Name: Ein Maus-Tumormodell der operativen Belastung zu Entdecken Sie die Mechanismen der postoperative Immunsuppression und Bewerten Novel Perioperative Immuntherapien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Erfahren Sie, wie perioperative Immuntherapien die postoperative Metastasierung in einem Maus-Tumormodell reduzieren können. Diese Methode zeigt, wie chirurgischer Stress das Immunsystem beeinflusst und wie Immuntherapien diesen Effekt abschwächen.

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Die Autoren möchten Sie Kim Yates, Eileen Franklin, und Rebecca Tjepkema (Tierpflege und Veterinärwesen, Universität Ottawa) für die Unterstützung bei Tierarztpraxen danken. Lee-Hwa Tai wird von einem Fonds de recherche santé Quebec Fellowship unterstützt. Führers Chance Grant Rebecca Auer - Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse von der kanadischen Krebsgesellschaft Research Institute Innovation Grant, Ontario Ministerium für Forschung und Entwicklung Frühe Researcher Award und kanadischen Stiftung für Innovation unterstützt.

1. Die Aufrechterhaltung 4T1 Tumorzellen in vitro <ol><li> Kultur unmodifizierten 4T1 Tumorzellen in komplettem DMEM (DMEM, 10% FBS, 1x Penicillin / Streptomycin) in 10 cm-Gewebekulturplatten. Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2-Brutschrank. </li><li> Split Kulturen 2-3 Mal / Woche. Zur Aufrechterhaltung optimale Rentabilität Zellen sollten 80% Konfluenz nicht überschreiten. Verwenden Sie keine Zellen für die Gründung in vivo Primärtumoren, wenn Kulturen wurden in vitro für&gt; 1 Monat agiert wurden, da dies verringert Krebserkrankung und metastatischen Potential als frühere agiert Zellen. </li></ol> 2. Ernten 4T1 Tumorzellen zur Injektion <ol><li> Aspirat Kulturmedium aus der Gewebekulturplatte unter Verwendung einer Pasteurpipette. </li><li> 10 ml 1x PBS, die sterile 2 ml EDTA. Lassen die PBS-Lösung inkubiert in der Platte bei 37 ° C, 5% CO 2-Brutschrank für 5-7 min. </li><li> Ernte-PBS-Lösung von der Platte, rinsing die Platte 2-3x mit Lösung, Transfer zu 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifuge Zellen 5 min bei 500 × g bei 4 ° C in einer Tischzentrifuge. </li><li> Saugt den Überstand und Zellpellet in serumfreiem DMEM. </li><li> Bestimmen Zellkonzentration mit Hilfe eines Zellzählers. </li><li> Verdünnen Sie die Zellen mit Serum-freien Medium zu 6 Zellen/500 ul (1x10 5 Zellen/50 ul (zur Injektion und Ort Zellen auf Eis 1x10. </li></ol> 3. Injektion Mäuse mit 4T1-Tumorzellen Alle Tierversuche durchgeführt wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts an den Animal Care Veterinary Services der Universität von Ottawa Empfehlungen für alle Tiere, die orthotope Injektionen oder Implantate Tumor. <ol><li> Gönnen Mäusen subkutan mit Buprenorphin (0,05 mg / kg) 1 h vor der Operation zur Schmerztherapie. </li><li> Einleitung und Aufrechterhaltung einer Maus mit 2,5% Isofluran während der Dauer der Injektion unter Narkosetion. Drücken Sie den Fußballen der Maus, um Reflexantwort zu erkennen. Wenn keiner gefunden wird, werden wirksame Anästhesie Niveau erreicht. Sterile Augensalbe wird dann angewendet, um Hornhauttrocknungs verhindern. </li><li> Legen Sie eine 30 G ½ &quot;Ultra-fine&quot; Spritze mit genau 50 ul Zellsuspension. Sicherzustellen, daß alle Luftblasen aus der Spritze Spalte, indem die Seite der Spritze, um Luftblasen zu entfernen entfernt. </li><li> Zeigen Maus (in Narkose) Bauchseite auf. </li><li> Reinigen Sie die Injektionsstelle mit einem Alkoholtupfer und horizontal und direkt vorstellen die Nadel in die vierte Brustfettpolster langsam die Spritze verzichten Lautstärke. </li><li> Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um mögliche Leckagen zu reinigen. </li><li> Lassen Mäuse aus der Narkose zu erholen. </li><li> Pflegen Buprenorphin (0,05 mg / kg) für die Schmerztherapie verabreicht sc alle 8 Stunden für 2 Tage. </li></ol> 4. Verwalten Perioperative Behandlung in 4T1 Tumor-tragenden BALB / c-Mäuse <ol><li> Mit 13 Tage nach der Injektion der Tumorzellen, messen Sie den Primärtumor mit einem externen Bremssattel. Messung der größten Längsdurchmesser (Länge) und den größten Querdurchmesser (Weite) mit dem Bremssattel. Das modifizierte ellipsoide Formel wird verwendet, um das Tumorvolumen zu berechnen (Tumorvolumen = 1/2 (Länge × Breite 2) </li><li> Mit 13 Tage nach der Injektion der Tumorzellen, sollte der Primärtumor ca. 1 cm 3 zu messen. Wenn diese Tumormessung erreicht, bereiten perioperative Therapie Reagenz. </li><li> Onkolytischen Virus ist ein innovativer Therapie, die man in der perioperativen Phase zu verwalten. Bereiten onkolytischen Virus (1x10 9 PFU / 1 ml) in 1x PBS steril und auf Eis vor der Injektion. </li><li> Sichere und Ort der Mausin Rainer für die intravenöse Injektion in die