Bewertung von Morphin-induzierte Hyperalgesie und Schmerztoleranz in Mäuse mit Thermal-und Maschinen Nozizeptive Modalitäten
29. Juli 2014
Wir beschreiben ein Protokoll, um die Entwicklung von Opioid-induzierte Hyperalgesie und Toleranz in Mäusen zu untersuchen. Basierend auf der Messung der thermischen und mechanischen nozizeptiven Reaktionen von naiven und Morphin-behandelten Tieren, erlaubt es, die Steigerung der Schmerzempfindlichkeit (Hyperalgesie) zu quantifizieren und Abnahme der Analgesie (Toleranz) mit chronischer Opiat-Verwaltung verbunden.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Entwicklung einer opioidinduzierten Hyperalgesie und analgetischen Toleranz bei Mäusen zu beobachten. Dies wird erreicht, indem die thermischen und mechanischen nozizeptiven Reaktionen naiver Mäuse nach Gabe von Morphin über einen Zeitverlauf am Tag null als zweiter Schritt gemessen werden. Die nozizeptive Schwelle wird täglich vor der Verabreichung von Morphin am siebten Tag bestimmt.
Die analgetische Wirkung von Morphin wird erneut über einen Zeitverlauf gemessen, um die Entwicklung einer analgetischen Toleranz aufzuzeigen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen eine Zunahme der Schmerzempfindlichkeit sowie die Entwicklung einer analgetischen Toleranz nach wiederholter Gabe von Morphin.
Obwohl diese Methode Einblicke in die Entwicklung von Schmerzüberempfindlichkeit und analgetischer Toleranz bei mehreren Mäusen ermöglichen kann. Nach chronischer Opiatbehandlung kann sie auch auf andere Opioide oder genetisch modifizierte Mäuse angewendet werden. Die Durchführung der Prozedur wird von einem Doktoranden aus meinem Labor demonstriert. Um die durch Stress induzierte Analgesie zu minimieren, werden die Mäuse täglich fünf Minuten lang angefasst und daran gewöhnt, bis sie freiwillig in den Fixierapparat eintreten.
Wenn der Maus die Gewöhnung abgeschlossen ist, beginnen Sie den Schwanz-Tauchtest, indem Sie den Thermostaten auf 48 Grad Celsius einstellen. Führen Sie die Maus vorsichtig in die Fixiervorrichtung ein. Sobald sie ordnungsgemäß fixiert ist, tauchen Sie das freiliegende distale Drittel ihres Schwanzes in das Wasserbad ein und starten Sie die Stoppuhr.
Die Unterscheidung zwischen nozizeptiven und nozizeptiven Reaktionen ist ein zentraler Bestandteil dieses Verfahrens. Eine sachgerechte Beurteilung und Übung ist entscheidend für den Erfolg. Überwachen Sie die Bewegungen des Tieres und stoppen Sie den Chronometer.
Sobald die Maus ihren Schwanz aus dem heißen Wasser zurückzieht, die Rückzugslatenz aufzeichnen. Die Maus anschließend in ihren Käfig zurückbringen und das nächste Tier testen, wobei die gleiche Reihenfolge bis zum Ende der Serie beibehalten wird. Die Messungen der nozizeptiven Reaktionen zwei weitere Male wiederholen.
Die Latenz der nozizeptiven Reaktion in Sekunden für jede Maus wird als Mittelwert aus drei aufeinanderfolgenden Bestimmungen ermittelt. Beim Schwanzdrucktest führen Sie zunächst die Maus vorsichtig in die Fixiervorrichtung ein und positionieren ihren Schwanz unter die kegelförmige Spitze des analen J-Meters. Sobald die Maus richtig positioniert ist, betätigen Sie den Fußschalter, um gleichmäßig ansteigenden Druck auf den proximalen Teil des Schwanzes auszuüben.
Bei erstem Anzeichen einer nozizeptiven Reaktion ziehen Sie die Spitze zurück. Nozizeptive Reaktionen können sich in Form von Sträuben, Quieken oder Schwanzrückzug äußern. Notieren Sie die Stromstärke in Gramm, die die nozizeptive Reaktion hervorruft.
