Name: Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Kultur dentaler epithelialer Stammzellen aus dem erwachsenen Maus-Schneidezahn. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Zellkulturen für die dentale Geweberegeneration.

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Die Autoren danken Xiu-Ping Wang für die erste Hilfe bei DESC Kulturen. Die Autoren sind zum Teil durch Stipendien und Zuschüsse aus den National Institutes of Health (K99-DE022059 zu AHJ, K12-GM081266 MGC, K08-DE022377-02 zu OH-und R01-DE021420 zu ODK) finanziert.

1. Dissect Nieder Hemi-Mandibeln von erwachsenen Maus <ol><li> Vor der Durchführung dieses Protokolls erforderlichen institutionellen Genehmigung zu erhalten und sicher sein, mit allen Tierpflege-Richtlinien. Euthanize Tier mit Standard IACUC genehmigten Verfahren. Für diese Arbeit CO 2-Erstickung wurde verwendet, gefolgt durch zervikale Dislokation. <ol><li> OPTIONAL: Separate Kopf vom Rest des Körpers mit einer Rasierklinge. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Haut vor der Unterlippe an den Halsausschnitt. </li><li> Mit einem Skalpell einen Einschnitt zwischen den beiden unteren Schneidezähne, die lose miteinander verbunden sind. Beim Anlegen von Druck wird der Unterkiefer in zwei Hälften geteilt werden. </li><li> Keil das Skalpell zwischen dem Gelenkkopf des Kiefers und der Kiefergelenk und neben der Kiefermuskel geschnitten, um den Kiefer zu lösen. </li><li> Entfernen Sie das gesamte Muskel-, Sehnen-und Bänder bis nur noch die Knochenreste. </li></ol> 2. Isolieren Sie die Schneidezahn <ol><li> Mit einem Skalpell Nr. 15Sorgfältig rasieren den Knochen in einem Winkel von 45 ° von dem distalen Ende zu dem proximalen Ende des membranartigen Bereichs. Verwenden Sie die Spitze des Skalpells zu holen Sie verbleibende Knochen einschließlich der Knochenfragmente am Rand. Langsam beginnen, bei der lingualen kortikalen Platte des Unterkiefers entfernt holen, beginnend knapp unterhalb der 3. Molaren. </li><li> Fortfahren, bis der Schneidezahn ist sauber, sorgfältig arbeiten auf den Bereich, der die CL. </li><li> Entfernen alveolaris inferior Nervenbündel. </li><li> Machen Sie einen sauberen Schnitt, zuerst die Knochen-und Gewebe proximal der CL zu entfernen. </li><li> Machen Sie einen zweiten Schnitt distal mit dem Skalpell, etwa unter dem 2. Molaren. Das proximale Schneidezahnbereich wird dann durch Einsetzen des Skalpells zwischen dem Knochen und der medialen Fläche des proximalen Schneidezahn präpariert. Dies muß sorgfältig durchgeführt werden, um nicht in das Gewebe zu zerreißen. Der Schnitt Bewegung ist proximal-distalen. ALTERNATIVE STEP: Zu entfernen, so viel Knochen wie möglich an dem Bereich über dem incisor. Sobald Bereich wird gelöscht, entfernen Sie vorsichtig gesamte Schneidezahn mit eine Größe von 5 Zange, um den Zahnschmelz Teil hand am nächsten CL Region. </li><li> Platzieren seziert Gewebe (entweder isoliert CL, wie in Fig. 3E oder ganze Schneidezahn nach alternativen Schritt 2.5) in 2% Kollagenase in 1X PBS für 3-4 Stunden bei 4 ° C in einer Niederhalten Platte. Für 1-10 Schneidezähne, verwenden Sie 100 ul pro Well in einer 12-Well-Platte. Für mehr als 10 Schneidezähne, verwenden Sie 500 ul pro Well in einer 6-Well Platte geringe