Schwanzvene. </li><li> Schonend erwärmen Maus Schwanz in warmem Leitungswasser, um seitliche Schwanzvenen zu visualisieren. </li><li> Legen Sie eine 27 G ½ &quot;Insulin-Spritze&quot; mit genau 100 ul von onkolytischen Virustherapie. Stellen Sie sicher, dass alle Luftblasen aus der Spritze Säule entfernt. </li><li> Spritzen Sie die Maus mit 1x10 8 PFU/100 ul / Maus an einen der seitlichen Schwanzvenen. Wenn die Nadel in geeigneter Weise in einer seitlichen Vene eingeführt, sollte kein Widerstand beim Niederdrücken des Spritzen spüren. </li></ol> 5. Vollständige Entfernung des primären Tumors und Bauch Left Nephrektomie <ol><li> Mit 14 Tage nach der Injektion der Tumorzellen einleiten Routine perioperativen folgenden Universität von Ottawa Tierpflege-und Veterinärdienst genehmigten Protokolle. Gönnen Mäusen subkutan mit Buprenorphin (0,05 mg / kg) 1 h vor der Operation zur Schmerztherapie. Einleitung und Aufrechterhaltung einer Narkose mit Isofluran 2,5% während der Operation. Under sterilen Bedingungen und mit sterilen chirurgischen Instrumenten wird Operationsstelle rasiert und gewaschen. Tiere verabreicht subkutanen Flüssigkeiten und Schmiermittel Auge vor der Operation. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt (1-2 cm Länge) vorsichtig und vollständig entfernen Sie die primäre 4T1 Tumor aus dem Brustfettpolster. </li><li> Schließen Sie den Schnitt mit 2-3 9 mm Heftklammern. </li><li> Expose der Bauch durch einen Schnitt durch die Haut-und Unterhautschicht entlang der ventralen Mittellinie der Maus. </li><li> Einen Einschnitt in der Linea alba (3-4 cm) auf Maus Peritoneum zugreifen. </li><li> Setzen Sie die linke Innenseite des Bauches durch Verschieben der darüberliegenden Darm zur Seite. Stellen Sie sicher, die Därme mit einer Kochsalzlösung getränkt steriler Gaze feucht gehalten. </li><li> Mit einem stumpfen Paar chirurgische Pinzette, fassen Sie die linke Niere sanft. </li><li> Mit einem 3:0-Wachs beschichtet geflochtenen Seidenfaden in eine Schleife gebunden, die ligieren Hilus der linken Niere und mit drei chirurgischen Knoten. Entfernen Sie die linke Niere mit chirurgischencal Schere. </li><li> Überprüfen Sie die Nahtverbindungs ​​sorgfältig, um sicherzustellen, dass eine angemessene Hämostase erzielt wird. </li><li> Schließen Sie die subkutane Schicht mit einer Endlosschleife Naht mit 5-0 resorbierbaren geflochten, dann Klammer Hautschicht mit 9 mm Heftklammern. Die Schritte 5,2-5,10 sollte 10 min / Tier erforderlich. </li><li> Pflegen Buprenorphin (0,05 mg / kg) für die Schmerztherapie verabreicht sc alle 8 Stunden für 2 Tage. </li></ol> 6. Euthanizing Mäuse und Verarbeitung und Quantifizierung von Lungentumorlast <ol><li> 28 Tage nach 4T1 Tumorinjektion einschläfern Mäusen nach Tierpflege und Veterinärwesen-Protokoll an der Universität von Ottawa. </li><li> Spray bis Maus mit 70% Ethanol. </li><li> Nutzen Sie den ersten Schnitt mit der Schere direkt unter dem Brustkorb. </li><li> Expose der Thorax durch einen Schnitt durch die Haut-und Unterhautschicht entlang der ventralen Mittellinie der Brusthöhle der Maus. </li><li> Machen seitliche Schnitte durch Haut und Gewebe auf jeder Seite bis zu der neck der Maus. </li><li> Präparieren Sie sich die Lunge durch leichtes Greifen der Lunge entfernt, während schnippeln das Bindegewebe über und unter der Lunge. </li><li> Einzuweichen extrahiert Lunge in kaltem PBS Rest Blut zu entfernen, dann in 10% Buffered Formalin. </li><li> Fotografieren Sie jede Lunge für Tumormetastasen Beurteilung. Wiegen Lunge für Tumorlast Quantifizierung. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die chirurgische Resektion ist die Hauptstütze der Therapie für Patienten mit lokalisierten solide Tumoren. Selbst bei vollständiger Resektion, entwickeln viele Patienten ein Rezidiv metastasiertem und letztlich sterben an ihrer Krankheit. Die unmittelbaren postoperativen Phase bietet eine ideale Umgebung für die Bildung von Metastasen, moduliert, zum großen Teil durch postoperative NK-Zell-Suppression. Dennoch bleibt es ein therapeutisches Fenster, die weitgehend ignoriert. Es liegen noch keine Standard perioperative Anti-Krebs-Therapien zur Verhinderung von postoperativen Metastasen ab. Die aktuelle Herausforderung ist es, sichere und vielversprechende Therapien, die NK-Zellen in der perioperativen Phase, wodurch die Einrichtung mikrometastatische Krankheit verhindert aktivieren identifizieren. Diese Therapien müssen streng auf Sicherheit und Wirksamkeit in präklinischen Tiermodellen charakterisiert werden und dann in klinischen Studien durchdachten übersetzt. Die Primärübersetzungnale der Entwicklung eines Maus-Tumormodell der operativen Belastung ist es, Mechanismen der Immunsuppression und Metastasierung zu erkunden und nach der Operation zu innovativen Immuntherapien mit Potenzial für