Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Myosphären zu erzeugen, eiballähnliche Strukturen, die aus Skelettmuskelzellen menschlicher embryonaler Stammzellen bestehen. Dies wird erreicht, indem die Zellen durch eine lentivirale Infektion mit Baf60C umprogrammiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, dieselben Zellen mit einem zweiten Virus, dem MyoD-Lentivirus, zu infizieren.

Die infizierten Zellen werden anschließend fünf Tage lang in einem serumhaltigen Kulturmedium zur Bildung ektodermalähnlicher Aggregate induziert. Danach wird das Medium für ektodermale Aggregate durch ein serumfreies Differenzierungsmedium ersetzt, und die Aggregate werden weitere zwei Wochen zu Myosphären herangezüchtet. Abschließend wird mittels Immunfluoreszenz die Visualisierung von Schnitten OCT-eingebetteter Aggregate durchgeführt.

Der Hauptvorteil dieser Technik ist die hohe Ausbeute an differenzierten Skelettmuskelzellen, deren Herleitung aus mesenchymalen oder mesodermalen Vorläuferzellen im Gegensatz zu anderen Methoden keine FACS-Sortierung erfordert und daher mit einem dreidimensionalen Kultursystem kompatibel ist. Am Tag vor der Infektion von humanen embryonalen Stammzellen in 6-Well-Platten fügen Sie dem Medium das humane embryonale Stammzell-Klonierungs- und Erholungs-Supplement in einer Verdünnung von 1000× für eine Endkonzentration von zwei Mikromolar hinzu. Am nächsten Tag infizieren Sie die humanen embryonalen Stammzellen mit einem Lentivirus mit hohem Titer, das das CGFP-Gen unter Kontrolle des BAT60-Promotors enthält. Dissociieren Sie zunächst eine Zellkultur aus einem Well in eine Einzelzell-Suspension, indem Sie ein Milliliter Tripe zugeben und die Platte fünf Minuten lang inkubieren. Sammeln Sie anschließend die Suspension und überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie neun Milliliter des zubereiteten Mediums hinzu und pelletieren Sie die Zellen bei 1.200 U/min fünf Minuten lang, während Sie auf ein Milliliter mt. SIR, eins warten. Fügen Sie Polybrain in einer Endkonzentration von sechs Mikrogramm pro Milliliter und das Supplement für die Wiederherstellung menschlicher embryonaler Stammzellen in einer Konzentration von zwei Mikromolar hinzu.

Suspenderen Sie die Zellen anschließend in dieser Lösung und überführen Sie sie in eine einzelne Vertiefung einer sechswelligen Low-Attachment-Platte. Geben Sie nun das konzentrierte Bad 60 C-Virus mit einer Multiplizität der Infektion von 100 Millionen hinzu. Inkubieren Sie die Platte drei Stunden lang mit dem Virus.

Sammlen Sie dann die Zellen und verteilen Sie sie auf zwei mit Matrigel beschichtete Plattenmulden. Geben Sie zu jeder Platte zwei Milliliter mt, SIR, jeweils mit zwei Mikromolar Supplement, und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium.

Die Zellen erscheinen bereits 48 Stunden nach Beginn der Infektion zusammengeklumpt. Überprüfen Sie die Fluoreszenz, um die Infektionseffizienz zu bewerten. Führen Sie die täglichen Mediumwechsel fort, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, dann lösen Sie die Zellen ab und infizieren Sie erneut mit dem Myo D-Virus, wobei Sie denselben Protokollablauf verwenden.

Pflegen Sie die infizierten Zellen mit täglichen Mediumwechseln, bis sie am Tag vor diesem Wachstumspunkt eine Konfluenz von 80 % erreichen. Säen Sie MES auf mit Matrigel beschichteten Platten mit 1000 Zellen pro Quadratzentimeter aus, um die infizierten Zellen auf die ME'S-Platte zu überführen. Am nächsten Tag.

Verwenden Sie Trip ALI, um sie zu dissociieren, und überführen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie neun Milliliter humanen embryonalen Stammzell-Medium hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen. Zentrifugieren Sie bei 1.200 U/min fünf Minuten lang.

Resuspendieren Sie die Zellen im Pellet in frischen sechs Millilitern humanem embryonalen Stammzellmedium. Entfernen Sie nun das Medium von zwei Platten mit Mes und geben Sie die infizierten Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen mehrere Tage lang.

