Name: Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
Description: Lernen Sie die hochauflösende Bildgebung dendritischer Dornen von primären Hippocampus-Neuronen der Ratte mit Structured Illumination Microscopy. Diese Methode ermöglicht detaillierte morphologische Analysen für die Neurowissenschaft.

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Diese Arbeit wurde durch ein Grant-Nummer VIDI H64.09.016, der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) zu CPF finanziert. CPF dankt Dr. Silvina A. Fratantoni für ihre kritischen Anmerkungen und Korrekturen in der letzten Manuskripts. GMRDL / Emmm werden von der niederländischen Technologiestiftung STW (Projekt 12151 und 11350), die Teil der NWO ist, und die teilweise durch das Wirtschaftsministerium gefördert unterstützt. Wir danken der Catherine Kitts und Peter Drent von Nikon Instruments Europe BV für Hilfe und Unterstützung. HX wurde von der Königlichen Niederländischen Akademie der Künste und Wissenschaften (Zuschuss 11CDP10) und WT unterstützt wurde durch Erteilung der Niederländischen Organisation für Wissenschaftliche Forschung (Förder 820.02.006) unterstützt.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In diesem Artikel wird ein Arbeitsprotokoll, um Bild dendritischen Dornen aus Ratten-Hippocampus-Neuronen primäre Verwendung der SIM in vitro beschrieben. Der primäre Hippocampus Kultur-Methode ist eine Anpassung der von Kaech und Banker 18 beschrieben ursprünglichen Methode. Die Hauptunterschiede sind die Verwendung von Neurobasal/B27 Kulturmedium, das das Erfordernis der Zuführung Astroglia Kulturen eliminiert, und die Zugabe des mitotischen Inhibitor FUDR an Tag 3, der das Überleben von Neuronen f...

Ein dendritisches Wirbelsäule ist ein kleiner Vorsprung des Neurons Membran. Diese charakteristische Struktur ist darauf spezialisiert, in der Regel erhalten Input von einer einzigen Synapse und stellt die physikalische Kontaktfläche zwischen zwei Nervenzellen. Die meisten funktionell reifen dendritischen Dornen bestehen aus einem kugelförmigen Spitze, genannt Kopf und einem dünnen Hals, der den Kopf mit dem dendritischen Welle verbindet. Allerdings sind nicht statisch, Stacheln und aktiv zu bewegen und ändern ihre Morphologie kontinuierlich auch im erwachsenen Gehirn 2. In einem 2-wöchigen Zeitraum, Ratte primären Hippocampus-Neuronen-Kulturen vom späten embryonalen oder frühen postnatalen Zeit abgeleitet Entwicklung komplexer dendritischen Dornen mit zahlreichen Membran Vorsprünge, die von Anfang an filipodia stachelartigen Strukturen 3 entwickeln. Basierend auf diesem dynamischen Verhalten und andere Merkmale werden dendritischen Dornen haben, um einen anatomischen Substrat für Speicher und synaptische Transmission 4,5 bereitzustellen. Angesichts thE kritischen Rolle, die dendritischen Dorn Größe und Form haben in der synaptischen Funktion, ist es wichtig, ihren Abmessungen exakt zu messen. Stacheln variieren von etwa 200 bis 2000 Nanometer in der Länge und kann leicht mit Hilfe der konfokalen Laserrasterfluoreszenzmikroskopie identifiziert werden. Aber auch andere als die Länge der Wirbelsäule Dimensionen sind in der Regel unter Auflösung der herkömmlichen optischen Systeme &quot;, theoretisch durch Beugung um 200 Nanometer 6 befestigt. Diese Auflösungsvermögen unzureichend zur Abbildung feiner Details, wie die Breite der Wirbelsäule Hals und Kopf. Viel Arbeit wurde gewidmet, um dieses Problem zu lösen und viele relativ neue Super-Resolution-Mikroskopie-Techniken haben erhebliche Fortschritte zur Verfügung gestellt. Insbesondere ist es möglich, die Auflösung über die klassische Grenze ohne Verwerfen jede Emissionslicht durch die Verwendung seitlich Structured Illumination Microscopy (SIM) in einer Weitfeld-, nicht-konfokalen Mikroskop 7-10 zu erreichen. Unter Verwendung dieser Technik in Kombination mit nicht-linear Mikroskopie-Techniken, ist es theoretisch möglich, die laterale Auflösung des Lichtmikroskops von einer unbegrenzten Faktor 11 zu verbessern. Aber in den meisten experimentellen Bedingungen erlaubt SIM zur Auflösungsgrenze um einen Faktor von zwei 1 übertreffen. Andere höchstauflösenden optischen Mikroskopie-Techniken wie Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie 12 und Photoaktivierung Lokalisationsmikroskopie (PALM) 12 haben Bildgebung von dendritischen Dornen angewendet. Localization-basierte Verfahren wie PALM erfordern sehr große Zahl von RAW-Bilder zu Super-Auflösung zu erreichen und werden daher in der Geschwindigkeit beschränkt. Andererseits kann STED hohe Abbildungsgeschwindigkeit zu erreichen, wenn auch relativ geringe Photonenzählungen und kleine Sichtfeldern, die nicht für SIM 13 sein kann. In diesem Artikel ist das Ziel, ein Arbeitsprotokoll zum Bild dendritischen Dornen aus Ratten primäre Neuronen im Hippocampus in vitro kultiviert bieten </em&gt; die Verwendung der SIM. Das Protokoll besteht aus zwei unterscheidbaren Phasen: eine erste, bestehend aus einer Einrichtung, Entwicklung, Transfektion und Immunhistochemie von primären Ratten-Hippocampus-Neuronen Kulturen und einer späten Phase gewidmet Bildgebung probieren.

