Ein Maus-Tumormodell der operativen Belastung zu Entdecken Sie die Mechanismen der postoperative Immunsuppression und Bewerten Novel Perioperative Immuntherapien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wirkung der Immuntherapie in der perioperativen Phase auf die Verringerung der Metastasierung und eines Mausmodells für Tumor- und chirurgischen Stress zu beobachten. Dazu werden zunächst vier T-on-Tumorzellen in das Gedächtnisfettpolster der Maus injiziert, um einen Primärtumor zu etablieren. Am Tag 13 oder einen Tag vor der Krebsoperation wird eine Immuntherapie verabreicht, von der angenommen wird, dass sie die postoperative metastasierende Erkrankung am Tag 14, nach der Implantation von Tumorzellen, abschwächt.

Der Primärtumor wird reseziert, gefolgt von zusätzlichem chirurgischen Stress in Form einer abdominalen Nephrektomie und einer Untergruppe von Mäusen. Der letzte Schritt besteht darin, die Anzahl der metastasierten Lungentumorknoten bei allen Mäusen zu opfern und zu quantifizieren. Letztlich wird dieses Mausmodell von spontanen Metastasen und chirurgischem Stress verwendet, um die vorteilhafte Wirkung der perioperativen Immuntherapie zu zeigen.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der chirurgischen Onkologie zu beantworten, z. B. wie sich größere chirurgische Eingriffe auf das Immunsystem und damit auf die Entstehung von Metastasen in der postoperativen Phase auswirken und wie Immuntherapien eingesetzt werden können, um diesen Effekt abzuschwächen. Dieses Verfahren wird von Christiano 10 dusa, einem Forschungstechniker und Dr. Rebecca's Labor, demonstriert, um die Tumorzellkultur einzurichten. Beginnen Sie damit, unmodifizierte 41 Tumorzellen in vollständiges DMEM in 10 Zentimeter große Gewebekulturplatten zu legen und sie bei 37 Grad Celsius 5 % CO2 in einem Gewebekultur-Inkubator zu inkubieren.

Teilen Sie die Kulturen je nach Bedarf zwei- bis dreimal pro Woche, so dass die Zellen 80 % Konfluenz nicht überschreiten. Beginnen Sie innerhalb eines Monats nach dem Einrichten der Zellkultur mit der Entnahme der Tumorzellen, indem Sie das Kulturmedium von der Gewebekulturplatte absaugen. Fügen Sie 10 Milliliter eines sterilen X PBS hinzu, das zwei Milliliter EDTA enthält, und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, 5 % CO2 für fünf bis sieben Minuten.

Nachdem Sie die PBS-Lösung aus der Platte genommen haben, spülen Sie die Platte zwei- bis dreimal mit PBS aus und geben Sie die Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen fünf Minuten lang in einer Tischzentrifuge bei 500 g und vier Grad Celsius. Nach dem Aspirieren der Überstände resuspendieren die Zellpellets und das serumfreie DMEM.

Als nächstes verwenden Sie einen Zellzähler, um die Zellkonzentration zu bestimmen und verdünnen Sie die Zellen mit freiem Serummedium auf eins mal 10 bis sechs Zellen pro 500 Mikroliter und legen Sie die Zellen eine Stunde vor der Operation auf Eis. Injizieren Sie einer Maus subkutan 0,05 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin zur Schmerzbehandlung. Nachdem Sie die Maus mit 2,5 % ISO-Fluor betäubt haben, kneifen Sie das Fußpolster zusammen, um ein angemessenes Maß an Anästhesie zu gewährleisten.

Laden Sie dann eine ultrafeine Spritze mit 30 Gauge Half Inch mit genau 50 Mikrolitern der Tumorzellsuspension. Klopfen Sie auf die Seite der Spritze, um Luftblasen zu entfernen. Fahren Sie mit der ISO-Fluoranästhesie fort und legen Sie die Maus mit der Bauchseite nach oben auf den Operationstisch.

Führen Sie nun die Nadel horizontal und direkt in das vierte Memory-Fettpad ein und geben Sie langsam das Spritzenvolumen ab. Es sollte etwa eine Minute dauern, bis die Injektion abgeschlossen ist. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um Leckagen nach der Injektion zu reinigen.

Lassen Sie die Maus sich von der Narkose erholen, bevor Sie sie in ihren Käfig zurückbringen. Setzen Sie die Schmerzbehandlung fort, indem Sie zwei Tage lang alle acht Stunden 0,05 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin subkutan verabreichen, wenn Sie 13 Tage nach der Injektion von Postumzellen injiziert werden. Verwenden Sie einen externen Messschieber, um die Größe des Primärtumors zu messen.

