Name: Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
Description: Lernen Sie die hochauflösende Bildgebung dendritischer Dornen von primären Hippocampus-Neuronen der Ratte mit Structured Illumination Microscopy. Diese Methode ermöglicht detaillierte morphologische Analysen für die Neurowissenschaft.

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Diese Arbeit wurde durch ein Grant-Nummer VIDI H64.09.016, der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) zu CPF finanziert. CPF dankt Dr. Silvina A. Fratantoni für ihre kritischen Anmerkungen und Korrekturen in der letzten Manuskripts. GMRDL / Emmm werden von der niederländischen Technologiestiftung STW (Projekt 12151 und 11350), die Teil der NWO ist, und die teilweise durch das Wirtschaftsministerium gefördert unterstützt. Wir danken der Catherine Kitts und Peter Drent von Nikon Instruments Europe BV für Hilfe und Unterstützung. HX wurde von der Königlichen Niederländischen Akademie der Künste und Wissenschaften (Zuschuss 11CDP10) und WT unterstützt wurde durch Erteilung der Niederländischen Organisation für Wissenschaftliche Forschung (Förder 820.02.006) unterstützt.

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<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In diesem Artikel wird ein Arbeitsprotokoll, um Bild dendritischen Dornen aus Ratten-Hippocampus-Neuronen primäre Verwendung der SIM in vitro beschrieben. Der primäre Hippocampus Kultur-Methode ist eine Anpassung der von Kaech und Banker 18 beschrieben ursprünglichen Methode. Die Hauptunterschiede sind die Verwendung von Neurobasal/B27 Kulturmedium, das das Erfordernis der Zuführung Astroglia Kulturen eliminiert, und die Zugabe des mitotischen Inhibitor FUDR an Tag 3, der das Überleben von Neuronen f...

Ein dendritisches Wirbelsäule ist ein kleiner Vorsprung des Neurons Membran. Diese charakteristische Struktur ist darauf spezialisiert, in der Regel erhalten Input von einer einzigen Synapse und stellt die physikalische Kontaktfläche zwischen zwei Nervenzellen. Die meisten funktionell reifen dendritischen Dornen bestehen aus einem kugelförmigen Spitze, genannt Kopf und einem dünnen Hals, der den Kopf mit dem dendritischen Welle verbindet. Allerdings sind nicht statisch, Stacheln und aktiv zu bewegen und ändern ihre Morphologie kontinuierlich auch im erwachsenen Gehirn 2. In einem 2-wöchigen Zeitraum, Ratte primären Hippocampus-Neuronen-Kulturen vom späten embryonalen oder frühen postnatalen Zeit abgeleitet Entwicklung komplexer dendritischen Dornen mit zahlreichen Membran Vorsprünge, die von Anfang an filipodia