<table><tbody><tr><td>Feine Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Große Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Große Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stumpfer Spatel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop mit Beleuchtung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 & Deg; C Wasserbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Zellkulturhaube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hochtemperatur-Trockenofen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsenbrenner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator (5% CO2, 37 &de; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Nikon Mikroskop mit strukturierter Beleuchtung, bestehend aus:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti Research Inverses Mikroskop mit Perfect Focus System</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon CFI Apo TIRF 100x Ölobjektiv (N.A. 1.49)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 Kohärente Saphirlaser (458, 488, 514 und 561 nm Austrittswellenlänge)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SIM Illuminator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Stage Controller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MCL Nano-Drive Piezo Controller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Intensilight C-HGFIE Quecksilberlampe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SIM Mikroskop Gehäusetemperaturregelung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor EM-CCD Kamera iXon DU897</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC mit Microsoft Windows 7 Home Edition</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon' s NiS Elements 6.14 SIM Softwarepaket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Typ A Immersionsöl</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging dendritischen dornen von rat primär hippocampus neuronen mit structured illumination microscopy

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendriten sind Vorsprünge, die aus der Dendriten eines Neurons und stellen die primären Ziele von exzitatorischen postsynaptischen Eingänge im Gehirn. Technologische Fortschritte haben diese Strukturen als Schlüsselelemente in Neuron-Konnektivität und synaptische Plastizität identifiziert. Die quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologie mittels Lichtmikroskopie bleibt ein wesentliches Problem aufgrund technischer Einschränkungen mit intrinsischer Brechungsgrenze Lichts verbunden. Dendritischen Dornen können leicht durch konfokale Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskopie identifiziert werden. , Mess subtile Veränderungen in der Form und Größe der Stacheln ist jedoch schwierig, weil andere ist als die Länge der Wirbelsäule Dimensionen sind in der Regel kleiner als herkömmliche theoretische Auflösungsgrenze von 200 nm Lichtmikroskopie fixiert optische Auflösung. Mehrere neu entwickelten Super-Resolution-Techniken, um Bild zellulären Strukturen kleiner als die 200 nm, einschließlich dendritischen Dornen verwendet. Tiese Techniken basieren auf klassischen Fernfeld-Operationen auf der Grundlage und ermöglichen die Nutzung der vorhandenen Probenvorbereitung und Bild über die Oberfläche einer Probe. Beschrieben wird hier ein Arbeitsprotokoll zum Super Resolution Structured Illumination Microscopy (SIM), um die Abbildung von dendritischen Dornen in primären hippokampalen Neuronenkulturen gelten. Mögliche Anwendungen der SIM schneiden sich mit denen der konfokalen Mikroskopie. Allerdings präsentieren sich die beiden unterschiedlichen Techniken Anwendbarkeit. SIM bietet eine höhere effektive laterale Auflösung, während der konfokalen Mikroskopie, die auf die Benutzung eines physischen Lochkamera, erreicht Verbesserung der Auflösung auf Kosten der Beseitigung der aus der Fokus Licht. In diesem Protokoll werden die primären Neuronen auf Deckgläschen mit einem Standard-Protokoll, mit DNA-Plasmiden, die fluoreszierende Proteine ​​und abgebildet mit SIM transfiziert, kultiviert. Die hierin beschriebene gesamte Protokoll dauert ca. 2 Wochen, da dendritischen Dornen abgebildet werden nach 16-17 Tagen in vitro, wenndendritischen Entwicklung optimal ist. Nach Beendigung des Protokolls kann dendritischen Dornen in 3D aus der Serie von SIM-Bildstapeln mit spezieller Software rekonstruiert werden.