Messen Sie den größten Längsdurchmesser bzw. die größte Längslänge bzw. Länge und den größten Querdurchmesser bzw. die größte Querbreite mit einem Messschieber. Die modifizierte ellipsoide Formel wird verwendet, um das Tumorvolumen als die Hälfte der Länge mal Breite zum Quadrat zu berechnen. Zu diesem Zeitpunkt, unter der Annahme, dass der Primärtumor etwa einen Kubikzentimeter misst, wurde das perioperative Therapiereagenz der Wahl, in diesem Fall das onkolytische Virus in einem x sterilen PBS, hergestellt.

Laden Sie eine 27-Gauge-Half-Inch-Insulinspritze mit genau 100 Mikrolitern der onkolytischen Virustherapie. Entfernen Sie alle Luftblasen aus der Spritze. Setze als Nächstes eine Maus in ein Zurückhaltesystem und lasse den Schwanz zugänglich.

Mit warmem Leitungswasser den Schwanz vorsichtig erhitzen. Um die lateralen Schwanzvenen sichtbar zu machen, wählen Sie die laterale Schwanzvene aus und injizieren Sie ihr das onkolytische Virus. Wenn die Nadel richtig in eine Seitenvene eingeführt wird, sollte beim Drücken der Spritze kein Widerstand zu spüren sein.

Wenn Sie fertig sind, bringen Sie die Maus über Nacht nach 14 Tagen Postum-Zellinjektion in ihren Käfig zurück. Behandeln Sie die Maus eine Stunde vor der Operation subkutan mit 0,05 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin zur Schmerzbehandlung, leiten Sie eine Anästhesie mit 2,5% ISO-Fluor ein und halten Sie sie aufrecht. Entfernen Sie nach einem ein bis zwei Zentimeter großen Hautschnitt vorsichtig den gesamten primären vier T 1 Tumor aus dem Brustfettpolster, der Tumor und alle anhaftenden Ablagerungen sollten in einem Stück herauskommen.

Bewahren Sie den Tumor in Formin für eine spätere immunhistochemische Analyse auf. Nach der Exzision des Tumors verschließen Sie den Schnitt mit zwei bis drei Neun-Millimeter-Klammern. Der nächste Schritt besteht darin, eine größere Operation an einer Untergruppe der Mäuse durchzuführen.

Beginnen Sie mit einem Schnitt an der ventralen Mittellinie durch die Haut und die Unterhautschicht. Machen Sie dann einen drei bis vier Zentimeter langen Schnitt am linearen Ellenbogen, um Zugang zum Bauchfell zu erhalten. Bewege nun den darüber liegenden Darm zur Seite, um die linke Innenseite des Bauches freizulegen.

Halten Sie den Darm mit einer mit Kochsalzlösung getränkten sterilen Gaze feucht. Fassen Sie dann mit einer stumpfen chirurgischen Zange vorsichtig die linke Niere. Verwenden Sie dann eine mit 3.0 Wachs beschichtete, geflochtene Seidennaht, die zu einer Schlaufe gebunden ist, um das Hilum der linken Niere zu ligieren.

Befestigen Sie die Naht mit drei chirurgischen Knoten. Entfernen Sie nun die linke Niere mit einer chirurgischen Schere. Untersuchen Sie den Nahtbinder sorgfältig, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Blutstillung erreicht wird.

Als nächstes verschließen Sie die subkutane Schicht mit einer durchgehenden Schlaufennaht mit fünf oh geflochtenen resorbierbaren Nähten. Heften Sie dann die Hautschicht mit neun Millimeter Klammern ab. Die Nephrektomie sollte 10 Minuten pro Tier dauern.

Wenn Sie sich erholt haben, bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück und setzen Sie die Schmerzbehandlung zwei Tage lang fort, indem Sie 28 Tage nach der vier T-1-Tumorinjektion alle acht Stunden 0,05 Milligramm pro Kilogramm subkutanes Buprenorphin verabreichen, die Maus einschläfern und mit 70 % Ethanol besprühen. Beginnen Sie die Lungenentfernung, indem Sie mit einer Schere einen ersten Schnitt direkt unter dem Brustkorb vornehmen. Schneiden Sie durch die Haut und die Unterhautschicht entlang der ventralen Mittellinie der Brusthöhle, um den Thorax freizulegen.

Machen Sie dann seitliche Schnitte durch die Haut und das Gewebe auf jeder Seite bis zum Hals. Fassen Sie nun vorsichtig die Lunge und schneiden Sie dabei das Bindegewebe ab, bis die Lunge frei ist. Schneide durch die Luftröhre oberhalb der Bifurkation, die den linken und rechten Lappen zusammenhält.