Haftung. </li></ol> 3. Microdissect die Labial Cervical-Schleife <ol><li> Entfernen CL Region aus der Kollagenase und in kaltem DMEM/F12-Medium. </li><li> Ziehen Sie am unteren Ende der CL entweder mit der Größe 5 Zange oder einer Insulinspritze (1 ml, 28 G ½); das Mesenchym auseinander fallen, während das Epithel intakt bleibt. Die CL-und die benachbarte Epithel, die sich seitlich als &quot;flügelartigen&quot; Struktur erstreckt sichtbar. </li><li> Entfernendie apikalen Knospe von der benachbarten Epithel, indem ein V-förmiger Einschnitt auf jeder Seite, und sofort in kaltem DMEM/F12 auf Eis. </li><li> Wiederholen Sie für alle CLs, sammeln in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Spin down Mikrozentrifugenröhrchen mit Proben, entfernen Medien, ersetzen mit 100 ul Zellablösung Lösung. </li><li> Gewebe in Zellentfernungslösung für 30 min bei 37 ° C. </li><li> Distanzieren das Gewebe, um eine Einzelzellsuspension durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren mit einer 1.000 ul geringer Haftung Pipettenspitze herzustellen. Zellen können auch durch ein steriles Sieb Zelle angeordnet werden, um die Dissoziation zu erreichen. </li><li> Zählen von Zellen mit Hämozytometers, Platte auf Gewebekultur Kunststoff oder anderen gewünschten Material. </li></ol> 4. Primärkultur von DESC <ol><li> Platten Zellen in einer 6-Well-Platte bei 1-6 × 10 4 Zellen / ml in DESC Medien, die von DMEM/F12 mit Maus-EGF rekombinantes Protein ergänzt war, bei einer Konzentration von 20 n bestehtg / ml FGF rekombinantes Protein in einer Konzentration von 25 ng / ml, 1 × B27 Ergänzung und 1% Antibiotika-Lösung (Penicillin, 100 U / ml Streptomycin, 50 ug / ml). </li><li> Wachsen Zellen auf einer 6-Well-Platte ausplattiert, auf 37 ° C in 5% CO 2 in 1 ml DESC Medien. Anfangs Kulturen für 5 Tage nach der Beschichtung, um die Zellhaftung und Koloniebildung ermöglichen nicht stören. </li><li> Zum ersten Medienwechsel, ersetzen Sie die Hälfte des Volumens (500 ul) alten Medien mit Halb Volumen (500 ul) der neuen Medien. Überprüfen Kolonien unter dem Mikroskop beim Medienwechsel. </li><li> Nach dem ersten Medienwechsel, weiterhin Medien (1-2 ml) alle 2 Tage ändern. Überprüfen Kolonien unter dem Mikroskop beim Medienwechsel. </li></ol> 5. Passage DESC <ol><li> Saugen Medien und waschen Sie die Zellen 3x mit vorgewärmter PBS. </li><li> Hinzufügen vorgewärmten 0,25% Trypsin-EDTA in einer Salzlösung und Inkubation bei 37 ° C für 10-15 Minuten für die DESC zu lösen. </li><li> In DESC Medien, um das Trypsin zu neutralisieren, vorsichtig pipettieren entlang Gewebekulturplatte, um die Zellen, und in eine 15 ml konischen Röhrchen zu sammeln. </li><li> Spin down Zellen bei 800 g für 2 min. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Epithelzellen wurden zuerst erfolgreich kultiviert vor 40 Jahren über 21-24, und in jüngerer Zeit erfolgreiche Isolierung von epithelialen Stammzellen 25-27 unserem Wissen epithelialer Biologie fortgeschritten. Wir berichten über ein Protokoll zur Isolierung der DESC der erwachsenen Maus Schneidezahn, eine relativ wenig erforschten Population von Stammzellen, die das Potenzial, wichtige Einblicke in die Biologie und Zahnschmelzbildung ergeben hat. Dieses Protokoll wurde zunächst auf früheren Berich...

