Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, dendritische Stacheln in Superauflösung abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst ein primäres Hippocampus der Ratte präpariert wird, der zweite Schritt besteht darin, die dendritischen Dornen mittels GFP-Transfektion und -Färbung sichtbar zu machen. Anschließend erfolgt die Aufnahme von GFP-markierten dendritischen Dornen in Superauflösung mit einem SIM-Mikroskop.

Der letzte Schritt besteht darin, die Rohbilddaten in 3D zu rekonstruieren, die für die anschließende Bildanalyse bereit sind. Letztendlich wird GFP, das primäre Hippocampus-Neuronen exprimiert, die in Superauflösung abgebildet werden, verwendet, um subtile Veränderungen in der Morphologie der dendritischen Wirbelsäule zu zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konventionellen konfokalen Mikroskopie besteht darin, dass Sie die Morphologie der dendritischen Wirbelsäule detaillierter untersuchen können.

Diese Methode kann helfen, wichtige aktuelle Fragen der Neurowissenschaften zu untersuchen, wie z. B. molekulare und pharmakologische abhängige Veränderungen in der Form der dendritischen Dornen. Die strukturierte Eliminationsmikroskopie basiert auf der Projektion von Linienmustern auf die Probe und liefert zusätzliche Informationen, die von einem Computerprogramm extrahiert werden können und besonders scharfe Bilder liefern, die es Ihnen ermöglichen, MI-Mitochondrien und andere kleine Strukturen in der Zelle zu betrachten. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist wichtig, um eine gültige Rekonstruktion eines SIM-Bildes zu erreichen, und es ist entscheidend, die Schritte zu durchlaufen, die Ihnen eine gute Qualität der Rohdaten liefern.

Ein wichtiger vorbereitender Schritt ist die Beschichtung der Deckgläser in einer sterilen Laminarhaube. Verwenden Sie eine kleine sterile Pinzette, um die einzelnen Deckgläser in einzelne Vertiefungen einer 12-Well-Platte zu legen. Geben Sie dann 500 Mikroliter Polylysinlösung in jede Vertiefung, um die Deckgläser einzutauchen.

Fügen Sie nach dem Waschen der Vertiefungen einen Milliliter Beschichtungsmedium hinzu und lassen Sie die Deckgläser bis zu 24 Stunden im Gewebekultur-Inkubator, bevor Sie die Zellen plattieren. Das Verfahren wird von HU is SH, einem Doktoranden in unserer Gruppe, demonstriert. Nachdem Sie den Embryo einer Ratte isoliert haben, verwenden Sie eine feine Pinzette, um das Kleinhirn aus dem Gehirn zu entfernen und zu entsorgen.

Trennen Sie die beiden Hemisphären, indem Sie unter einem Präpariermikroskop einen sagittalen Schnitt entlang der Mittellinie machen, halten Sie das Mittelhirn mit einer kleinen Pinzette vorsichtig fest und entfernen Sie das Mittelhirn. Lassen Sie mit einer weiteren Pinzette den Rest der Hemisphäre, in der sich die Hirnrinde und der Hippocampus befinden, intakt. Entfernen Sie dann vorsichtig die Hirnhäute, richten Sie das Gewebe so aus, dass der Hippocampus nach oben zeigt.

Der Hippocampus ist an seiner charakteristischen CS-förmigen Struktur zu erkennen. Präparieren Sie den Hippocampus mit einer feinen Pinzette und legen Sie ihn in eine neue 30-Millimeter-Schale, die frisches, kaltes X-H-B-S-S enthält. Nachdem Sie die Nilpferd-Campi von allen Embryonen entfernt haben, zählen Sie die Gesamtzahl der Nilpferd-Campi und schneiden Sie sie dann in kleine Stücke.

Sammeln Sie die Stücke in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das drei Milliliter eines X-H-B-S-S enthält. Nach dem Zentrifugieren und Entfernen des Überstands werden sechs Mikroliter Trypsin pro Hippocampus hinzugefügt. Nach dem Inkubieren und Waschen der Hippocampus-Fragmente, wie im Textprotokoll beschrieben, werden die Fragmente langsam 30 Mal mit einer feuerpolierten Pastor-Pipette gefärbt, bis alle Gewebestücke homogen in einzelne Zellen verteilt sind.