Beschrieben wird hier eine standardisierte Arbeitsprotokoll zur Abbildung dendritischen Dornen aus Ratten primäre Neuronen im Hippocampus in vitro mit SIM-Karte. Der Protokollablauf sowie die wesentlichen Schritte sind in Abbildung 1 dargestellt. Insgesamt dauert das Protokoll etwa 2 Wochen nach der experimentellen Arbeit in einer ersten Phase der Probenvorbereitung, einschließlich Kultur, Entwicklung und Transfektion von primären Ratten-Hippocampus-Neuronen und Immunhistochemie getrennt, und d...

Dieser Artikel beschreibt ein Arbeitsprotokoll, um Bild dendritischen Dornen von Neuronen im Hippocampus in vitro unter Verwendung Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-Resolution-Mikroskopie mit SIM bietet Bildauflösung deutlich über der Lichtbeugungsgrenze in allen drei Raumdimensionen, so dass die Abbildung der einzelnen dendritischen Dornen mit verbesserten Details.

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dendritische Dornen in Superauflösung abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst eine primäre hippocampale Ratte-Zellkultur hergestellt wird, gefolgt vom zweiten Schritt, bei dem die dendritischen Dornen mittels GFP-Transfektion und Färbung sichtbar gemacht werden. Anschließend erfolgt die Aufnahme der mit GFP markierten dendritischen Dornen in Superauflösung unter Verwendung eines SIM-Mikroskops.Der letzte Schritt besteht darin, die Rohbilddaten in 3D zu rekonstruieren, sodass sie für die anschließende Bildanalyse bereitstehen. Letztendlich wird GFP-exprimierendes primäres hippocampales Neuron, das in Superauflösung abgebildet wurde, verwendet, um subtile Veränderungen in der Dendritenspinnen-Morphologie darzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konventionellen konfokalen Mikroskopie liegt darin, dass sie eine detailliertere Untersuchung der Dendritenspinnen-Morphologie ermöglicht.Mit dieser Methode lassen sich wichtige, aktuelle Fragen der Neurowissenschaften untersuchen, wie beispielsweise molekulare und pharmakologische Abhängigkeiten bei Formveränderungen dendritischer Dornen

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Forschung

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Neurowissenschaften

Zahlreiche neuere Studien haben Mutationen in synaptischen Proteinen mit Hirnerkrankungen assoziiert identifiziert. Primär kultivierte kortikalen Neuronen bieten eine große Flexibilität bei der Prüfung der Auswirkungen dieser Krankheit assoziierte Proteine ​​auf dendritischen Dorn Morphologie und Motilität.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Quelle: Pekarek, B. T., et. al., Bildgebung und Quantifizierung von intakten neuronalen Dendriten mittels CLARITY Tissue Clearing. (2021)In diesem Video demonstrieren wir die Präparation, Bildgebung und Analyse eines gereinigten Mäusegehirns, um dendritische Dorne, die Morphologie der Wirbelsäule und die neuronale Verteilung mithilfe von konfokaler Mikroskopie und 3D-Rekonstruktionstechniken zu untersuchen.