stachelartigen Strukturen 3 entwickeln. Basierend auf diesem dynamischen Verhalten und andere Merkmale werden dendritischen Dornen haben, um einen anatomischen Substrat für Speicher und synaptische Transmission 4,5 bereitzustellen. Angesichts thE kritischen Rolle, die dendritischen Dorn Größe und Form haben in der synaptischen Funktion, ist es wichtig, ihren Abmessungen exakt zu messen. Stacheln variieren von etwa 200 bis 2000 Nanometer in der Länge und kann leicht mit Hilfe der konfokalen Laserrasterfluoreszenzmikroskopie identifiziert werden. Aber auch andere als die Länge der Wirbelsäule Dimensionen sind in der Regel unter Auflösung der herkömmlichen optischen Systeme &quot;, theoretisch durch Beugung um 200 Nanometer 6 befestigt. Diese Auflösungsvermögen unzureichend zur Abbildung feiner Details, wie die Breite der Wirbelsäule Hals und Kopf. Viel Arbeit wurde gewidmet, um dieses Problem zu lösen und viele relativ neue Super-Resolution-Mikroskopie-Techniken haben erhebliche Fortschritte zur Verfügung gestellt. Insbesondere ist es möglich, die Auflösung über die klassische Grenze ohne Verwerfen jede Emissionslicht durch die Verwendung seitlich Structured Illumination Microscopy (SIM) in einer Weitfeld-, nicht-konfokalen Mikroskop 7-10 zu erreichen. Unter Verwendung dieser Technik in Kombination mit nicht-linear Mikroskopie-Techniken, ist es theoretisch möglich, die laterale Auflösung des Lichtmikroskops von einer unbegrenzten Faktor 11 zu verbessern. Aber in den meisten experimentellen Bedingungen erlaubt SIM zur Auflösungsgrenze um einen Faktor von zwei 1 übertreffen. Andere höchstauflösenden optischen Mikroskopie-Techniken wie Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie 12 und Photoaktivierung Lokalisationsmikroskopie (PALM) 12 haben Bildgebung von dendritischen Dornen angewendet. Localization-basierte Verfahren wie PALM erfordern sehr große Zahl von RAW-Bilder zu Super-Auflösung zu erreichen und werden daher in der Geschwindigkeit beschränkt. Andererseits kann STED hohe Abbildungsgeschwindigkeit zu erreichen, wenn auch relativ geringe Photonenzählungen und kleine Sichtfeldern, die nicht für SIM 13 sein kann. In diesem Artikel ist das Ziel, ein Arbeitsprotokoll zum Bild dendritischen Dornen aus Ratten primäre Neuronen im Hippocampus in vitro kultiviert bieten </em&gt; die Verwendung der SIM. Das Protokoll besteht aus zwei unterscheidbaren Phasen: eine erste, bestehend aus einer Einrichtung, Entwicklung, Transfektion und Immunhistochemie von primären Ratten-Hippocampus-Neuronen Kulturen und einer späten Phase gewidmet Bildgebung probieren.

