Name: Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Erfahren Sie die epigenetische Reprogrammierung von hESCs zur Generierung kontraktiler Myospheren. Diese Methode ermöglicht die effiziente Erzeugung von Skelettmuskelvorläuferzellen für die Muskelbiologie und regenerative Medizin.

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PLP ist Associate Investigator von Sanford Gesundheit von Kindern Research Center. R01AR056712, R01AR052779 und P30 AR061303 aus dem National Institute of Health / National Institute of Arthritis und Muskel-Skelett-und Hautkrankheiten (NIAMS), MDA und Kinder Sanford Health Research award: Diese Arbeit wurde durch die folgenden Stipendien an PLP unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise von der Forschungsförderung des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Gemeinschaft in diesem Projekt profitiert FP7-Health - 2009 EndoStem 241440 (Aktivierung des Gefäßsystems verbunden Stammzellen und Muskel-Stammzellen für die Reparatur und Wartung von Muskelgewebe) SA wurde unterstützt. CIRM Gemeinschaft.

1. Infektion von HES Dieses Protokoll erfordert hohe Titer Lentiviren Codierung BAF60C und MyoD 13. Diese Konstrukte sind auf Anfrage erhältlich. <ol><li> Empfehlungen vor dem Start <ol><li> Um eine hohe Effizienz der Infektion, Platte hESCs für die Infektion auf Feeder-freien Bedingungen (2A), um zelluläre Konkurrenten während der Virusaufnahme beseitigen zu gewährleisten. Tatsächlich sind notorisch MEFs leichter zu infizieren im Vergleich zu HES und sind für die MyoD-vermittelte Umwandlung zuständig. So beseitigen MEFs von hESC-Kulturen erhöht die Infektionsrate. </li><li> Es wird empfohlen, einen hohen Titer Lentiviren müssen hohe Infektionseffizienz zu gewährleisten. Optionen, um die Effizienz der Infektion zu verbessern, werden im Abschnitt &quot;Kontrolle der Infektion&quot; diskutiert. </li><li> Bereiten Matrigel-beschichteten Platten durch Zugabe von 1 ml 1 mg / ml Matrigel in jede Vertiefung und lassen Sie mindestens 1 h bei RT (oder O / N bei 4 ° C versiegeltvorbereitet, wenn am Tag vor). </li></ol></li><li> Infektion Verfahren <ol><li> Tag vor der Infektion <ol><li> In hES-Zell-Klonen &amp; Recovery Supplement in dem Medium bei 1.000 X Verdünnung (2 mM Endkonzentration). </li></ol></li><li> Tag 0 - Infektion mit BAF60C Hinweis: Führen Sie die Infektion von HES mit BAF60C ersten durch eine Infektion mit MyoD gefolgt. <ol><li> Distanzieren eine Vertiefung einer 6-Well-Platte von HES als Kolonien 14 in einer Einzelzellsuspension durch Inkubation mit 1 ml TrypLE für 5 min bei 37 ° C gezüchtet </li><li> Über Suspension auf eine 15-ml-Tube, fügen 9 ml hESC mittel-und Zentrifuge für 5 min bei 1.200 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Während der Zentrifugation, bereiten die Infektion Mischung in ein sauberes Röhrchen durch Zugabe von 1 ml mTeSR1 Polybren (6 mg / ml) und hES-Zell-Klonen &amp; Recovery Supplement (2 mM). </li><li> Resuspendiere das Zellpellet (etwa 5 × 10 5 -1 × 10 6 Zellen aus einer confluent auch von HES) mit 1 ml der Infektion Mix und Platte auf einer 6-Well niedrigen Befestigungsplatte, die die Zellen aus, um den Kunststoff anhaftenden verhindert. </li><li> In BAF60C-IRES-GFP-Virus bei 10 8 MOI und Inkubation von 3 Stunden im Brutschrank </li><li> Sammeln Sie die Zellsuspension, die Viren enthalten, und teilen Sie ebenso in zwei Matrigel-beschichteten Vertiefungen. Dann fügen Sie 2 ml mTeSR1 + hES-Zell-Klonen &amp; Recovery Supplement in jede Vertiefung und lassen O / N im Brutschrank. </li></ol></li><li> Tag 1 <ol><li> Das Medium mit dem Virus vorsichtig entfernen und ersetzen mit 2 ml mTeSR1and hES-Zell-Klonen &amp; Recovery-Ergänzung. Cells Verklumpung starten, wie in 2B gezeigt. </li></ol></li><li> Tag 2 - Infektion mit MyoD <ol><li> Bevor Sie fortfahren überprüfen Sie die Fluoreszenz Status der Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop, um sicherzustellen, um eine hohe Effizienz der Infektion haben. Wenn nicht, siehe Abschnitt &quot;Kontrolle infizierenion &quot;. </li><li> Wenn die Zellen mindestens 80% Konfluenz erreicht, gehen Sie wie folgt; sonst warten noch einen Tag, bevor Sie fortfahren. </li><li> Entfernen Sie das Medium und 1 ml TrypLE Reagenz, um die Zellen zu distanzieren. Inkubiere 5 min bei 37 ° C. </li><li> Wiederholen Sie wie beschrieben from1.2.2.2 - 1.2.2.6 Hinzufügen MyoD Virus bei 10 8 MOI. </li></ol></li><li> Tag 3 <ol><li> Das Medium mit dem Virus vorsichtig entfernen und ersetzen mit 2 ml mTeSR1and hES-Zell-Klonen &amp; Recovery-Ergänzung. </li><li> Platte MEFs auf Matrigel-beschichteten Platten bei 2,5 x 10 5 / cm 2 für den nächsten Tag zu Fortpflanzung der infizierten Zellen zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Tag 4 <ol><li> Entfernen Sie das Medium und 1 ml TrypLE Reagenz, um die Zellen zu distanzieren. Inkubiere 5 min bei 37 ° C. </li><li> Übertragen Sie die Zellen in einer 15-ml-Falcon-Röhrchen, fügen 9 ml hESC mittel-und Zentrifuge für 5 min bei 1.200 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Remove der Überstand und resuspendieren in 6 ml HES-Medium. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus dem MEF-mit 6-Well-Platte und Teller hESCs 1:2 Split-Verhältnis, Abgabe 3 ml für jeweils MEFs haltigen gut. Tipp: Wenn die Kolonien Zusammenfluss erreichen, können einige der Vertiefungen MyoD/BAF60C-infected Zellen in flüssigem Stickstoff als Reservevorrat eingefroren werden. Gefriermedium enthält 90% KOSR und 10% DMSO plus 2 mM hES-Zell-Klonen &amp; Recovery-Ergänzung. Die übrigen Brunnen kann dann auf die Differenzierung Protokoll ausgesetzt werden - Beschreibung siehe unten. Wenn mehr Zellen benötigt werden, um mehr myospheres erzeugen, kann infiziert hESCs wie folgt weiter propagiert werden: </li><li> Entfernen des Mediums und Inkubation mit 1 ml von 1 mg / ml Collagenase IV für 5 min bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Kollagenase IV und 1 ml hESC Medium. </li><li> Unter einem Dissektionsmikroskop kratzen die Kolonien mit einer 10 ml-Spitze. </li><li> Sammeln Sie die Stücke von colonies in einem 15-ml-Tube und lassen Sie sie für 3 min sedimentieren. Dann entfernen Sie den Überstand, resuspendieren in hES-Medium und Platte auf MEFs Platten unter Verwendung eines im Verhältnis 1:4. </li></ol></li></ol></li><li> Überprüfen Infektion <ol><li> Während Vermehrung der Zellen, wird empfohlen, um die infizierten Zellen Platte in einem kleineren Maßstab, für RNA-Analyse durchführen zu ernten und Proteinexpressionsanalyse mittels Immunfluoreszenz, um nach Biomarkern, die die korrekte biologischen Status auf jeder Stufe reflektieren überprüfen (siehe Repräsentative Ergebnisse). Für hohe Titer Lentiviren der Prozentsatz der infizierten Zellen zu erwarten sollte mindestens 80% betragen. </li><li> Um eine hohe Effizienz zu gewährleisten, können die lentiviralen Vektoren modifiziert werden, die Einführung einer fluoreszierenden Selektionsmarker und / oder eine Antibiotikaresistenz. Unsere lentiviralen Plasmid BAF60C ausdrücken trägt auch GFP-Fluoreszenz. </li><li> Sortierung hESCs für eine Fluoreszenzmarkierung. Im Fall der geringen Effizienz der Infektion wird empfohlen, ein Fluoreszenz verwendenctivated Zellen Sortierung (FACS-Sortierung), um auf Zellen BAF60C Virus, bereichern und dann infizieren die Zellen mit hohem Titer MyoD-Virus. <ol><li> In hES-Zell-Klonen &amp; Recovery Supplement im Medium der Tag vor der Sortierung. </li><li> Der Tag der Sortierung, distanzieren die Zellen durch TrypLE (wie am Tag 0 beschrieben) und Resuspendieren der Zellen in KO Ersatz Serum Plus hES-Zell-Klonen &amp; Recovery Supplement in FACS-Röhrchen. </li><li> Am Ende des Sortier, sammeln die Zellen in KO Ersatz Serum und Platte auf MEFs Platten Zugabe von hES-Zell-Klonen &amp; Recovery-Ergänzung. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. EB-wie Induktion und Differenzierung <ol><li> Induktions-und Differenzierungsverfahren <ol><li> Tag 0 - EB-Induktions <ol><li> Stellen Sie sicher, bevor Differenzierung von hES BAF60C/Myod-infected, zu hohe Anzahl der Kolonien in der gut (2C) haben. </li><li> Für jeden gut remove das Medium, waschen mit PBS und 1 ml 1 mg / ml Kollagenase IV. Inkubation für 5 min bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Collagenase und 1 ml EB Medium. </li><li> Unter einem Dissektionsmikroskop schnell mechanisch distanzieren, die Kolonien in 400-800 Zellaggregate durch Abschaben mit einem 10-ml-Spitze. </li><li> Sammeln Sie die Stücke von Kolonien in einen 15-ml-Tube und lassen Sie sie für 3 min sedimentieren. Entfernen Sie den Überstand erneut zu suspendieren in 3 ml EB Medium und übertragen die Zellsuspension auf eine Vertiefung einer 6-well niedrigen Befestigungsplatte. </li></ol></li><li> Tag 1 <ol><li> Überprüfen Sie die Größe der Kolonien und der Zelltod, bevor Sie fortfahren. Wenn große Stücke vorhanden sind, brechen sie durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren mit einer 5-ml-Pipette 3-4 mal. Wenn der Zelltod ist sehr hoch (viele schwimmende Zellen und Debris) ersetzen das Medium durch das Sammeln der Aggregate in einem 15-ml-Tube durch die Schwerkraft und die Platte sie mit 3 ml frischem Medium EB, sonst gehen Sie wie folgt. </li><li> In 1,5ml frischem EB Medium in den Wells </li></ol></li><li> Tag 2 <ol><li> Ändern Sie das Medium durch das Sammeln der Aggregate aus den Brunnen in einem 15-ml-Tube. Lassen Sie sie richten sich für 2 min. </li><li> Überstand entfernen, ersetzen Sie mit 3 ml frischem Medium EB und verteilen sich auf dem gleichen Brunnen. </li></ol></li><li> Tag 3 <ol><li> In 1,5 ml frischem Medium EB in den Vertiefungen. </li></ol></li><li> Tag 4 <ol><li> Gehen Sie wie in &quot;Tag 2&quot; beschrieben. </li></ol></li><li> Tag 5 - Myogenic Differenzierung der EB-wie Cluster (Abb. 2D). <ol><li> Sammeln Sie die Aggregate wie in 2.1.3.1 beschrieben und einmal mit 2 ml PBS waschen; damit die aggregierten zu sedimentieren. </li><li> Entfernen PBS und 3 ml der DM Medium; Platte auf den gleichen Brunnen. </li></ol></li><li> Tag 6 - Tag 20 <ol><li> Von d6 d20 zu ersetzen, das Medium mit frischem Medium alle 3 Tage. Repräsentative myospheres in F gezeigtild 2E. </li></ol></li></ol></li><li> Überprüfen myosphere Differenzierung <ol><li> Bevor Sie fortfahren, wird empfohlen, die Effizienz der Muskeldifferenzierung innerhalb der myospheres, indem sie Teile der myospheres in OCT-Verbindung, wie in einem früheren JoVE Protokoll 12 beschrieben überprüfen. Führen Sie eine Immunfluoreszenzfärbung für myogenen Marker wie myognenin (Klon F5D, DSHB) und Myosin schwere Kette (Klon MF20, DSHB) (siehe Repräsentative Ergebnisse). Tipp: Um erfolgreich mit der Färbung für Myogenin auf EB Abschnitte ist es wichtig, Antigen-Retrieval durch Behandlung mit Natriumdodecylsulfat (SDS) von 0,5% für 5 Minuten durchzuführen. Zusätzlich ist es möglich, dieses Protokoll für die Doppelfärbung mit F5D und MF20-Antikörper verwenden. </li></ol></li></ol> 3. Medien Rezepte <ol><li> ESC-Medium DMEM-F12 1 mM L-Glutamin 20% Knockout Serähm Ersatzmedium (KOSR) 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) 50 U / ml Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep) 0,1 mM beta-Mercaptoethanol 8 ng / ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) </li><li> EB Medium DMEM F12 1 mM L-Glutamin 15% FBS 5% Pferdeserum </li><li> DM Medium DMEF F12 1X seiner flüssigen Medien Supplement 1X N-2-Beilage </li></ol>