Tauchen Sie anschließend die extrahierte Lunge in kaltes PBS, um jegliches Restblut zu entfernen, und legen Sie sie in ein 10%iges gepuffertes Formin-Finish, indem Sie die Lunge zur Beurteilung der Tumormetastasen fotografieren und zur Quantifizierung der Tumorlast wiegen. 14 Tage nach der vier T-1-Tumorresektion wurde die Lunge entnommen und auf Metastasen visualisiert, die hier als Lunge einer Maus gezeigt werden, die keine abdominale Nephrektomie hatte. Einige metastasierte Tumoren sind sichtbar.

Im Gegensatz dazu führte eine operative Nephrektomie unmittelbar nach der Tumorresektion zu einem sichtbaren Anstieg der Anzahl der Lungenmetastasen. Dieses Foto zeigt die Lunge einer Maus, die nach einer Tumorresektion und Nephrektomie mit einem onkolytischen Virus behandelt wurde. Hier sind die Lungen einer Maus, die nach Tumorresektion und Nephrektomie mit einem Influenza-Impfstoff behandelt wurde. Die Zählung der Lungentumorknoten in jeder dieser Kategorien zeigt einen deutlichen Anstieg der Anzahl von Lungenmetastasen und Mäusen mit Nephrektomie im Vergleich zu denen ohne Operation. oder solche mit einem präoperativen therapeutischen Eingriff. Die Lungen der Mäuse mit einer Nephrektomie, aber keiner präoperativen Therapie, wiegen signifikant mehr als die anderen Testkategorien.

Somit konnte die präoperative Verabreichung des replizierenden onkolytischen Virus und des inaktivierten Influenzaimpfstoffs die prometastasierenden Effekte größerer Operationen nach einer Tumorresektion signifikant retten. Diese Diagramme zeigen die Anzahl der Lungentumoren bei Mäusen mit normaler oder intakter Anzahl von NK-Zellen und bei Mäusen, deren NK-Zellen mit Anasi ALO GM one pharmakologisch depletiert wurden. Die NK-depletierten Mäuse hatten eine verminderte therapeutische Wirkung von perioperativen Immuntherapien mit onkolytischen Viren oder Influenza-Impfstoffen.

Dies deutet darauf hin, dass die NK-Zellen eine vermittelnde Rolle bei der Verhinderung von Metastasen nach der Impfung spielen. Um die Funktion der NK-Zellen weiter zu charakterisieren, wurde die ex vivo Abtötung von NK-Zellen bewertet: Fünf positive Zellen von chirurgisch gestressten und unbehandelten Kontrollen wurden mit Yak-One-Zielzellen kultiviert. Die schwarze durchgezogene Linie zeigt die Abtötungsfähigkeit von NK-Zellen von unbehandelten Mäusen und die schwarze gestrichelte Linie zeigt die Fähigkeit zur Abtötung von NK-Zellen von chirurgisch gestressten Mäusen.

Die Abnahme der prozentualen Zytotoxizität, die durch die Abwärtsverschiebung von der schwarzen durchgezogenen Linie zur schwarz gestrichelten Linie gezeigt wird, zeigt einen Defekt der zytotoxischen Funktion von NK-Zellen und Mäusen nach der Operation. Die grauen durchgezogenen Linien deuten auf die Abtötung von NK-Zellen von Mäusen hin, die eine Immuntherapie erhielten, entweder ein onkolytisches Virus oder einen Influenza-Impfstoff, aber keine Operation. Die grauen gestrichelten Linien zeigen die Fähigkeit zur Abtötung von NK-Zellen von Mäusen, die sowohl eine perioperative Immuntherapie als auch eine Operation erhielten.

Die Abnahme der prozentualen Zytotoxizität, die sich durch die Abwärtsverschiebung von der grauen durchgezogenen Linie zur grauen gestrichelten Linie zeigt, zeigt einen Defekt in der zytotoxischen Funktion der NK-Zellen und der Mäuse nach der Operation trotz perioperativer Immuntherapie. Am wichtigsten ist, dass die grauen gepunkteten Linien immer noch viel höher sind als die schwarzen gepunkteten Linien. Dies deutet darauf hin, dass es möglich sein könnte, die durch eine Operation induzierte zytotoxische Dysfunktion der NK-Zellen mit einer perioperativen Immuntherapie zu retten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Tiermodell für spontane Metastasen und chirurgischen Stress erstellen können, indem Sie die besten primären Tumoren etablieren. Resektion der Primärtumoren, Induktion zusätzlicher chirurgischer Belastung durch Nephrektomie und Beurteilung lungenmetastasierender Tumorknoten am Endpunkt. Darüber hinaus sollten Sie verstehen, wie dieses Modell verwendet werden kann, um die unterdrückende Wirkung von Operationen auf das angeborene Immunsystem und die Fähigkeit von Immuntherapien, diesen Effekt umzukehren, zu untersuchen.