die zukünftige Verwendung bei Krebspatienten einer Operation unterziehen, um den Primärtumor zu entfernen beurteilen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde ein Maus-4T1 Mammakarzinom-Modell gepaart mit operativen Belastung entwickelt. Während die 4T1-Zelllinie ist eine Maus &quot;Mammakarzinom&quot;, ist der Grund, diese Zelllinie verwenden die Reproduzierbarkeit der spontanen Metastasen, die uns um die Auswirkungen der operativen Belastung in einer realistischen Krebs Modell bewerten können. In diesem Zusammenhang ist die eigentliche Ursache der Malignität weniger wichtig als der metastatischen Potential und Tumorbiologie. Der zweite entscheidende Komponente unseres Modells ist die Entwicklung eines Tier chirurgische Verfahren für die menschliche Krebs-Operation ähneln. In diesem Tier chirurgischen Stress-Modell wird der Primär 4T1 Brusttumor herausgeschnitten, nachdem es 1 cm 3 erreicht. DaKrebsoperationen in menschlichen Patienten mit erheblichen Immunsuppression, ein Open-Bauch Nephrektomie in &quot;chirurgischen Stress&quot; Behandlungsgruppen wird zusätzlich durchgeführt. Da es mit konventionellen Tumorentfernung beim Menschen vergleicht, ist die invasive Natur eines ganz links Nephrektomie sehr vergleichbar mit zahlreichen Arten von chirurgischen Behandlungen für solide Malignomen, einschließlich der Chirurgie für Darmkrebs, Eierstockkrebs, Nierenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Lungen-und Speiseröhren Krebs. Darüber hinaus würden wir argumentieren, dass die tiefgreifenden physiologischen Veränderungen, die perioperativ auftreten, durch Laparotomie + Nephrektomie, ausreichend reproduziert die überwältigende physiologischen Veränderungen, die nach invasiven Chirurgie für die meisten soliden Malignome auf. Für perioperative Faktoren, die zu übermäßigen operativen Belastung und Mortalität, die Dauer der Anästhesie und Chirurgie führen und halten die Körpertemperatur während der Operation könnte zu steuern ist genau definiert. Alle diese Parameter werden genauer ein ausgeführtesd in unserer Praxis-Protokoll definiert spiegeln Routine perioperative Versorgung in menschlichen Krebspatienten. Der Zeitplan für die perioperative Behandlung ist eine zusätzliche kritische Komponente für den perioperativen Rettungsmodell. 4T1 Tumor tragenden Mäuse wurden zuvor mit 3-Schemata von Influenza-Impfstoff behandelt wurden: neoadjuvante (bei 5 Tage vor der Operation), perioperative (am Tag der Operation angegeben) und perioperative + Mehrfachdosis (am Tag der Operation gegeben, gefolgt von 2 zusätzliche Dosen Abstand von 5 Tagen). Bemerkenswert ist, alle 3 Modi des Impfstoff-Behandlung deutlich verringert Lungenmetastasen 22. Allerdings Influenza-Impfstoff perioperativ als eine einzige Dosis reduziert Metastasen effektiv verwaltet. Gemeinsam, markieren diese Experimente die Bedeutung der unmittelbaren perioperativen Phase als enges therapeutisches Fenster in der metastatischen Prozess eingreifen. Perioperative Einsatz von innovativen Immuntherapien wie oncolytic-Virus und Impfstoffe hat exklusiv für unsere Forschungsgruppe beschränkt. Wir haben gezeigt, für das erste Mal, dass die perioperative Gabe von Roman onkolytischen ORF und Vaccinia-Viren können NK-Zell-Suppression nach der Operation im Tiermodell ein umzukehren. Noch wichtiger ist, dass diese Rettungs der Immunfunktion korreliert mit einer Verringerung der postoperativen Bildung von Metastasen. In Studien am Menschen, hatte Krebs-Chirurgie-Patienten postoperative NK-Zell-Zytotoxizität reduziert und perioperative OV deutlich erhöht NK-Zellaktivität bei Krebspatienten ein. Verwendung von handelsüblichen prophylaktische Impfstoffe zeigten wir, dass perioperative Influenza-Impfstoff Verwaltung deutlich reduziert Tumormetastasen und verbesserte NK-Zell-Zytotoxizität in präklinischen Tumormodellen. In Studien am Menschen deutlich Influenza-Impfstoff NK-Zellaktivität bei gesunden Spendern und Patienten 22 Krebsoperation verbessert. Viele Ansätze werden verwendet, um canc reduzierener Rezidiv, einschließlich Chemotherapie und Bestrahlung, aber diese Therapien sind in der Regel verabreicht Wochen bis Monate vor (neoadjuvante) oder nach (adjuvant) Chirurgie. Forschung in diesem Bereich zeigt, dass die unmittelbaren postoperativen Phase ist entscheidend bei der Bestimmung langfristige Tumorrezidivraten. Daher kann klinische Interventionen in Form von Immuntherapien in dieser kritischen Zeit haben erhebliche langfristige Vorteile. Unsere Untersuchungen mit einem Maus-Modell der spontanen Lungenmetastasen und chirurgischen Stress bieten eine einzigartige Gelegenheit, um neue Therapien zu erforschen und zu bestimmen, ihr Potenzial zur perioperativen Immunsuppression in der Krebschirurgie-Patienten verhindern und dadurch auch Krebs Rezidivraten zu reduzieren.