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die hier vorgeschlagene Protokoll beschreibt, wie man dreidimensionale Cluster von kontraktilen Muskelfasern (myospheres) direkt aus hES-Zellen zu generieren. Die vorgeschlagene Strategie hat die beispiellose und außergewöhnliche Potenzial, Mini-Muskeln in Suspension, die als geeignet &quot;Krankheit in einer Schale&quot;-Modell für beide Screening-Tests und Entwicklungsstudien sein kann, zu produzieren. Darüber hinaus ist das Verfahren zur myospheres von hES erzeugen einfach und erfordert keine FACS-Sortierungsschritt während der Differenzierung, der typischerweise eine negative Auswirkung auf die Ausbeute an Zellen gewonnen erforderlich. Außerdem würde ein Sortierverfahren während der Differenzierung mit der Aggregation stören da sie eine Dissoziation der EB in einzelne Zellen. Das vorgeschlagene Verfahren basiert auf der epigenetischen reprograming von HES mit bestimmten Faktoren, MyoD und BaAF60C, die nicht in pluripotenten embryonalen Stammzellen exprimiert basieren. MyoD und BAF60C bieten dem &quot;Kern&quot;-Protein-Komplex thMarkierungen an der genomischen Loci, von dem Transkriptions geht um die Skelett myogene Programm zu aktivieren. Die beiden Faktoren zu den Zellen durch lentivirale Infektionen geliefert und es ist daher wichtig, um eine hohe Effizienz der Infektion beider Faktoren in allen Zellen zu erhalten. Dies kann durch einen hohen Titer Viren oder Viren mit Selektionsmarkern ausgestattet erreicht werden. Kulturbedingungen spielen auch eine wichtige Rolle bei der Optimierung des Ausmaßes der Muskeldifferenzierung. Wir schlagen vor, ein Serum-basierte Differenzierung Protokoll für die Differenzierung von hES-Zellen exprimieren MyoD/BAF60C in Cluster myogener Vorstufen, gefolgt von einer Inkubation in Serum-freien definierten Medium (das Insulin-Transferrin - ITS), um die Umwandlung von myogenen Vorläufersubstanzen in Skelett Myotuben zu erreichen. Es ist jedoch möglich, dass andere definierte Medien können eine gleiche oder bessere Muskeldifferenzierung zu erreichen. Eine Strombegrenzung des Protokolls ist, dass es für die Verwendung von fötalem Rinderserum, das neben enthalten stütztten viele tierische Proteine ​​und Substanzen, zeigt viel-zu-viele Variationen. Dies kann zu geringeren Wirkungsgrad oder Heterogenität der myogenen Umwandlung innerhalb myospheres führen. Der Hinweis, nicht alle EB-Strukturen aus BAF60/MyoD-expressing hESCs abgeleitet sind myospheres; nämlich sind einige EB-Aggregate wie voll der Muskelfasern zusammen. Die Anzahl der myospheres normalerweise von hES BAF60C und MyoD exprimieren, abgeleitet aus 30 bis 60% variieren, wie durch Immunfärbung auf EB Abschnitte am Ende des Protokolls durchgeführt (siehe Ergebnisse) geschätzt. Ein möglicher Ansatz, um eine Kulturschale nur myospheres bereichern wäre, eine myogene Reporter zu verwenden. Dies würde die teilweise oder Verwerfen der nicht unterschieden EB-wie Cluster und Auswahl nur die myospheres. Schließlich würde ein besseres Verständnis der Mechanismen, die die zeitlichen Anforderungen der Faktoren eingeführt nützlich, um die Art der Lieferung zu verbessern. Zum Beispiel werden, wenn BAF60C und MyoD nur für sh erforderlichort Zeit zu &quot;Kick&quot; der Zellen in die richtige Richtung, Methoden auf Basis modifizierter mRNA Lieferung könnte angewendet werden. Im Gegensatz dazu, wenn die Faktoren für eine längere Zeit, bevor die Zellen nutzen ihre endogenen Proteinen benötigt wird, wäre ein episomaler Ansatz empfohlen werden, um die Variabilität und unkontrollierte Effekte durch die Integration in das Genom zu beseitigen. Schließlich ist zu beachten wir, dass es zwingend erforderlich, um BAF60C vor oder zur gleichen Zeit wie MyoD (nie nach), um hESC Umwandlung in Skelettmuskeln erreichen auszudrücken. Das Erfordernis der vorherigen Ausdruck BAF60C vermutlich verlässt sich auf seine Rolle bei der Voreinstellung der epigenetischen Landschaft für die richtige MyoD Chromatin Vertrieb über das Genom 6,15. Als solche könnten zukünftige Protokolle von Verbindungen oder andere Manipulationen, die BAF60C Ausdruck in hESCs Förderung verbessert werden.