Eines der einzigartigen Merkmale von Wirbeltieren ist die Entwicklung der Zähne. Der Zahn ist ein wichtiges Modellsystem für viele Bereiche der Forschung, da die molekularen Signalwege und relevant zu dieser Orgel morphologischen Spezialisierungen aus verschiedenen Perspektiven untersucht worden, unter anderem durch Entwicklungs-und Evolutionsbiologen 5. Vor kurzem hat der Bereich der regenerativen Medizin hat damit begonnen, wertvolle Erkenntnisse zu gewinnen mit dem Zahn als Modell. Insbesondere die Entdeckung von Zahn epithelialen Stammzellen ist ein wichtiger Fortschritt 6-13. Alle Nager besitzen stetig wachsenden Schneidezähne, deren Wachstum durch Stammzellen angeheizt, so dass diese Zähne ein zugängliches Modellsystem, um die adulte Stammzellregulation zu studieren. Markierungsexperimente in der 1970er 10,11, gefolgt von genetischer Abstammung Tracing 8,9,12,14 Experimente haben gezeigt, dass DESC befinden sich im proximalen Bereich der Schneidezähne. Der SchaftZelle Nachkommen in der epithelialen Fach auf der labialen Seite bewegen sich aus der vermeintlichen Nische, wie die Lippen-Hals-Schleife (CL) bekannt ist, und zu einer Population von Zellen, die sogenannten Transit-Verstärkung (TA)-Zellen (Abbildung 1). Genauer gesagt, befinden DESC in der äußeren Schmelzepithels (OEE) und sternförmigen Retikulum (SR) 8,9,14 und die innere Schmelzepithels (IEE) gibt Anlass zu den TA-Zellen, die durch eine begrenzte Anzahl von Zellzyklen fortschreiten und dann bewegen distal entlang der Länge der Schneidezähne (Abbildung 1). Die Differenzierung Ameloblasten in der Maus Schneidezahn weiter distal entlang der Schneidezähne mit einer bemerkenswerten Geschwindigkeit von etwa 350 um an einem einzigen Tag 15,16 bewegen. Wie sie sich bewegen, zu differenzieren die Zellen zu reifen Ameloblasten und Stratum intermedium (SI)-Zellen. Nach dem Aufbringen der gesamten Dicke von Schmelzmatrix, viele der Adamantoblasten Apoptose, und die verbleibenden Zellen in der Größe schrumpfen und zu regulieren Schmelzreifung &lt;sup&gt; 17. Die Linie der anderen Zelltypen im Lippen CL, wie der SR, ist weniger klar, und Daten über den Stammzellen im Mesenchym 18 und in der lingualen CL beginnen erst zu entstehen. Mit der Maus Schneidezahn-Modell, eine Reihe von Gruppen gearbeitet haben, um die genetischen Signalwege und zellbiologische Prozesse in natürlichen Stammzellen-basierten Orgelerneuerung beteiligt aufzuklären. Jedoch enthält der labialen CL eine relativ kleine Anzahl von Zellen, auf etwa 5000 pro Maus Schneidezahn, die die Arbeit mit primären Zellen Herausforderung macht. Daher haben sich bemüht, Kultur wurden und erweitern diese Zellen in vitro 6,16,19,20, um neue Türen zu experimentellen Ansätzen, die nicht in vivo erreichbar sind zu öffnen. Die jüngste Studie hat gezeigt, dass diese Zellen sowohl selbst erneuern und zu differenzieren in amelogenin exprimierenden Zellen kultiviert, wenn 13. Hier beschreiben wir und zeigen ein Verfahren zur the zuverlässige und konsistente Kultur von Zellen von der Maus labialen CL.