Chirurgie ist eine wichtige Komponente in der Krebsheil Behandlung von soliden Tumoren, aber trotz kompletter Resektion, entwickeln viele Patienten ein Rezidiv metastasiertem und letztlich sterben an ihrer Krankheit. Zunehmend wird die postoperativen Phase, als Ergebnis der physiologischen Belastung als Reaktion auf Operationen, einschließlich der Blutgerinnung, Freisetzung von Wachstumsfaktoren und Immununterdrückung wird als kritische Zeit für die Entwicklung von Metastasen zu erkennen. Unsere Gruppe 1,2 und andere 5.3 haben gezeigt, dass die unmittelbaren postoperativen Phase ist ein einzigartig anfällig Zeit für die Bildung von Metastasen. Einer der wichtigsten Mechanismen für die prometastatic Wirkungen der Operation verantwortlich ist postoperativen Funktionsstörungen der natürlichen Killerzellen (NK) 03.01. NK-Zellen sind zytotoxischen Lymphozyten des angeborenen Immunsystems bei der Kontrolle von Tumorwachstum und Metastasen 6 beteiligt. NK-Zell-Dysfunktion nach der Operation wurde ich dokumentiertn sowohl menschliche Patienten 1,7-9 und Tiermodelle 1,10,11. Postoperative NK-Zell-Suppression korreliert mit erhöhten Metastasen in Tiermodellen von spontanen und Metastasen 1,11-14 implantiert, während in Studien am Menschen wird Nieder NK-Aktivität während der perioperativen Phase mit einer höheren Rate von Rezidiv-und Mortalitäts 15,16 verbunden. Trotzdem gibt es noch keine Krebstherapien speziell auf den prometastatic Veränderungen, die unmittelbar nach der Krebsoperation auftreten. Die perioperativen Phase stellt eine therapeutische Fenster der Gelegenheit, in der in den metastatischen Prozess eingreifen. Während traditionelle Krebstherapien, wie zytotoxische Chemotherapie, als zu giftig für den Patienten nach großen Operationen 17 verabreicht werden, Immun-Therapien sind ideale Kandidaten für perioperative Verwaltung. Perioperativen Verwendung von rekombinantem IL-2 und IFN-I ³ i untersucht worden sindn frühen Phase der klinischen Studien, die ihr Potenzial zur postoperativen NK-Zell-Unterdrückung zu verhindern und zur Verbesserung der progressionsfreien Überlebens 18-21. Leider hat sich die weitere Entwicklung von Verträglichkeit dieses unspezifischen Zytokin-Therapie kombiniert mit einer größeren Operation 17 behindert. Viren sind auch starke unspezifische Aktivatoren von NK-Zellen. Unsere Forschung hat gezeigt, dass bereits eine präoperative Verabreichung von replizierenden Viren, wie neuartige Krebs onkolytischen Viren (OV) und nicht-replizierende virale Impfstoffe wie Influenza-Impfstoff, kann die Operation induzierte NK-Zellfehlfunktion zu verhindern und zu dämpfen Metastasen 1,22. Die in diesem Dokument beschriebenen Operationsmodell hat sich unser Verständnis der Mechanismen bei der Ausbreitung und das Wachstum von Tumorzellen nach der Operation beteiligt erleichtert und uns erlaubt, neue zielgerichtete Therapien, die in der perioperativen Phase verabreicht werden kann, zu erkunden. Um dieses Ziel zu erreichen, ein TierModell der operativen Belastung und spontane Metastasierung wad entwickelt. Das Modell macht Gebrauch von Maus Mammakarzinom Tumoren (BALB / c - 4T1), die in der Lage, spontan metastasieren aus dem primären Brustdrüse, mehrere entfernte Orte insbesondere die Lunge. Am Tag 0 werden Brustkrebszellen in der Maus-Brustfettpolster implantiert. Am Tag 14 nach der Tumorimplantation, wird eine vollständige Resektion des Primärmammatumor bei allen Tieren durchgeführt. Eine Untergruppe von Tieren erhält zusätzlichen operativen Belastung in Form einer Bauch Nephrektomie. Am Tag 28, Lungen-Tumorknoten in chirurgisch gestresst und keine Operation Kontrollmäusen verglichen werden isoliert und quantifiziert. In diesem Tiermodell von Krebs und Chirurgie, werden die Auswirkungen der Operation auf Metastasen untersucht und die Wirksamkeit der perioperativen Gabe von innovativen Immuntherapien, einschließlich replizieren und nicht-replizierende Viren basierter Immunstimulanzien sind zum ersten Mal getestet.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning Cell-Gro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Inaktiviertes fötales Rinderserum (FBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>1x sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Corning Cell Gro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>Chiron, Welpe</td><td></td><td></td>RXN309968</tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter Corp</td><td>1001936040</td><td></td></tr><tr><td>1/2 Ultrafeine Spritze</td><td>Terumo</td><td>30 G, SS05M3009</td><td></td></tr><tr><td>9 mm Heftklammern</td><td>Braintree</td><td>ACS BX</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Geflochtenes resorbierbares Nahtmaterial</td><td>Covidien</td><td>UL-202</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Wachsgeflochtenes Seidennaht</td><td>Covidien</td><td>S-194</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Fisher</td><td>SF100-20</td><td></td></tr><tr><td>4T1 Tumorzellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c Mäuse</td><td>Charles Rivers Labs</td><td>Stammcode:028</td><td></td></tr></tbody></table>