Wiederholen Sie diese Messung im mittleren und distalen Teil des Schwanzes derselben Maus in 32tel-Abständen, bringen Sie das Tier in seinen Heimkäfig zurück und wiederholen Sie diese Schritte, bis alle Mäuse getestet wurden. Definieren Sie zunächst zwei Tiergruppen mit vergleichbaren durchschnittlichen nozizeptiven Werten. Messen und notieren Sie anschließend das Körpergewicht jedes Tieres.
Nachdem die Saline- und Morphin-Gruppen eingerichtet wurden, bereiten Sie eine Morphinlösung in physiologischer Kochsalzlösung zur subkutanen Verabreichung vor. Messen Sie die nozizeptiven Reaktionslatenzen sowohl im Schwanztauch- als auch im Schwanzkompressionstest und notieren Sie diese als Zeitpunkt 0,0 für jede Gruppe. Injizieren Sie anschließend jedem Tier je nach Gruppe entweder Morphin oder Saline.
Nach 30 Minuten beginnen Sie mit der Aufzeichnung der nozizeptiven Reaktionen bei jedem Tier. Achten Sie besonders auf die Abschaltwerte, da Mäuse zu diesem frühen Zeitpunkt wahrscheinlich nicht auf die noxischen Reize reagieren. Bei fehlender nozizeptiver Reaktion wird ein Abschaltwert von 25 Sekunden angewendet, um Gewebeschäden zu vermeiden, und die gleiche Testreihenfolge wird beibehalten.
Wiederholen Sie die nozizeptiven Messungen alle 30 Minuten bis 3,5 Stunden nach der Injektion für die chronische Morphinbehandlung. Ermitteln Sie die Werte des ersten Tages, indem Sie die nozizeptive Reaktion der Tiere am TIT und TPT messen, wie zuvor gezeigt. Bereiten Sie eine frische Morphinlösung vor.
Verabreichen Sie je nach Gruppenzuordnung Injektionen mit Morphin oder Kochsalzlösung und lassen Sie die Tiere bis zum nächsten Tag ruhen. Am nächsten Tag messen Sie die nozizeptiven Reaktionen am TIT und TPT, bevor Sie eine zweite Runde Injektionen verabreichen. Wiederholen Sie diese Schritte täglich über sechs Tage hinweg.
Am siebten Tag wird die durch Morphin hervorgerufene Analgesie bewertet. Gemäß dem zuvor beim Schwanztauchtest gezeigten Zeitverlaufs-Paradigma wurde die maximale analgetische Wirkung von Morphin nach 30 Minuten erreicht. Beim Schwanzdrucktest dagegen wurde die maximale Wirkung im Vergleich zu den mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollen erst nach 60 Minuten erreicht.
Diese Ergebnisse zeigen, dass tägliche Morphininjektionen über einen Behandlungszeitraum von sieben Tagen eine signifikante und fortschreitende Absenkung der thermischen und mechanischen basalen nozizeptiven Werte hervorriefen. Nach chronischer Behandlung waren die basalen nozizeptiven Werte bei mit Morphin behandelten Mäusen signifikant niedriger als die von mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollmäusen. Nach akuter Morphinverabreichung stieg die nozizeptive Reaktion der Gruppe mit chronischer Morphinbehandlung signifikant an, überstieg jedoch nur geringfügig den basalen nozizeptiven Wert der mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollgruppe.
Mäuse wurden nach 30 Minuten im TIT und TPT sowie nach 60 Minuten im TIT gemessen, wobei hier die nach 30 Minuten nach Injektion von Kochsalzlösung oder Morphin ermittelten nozizeptiven Schwellenwerte für Tag null und Tag sieben dargestellt sind. Danach folgte die Entwicklung. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Schmerzforschung den Weg, um die Wirkung pharmakologischer oder genetischer Eingriffe bei der Entwicklung von Schmerzhyersensitivität und analgetischer Toleranz, die durch chronische Morphingabe induziert wird, zu untersuchen.
Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Untersuchung opioidinduzierter Hyperalgesie und analgetischer Toleranz bei Mäusen vor. Durch die Messung thermischer und mechanischer nozizeptiver Reaktionen quantifiziert das Protokoll Veränderungen der Schmerzempfindlichkeit und Analgesie nach chronischer Verabreichung von Morphin.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Pharmakologie
- Verhaltenswissenschaft
Hintergrund
- Opioidinduzierte Hyperalgesie ist ein Phänomen, bei dem Patienten nach einer Opioidbehandlung eine erhöhte Schmerzempfindlichkeit verspüren.
- Analgetische Toleranz tritt auf, wenn die Wirksamkeit von Opioiden im Laufe der Zeit abnimmt.
- Das Verständnis dieser Mechanismen ist entscheidend, um Strategien zur Schmerztherapie zu verbessern.
- Diese Studie verwendet ein Mausmodell, um diese Effekte in einer kontrollierten Umgebung zu untersuchen.
Zweck der Studie
- Die Entwicklung einer opioidinduzierten Hyperalgesie bei Mäusen beobachten.
- Die analgetische Toleranz messen, die durch chronische Morphinverabreichung entsteht.
- Einblicke in die Mechanismen der Schmerzüberempfindlichkeit gewinnen.
Verwendete Methoden
- Mäuse wurden mit Morphin behandelt, und ihre nozizeptiven Reaktionen wurden mittels Schwanztauch- und Schwanzdrucktests gemessen.
- Die Messungen wurden täglich über einen Zeitraum von sieben Tagen durchgeführt, um Veränderungen der Schmerzempfindlichkeit zu bewerten.
- Sowohl thermische als auch mechanische Schwellenwerte wurden ermittelt, um Hyperalgesie und Toleranz zu quantifizieren.
- Die Ergebnisse wurden zwischen den mit Morphin behandelten Tieren und den Kontrollgruppen mit Kochsalzlösung verglichen.
Hauptergebnisse
- Die chronische Behandlung mit Morphin führte zu einer signifikanten Zunahme der Schmerzempfindlichkeit.
- Es wurde eine analgetische Toleranz beobachtet, die mit einer verminderten Wirksamkeit von Morphin im Zeitverlauf einherging.
- Die Messungen zeigten eine fortschreitende Absenkung der nozizeptiven Schwellen bei mit Morphin behandelten Mäusen.
- Die Ergebnisse stützen die Hypothese, dass ein chronischer Opioidkonsum zu Hyperalgesie und Toleranz führt.
Schlussfolgerungen
- Die Studie liefert eine zuverlässige Methode zur Beurteilung opioidinduzierter Hyperalgesie und Toleranz bei Mäusen.
- Die Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit einer sorgfältigen Verwaltung opioidbasierter Therapien, um eine erhöhte Schmerzempfindlichkeit zu vermeiden.
- Dieses Protokoll kann für weitere Untersuchungen zu anderen Opioiden oder genetischen Modifikationen angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Opioidinduzierte Hyperalgesie und analgetische Toleranz stellen kritische Herausforderungen in der Entwicklung von Schmerzmitteln dar, da sie die Langzeitwirksamkeit opioider Therapeutika beeinträchtigen. Dieses Protokoll ermöglicht eine mechanistische Entlastung, indem es thermische und mechanische nozizeptive Verschiebungen in vivo quantifiziert und somit die Zielvalidierung sowie die Vorhersagesicherheit für neue Analgetika unterstützt. Der Ansatz bietet ein krankheitsrelevantes System zur Bewertung genetischer und pharmakologischer Modulatoren der Opioidwirkung und hilft so bei der Portfolio-Priorisierung und der Identifizierung führender Wirkstoffkandidaten in der Schmerzforschung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem bidirektionale Veränderungen der thermischen und mechanischen Nozizeption nach chronischer Morphineinwirkung gemessen werden.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch Quantifizierung der Hyperalgesie- und Toleranzphänotypen bei Wildtyp- und genetisch veränderten Mäusen.