Aufgrund ihrer einzigartigen Fähigkeit zur Selbsterneuerung unter Beibehaltung Pluripotenz werden menschliche embryonale Stammzellen (hES-Zellen) als eine wertvolle Ressource in der regenerativen Medizin. Stammzell-vermittelten Wiederbesiedlung der erkrankten Muskeln und hES-oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS)-abgeleiteten Generation der Skelettmuskulatur für die in vitro-Krankheit Modellierung sind wichtige Ziele der Studien zu identifizieren Behandlungen und die Aufklärung der Pathogenese vieler neuromuskuläre Erkrankungen ausgerichtet. Allerdings haben diese Studien durch den Widerstand von HES in Skelettmuskelzellen umwandeln und durch den Mangel an Informationen über die molekulare Regulation von hES-Engagement in Richtung Skelett myogenesis fochten. Tatsächlich bisherigen Versuche, Skelettmuskelvorläuferzellen aus hES-Zellen zu erzeugen, ergab, dass nur Embryoidkörper (EB)-abgeleiteten Nachkommen oder mesenchymalen Zellen zuständig Skelett myogenesis aktivieren folgende ektopische Expression von Transkriptionsaktivatoren sind (zBPax3 oder Myf5) 1-3 oder durch Bestrahlen mit spezifischen Kulturbedingungen 5.4. Wir haben zuvor gezeigt, dass die SWI / SNF-Komponente BAF60C (durch SMARCD3 kodiert) ist eine wesentliche Komponente der Transkriptionsmaschinerie, die MyoD-vermittelte Aktivierung von Muskel-spezifische Loci 6 ermöglicht. Wir haben vor kurzem entdeckt, dass die selektive Fehlen BAF60C verleiht hESCs auf den Widerstand gegen die MyoD vermittelte Aktivierung der Skelett myogenesis 7, die sonst in BAF60C beobachtet ausdrückt somatischen Zellen 8-10, ein Prozess allgemein als myogenen Umwandlung bezeichnet. Zwangs Ausdruck BAF60C ermöglicht MyoD Skelett myogenesis direkt in hESCs aktivieren, auf bestimmte Kulturbedingungen mit BAF60C und MyoD Einführung eines epigenetischen Signatur, die in Richtung der hESCs myogenen Linie 7 verpflichtet. Zu beachten ist, offenbart vorherigen Proteomanalyse die selektive Fehlen BAF60 ° C unter den SWI / SNF-Komponenten, WSR 11. Wir haben dieses Wissen, um eine epigenetische Engagement von HES auf den myogenen Linie zu verhängen, die zur Erzeugung eines homogenen Population von Skelettmyoblasten, die aggregiert werden könnten, um dreidimensionale Kontraktions bilden Strukturen (myospheres), die funktionell nachahmen miniaturisierten Skelettmuskulatur 7. Tat unsere Verfahren zur Erzeugung von Skelettmuskelvorläuferzellen aus hES-Zellen beruht auf der epigenetischen Engagement von HES auf die myogenen Linie, die phänotypisch latent ist, bis die Zellen an Differenzierungssignale ausgesetzt ist, wie z. B. Zell Aggregation und Kultur in Differenzierungsmedium (siehe spezifische Protokoll). Diese Strategie erlaubt die Expansion einer homogenen Population von HES, die epigenetically Skelettmuskelabstammungslinie gebunden sind und geeignet, um die Bildung von dreidimensionalen kontraktilen myospheres die histologischen und funktionellen Eigenschaften der Skelett rekapitulierenMuskeln. Die myospheres liefern den ersten Beweis von miniaturisierten Muskeln nutzbare für eine &quot;Krankheit in einer Schale&quot;-Modell der Muskelkrankheiten. Wenn von Patienten gewonnen iPS erzeugt haben diese myospheres das Potenzial, langjährige Entwicklungsfragen aufzuklären und die Pathogenese der seltenen Krankheiten, zusätzlich zum Angebot das enorme Potenzial als Instrument für die Hochdurchsatz-Screening von therapeutischen Verbindungen. Wir merken auch, dass eine sofortige Auslesen myosphere Analyse könnte durch Immunhistochemie auf Abschnitte vorgesehen werden, wie in einem Protokoll, das von JoVE Gomes et al. Beschrieben 12