<table><tbody><tr><td>Feine Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Große Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Große Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stumpfer Spatel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop mit Beleuchtung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 & Deg; C Wasserbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Zellkulturhaube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hochtemperatur-Trockenofen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsenbrenner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator (5% CO2, 37 &de; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Nikon Mikroskop mit strukturierter Beleuchtung, bestehend aus:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti Research Inverses Mikroskop mit Perfect Focus System</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon CFI Apo TIRF 100x Ölobjektiv (N.A. 1.49)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 Kohärente Saphirlaser (458, 488, 514 und 561 nm Austrittswellenlänge)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SIM Illuminator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Stage Controller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MCL Nano-Drive Piezo Controller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Intensilight C-HGFIE Quecksilberlampe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SIM Mikroskop Gehäusetemperaturregelung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor EM-CCD Kamera iXon DU897</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC mit Microsoft Windows 7 Home Edition</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon' s NiS Elements 6.14 SIM Softwarepaket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Typ A Immersionsöl</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging dendritischen dornen von rat primär hippocampus neuronen mit structured illumination microscopy

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendriten sind Vorsprünge, die aus der Dendriten eines Neurons und stellen die primären Ziele von exzitatorischen postsynaptischen Eingänge im Gehirn. Technologische Fortschritte haben diese Strukturen als Schlüsselelemente in Neuron-Konnektivität und synaptische Plastizität identifiziert. Die quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologie mittels Lichtmikroskopie bleibt ein wesentliches Problem aufgrund technischer Einschränkungen mit intrinsischer Brechungsgrenze Lichts verbunden. Dendritischen Dornen können leicht durch konfokale Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskopie identifiziert werden. , Mess subtile Veränderungen in der Form und Größe der Stacheln ist jedoch schwierig, weil andere ist als die Länge der Wirbelsäule Dimensionen sind in der Regel kleiner als herkömmliche theoretische Auflösungsgrenze von 200 nm Lichtmikroskopie fixiert optische Auflösung. Mehrere neu entwickelten Super-Resolution-Techniken, um Bild zellulären Strukturen kleiner als die 200 nm, einschließlich dendritischen Dornen verwendet. Tiese Techniken basieren auf klassischen Fernfeld-Operationen auf der Grundlage und ermöglichen die Nutzung der vorhandenen Probenvorbereitung und Bild über die Oberfläche einer Probe. Beschrieben wird hier ein Arbeitsprotokoll zum Super Resolution Structured Illumination Microscopy (SIM), um die Abbildung von dendritischen Dornen in primären hippokampalen Neuronenkulturen gelten. Mögliche Anwendungen der SIM schneiden sich mit denen der konfokalen Mikroskopie. Allerdings präsentieren sich die beiden unterschiedlichen Techniken Anwendbarkeit. SIM bietet eine höhere effektive laterale Auflösung, während der konfokalen Mikroskopie, die auf die Benutzung eines physischen Lochkamera, erreicht Verbesserung der Auflösung auf Kosten der Beseitigung der aus der Fokus Licht. In diesem Protokoll werden die primären Neuronen auf Deckgläschen mit einem Standard-Protokoll, mit DNA-Plasmiden, die fluoreszierende Proteine ​​und abgebildet mit SIM transfiziert, kultiviert. Die hierin beschriebene gesamte Protokoll dauert ca. 2 Wochen, da dendritischen Dornen abgebildet werden nach 16-17 Tagen in vitro, wenndendritischen Entwicklung optimal ist. Nach Beendigung des Protokolls kann dendritischen Dornen in 3D aus der Serie von SIM-Bildstapeln mit spezieller Software rekonstruiert werden.

Beschrieben wird hier eine standardisierte Arbeitsprotokoll zur Abbildung dendritischen Dornen aus Ratten primäre Neuronen im Hippocampus in vitro mit SIM-Karte. Der Protokollablauf sowie die wesentlichen Schritte sind in Abbildung 1 dargestellt. Insgesamt dauert das Protokoll etwa 2 Wochen nach der experimentellen Arbeit in einer ersten Phase der Probenvorbereitung, einschließlich Kultur, Entwicklung und Transfektion von primären Ratten-Hippocampus-Neuronen und Immunhistochemie getrennt, und d...

Dieser Artikel beschreibt ein Arbeitsprotokoll, um Bild dendritischen Dornen von Neuronen im Hippocampus in vitro unter Verwendung Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-Resolution-Mikroskopie mit SIM bietet Bildauflösung deutlich über der Lichtbeugungsgrenze in allen drei Raumdimensionen, so dass die Abbildung der einzelnen dendritischen Dornen mit verbesserten Details.