Fügen Sie einmal 80 % Konfluenz hinzu. Entfernen Sie das gesamte Medium und geben Sie ein Milliliter Kollagenase vier hinzu. Fügen Sie nach fünf Minuten in Kollagenase bei 37 Grad Celsius ein Milligramm pro Milliliter hinzu.

Ersetzen Sie die Kollagenase durch ein Milliliter humanes embryonales Stammzellmedium. Dann kratzen Sie unter einem Stereomikroskop die Kolonien mit einer 10-Milliliter-Pipettenspitze ab, überführen Sie die Kolonien in ein 15-Milliliter-Röhrchen und lassen Sie sie absetzen. Entfernen Sie nach drei Minuten den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in humanem embryonalen Stammzellmedium.

Anschießend die Zellen im Verhältnis eins zu vier auf Meth-Platten ausplattieren. Die infizierten Zellen müssen in hoher Zahl vorliegen und Kolonien von guter Qualität gebildet haben, damit dieses Verfahren funktioniert. Das Medium aus jedem Wells entfernen und ein Milliliter Kollagenase.Vier hinzufügen.

Fügen Sie erneut eine Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter hinzu und beenden Sie die Kollagenase-Reaktion nach fünf Minuten, indem Sie das Reagenz durch EB-Medium ersetzen. Danach verwenden Sie schnell ein Mikroskop, um die Kolonien abzukratzen. Mithilfe einer 10-Milliliter-Pipettenspitze können die Zellen in kleine Zellklumpen dissoziiert werden.

Sammeln Sie diese Aggregate in einem 15-Milliliter-Röhrchen und entfernen Sie nach einer Sedimentationszeit von etwa drei Minuten den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in drei Milliliter EB-Medium und überführen Sie alles in eine einzelne Vertiefung einer sechswelligen Low-Attachment-Platte. Inkubieren Sie die Platte am nächsten Tag über Nacht. Überprüfen Sie die Kulturen auf große Koloniebröckchen.

Falls vorhanden. Zerlegen Sie sie, indem Sie sie mehrmals mit einer fünf Milliliter-Pipette durchpipettieren. Wenn viele einzelne schwebende Zellen vorliegen, sammeln Sie die Aggregate durch Sedimentation und ersetzen Sie das Medium durch frisches EB-Medium.

Ersetzen Sie das Medium alle zwei Tage, beginnend nach fünf Tagen der Kultivierung. Sammeln Sie die Zellaggregate ein und waschen Sie sie einmal mit zwei Millilitern PBS, wobei die Zellen unter Normalgravitation sedimentieren dürfen. Ersetzen Sie anschließend den PBS durch drei Milliliter DM-Medium und geben Sie die Zellen in die gleichen Brunnen der Platte zurück, wo sie während der nächsten 15 Tage kultiviert werden.

Ersetzen Sie das Medium alle drei Tage. In dieser Zeit bilden sich Mesosphären. Menschliche embryonale Stammzellen wurden mit Bad 60 C, das die GFP-Fluoreszenz trägt, infiziert.

Nach 72 Stunden wurden die Zellen per FACS sortiert. Die Zellen, die BAF 60 C exprimierten, wurden bis zu einer Konfluenz von etwa 75 % kultiviert und anschließend mit einem Myo D-Lentivirus infiziert. Die Expression des exogenen Gens wurde in den infizierten Zellen mittels quantitativer Echtzeit-PCR nachgewiesen.

Die Expression und Verteilung auf Proteinebene wurde untersucht. Dabei entspricht GFP der Baf60C-Expression, und ein MyoD-Antikörper wurde verwendet, um die MyoD-Expression zu überprüfen. 15 Tage nachdem die humanen embryonalen Stammzellen begannen, keimkörperähnliche Aggregate zu bilden.

Ein Teil der Myos-Sphären wurde in OCT-Compound eingebettet und geschnitten; der Schnitt war positiv für myogene Marker und Myosin-Schwerketten-Marker gefärbt. Ab dem 10. Tag war es möglich, gelegentliche Kontraktionen in den Myos-Sphären zu beobachten. Einige Myos-Sphären nahmen unterschiedliche oder ungewöhnliche Formen an, möglicherweise aufgrund einer Fusion zwischen Myos-Sphären.

Diese Technik wird die Forschung im Bereich der Krankheitsmodellierung und Therapie voranbringen, da Myosphären aus pluripotenten Stammzellen von Patienten mit verschiedenen Muskelerkrankungen erzeugt werden können. Aus diesem Grund stellen Myosphären ein Krankheitsmodell in Edition dar, das für die Arzneimittelscreening und die Erforschung der Krankheitspathogenese geeignet ist.