<table><tbody><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte mit niedrigem Attachment</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>GFR Matrigel</td><td>BD Biosciencies</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>MEFs (growth arrested)14</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Invitrogen</td><td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>1 mM L-Glutamin (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (100X)</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Polybren</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>ITS Nahrungsergänzungsmittel für flüssige Medien</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>N2-Nahrungsergänzungsmittel</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>HS</td><td>Invitrogen</td><td>16050114</td><td></td></tr><tr><td><a href="https://www.stemgent.com/products/193">hES Zellklonierung & Recovery Supplement</a></td><td>Stemgent</td><td>01-0014-100</td><td></td></tr><tr><td>bfgf</td><td>Sigma</td><td>4114-TC</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyoD</td><td>BD Biosciences</td><td>554130</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyHC</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myogenin</td><td>DSHB</td><td>F5D</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung von myospheres von hescs durch epigenetische reprogrammierung

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Erzeugung eines homogenen und reichlich Population von Skelettmuskel-Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES) ist eine Voraussetzung für zellbasierte Therapien und für eine &quot;Krankheit in einer Schale&quot;-Modell der menschlichen neuromuskulären Erkrankungen. Haupthürden, wie geringe Fülle und Heterogenität der Population von Interesse, als auch einen Mangel an Protokollen für die Bildung von dreidimensionalen Strukturen kontraktilen haben die Anwendungen von Stammzellen für die neuromuskuläre Störungen begrenzt. Wir haben ein Protokoll, das diese Grenzen überwindet in hESCs von Eileiter Einführung von definierten Faktoren entwickelt - der Muskel Bestimmung Faktor MyoD und SWI / SNF Chromatin-Remodeling-Komplex-Komponente BAF60C -, die in der Lage, hESCs in den Skelettmuskel-Zellen umzuprogrammieren sind. Hier beschreiben wir das Protokoll eingerichtet, um hESC-abgeleiteten Myoblasten zu generieren und ihre Clusterbildung fördern in miniaturisierten dreidimensionalen Strukturen (myospheres), die funktionell nachahmen miniaturisierten Skelettmuskulatur 7 </sup&gt;.