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dendritische Dornen in Superauflösung abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst eine primäre hippocampale Ratte-Zellkultur hergestellt wird, gefolgt vom zweiten Schritt, bei dem die dendritischen Dornen mittels GFP-Transfektion und Färbung sichtbar gemacht werden. Anschließend erfolgt die Aufnahme der mit GFP markierten dendritischen Dornen in Superauflösung unter Verwendung eines SIM-Mikroskops.Der letzte Schritt besteht darin, die Rohbilddaten in 3D zu rekonstruieren, sodass sie für die anschließende Bildanalyse bereitstehen. Letztendlich wird GFP-exprimierendes primäres hippocampales Neuron, das in Superauflösung abgebildet wurde, verwendet, um subtile Veränderungen in der Dendritenspinnen-Morphologie darzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konventionellen konfokalen Mikroskopie liegt darin, dass sie eine detailliertere Untersuchung der Dendritenspinnen-Morphologie ermöglicht.Mit dieser Methode lassen sich wichtige, aktuelle Fragen der Neurowissenschaften untersuchen, wie beispielsweise molekulare und pharmakologische Abhängigkeiten bei Formveränderungen dendritischer Dornen. Die strukturierte Eliminationsmikroskopie basiert auf der Projektion von Linielmustern auf die Probe, wodurch zusätzliche Informationen gewonnen werden können, die mithilfe eines Computerprogramms extrahiert werden und schärfere Bilder liefern. Dies ermöglicht die Betrachtung von MI-Mitochondrien und anderen kleinen zellulären Strukturen. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, da eine gültige Rekonstruktion eines SIM-Bildes entscheidend von der sorgfältigen Durchführung der Schritte abhängt, die qualitativ hochwertige Rohdaten liefern.Ein wichtiger Vorbereitungsschritt besteht darin, die Deckgläser unter sterilen Bedingungen in einer sterilen Flüssigkeitsabsaughaube zu beschichten. Legen Sie die einzelnen Deckgläser mit sterilen Pinzetten in die einzelnen Vertiefungen einer 12-Loch-Platte. Geben Sie anschließend 500 µL Polylysin-Lösung in jede Vertiefung, um die Deckgläser vollständig zu bedecken. Nach dem Waschen der Vertiefungen ein Milliliter Plattiernährmedium hinzufügen und die Deckgläser bis zu 24 Stunden vor dem Plattieren der Zellen im Zellkulturinkubator belassen. Das Verfahren wird von HU IS SH, einem Doktoranden in unserer Gruppe, demonstriert. Nach der Isolierung eines Rattenembryos das Kleinhirn mithilfe einer feinen Pinzette vom Gehirn entfernen und entsorgen.Trennen Sie die beiden Hemisphären, indem Sie einen sagittalen Schnitt entlang der Mittellinie unter einem Stereomikroskop durchführen. Verwenden Sie ein Paar kleiner Pinzetten, um das Mittelhirn vorsichtig zu fixieren und dieses zu entfernen. Mit einem weiteren Paar Pinzetten bleibt der Rest der Hemisphäre, der die Großhirnrinde und das Hippocampus enthält, intakt. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die Hirnhäute und drehen Sie das Gewebe so um, dass der Hippocampus nach oben zeigt.Das Hippocampus kann anhand seiner charakteristischen CS-förmigen Struktur identifiziert werden. Mit feinen Pinzetten das Hippocampus auspräparieren und in eine neue 30-Millimeter-Schale mit frischem kaltem 1×-HBSS geben. Nachdem alle Hippocampi aus den Embryonen entfernt wurden, die Gesamtanzahl der Hippocampi zählen und sie anschließend in kleine Stücke schneiden.Sammeln Sie die Stücke in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das drei Milliliter eines 1x-H-B-S-S enthält. Nach der Zentrifugation und Entfernung des Überstandes geben Sie sechs Mikroliter Trypsin pro Hippocampus hinzu. Nach der Inkubation und dem Waschen der Hippocampusfragmente gemäß der schriftlichen Anleitung schwenken Sie die Fragmente langsam 30-mal mit einer feuerpolierten Pasteurpipette, bis alle Gewebestücke gleichmäßig in Einzelzellen dispergiert sind.Achten Sie darauf, Blasenbildung zu vermeiden. Fügen Sie anschließend fünf Milliliter Platingmedium hinzu, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Nachdem Sie die Zellen mit einer vitalen Trypanblau-Färbung gezählt haben, säen Sie 50.000 Zellen pro Mulde einer 