ein maus-tumormodell der operativen belastung zu entdecken sie die mechanismen der postoperative immunsuppression und bewerten novel perioperative immuntherapien

A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

Chirurgische Resektion ist ein wesentlicher Behandlung für die meisten Krebspatienten, aber Operation induziert Dysfunktion des Immunsystems, und dies hat zu der Entwicklung von Metastasen in Tiermodellen und bei Patienten mit Krebs in Verbindung gebracht worden. Die präklinischen Arbeiten aus unserer Gruppe und andere hat eine tiefgreifende Unterdrückung der angeborenen Immunfunktion, insbesondere NK-Zellen in der postoperativen Phase demonstriert und diese nach der Operation spielt eine wichtige Rolle in der verstärkten Entwicklung von Metastasen. Relativ wenige Untersuchungen an Tieren und klinische Studien haben sich auf die Charakterisierung und die Umkehrung der schädlichen Wirkungen von Krebsoperation konzentriert. Verwendung einer strengen Tiermodell der spontan metastasierenden Tumoren und operativen Belastung wurde die Verbesserung der Krebsoperation auf die Entwicklung von Lungenmetastasen bewiesen. In diesem Modell werden die 4T1-Brustkrebszellen in der Maus-Mamma-Fettpolster implantiert. Am Tag 14 nach der Tumorimplantation ist eine komplette Resektion des Primärmammatumor performed bei allen Tieren. Eine Untergruppe von Tieren erhält zusätzlichen operativen Belastung in Form einer Bauch Nephrektomie. Am Tag 28 werden die Lungentumorknoten quantifiziert. Wenn Immuntherapie wurde sofort präoperativ gegeben wurde eine tiefgreifende Aktivierung von Immunzellen, die die Entwicklung von Metastasen nach der Operation verhindert erkannt. Während die 4T1 Brusttumorchirurgie Modell ermöglicht die Simulation der Auswirkungen von Stress auf abdominale chirurgische Tumormetastasen, die Anwendbarkeit auf andere Tumortypen getestet werden muss. Die aktuelle Herausforderung ist es, sichere und vielversprechende Immuntherapien in präklinischen Mausmodellen zu identifizieren und zu tragfähigen perioperative Therapie zu übersetzen, um Krebs-Chirurgie-Patienten gegeben, um das Wiederauftreten von Metastasen zu verhindern.

Eine reproduzierbare Mausmodell der operativen Belastung, die in der dramatischen Verbesserung der Lungenmetastasen Ergebnisse entwickelt worden. Am Tag 28 nach der Tumorimpfung 4T1 (und 14 Tage nach der Tumorentfernung + / - Bauch Nephrektomie) wurden die Lungen entnommen und auf Metastasen visualisiert. Operation deutlich erhöht die Menge an Lungenmetastasen im Vergleich zu unbehandelten Mäusen, wie durch Lungen Photographien (Fig. 1A), Zählung von Lungenknoten (1B) und Lungengewicht (1C) gezeigt. Die präoperative Gabe von onkolytischen Virus replizieren und inaktivierte Influenza-Impfstoff deutlich rettet die prometastatic Wirkungen der Krebschirurgie (den 1A-C). Um festzustellen, ob NK-Zellen spielen eine vermittelnde Rolle bei der Verhinderung Metastasen Post-Impfstoff der Behandlung wurden die NK-Zellen pharmakologisch mit Anti-Asialo-GM-1 in der Tumormetastasierung Modell erschöpft. In Abwesenheit von NKZellen beobachteten wir eine Aufhebung der therapeutischen Wirkung von Immuntherapien perioperative (2A und 2B). Diese Daten legen nahe, dass Tumormetastasen Entfernung in unserer chirurgischen Stress-Modell wird vor allem durch onkolytischen Virus und Influenza-Impfstoff Aktivierung von NK-Zellen und die anschließende NK vermittelten Tumor-Lyse vermittelt. Zur weiteren Charakterisierung NK-Zellfunktion folgende perioperative Gabe von onkolytischen Virus und Influenza-Impfstoff, wurde ex vivo NK-Zell-Tötung beurteilt. Kurz gesagt, gesammelt und sortiert DX5 + NK-Zellen wurden aus Milzzellen isoliert chirurgisch gestresst und Kontrollmäusen. Sie wurden für 4 Stunden mit Chrom markierten YAC-1-Zielzellen kokultiviert, bei verschiedenen Effektor-Verhältnisse, gefolgt von der Messung der Überstand Chrom Release mit einem Gamma-Zähler Ziel. Eine signifikante Operation induzierten Defekt in NK-Zell-Zytotoxizität zusammen mit einer deutlichen Erholung der NK Tötung folgende perioperative Gabe von onkolytischen Virus und Einfluenza Impfstoff im Vergleich zu der alleinigen Operation (Fig. 2C und 2D) beobachtet. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die NK-Zell-Suppression perioperative erfolgreich behandelt werden können und Metastasen mit neuartigen immunstimulierende Therapien reduziert. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51253/51253fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51253/51253fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Neue Anti-Krebs-onkolytischen Virus und Influenza-Impfstoff als perioperative Therapie gegen Chirurgie-induzierte Erhöhung der Lungenmetastasen. Beurteilung der 4T1 Lungentumormetastasen an Tag 28 der angezeigten Behandlungsgruppen durch (A) Fotografien von repräsentativen Lunge, (B) Aufzählung der Lungentumor Knötchen und (C) Lungengewichte. Daten, die für 3 ähnliche Experimente mit n = 5-10/group (*, p = 0,01, ** p &lt;0,0001;<html> ns, nicht signifikant). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51253/51253fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51253/51253fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51253/51253fig2.jpg" /> 2. OP-Stress erhöht Lungentumormetastasen durch NK-Zellen zu beeinträchtigen. (A, B) Quantifizierung der Lungentumormetastasen chirurgisch in gestressten Mäusen mit neuartigen perioperative Therapie behandelt werden. (C, D) Die Fähigkeit von gereinigtem DX5 + NK-Zellen aus chirurgisch gestresst und unbehandelten Kontrollen, um Tumorzellen zu töten. T-Verhältnissen: - (SD + /) von Chrom-Freisetzung aus drei Vertiefungen für die angegebene E Die Daten sind als Mittelwert Prozent angezeigt. . Daten, die 3 ähnliche Experimente, bei denen n = 4-5/group (; ** p &lt;0,005, ns, nicht signifikant * p = 0,01) sind/ Www.jove.com/files/ftp_upload/51253/51253fig2highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ein Maus-Tumormodell der chirurgischen Stress wird verwendet, um zu erkunden, wie postoperative Immunsuppression fördert Metastasen und immunstimulierende perioperative Therapien zu evaluieren.

Ein Maus-Tumormodell der operativen Belastung zu Entdecken Sie die Mechanismen der postoperative Immunsuppression und Bewerten Novel Perioperative Immuntherapien

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wirkung einer im perioperativen Zeitraum verabreichten Immuntherapie auf die Verringerung von Metastasen in einem Mausmodell für Tumore und chirurgischen Stress zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst vier T-one-Tumorzellen in das fetthaltige Gewebe der Mausbrust injiziert werden, um einen primären Tumor zu etablieren. Am Tag 13 oder einen Tag vor der Krebsoperation wird die Immuntherapie verabreicht, von der angenommen wird, dass sie die postoperative metastatische Erkrankung am Tag 14 nach der Implantation der Tumorzellen abschwächt.Der Primärtumor wird reseziert, gefolgt von zusätzlichem chirurgischem Stress in Form einer abdominellen Nephrektomie an einer Teilgruppe der Mäuse. Der letzte Schritt besteht darin, alle Mäuse zu töten und die Anzahl der metastatischen Lungenherde zu quantifizieren. Letztendlich wird dieses Mausmodell spontaner Metastasen und chirurgischen Stresses verwendet, um den positiven Effekt einer perioperativen Immuntherapie zu demonstrieren.Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen auf dem Gebiet der chirurgischen Onkologie beantworten, beispielsweise wie eine große Operation das Immunsystem und infolgedessen die Entstehung metastatischer Erkrankungen in der postoperativen Phase beeinflusst, und wie Immuntherapien eingesetzt werden können, um diese Wirkung abzuschwächen. Die Durchführung des Verfahrens wird demonstriert von Christiano 10 dusa, einem wissenschaftlichen Techniker im Labor von Dr. Rebecca s. Um die Tumorzellkultur vorzubereiten, geben Sie zunächst unveränderte 41 Tumorzellen in komplettes DMEM in 10 cm großen Zellkulturschalen und inkubieren diese bei 37 Grad Celsius und 5 %CO2 in einem Zellkulturschrank.Teilen Sie die Kulturen nach Bedarf zwei- bis dreimal pro Woche, sodass die Zellen eine Konfluenz von 80 % nicht überschreiten. Innerhalb eines Monats nach Einrichtung der Zellkultur beginnen Sie mit der Gewinnung der Tumorzellen, indem Sie das Kulturmedium von der Gewebekulturplatte abpipettieren. Geben Sie 10 Milliliter sterilem einmaligem PBS mit zwei Milliliter EDTA hinzu und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, 5 % CO2 für fünf bis sieben Minuten.Danach die PBS-Lösung von der Platte entfernen, die Platte zwei bis drei Mal mit PBS spülen und die Zellen in ein 50-Milliliter-Konischglas überführen. Anschließend die Zellen in einer Tischzentrifuge bei 500 G und vier Grad Celsius fünf Minuten lang zentrifugieren. Nach dem Absaugen der Überstände das Zellpellet in serumfreiem DMEM resuspendieren.Verwenden Sie anschließend einen Zellzähler, um die Zellkonzentration zu bestimmen, und verdünnen Sie die Zellen mit serumfreiem Medium auf eine Konzentration von einer Million Zellen pro 500 µL. Stellen Sie die Zellen eine Stunde vor der Operation auf Eis. Injizieren Sie einer Maus subkutan 0,05 