Fig. 1a zeigt eine schematische Darstellung des Protokoll vorgeschlagen, myospheres von hES erzeugen. Die kritischen Schritte zu steuern (durch die Pfeile angedeutet) die Effizienz der Infektion in hESCs und die myogenen Umwandlung innerhalb der myospheres. In unseren Experimenten nutzen wir einen lentiviralen Vektor-Codierung BAF60C, die GFP-Fluoreszenz führt. Wir in der Regel infizieren die Zellen mit BAF60C und FACS-Sortierung 72 Stunden nach der Infektion für die Bevölkerung BAF60C ausdrücken zu bereichern. Wenn die Zellen zu erreichen etwa 70-80% der Zusammenfluss, infizieren wir mit MyoD Lentiviren. Nach der ersten Infektion dauert normalerweise zwei bis drei Tage, dass die Zellen Konfluenz erreichen. 1B zeigt Expression von exogenen Genen als-fache Induktion relativ zu HES nicht infiziert. 1C zeigt die Expression und Verteilung auf der Proteinebene der Faktoren eingeführt. BAF60C<html> Ausdruck als GFP-Fluoreszenz gezeigt, während MyoD Expression durch Immunfluoreszenz mit einem MyoD Antikörper nachgewiesen. Wir betrachten Tag 0 der Tag beginnen wir die Differenzierung von hES-Zellen in infizierten EB-ähnliche Aggregate. Nach 15 Tagen in DM Medium wird ein Teil der myospheres (in der Regel eine ganze auch) in OCT-Verbindung 12 eingebettet und geschnitten, um Immunfluoreszenz für myogenen Marker durchführen, um myogene Umwandlungseffizienz zu überprüfen. 1D zeigt repräsentative Färbung für Myogenin und Myosin schwere Kette in eine optimale Muskeldifferenzierung. Myospheres können verschiedene oder ungewöhnliche Formen haben, vielleicht als Folge der Fusion mit kleineren myospheres. Ab Tag 10 ist es möglich, sporadische Kontraktion in den myospheres beobachten (siehe Film 1 und 2). 43/51243fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. A) Schematische Darstellung der für die Erzeugung von myospheres hESCs. B) mRNA-Spiegel der exogenen Gene in hESCs mit BAF60C und MyoD (H9-BM) durch qRT-PCR überwacht und als fache Induktion infiziert verwendete Protokoll, wie im Vergleich zu infizierten hESCs verspotten (H9-ctr). C) Immunfluoreszenz-Bilder, die MyoD-Färbung (rot) und BAF60C Fluoreszenz (grün) aufgrund der IRES-GFP-Element im Vektor. D) Immunfluoreszenz auf myosphere Abschnitte für Myogenin angefärbt (MYOG ), Myosin Heavy Chain (MyHC) und DAPI gegengefärbt (siehe Immunfluoreszenz Details). Maßstab ist 100 um. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Bilder von Zell Aussehen in den verschiedenen Phasen desProtokoll von der Infektion (Teil I) mit der Differenzierung (Teil II). Maßstabsbalken ist 100 um. Während EB-Strukturen von D1 bis D5 sind meist kreisförmig (D), myospheres über 15 Tage nach der Regelung in 1A präsentieren eine unvorhersehbare Form und sind heterogen in Kultur gezüchtet; sehen zwei Beispiele in E und F.

Hier ein Protokoll, das auf epigenetische Reprogrammierung von menschlichen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) in Richtung Erzeugung eines homogenen Bevölkerung von Skelettmuskelvorläuferzellen, die unter permissiven Kulturbedingungen bilden dreidimensionale Cluster von kontraktilen Muskelfasern (myospheres), die biologischen Merkmale der menschlichen rekapitulieren beschreiben wir Skelettmuskeln.

Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Myosphären zu erzeugen, eiballähnliche Strukturen, die aus Skelettmuskelzellen menschlicher embryonaler Stammzellen bestehen. Dies wird erreicht, indem die Zellen durch eine lentivirale Infektion mit Baf60C umprogrammiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, dieselben Zellen mit einem zweiten Virus, dem MyoD-Lentivirus, zu infizieren.Die infizierten Zellen werden anschließend fünf Tage lang in einem serumhaltigen Kulturmedium zur Bildung ektodermalähnlicher Aggregate induziert. Danach wird das Medium für ektodermale Aggregate durch ein serumfreies Differenzierungsmedium ersetzt, und die Aggregate werden weitere zwei Wochen zu Myosphären herangezüchtet. Abschließend wird mittels Immunfluoreszenz die Visualisierung von Schnitten OCT-eingebetteter Aggregate durchgeführt.Der Hauptvorteil dieser Technik ist die hohe Ausbeute an differenzierten Skelettmuskelzellen, deren Herleitung aus mesenchymalen oder mesodermalen Vorläuferzellen im Gegensatz zu anderen Methoden keine FACS-Sortierung erfordert und daher mit einem dreidimensionalen Kultursystem kompatibel ist. Am Tag vor der Infektion von humanen embryonalen Stammzellen in 6-Well-Platten fügen Sie dem Medium das humane embryonale Stammzell-Klonierungs- und Erholungs-Supplement in einer Verdünnung von 1000× für eine Endkonzentration von zwei Mikromolar hinzu. Am nächsten Tag infizieren Sie die humanen embryonalen Stammzellen mit einem Lentivirus mit hohem Titer, das das CGFP-Gen unter Kontrolle des BAT60-Promotors enthält. Dissociieren Sie zunächst eine Zellkultur aus einem Well in eine Einzelzell-Suspension, indem Sie ein Milliliter Tripe zugeben und die Platte fünf Minuten lang inkubieren. Sammeln Sie anschließend die Suspension und überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen.Geben Sie neun Milliliter des zubereiteten Mediums hinzu und pelletieren Sie die Zellen bei 1.200 U/min fünf Minuten lang, während Sie auf ein Milliliter mt. SIR, eins warten. Fügen Sie Polybrain in einer Endkonzentration von sechs Mikrogramm pro Milliliter und das Supplement für die Wiederherstellung menschlicher embryonaler Stammzellen in einer Konzentration von zwei Mikromolar hinzu.Suspenderen Sie die Zellen anschließend in dieser Lösung und überführen Sie sie in eine einzelne Vertiefung einer sechswelligen Low-Attachment-Platte. Geben Sie nun das konzentrierte Bad 60 C-Virus mit einer Multiplizität der Infektion von 100 Millionen hinzu. Inkubieren Sie die Platte drei Stunden lang mit dem Virus.Sammlen Sie dann die Zellen und verteilen Sie sie auf zwei mit Matrigel beschichtete Plattenmulden. Geben Sie zu jeder Platte zwei Milliliter mt, SIR, jeweils mit zwei Mikromolar Supplement, und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag ersetzen Sie das Medium durch frisches Medium.Die Zellen erscheinen bereits 48 Stunden nach Beginn der Infektion zusammengeklumpt. Überprüfen Sie die Fluoreszenz, um die Infektionseffizienz zu bewerten. Führen Sie die täglichen Mediumwechsel fort, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, dann lösen Sie die Zellen ab und infizieren Sie erneut mit dem Myo D-Virus, wobei Sie denselben Protokollablauf verwenden.Pflegen Sie die infizierten Zellen mit täglichen Mediumwechseln, bis sie am Tag vor diesem Wachstumspunkt eine Konfluenz von 80 % erreichen. Säen Sie MES auf mit Matrigel beschichteten Platten mit 1000 Zellen pro Quadratzentimeter aus, um die infizierten Zellen auf die ME'S-Platte zu überführen. Am nächsten Tag.Verwenden Sie Trip ALI, um sie zu dissociieren, und überführen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie neun Milliliter humanen embryonalen Stammzell-Medium hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen. Zentrifugieren Sie bei 1.200 U/min fünf Minuten lang.Resuspendieren Sie die Zellen im Pellet in frischen sechs Millilitern humanem embryonalen Stammzellmedium. Entfernen Sie nun das Medium von zwei Platten mit Mes und geben Sie die infizierten Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen mehrere Tage lang.Fügen Sie einmal 80 % Konfluenz hinzu. Entfernen Sie das gesamte Medium und geben Sie ein Milliliter Kollagenase vier hinzu. Fügen Sie nach fünf Minuten in Kollagenase bei 37 Grad Celsius ein Milligramm pro Milliliter hinzu.Ersetzen Sie die Kollagenase durch ein Milliliter humanes embryonales Stammzellmedium. Dann kratzen Sie unter einem Stereomikroskop die Kolonien mit einer 10-Milliliter-Pipettenspitze ab, überführen Sie die Kolonien in ein 15-Milliliter-Röhrchen und lassen Sie sie absetzen. Entfernen Sie nach drei Minuten den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in humanem embryonalen Stammzellmedium.Anschießend die Zellen im Verhältnis eins zu vier auf Meth-Platten ausplattieren. Die infizierten Zellen müssen in hoher Zahl vorliegen und Kolonien von guter Qualität gebildet haben, damit dieses Verfahren funktioniert. Das Medium aus jedem Wells entfernen und ein Milliliter Kollagenase.Vier hinzufügen.Fügen Sie erneut eine Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter hinzu und beenden Sie die Kollagenase-Reaktion nach fünf Minuten, indem Sie das Reagenz durch EB-Medium ersetzen. Danach verwenden Sie schnell ein Mikroskop, um die Kolonien abzukratzen. Mithilfe einer 10-Milliliter-Pipettenspitze können die Zellen in kleine Zellklumpen dissoziiert werden. Sammeln Sie diese Aggregate in einem 15-Milliliter-Röhrchen und entfernen Sie nach einer Sedimentationszeit von etwa drei Minuten den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in drei Milliliter EB-Medium und überführen Sie alles in eine einzelne Vertiefung einer sechswelligen Low-Attachment-Platte. Inkubieren Sie die Platte am nächsten Tag über Nacht. Überprüfen Sie die Kulturen auf große Koloniebröckchen.Falls vorhanden. Zerlegen Sie sie, indem Sie sie mehrmals mit einer fünf Milliliter-Pipette durchpipettieren. Wenn viele einzelne schwebende Zellen vorliegen, sammeln Sie die Aggregate durch Sedimentation und ersetzen Sie das Medium durch frisches EB-Medium.Ersetzen Sie das Medium alle zwei Tage, beginnend nach fünf Tagen der Kultivierung. Sammeln Sie die Zellaggregate ein und waschen Sie sie einmal mit zwei Millilitern PBS, wobei die Zellen unter Normalgravitation sedimentieren dürfen. Ersetzen Sie anschließend den PBS durch drei Milliliter DM-Medium und geben Sie die Zellen in die gleichen Brunnen der Platte zurück, wo sie während der nächsten 15 Tage kultiviert werden.Ersetzen Sie das Medium alle drei Tage. In dieser Zeit bilden sich Mesosphären. Menschliche embryonale Stammzellen wurden mit Bad 60 C, das die GFP-Fluoreszenz trägt, infiziert.Nach 72 Stunden wurden die Zellen per FACS sortiert. Die Zellen, die BAF 60 C exprimierten, wurden bis zu einer Konfluenz von etwa 75 % kultiviert und anschließend mit einem Myo D-Lentivirus infiziert. Die Expression des exogenen Gens wurde in den infizierten Zellen mittels quantitativer Echtzeit-PCR nachgewiesen.Die Expression und Verteilung auf Proteinebene wurde untersucht. Dabei entspricht GFP der Baf60C-Expression, und ein MyoD-Antikörper wurde verwendet, um die MyoD-Expression zu überprüfen. 15 Tage nachdem die humanen embryonalen Stammzellen begannen, keimkörperähnliche Aggregate zu bilden.Ein Teil der Myos-Sphären wurde in OCT-Compound eingebettet und geschnitten; der Schnitt war positiv für myogene Marker und Myosin-Schwerketten-Marker gefärbt. Ab dem 10. Tag war es möglich, gelegentliche Kontraktionen in den Myos-Sphären zu beobachten. Einige Myos-Sphären nahmen unterschiedliche oder ungewöhnliche Formen an, möglicherweise aufgrund einer Fusion zwischen Myos-Sphären. Diese Technik wird die Forschung im Bereich der Krankheitsmodellierung und Therapie voranbringen, da Myosphären aus pluripotenten Stammzellen von Patienten mit verschiedenen Muskelerkrankungen erzeugt werden können. Aus diesem Grund stellen Myosphären ein Krankheitsmodell in Edition dar, das für die Arzneimittelscreening und die Erforschung der Krankheitspathogenese geeignet ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen mit induzierbaren Lentivirus, dass ausdrückliche Oct4, Sox2, c-Myc und Klf4.