12-Muldenplatte in einem Milliliter Platingmedium, sodass sich ein Gesamtvolumen von zwei Millilitern ergibt.Nachdem die Platte geschwenkt wurde, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach zwei bis drei Tagen ersetzen Sie 0,5 Milliliter des Ansämezmediums durch Kulturmedium, das 10 Mikromolar FUDR enthält. Zum Transfizieren der Neuronen fügen Sie ein Lipofektionsreagenz hinzu.Geben Sie die Mischung tropfenweise zu der DNA-Mischung hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Zehn Minuten vor Ende der 30-minütigen Inkubationszeit der DNA-Lipofektionsmischung pipettieren Sie im laminarer Luftstrom-Gehäuse das konditionierte Medium von der ursprünglichen oder ersten Kulturplatte in eine zweite 12-Loch-Platte und lagern Sie diese Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in der ersten Kulturplatte.Ersetzen Sie das konditionierte Medium schnell durch ein Milliliter vorgewärmtes Inkubationsmedium, um zu verhindern, dass die Zellen austrocknen. Stellen Sie beide Platten wieder in den Inkubator bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid. Am Ende der 30-minütigen DNA-Lipofektions-Inkubation ist die DNA-Lipofektions-Mischung bereit, den Zellen zugegeben zu werden.Fügen Sie vorsichtig 200 Mikroliter der DNA-Lipofektionsmischung tropfenweise zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie 45 Minuten bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid. Nach der 45-minütigen Inkubation heben Sie mit einer kleinen Pinzette die Deckgläser mit den Neuronen an. Spülen Sie sie, indem Sie sie in eine drei Zentimeter durchmessende Schale mit frischem, warmem Neurobasal-Medium eintauchen, und legen Sie sie anschließend in einen Brunnen. In der zweiten 12-Loch-Platte mit dem konditionierten Medium. Inkubieren Sie die transfizierten Neuronen dann 48 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Zum Vorbereiten der Immunfärbung saugen Sie vorsichtig das Medium von den Vertiefungen mit den Deckgläsern ab.Dann vorsichtig 500 Mikroliter warme 4 % PFA hinzufügen, um die Dendriten nicht zu beschädigen. Nach der Inkubation und dem Waschen der Zellen diese mit 1 % TBS-BSA-Lösung bei Raumtemperatur für 30 Minuten blockieren, danach erneut waschen, den primären Antikörper in Inkubationspuffer verdünnt hinzufügen, mischen und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend über Nacht bei vier Grad Celsius mit sanftem Schütteln inkubieren.Am nächsten Morgen entfernen Sie den primären Antikörper und waschen Sie ab diesem Zeitpunkt erneut; dabei müssen die Deckgläser vor Licht geschützt bleiben. Fügen Sie anschließend den sekundären, fluoreszenzmarkierten Antikörper, der in Inkubationspuffer verdünnt ist, hinzu. Mischen und inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur.Entfernen Sie dann den sekundären Antikörper und waschen Sie die Zellen mit feinen Pinzetten. Nehmen Sie die Deckgläser aus den Vertiefungen und trocknen Sie überschüssiges TBS mit einem Tuch ab. Bringen Sie die Deckgläser schließlich mit Einbettmedium auf Objektträgern an und verschließen Sie sie mit Nagellack.Um die SIM-Bildgebung zu beginnen, schalten Sie den 488-Nanometer-Laser, die Quecksilberlampe, die Stufensteuerung, die Piezo-Steuerung und die Halogenlampe für durchgehendes Licht ein. Starten Sie die SIM-Software im und oder für den nsim-Modus. Nachdem Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Objektiv gegeben haben, überprüfen Sie, dass sich keine Luftblasen im Öltropfen befinden.Platzieren Sie den Deckel mit den hippokampalen Neuronen auf dem Mikroskoptisch. Bewegen Sie das Objektiv nach oben, bis das Öl die Probe berührt. Denken Sie daran, während des Erfassungsverfahrens eine Abdeckung über den Tisch zu legen, um die Probe vor Umgebungslicht zu schützen, und dimmen Sie das Licht im Raum so weit wie möglich.Wählen Sie in der SIM-Software die optische Konfiguration IFI aus und wählen Sie einen leeren Filterblock für die visuelle Inspektion mit weißem Licht, um die Probenfokussierung einzustellen. Schalten Sie anschließend das weiße Licht aus und das Quecksilberlampe ein. Öffnen Sie die Blende und wählen Sie den grünen Filter, um einen ausreichend hellen Dendriten zu finden.Nachdem ein ausreichend heller Dendrit von Interesse gefunden und ein Abschnitt von Interesse im Sichtfeld zentriert wurde, schließen Sie den Verschluss. Stellen Sie die Software auf die optische Konfiguration 3D SIM 4 88 ein und konfigurieren Sie die Kameraeinstellungen wie folgt. Wählen Sie den Auslesemodus em.EM-Verstärkung auf 200 einstellen. Belichtungszeit auf 100 Millisekunden einstellen. Laserleistung auf 5 % einstellen. 