<table><tbody><tr><td>Pinzette, Größe 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>FST by Dumont, Dumoxel</td></tr><tr><td>Pinzette gerade, fein, 3,5</td><td>Roboz</td><td>RS5070</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>Elektronenmikroskopie Services</td><td>#71960</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff Nr. 3</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Federklinge Nr. 15</td><td>Elektronenmikroskopie Services</td><td>#72044-15</td><td>Chirurgisch </td></tr><tr><td>Edelstahl-Kollagenase Typ-1 gefiltert</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>#4214</td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritze</td><td>BD</td><td>#329424</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>EMD Millipore</td><td>#SCR006</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D</td><td>2028-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>F& Technik D</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>B27 Nachtrag</td><td>Gibco</td><td>10889-038</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation und kultur der dental epithelialen stammzellen aus dem erwachsenen maus schneidezahn

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Das Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen, die den Zahnwiedergeburt und Erneuerung zugrunde liegen, hat sich zu einem Thema von großem Interesse 1-4, und die Maus Schneidezahn ein Modell für diese Prozesse. Diese bemerkenswerte Orgel wächst kontinuierlich während des ganzen Lebens des Tieres und alle notwendigen Zelltypen aus dem aktiven Pools von adulten Stammzellen in der labialen (in Richtung der Lippe) und lingual (zur Zunge) Hals-Schleife (CL) untergebracht Regionen erzeugt. Nur die Zahn Stammzellen von der labialen CL verursachen Adamantoblasten die Emaille, die äußere Ummantelung der Zähne, auf der labialen Oberflächen zu erzeugen. Diese asymmetrische Zahnschmelzbildung ermöglicht Abrieb an der Schneidezahnspitze und Vorläuferzellen und Stammzellen in der proximalen Schneidezahn sicherzustellen, dass die Zahngewebe werden ständig aufgefüllt. Die Fähigkeit, in vitro zu isolieren und zu wachsen diese Vorläufer-oder Stammzellen erlaubt die Expansion und öffnet Türen zu zahlreichen Versuchen nicht erreichbar in vivo, wie Hoch Durch Prüfung von potenziellen Stammzellregulationsfaktoren. Hier beschreiben wir und zeigen eine zuverlässige und konsistente Methode zur Kultivierung von Zellen von der labialen CL der Maus Schneidezahn.

Die Maus halbKiefers weist einen kontinuierlich wachsenden Schneidezähne und Backenzähne drei Wurzeln (Fig. 1A). Alle Zähne aus Dentin und Zahnschmelz, der zwei mineralisierten Komponenten der Zahnkrone (Fig. 1A und 1A &#39;). Die Schneidezähne beherbergt zwei Stammzellnischen genannt labialen und lingualen CL CL und Email wird ausschließlich auf der labialen Seite (Abbildung 1A &#39;) gebildet wird. DESC für Schneidezahn Schmelzbildung verantwortlich u...

Das kontinuierlich wachsende Maus Schneidezahn stellt ein Modell für die Untersuchung Erneuerung der Zahngewebe aus Zahn epithelialen Stammzellen (DESC). Ein robustes System für konsistent und zuverlässig diese Zellen von den Schneide erhalten und in vitro expandiert sie hier berichtet wird.

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, auf zuverlässige und reproduzierbare Weise Zellen aus dem Schneidezahn des Mäusen, speziell aus dem labialen Zervikalschleifenbereich, für die Kultur zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem zunächst der untere Hemi-Mandibula aus der erwachsenen Maus präpariert und der die Zervikalschleife bedeckende Knochen entfernt wird. Im zweiten Schritt wird der Zervikalschleifenbereich isoliert und das Mesenchym vom Epithel getrennt.Anschließend wird die Zervikalschleife mikrodissekiert. Der letzte Schritt besteht darin, die isolierten epithelialen Zellen zu dissociieren und anschließend zu kultivieren. Letztendlich dient dieses Video dazu, die korrekte Vorgehensweise zur erfolgreichen Isolierung von Zellen aus der labialen Zervikalschleife zu demonstrieren.Den Vorgang werden ich selbst, die Postdocs Kirsten, SEL und Jimmy Hu sowie ing Lee, ein Gastwissenschaftler im Klein-Labor, demonstrieren. Nach der Tötung des Tieres wird die Haut vom unteren Lippenrand bis zum Halsansatz entfernt. Anschließend wird mit einem Skalpell ein Schnitt zwischen den beiden unteren Schneidezähnen ausgeführt, die locker miteinander verbunden sind.Unter Druckanw

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine schnelle und robuste Lösung zur Isolierung von lebensfähigen Erwachsenen epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut beschrieben wird. Das Verfahren nutzt enzymatische Verdauung der Haut Kollagen-Matrix, durch Zupfen der Haarfollikel und Isolierung von einzelnen Zellsuspensionen oder Gewebestücke für die Zellkultur gefolgt.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

Das beschriebene Verfahren Isolierung und Charakterisierung von menschlichen Zahnpulpa Stammzellen (hDPSCs) unter Verwendung...

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Die Trowell-Typ-Organkulturmethode wurde verwendet, um komplexe Signalnetzwerke zu entschlüsseln, die die Zahnentwicklung steuern, und in jüngerer Zeit zur Untersuchung der Regulation von Stammzellen des kontinuierlich wachsenden Mausschneidezahns. Fluoreszenzreporter-Tiermodelle und Live-Imaging-Verfahren ermöglichen eingehende Analysen von dentalen Stammzellen und ihrer spezifischen Nischenmikroumgebung.