Konfokalmikroskopische Bildgebung von intakten dendritischen Dornen und der Morphologie der Wirbelsäule in einem gereinigten Mausgehirn

Quelle: Gouder, et. al. Dreidimensionale Quantifizierung von dendritischen Dornen aus pyramidalen Neuronen, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden. J. Vis. Exp. (2015).Dieses Video zeigt die Bildgebung und Analyse von dendritischen Dornen in transduzierten, immunmarkierten Pyramidenneuronen mittels konfokaler Mikroskopie. Hintergrundgeräusche werden reduziert und Dendriten werden durch Schätzung ihres Durchmessers und ihrer Länge verfolgt. Die automatisierte...

Quantifizierung dendritischer Dornen mittels konfokaler Mikroskopie

Zeitraffer-Bildgebung am lebenden Tier liefert wertvolle Informationen über die strukturelle Reorganisation im intakten Gehirn. Hier stellen wir ein verdünntes Schädelpräparat vor, das die transkranielle Bildgebung von fluoreszenzmarkierten synaptischen Strukturen in der lebenden Mausrinde mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Wir beschreiben zwei Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung der dendritischen Arborisierung im Hippocampus von Mausmodellen: Echtzeit- und erweiterte Tiefenschärfebildgebung. Während die erste Methode eine ausgefeilte topographische Verfolgung und Quantifizierung des Ausmaßes der Verzweigung ermöglicht, ermöglicht die zweite eine schnelle Visualisierung des dendritischen Baumes.

Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus

Dendritischen Dornen von Pyramidenneuronen sind die Websites der meisten Synapsen im Gehirn von Säugetieren Kortex. Diese Methode beschreibt ein 3D-quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien in der menschlichen kortikalen Pyramiden glutamatergen Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet.

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Diese Methode beschreibt eine chronische Zubereitung, die den optischen Zugang zum Hippocampus lebender Mäuse ermöglicht. Dieses Präparat kann verwendet werden, um längsinale optische Bildgebung der neuronalen strukturellen Plastizität und aktivitätsbeschworenen zellulären Plastizität über einen Zeitraum von mehreren Wochen durchzuführen.

Längs-Zwei-Photon-Bildgebung des Dorsal Hippocampal CA1 in lebenden Mäusen

Die serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) wird angewendet, um dendritische Stacheln im murinen Hippocampus abbilden und analysieren zu können.

Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) zur Untersuchung dendritischer Stacheln

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Visualisierung und Messung von Aktinringen und anderen Komponenten des periodischen Membranskeletts des Axon-Anfangssegments unter Verwendung von kultivierten Ratten-Hippocampus-Neuronen und 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM).

Messung der Eigenschaften des periodischen Membranskeletts des Axon-Anfangssegments mittels 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM)

Das Protokoll beschreibt eine Modifikation der schnellen Golgi-Methode, die an jeden Teil des Nervensystems angepasst werden kann, zur Färbung von Neuronen im Hippocampus und im medialen präfrontalen Kortex der Ratte.

Schneller Golgi-Fleck für die Visualisierung der dendritischen Wirbelsäule im Hippocampus und im präfrontalen Kortex

Dendritische Stacheln sind postsynaptische Kompartimente der meisten exzitatorischen Synapsen. Veränderungen der Morphologie der dendritischen Wirbelsäule treten während der neurologischen Entwicklung, des Alterns, des Lernens und vieler neurologischer und psychiatrischer Erkrankungen auf, was die Bedeutung einer zuverlässigen dendritischen Wirbelsäulenanalyse unterstreicht. Dieses Protokoll beschreibt die genaue und reproduzierbare Quantifizierung der Morphologie der dendritischen Wirbelsäule...

Quantifizierung der dendritischen Wirbelsäule mit einer automatischen dreidimensionalen Neuronenrekonstruktionssoftware

Lernen Sie die hochauflösende Bildgebung dendritischer Dornen von primären Hippocampus-Neuronen der Ratte mit Structured Illumination Microscopy. Diese Methode ermöglicht detaillierte morphologische Analysen für die Neurowissenschaft.

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

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