Generieren von iPS-Zellen aus MEFS durch Forced Expression von Sox-2, Oct-4, c-Myc und Klf4

Wir präsentieren ein Protokoll für die effiziente Reprogrammierung von menschlichen Körperzellen in die menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) mit retroviralen Vektoren kodieren Oct3 / 4, Sox2, Klf4 und c-Myc (OSKM) und Identifizierung von richtig umprogrammiert hiPSC durch Live-Färbung mit Tra- 1-81 Antikörper ist.

Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Embryonale Fibroblasten der Maus können durch die erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc mit geringer Effizienz in induzierte pluripotente Stammzellen reprogrammiert werden. Die seltenen Zwischenprodukte der Reprogrammierungsreaktion sind FACS-isoliert durch Markierung mit Antikörpern gegen die Zelloberflächenhersteller Thy-1.2, Ssea-1 und Epcam.

Zelloberflächenmarker vermittelte Reinigung von iPS-Zellen aus einer Zwischen Reprogrammierbare Maus-Modell

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit Hilfe eines Episoms basierend Neuprogrammierung Strategie und Histon-Deacetylase-Inhibitoren.

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

Pluripotenten Stammzellen (iPS) Quelle eines patientenspezifischen Geweben für die klinische Anwendung und Grundlagenforschung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMNC) von gefrorenen Buffy Coats in virale freien iPSCs mit nicht-integrierenden episomalen Plasmiden erhalten neu zu programmieren.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus Gefrorene Buffy Coats mit Non-Integration episomalen Plasmiden

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Induktion eines hämogenen Programms in embryonalen Fibroblasten der Maus durch Überexpression eines minimalen Satzes von Transkriptionsfaktoren. Diese Technologie kann auf das menschliche System übertragen werden, um Plattformen für zukünftige Studien zur Hämatopoese, zu hämatologischen Erkrankungen und hämatopoetischen Stammzelltransplantationen bereitzustellen.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur effizienten Erzeugung integrationsfreier iPSCs aus menschlichen adulten peripheren Blutzellen. Durch die Verwendung von vier oriP/EBNA-basierten episomalen Vektoren zur Expression der Reprogrammierungsfaktoren KLF4, MYC, BCL-XL oder OCT4 und SOX2 können Tausende von iPS-Kolonien aus 1 ml peripherem Blut gewonnen werden.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Dieses Protokoll demonstriert die Induktion eines hämogen Programms in humanen dermalen Fibroblasten durch erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren GATA2, GFI1B und FOS zur Erzeugung hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen.

Hämogene Reprogrammierung menschlicher Fibroblasten durch erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren

Dieses Video zeigt, wie menschliche embryonale Stammzellen (hES) am embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder-Zellen wachsen.

Von MEFs auf Matrigel I: Die Passage hESCs in Gegenwart von MEFs

Erfahren Sie die epigenetische Reprogrammierung von hESCs zur Generierung kontraktiler Myospheren. Diese Methode ermöglicht die effiziente Erzeugung von Skelettmuskelvorläuferzellen für die Muskelbiologie und regenerative Medizin.

Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung

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