Verwendung von Organkulturen vom Trowell-Typ zur Untersuchung der Regulation von dentalen Stammzellen

Dieses Protokoll stellt eine Methode für die Kultur und das 3D-Wachstum von Ameloblasten-ähnlichen Zellen in Schwerelosigkeit vor, um ihre längliche und polarisierte Form sowie die schmelzspezifische Proteinexpression zu erhalten. Auch Kulturbedingungen für die Kultur von parodontalen Engineering-Konstrukten und Lungenorganen in Schwerelosigkeit werden beschrieben.

Vermehrung von Zahn- und Atmungszellen und -organen in Schwerelosigkeit

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen. Eine Bewertungsmethode unter Verwendung von Immunfärbung wird ebenfalls berichtet.

Isolierung und Kultur von primären oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen

Hier stellen wir eine modifizierte Methode zur Isolierung und Kultur menschlicher Zahnfleischepithelzellen vor, indem wir den Rock-Inhibitor Y-27632 zur traditionellen Methode hinzufügen. Diese Methode ist einfacher, weniger zeitaufwendig, verbessert die Stammzelleigenschaften und produziert eine größere Anzahl von Epithelzellen mit hohem Potenzial sowohl für das Labor als auch für klinische Anwendungen.

Isolierung und Kultur primärer humaner Zahnfleischepithelzellen mit Y-27632

Das aktuelle Protokoll stellt eine schnelle, effiziente und schonende Methode zur Isolierung einzelner Zellen dar, die für die Einzelzell-RNA-seq-Analyse aus einem kontinuierlich wachsenden Mausschneidezahn, Mausmollaren und menschlichen Zähnen geeignet sind.

Schnelle Isolierung einzelner Zellen aus Maus- und menschlichen Zähnen

Der Dentalfollikel enthält eine Epithelpopulation und mesenchymale Zellen. Die Epithelpopulation wurde aus der heterogenen Dentalfollikelzellpopulation ausgewählt, indem ein bestimmtes Kulturmedium bereitgestellt wurde. Epithelzellen überlebten und bildeten Kolonien in einem serumfreien Medium.

Isolierung von Epithelzellen aus dem menschlichen Zahnfollikel

Wir präsentieren ein Protokoll zur Entwicklung epithelialer Organoidkulturen ausgehend vom menschlichen Zahn. Die Organoide sind robust expandierbar und rekapitulieren die epithelialen Stammzellen des Zahnes, einschließlich ihrer Ameloblasten-Differenzierungskapazität. Das einzigartige Organoidmodell bietet ein vielversprechendes Werkzeug, um die Biologie der menschlichen Zahnmedizin (Stammzelle) mit Perspektiven für zahnregenerative Ansätze zu untersuchen.

Etablierung von Organoiden aus dem menschlichen Zahn als mächtiges Werkzeug für die mechanistische Forschung und regenerative Therapie

Der Schneidezahn der Maus enthält in seiner Stammzellnische wertvolle markierungshaltende Zellen. Wir haben eine neuartige Methode, um die markierungserhaltenden Zellen unvoreingenommen zu erkennen und zu quantifizieren. Unsere Studie verwendete eine EdU-Markierung und einen 3D-Rekonstruktionsansatz nach der PEGASOS-Gewebereinigung des Unterkiefers.

Detektion und Quantifizierung von markierungshaltenden Zellen in Schneidezähnen von Mäusen mittels eines 3D-Rekonstruktionsansatzes nach Gewebereinigung

Die Ex-vivo-Live-Bildgebung ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung der dynamischen Prozesse zellulärer Bewegungen und Interaktionen in lebendem Gewebe. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Zwei-Photonen-Mikroskopie implementiert, um dentale Epithelzellen in kultivierten ganzen erwachsenen Mausschneidezähnen live zu verfolgen.

Verwendung von Ex-vivo-Live-Bildgebung zur Untersuchung von Zellteilungen und -bewegungen während der Zahnerneuerung von Mäusen

Lernen Sie die Isolierung und Kultur dentaler epithelialer Stammzellen aus dem erwachsenen Maus-Schneidezahn. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Zellkulturen für die dentale Geweberegeneration.

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

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