransport in situ und nicht in heterologen Expressionssystemen oder primären neuronalen Kulturen untersucht wird. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, lebensfähige Hirnschnitte herzustellen. Um Hirnschnitte vorzubereiten, stellen Sie zunächst frische 1× künstliche zerebrospinale Flüssigkeit (A CSF)

brain-slice-biotinylation-an-ex-vivo-approach-to-measure-region

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Regulierte Endozytose regelt die Zelloberflächenexpression Ebenen der Mehrheit der Membranproteinen. Hier nutzen wir reduzierbar, Membran impermeante Biotinylierungsreagenzien die endocytischen Rate der Dopamin-Transporter (DAT), ein polytoper Membranprotein zu messen. Das Verfahren ermöglicht eine einfache Methode zur Messung der Endozytose von den meisten Plasmamembranproteinen.

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Dieser Bericht beschreibt die Verwendung von Live Cell Imaging und Photobleichmittels Techniken, um die Oberfläche Ausdruck, Transportwege und-handel Kinetik der exogen exprimiert, pH-sensitiven GFP-markierten Proteine ​​an der Plasmamembran von Nervenzellen zu ermitteln.

Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Wir beschreiben ein Verfahren, um Protein auf der Oberfläche von lebenden Neuronen mit einem spezifischen polyklonalen Antikörper, der an die extrazelluläre Epitope zu beschriften. Protein, das von dem Antikörper auf der Zelloberfläche gebunden und anschließend über Endozytose aus Protein verbleibende unterschieden werden können, oder an der Oberfläche während der Inkubation gehandelt.

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Induktion von Langzeit-Potenzierung in der CA1-Region des Hippocampus und der anschließenden Trennung der Kern angereicherten Fraktionen aus dem tetanized Bereich der Scheibe. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um abhängig Kernproteinimport in Zellmodellen von Lernen und Gedächtnis zu bestimmen Aktivität.

Isolierung der CA1 Kern angereicherten Fraktionen von Hippocampus-abhängigen Aktivität zu Nuclear Import von Synapto-Atom-Messenger Proteine ​​Studieren

Axonalen Transport von BDNF, einem neurotrophen Faktor, ist entscheidend für das Überleben und die Funktion von verschiedenen Neuronenpopulationen. Einige degenerativen Erkrankungen werden durch Störungen des axonalen Struktur und Funktion markiert. Wir haben gezeigt, die Techniken verwendet, um Live-Handel mit QD-BDNF in mikrofluidischen Kammern mit primären Neuronen zu untersuchen.

Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

Lichtmikroskopische Techniken in Verbindung mit biochemischen Assays klären die Beteiligung der SNARE-vermittelten Exozytose an der Netrin-abhängigen Axonverzweigung auf. Diese Kombination von Techniken ermöglicht die Identifizierung molekularer Mechanismen, die die Axonverzweigung und die Veränderung der Zellform steuern.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

Hier stellen wir ein Hirnmembran-Fraktionierungsprotokoll vor, das ein robustes Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten gehören, darstellt.

Gehirn Membran Fraktionierung: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Bewertung der Subsynaptischen Protein-Lokalisierung

Zwei biotinylierungsbasierte Verfahren zur Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen, die an der Plasmamembran exprimiert werden, sind in diesem Bericht dargestellt.

Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels (GluR) in dissoziierten primären Hippocampuskulturen vor. Mit einem Antikörper-Fütterungsansatz zur Kennzeichnung endogenes oder überexprimierter Rezeptoren in Kombination mit pharmakologischen Ansätzen ermöglicht diese Methode die Identifizierung molekularer Mechanismen zur Regulierung der GluR-Oberflächenexpression durch Modulation Internalisierungs- oder Recyclingprozesse.

Ein Antikörper-Fütterungsansatz zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels in dissoziierten primären Hippocampuskulturen

Diese Methode führt eine einfache Technik zum Nachweis der endogenen Monoaminfreisetzung unter Verwendung akuter Hirnschnitte ein. Das Setup verwendet eine 48-Well-Platte, die einen Gewebehalter für die Monoaminfreisetzung enthält. Freigesetztes Monoamin wird mittels HPLC in Verbindung mit elektrochemischem Nachweis analysiert. Darüber hinaus bietet diese Technik eine Screening-Methode für die Arzneimittelentdeckung.

Ein plattenbasierter Assay zur Messung der endogenen Monoaminfreisetzung in akuten Hirnschnitten

Dieses Protokoll demonstriert eine einfache und robuste Methode zur Untersuchung des In-situ-Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik. Es beschreibt, wie ex vivo physiologisch relevante akute Hirnschnitte hergestellt werden können und stellt eine benutzerfreundliche Analysepipeline zur Verfügung.

In situ Visualisierung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Hirnschnittkulturen

Lernen Sie die Hirnschnitt-Biotinylierung zur Quantifizierung akuter Veränderungen neuronaler Oberflächenproteine in adulten Neuronen. Diese ex-vivo-Methode ermöglicht präzise Analysen des Proteinhandels für Neurowissenschaft und Neuropharmakologie.

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine Ex Vivo Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen (Video) | JoVE Journal

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine

Weitere Videos entdecken