16 Bit bei 1 Megahertz erfassen.Stellen Sie bei eingestellter Fokusgeschwindigkeit auf „extra fein“ auf das gewünschte Objekt scharf. Passen Sie die Kameraeinstellungen anschließend schnell wie folgt an. Um einen Intensitätswert zwischen 30,040 und 5.000 zu erreichen, stellen Sie die Laserleistung auf 0 % bis 20 % ein. Die Belichtungszeit wird auf 50 Millisekunden bis zwei Sekunden eingestellt.Stellen Sie den Auslesemodus auf EM ein. Gewinn ein Megahertz 16 Bit. Stellen Sie den EM-Gewinn auf null bis 300 ein.Stellen Sie die Konvertierungsverstärkung auf eins x bis 5,1 x ein. Stellen Sie das Format für Live auf kein Benning ein. Stellen Sie das Format für Aufnahme auf kein Benning ein.Konfigurieren Sie anschließend die Einstellungen des dreifachen DZ-Stacks im ND-Sequenzfenster wie folgt: Stellen Sie den Bereich auf zwei Mikrometer ein. Wählen Sie die Schrittgröße mit 120 Nanometern und klicken Sie auf die Startposition. Wählen Sie dann im Lambda-Bereich die optische Konfiguration 3D SIM 4 88 aus.Nachdem 3D-SIM als Aufnahmemodus ausgewählt wurde, führen Sie die ND-Sequenzaufnahme durch und speichern Sie die Rohdaten. Hier werden mit konfokaler und SIM-Mikroskopie abgebildete Dendriten und dendritische Dornen gezeigt. Die Aufnahmen wurden aus konfokalen und SIM-Bildern rekonstruiert. Die Dendriten wurden nachverfolgt und die Dornen automatisch mit der Software klassifiziert, nachdem die Hauptparameter wie Halslänge, Halsdurchmesser und Kopfdurchmesser angepasst wurden.Die markierten Bereiche zeigen eine einzelne dendritische Dorn, die mittels konfokaler und SIM-Mikroskopie abgebildet und aus den entsprechenden Z-Stapeln rekonstruiert wurde, wobei Unterschiede in der Auflösung und Genauigkeit der resultierenden 3D-Rekonstruktionen deutlich werden. Aufgrund der höheren Auflösung von SIM zeigte die quantitative Analyse sowohl des Kopf- als auch des Halsdurchmessers, dass die SIM-Mikroskopie signifikant kleinere Dimensionen misst als die konfokale Mikroskopie für dieselben dendritischen Dornen, was darauf hinweist, dass SIM in der Lage ist, kleinere Veränderungen in der Morphologie dendritischer Dornen zu erfassen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets daran zu denken, Rohbilder von hoher Qualität aufzunehmen, um eine aussagekräftigere anschließende Rekonstruktion derselben Bilder zu ermöglichen.Die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie kann auch für die Bildgebung lebender Zellen wirksam sein und ermöglicht die Untersuchung der Dynamik von Zellen wie Hela-Zellen, Neuronen oder E. coli-Bakterien. Nach dem Ansehen dieses Videos sollte man ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Standardproben aus primären hippocampalen Neuronen in einer Super-Auflösungsbildgebung vorbereitet, visualisiert und abbildet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Zahlreiche neuere Studien haben Mutationen in synaptischen Proteinen mit Hirnerkrankungen assoziiert identifiziert. Primär kultivierte kortikalen Neuronen bieten eine große Flexibilität bei der Prüfung der Auswirkungen dieser Krankheit assoziierte Proteine ​​auf dendritischen Dorn Morphologie und Motilität.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Quelle: Pekarek, B. T., et. al., Bildgebung und Quantifizierung von intakten neuronalen Dendriten mittels CLARITY Tissue Clearing. (2021)In diesem Video demonstrieren wir die Präparation, Bildgebung und Analyse eines gereinigten Mäusegehirns, um dendritische Dorne, die Morphologie der Wirbelsäule und die neuronale Verteilung mithilfe von konfokaler Mikroskopie und 3D-Rekonstruktionstechniken zu untersuchen.