mg/kg Buprenorphin zur Schmerztherapie. Nach der Anästhesie der Maus mit 2,5 % Isofluran überprüfen Sie durch leichten Druck auf die Fußsohle, ob eine ausreichende Anästhesietiefe erreicht wurde.Danach eine halbzöllige Ultrafeinnadel mit 30 Gauge genau mit 50 Mikrolitern der Tumorzellsuspension befüllen. Die Seite der Spritze antippen, um Luftblasen zu lösen. Unter Fortsetzung der ISO-Fluoranästhesie das Mäuschen mit der Bauchseite nach oben auf den Operationstisch legen.Führen Sie nun die Nadel horizontal und direkt in das vierte Membranfettpolster ein und geben Sie das Volumen der Spritze langsam ab. Die Injektion sollte etwa eine Minute dauern. Reinigen Sie nach der Injektion eventuelle Austritte mit einem Wattestäbchen.Lassen Sie die Maus sich von der Anästhesie erholen, bevor Sie sie in ihren Käfig zurückbringen. Setzen Sie die Schmerztherapie fort, indem Sie 0,05 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin subkutan alle acht Stunden für zwei Tage am 13. Tag nach der Zellinjektion verabreichen. Verwenden Sie einen externen Messschieber, um die Größe des Primärtumors zu bestimmen.Messen Sie den größten Längsdurchmesser oder die Länge und den größten Querdurchmesser oder die Breite mit einem Messschieber. Zur Berechnung des Tumorvolumens wird die modifizierte ellipsoide Formel verwendet, die einem halben Längenwert mal dem quadrierten Breitenwert entspricht. Zu diesem Zeitpunkt wurde, unter der Annahme, dass der Primärtumor etwa ein Kubikzentimeter misst, das gewählte perioperative Therapeutikum, in diesem Fall onkolytisches Virus in einem x, steriles PBS, vorbereitet.Befüllen Sie eine halbzöllige Insulinspritze mit 27 Gauge genau mit 100 Mikrolitern der onkolytischen Virustherapie. Entfernen Sie alle Luftblasen aus der Spritze. Platzieren Sie anschließend eine Maus in einen Halter, wobei der Schwanz frei zugänglich bleibt.Erwärmen Sie den Schwanz vorsichtig mit warmem Leitungswasser. Um die seitlichen Schwanzvenen sichtbar zu machen, wählen Sie eine seitliche Schwanzvene aus und injizieren Sie das onkolytische Virus. Wenn die Nadel korrekt in eine seitliche Vene eingeführt ist, sollte beim Drücken des Spritzenkolbens kein Widerstand spürbar sein.Wenn abgeschlossen, bringen Sie die Maus nach der Zellinjektion am 14. Tag postum für die Nacht in ihren Käfig zurück. Behandeln Sie die Maus eine Stunde vor der Operation subkutan mit 0,05 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin zur Schmerztherapie, induzieren und erhalten Sie die Anästhesie mit 2,5 % ISO-Fluoran. Nachdem Sie einen ein bis zwei Zentimeter langen Hautschnitt angelegt haben, entfernen Sie vorsichtig den gesamten primären 4T1-Tumor aus dem Brustfettgewebe; der Tumor und jeglicher anhaftender Detritus sollten als ein Stück herausgenommen werden.Den Tumor für die spätere immunhistochemische Analyse in Formalin aufbewahren. Nach der Entfernung des Tumors die Inzision mit zwei bis drei neun Millimeter langen Klammern verschließen. Der nächste Schritt besteht darin, bei einer Untergruppe der Mäuse eine größere Operation durchzuführen.Beginnen Sie mit einem ventralen medianen Schnitt durch die Haut und die subkutane Schicht. Führen Sie anschließend einen drei bis vier Zentimeter langen Schnitt am linearen Ellbogen durch, um auf das Peritoneum zuzugreifen. Verschieben Sie nun die daraufliegenden Därme zur Seite, um die linke innere Bauchseite freizulegen.Halten Sie die Därme mit einem in Kochsalzlösung getränkten sterilen Mulltuch feucht. Fassen Sie anschließend mit einem stumpfen Paar chirurgischer Pinzetten vorsichtig die linke Niere. Verwenden Sie dann eine 3,0-wachsbeschichtete, geflochtene Seidennaht, die zu einer Schleife verknotet ist, um das Hilum der linken Niere zu ligieren.Fixieren Sie die Naht mit drei chirurgischen Knoten. Entfernen Sie nun die linke Niere mit einer chirurgischen Schere. Überprüfen Sie sorgfältig den Nahtverschluss, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Blutstillung erreicht wurde.Als Nächstes wird die subkutane Schicht mit einer kontinuierlichen Schlaufe aus 5-0-Vicryl-Nahtmaterial verschlossen. Anschließend wird die Hautschicht mit 9-Millimeter-Heftclips versorgt. Die Nephrektomie sollte pro Tier 10 Minuten dauern.Wenn sich das Tier erholt hat, bringen Sie es in seinen Käfig zurück und setzen Sie die Schmerztherapie zwei Tage lang fort, indem Sie 0,05 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin subkutan alle acht Stunden verabreichen. 