- Prädiktiver Wert: Stützt die Vorhersagegenauigkeit, indem dosis- und zeitabhängige Zusammenhänge zwischen Opioidexposition und Verschiebungen der nozizeptiven Schwelle etabliert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Untersuchung vor, indem Baseline- und durch Wirkstoffe veränderte nozizeptive Reaktionsprofile etabliert werden.
- Quantitative Ausgabe: Erzeugt reproduzierbare, kontinuierliche Messwerte (Withdrawal-Latenz in Sekunden, Kraft in Gramm), die eine standardisierte Bewertung von Substanzen über verschiedene Studien hinweg ermöglichen.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform zur Prüfung von analgetischen Wirkstoffkandidaten, genetischen Interventionen oder Kombinationstherapien innerhalb eines konsistenten Rahmens zur Messung nozizeptiver Reaktionen.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Modelliert opioidinduzierte Hyperalgesie und Toleranz, zentrale Limitationen der klinischen Opioidtherapie, und liefert eine translationale Biomarker-Abstimmung für Schmerzüberempfindlichkeit.
- Präklinische Kontinuität: Verbindet die Entdeckungsforschung durch langzeitliche nozizeptive Überwachung und ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen zum Fortschreiten basierend auf der Wirksamkeitsdauer von Analgetika.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Isoliert Variablen, die zur analgetischen Toleranz im Vergleich zur Hyperalgesie beitragen, und unterstützt so die Zielstrukturauswahl und Biomarker-Strategie.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Schmerzmittelentdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung über die Lead-Optimierung bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung und ermöglicht eine iterative Beurteilung der analgetischen Wirksamkeit und des therapeutischen Index.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung der nozizeptiven Signalwegmodulation und die biologische Entlastung von Opioid-Zielen durch longitudinales Empfindlichkeitsprofilen.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch standardisierte, quantitative Messungen thermischer und mechanischer nozizeptiver Reaktionen, die für die Auswertung von Substanzbibliotheken geeignet sind.
- Analytik: Liefert Daten über den zeitlichen Verlauf und Gruppenvergleiche (Morphin vs. Kochsalzlösung, akut vs. chronisch), die eine statistische Beurteilung der Entwicklung analgetischer Toleranz ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft einen Bezug zur präklinischen Validität, indem klinisch relevante, opioidinduzierte Hyperalgesie und Toleranzphänotypen bei Mäusen modelliert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur nozizeptiven Phänotypisierung, die auf verschiedene Opioidklassen, genetische Modelle und Studien zu therapeutischen Interventionen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert die Vorhersagesicherheit, indem die mechanistische Uneindeutigkeit bei opioidinduzierter Hyperalgesie und Toleranz durch direkte, longitudinale nozizeptive Messung verringert wird.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch Gewöhnung, verblindete Messung und Mittelwertbildung aus drei Messwiederholungen über thermische und mechanische Modalitäten hinweg.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch der Entwicklung, indem analgetische Risiken früh erkannt werden, wodurch späte Fehlschläge aufgrund unvorhergesehener Hyperalgesie oder Toleranz reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von analgetischen Kandidaten basierend auf der Wirkdauer und der Abgrenzung gegenüber hyperalgetischen Mustern.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Nagetieren, in nozizeptiven Testverfahren und bei der Unterscheidung zwischen reflektorischen und affektiven Schmerzreaktionen, um die Datenvalidität sicherzustellen.
- Benötigt kalibrierte thermische (48 °C Wasserbad) und mechanische (abgestufter Druckreizgeber) Messgeräte mit präzisen Fähigkeiten zur Latenz- und Kraftmessung.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg bei Gewöhnungsprotokollen, Injektionsverfahren und Messzeitpunkten, um die Variabilität zwischen verschiedenen Bedienern zu minimieren.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Übertragung auf Rattenmodelle oder nicht-murine Arten aufgrund von Unterschieden in der Schwanzmorphe und der nozizeptiven Empfindlichkeit.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen mögliche stressinduzierte Analgesie bei unzureichender Gewöhnung sowie Deckeleffekte bei nozizeptiven Messungen bei extremen Medikamentendosen.