Konfokalmikroskopische Bildgebung von intakten dendritischen Dornen und der Morphologie der Wirbelsäule in einem gereinigten Mausgehirn

Quelle: Gouder, et. al. Dreidimensionale Quantifizierung von dendritischen Dornen aus pyramidalen Neuronen, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden. J. Vis. Exp. (2015).Dieses Video zeigt die Bildgebung und Analyse von dendritischen Dornen in transduzierten, immunmarkierten Pyramidenneuronen mittels konfokaler Mikroskopie. Hintergrundgeräusche werden reduziert und Dendriten werden durch Schätzung ihres Durchmessers und ihrer Länge verfolgt. Die automatisierte...

Quantifizierung dendritischer Dornen mittels konfokaler Mikroskopie

Zeitraffer-Bildgebung am lebenden Tier liefert wertvolle Informationen über die strukturelle Reorganisation im intakten Gehirn. Hier stellen wir ein verdünntes Schädelpräparat vor, das die transkranielle Bildgebung von fluoreszenzmarkierten synaptischen Strukturen in der lebenden Mausrinde mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Wir beschreiben zwei Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung der dendritischen Arborisierung im Hippocampus von Mausmodellen: Echtzeit- und erweiterte Tiefenschärfebildgebung. Während die erste Methode eine ausgefeilte topographische Verfolgung und Quantifizierung des Ausmaßes der Verzweigung ermöglicht, ermöglicht die zweite eine schnelle Visualisierung des dendritischen Baumes.

Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus

Dendritischen Dornen von Pyramidenneuronen sind die Websites der meisten Synapsen im Gehirn von Säugetieren Kortex. Diese Methode beschreibt ein 3D-quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologien in der menschlichen kortikalen Pyramiden glutamatergen Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet.

Dreidimensionale Quantifizierung der dendritischen Dornen von Pyramidenzellen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Diese Methode beschreibt eine chronische Zubereitung, die den optischen Zugang zum Hippocampus lebender Mäuse ermöglicht. Dieses Präparat kann verwendet werden, um längsinale optische Bildgebung der neuronalen strukturellen Plastizität und aktivitätsbeschworenen zellulären Plastizität über einen Zeitraum von mehreren Wochen durchzuführen.

Längs-Zwei-Photon-Bildgebung des Dorsal Hippocampal CA1 in lebenden Mäusen

Dieses Protokoll zeigt, wie man eine hochauflösende Mikroskopie einsetzt, um die Proteinkolokalisierung in primären neuronalen Kulturen zu untersuchen.

Super-Resolution Imaging zur Untersuchung der Kolokalisierung von Proteinen und synaptischen Markern in primärer Neuronen

Die serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) wird angewendet, um dendritische Stacheln im murinen Hippocampus abbilden und analysieren zu können.

Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBEM) zur Untersuchung dendritischer Stacheln

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Visualisierung und Messung von Aktinringen und anderen Komponenten des periodischen Membranskeletts des Axon-Anfangssegments unter Verwendung von kultivierten Ratten-Hippocampus-Neuronen und 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM).

Messung der Eigenschaften des periodischen Membranskeletts des Axon-Anfangssegments mittels 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM)

Das Protokoll beschreibt eine Modifikation der schnellen Golgi-Methode, die an jeden Teil des Nervensystems angepasst werden kann, zur Färbung von Neuronen im Hippocampus und im medialen präfrontalen Kortex der Ratte.

Schneller Golgi-Fleck für die Visualisierung der dendritischen Wirbelsäule im Hippocampus und im präfrontalen Kortex

Lernen Sie die hochauflösende Bildgebung dendritischer Dornen von primären Hippocampus-Neuronen der Ratte mit Structured Illumination Microscopy. Diese Methode ermöglicht detaillierte morphologische Analysen für die Neurowissenschaft.

Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

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