28 Tage nach der 4T1-Tumoreinspritzung euthanasieren Sie die Maus und besprühen sie mit 70 % Ethanol. Beginnen Sie die Entfernung der Lunge, indem Sie mit einer Schere einen ersten Schnitt direkt unterhalb des Rippenbogens anlegen. Schneiden Sie entlang der ventralen Mittellinie des Brustkorbgebiets durch die Haut und die subkutane Schicht, um den Thorax freizulegen.Danach laterale Schnitte durch die Haut und das Gewebe auf jeder Seite bis zum Hals vornehmen. Nun die Lungen vorsichtig fassen und das Bindegewebe abschneiden, bis die Lungen frei liegen. Die Luftröhre oberhalb der Gabelung durchtrennen, wodurch die linke und rechte Lunge noch verbunden bleiben.Als Nächstes die entnommenen Lungen in kaltes PBS tauchen, um verblutetes Blut zu entfernen, und sie in 10 % gepuffertem Formalin zur weiteren Fixierung geben, wobei die Lungen zunächst zur Beurteilung von Tumormetastasen fotografiert und anschließend zur Quantifizierung der Tumorlast gewogen werden. 14 Tage nach der Entfernung des vier-T-eins-Tumors wurden die Lungen gewonnen und auf Metastasen untersucht, wie hier am Beispiel der Lunge einer Maus gezeigt, die keiner abdominellen Nephrektomie unterzogen wurde. Einige metastasierte Tumoren sind sichtbar.Im Gegensatz dazu führte eine chirurgische Nephrektomie unmittelbar nach der Tumorresektion zu einer deutlichen Zunahme der Anzahl pulmonaler Metastasen. Auf diesem Foto sind die Lungen einer Maus zu sehen, die nach Tumorresektion und Nephrektomie mit einem onkolytischen Virus behandelt wurde; hier abgebildet sind jedoch die Lungen einer Maus, die nach Tumorresektion und Nephrektomie mit einem Influenza-Impfstoff behandelt wurde. Die Zählung der Lungen-Tumorknoten in jeder dieser Kategorien zeigt eine klare Zunahme der Anzahl pulmonaler Metastasen bei Mäusen mit Nephrektomie im Vergleich zu Tieren ohne Operation oder solchen mit einer präoperativen therapeutischen Intervention. Die Lungen der Mäuse mit Nephrektomie, jedoch ohne präoperative Therapie, wogen signifikant mehr als die der anderen Testkategorien.Daher hat die präoperative Gabe eines replizierenden onkolytischen Virus und eines inaktivierten Influenza-Impfstoffs die prometastatischen Effekte einer großen Operation nach Tumorresektion signifikant reduziert. Diese Diagramme zeigen die Anzahl der Lungentumoren bei Mäusen mit normalen bzw. intakten NK-Zellzahlen und bei Mäusen, deren NK-Zellen pharmakologisch mittels anasi ALO GM one depletiert wurden. Bei den NK-depletierten Mäusen war die therapeutische Wirkung perioperativer onkolytischer Virus- oder Influenza-Impfstoff-Immuntherapien vermindert.Dies legt nahe, dass die NK-Zellen eine vermittelnde Rolle bei der Verhinderung von Metastasen nach der Impfungsbehandlung spielen. Um die Funktion der NK-Zellen weiter zu charakterisieren, wurde die ex vivo NK-Zell-vermittelte Zerstörung bewertet; DX5-positive Zellen, die aus operativ belasteten und unbehandelten Kontrollen gewonnen wurden, wurden mit YAC-1-Zielzellen kultiviert. Die schwarze durchgezogene Linie zeigt die NK-Zell-vermittelte Zerstörungsfähigkeit von unbehandelten Mäusen, während die schwarze gestrichelte Linie die NK-Zell-vermittelte Zerstörungsfähigkeit von operativ belasteten Mäusen darstellt.Die Abnahme der prozentualen Zytotoxizität, die durch die Verschiebung von der schwarzen durchgezogenen Linie zur schwarzen gestrichelten Linie angezeigt wird, zeigt einen Defekt in der zytotoxischen Funktion der NK-Zellen bei Mäusen nach einer Operation. Die grauen durchgezogenen Linien zeigen die NK-Zell-vermittelte Zerstörung bei Mäusen, die eine Immuntherapie, entweder mit onkolytischem Virus oder Influenza-Impfstoff, aber keine Operation erhalten hatten. Die grauen gestrichelten Linien zeigen die Fähigkeit zur NK-Zell-vermittelten Zerstörung bei Mäusen, die sowohl eine perioperative Immuntherapie als auch eine Operation erhalten hatten.Die Abnahme der prozentualen Zytotoxizität, die durch die Verschiebung von der grauen durchgezogenen Linie zur grauen gestrichelten Linie dargestellt wird, zeigt einen Defekt in der zytotoxischen Funktion der NK-Zellen bei Mäusen nach der Operation auf, obwohl diese eine perioperative Immuntherapie erhalten haben. Wichtig ist, dass die grauen gestrichelten Linien immer noch deutlich höher liegen als die schwarzen gestrichelten Linien. Dies legt nahe, dass es möglicherweise möglich ist, die durch die Operation induzierte zytotoxische Dysfunktion der NK-Zellen mittels perioperativer Immuntherapie zu kompensieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Tiermodell für spontane Metastasen und chirurgischen Stress erzeugt, indem man primäre Brusttumoren etabliert. Die Resektion der primären Tumoren induziert zusätzlichen chirurgischen Stress durch Nephrektomie, und die lungären metastatischen Tumorknoten werden am Verschlusspunkt bewertet. Außerdem sollten Sie verstehen, wie dieses Modell genutzt werden kann, um die suppressiven Effekte der Chirurgie auf das angeborene Immunsystem sowie die Fähigkeit von Immuntherapien, diesen Effekt umzukehren, zu untersuchen.

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