Achten Sie darauf, dass es keine Blasenbildung gibt. Als nächstes fügen Sie fünf Milliliter Beschichtungsmedium hinzu, das auf 37 Grad Celsius vorgewarnt ist. Nach Zählung der Zellen unter Verwendung eines Trianblau-Vitalfärbeseeds wurden 50.000 Zellen pro Vertiefung einer 12-Well-Platte in einem Milliliter Beschichtungsmedium für ein Gesamtvolumen von zwei Millilitern hergestellt.

Nachdem Sie die Platte geschaukelt haben, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid. Nach zwei bis drei Tagen werden 0,5 Milliliter des Beschichtungsmediums durch Kulturmedium ersetzt, das 10 mikromolare FUDR enthält. Um zu transfizieren, fügen die Neuronen eine Lipektomie hinzu.

Tröpfchenweise zu A DNA mischen und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. In einer Laminar-Flow-Haube, 10 Minuten vor dem Ende der 30-minütigen DNA-Lipektomie-Mischung, Inkubation, pipettieren Sie das konditionierte Medium von der ursprünglichen oder ersten Kulturplatte auf eine zweite 12. Füllen Sie diese Platte gut aus und lagern Sie sie bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid in der ersten Kulturplatte.

Ersetzte das konditionierte Medium schnell durch einen Milliliter Vorwärm-Inkubationsmedium, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern. Legen Sie beide Platten bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid, wieder in den Inkubator. Am Ende der 30-minütigen DNA-Lipektomie-Inkubation ist die DNA-Lipektomie-Mischung bereit, den Zellen zugesetzt zu werden.

Geben Sie vorsichtig tropfenweise 200 Mikroliter der DNA-Lipektomiemischung in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid. Nach der 45-minütigen Inkubation heben Sie mit einer kleinen Pinzette die Deckgläser an, die die Neuronen halten. Spülen Sie sie ab, indem Sie sie in eine drei Zentimeter große Schale mit frischem, warmem Neuro-Basalmedium tauchen und in eine Vertiefung legen.

In der zweiten 12 Well-Platte, die das konditionierte Medium enthält. Dann inkubieren Sie die transfizierten Neuronen 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid. Zur Vorbereitung der Immunfärbung saugen Sie das Medium vorsichtig aus den Vertiefungen mit den Deckgläsern ab.

Fügen Sie dann vorsichtig 500 Mikroliter warmes 4%PFA hinzu, um eine Beschädigung der Dendriten zu vermeiden. Nach dem Inkubieren und Waschen blockieren die Zellen 30 Minuten lang mit 1%iger T-B-S-B-S-A-Lösung bei Raumtemperatur, nach erneutem Waschen den in der Inkubation verdünnten Primärantikörper hinzufügen, mischen und eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Dann über Nacht bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln inkubieren.

Am nächsten Morgen den Primärantikörper entfernen und von hier an erneut waschen, die Deckgläser lichtgeschützt aufbewahren. Als nächstes fügen Sie den sekundären fluoreszierenden konjugierten Antikörper hinzu, der in der Inkubation verdünnt wird. Mischen und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.

Entfernen Sie dann den Sekundärantikörper und waschen Sie die Zellen mit einer feinen Pinzette. Entfernen Sie die Deckgläser von den Vertiefungen und trocknen Sie überschüssiges TBS mit einem Taschentuch ab. Abschließend die Deckgläser mit Eindeckmedium aufkleben und mit Nagellack versiegeln.

Um das SIM-Imaging zu starten, schalten Sie den 488-Nanometer-Laser, die Quecksilberlampe, den Tischregler, den Pizo-Controller und die Halogenlampe für das Durchlicht ein. Starten Sie die SIM-Software im und oder für den NSIM-Modus. Nachdem Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Objektiv gegeben haben, überprüfen Sie, ob sich keine Luftblasen im Öltropfen befinden.

Legen Sie das Deckglas mit den Hippocampus-Neuronen auf den Mikroskoptisch. Bewegen Sie das Objektiv nach oben, bis das Öl die Probe berührt. Denken Sie daran, während des Aufnahmevorgangs eine Abdeckung über den Tisch zu legen, um die Probe vor Umgebungslicht zu schützen und das Licht im Raum so weit wie möglich zu dimmen.

Wählen Sie in der SIM-Software die optische Konfiguration IFI und wählen Sie einen leeren Filterblock für die visuelle Inspektion mit Weißlichteinstellung für den Probenfokus aus. Schalten Sie anschließend das weiße Licht aus und schalten Sie die Quecksilberlampe ein. Öffnen Sie den Verschluss und wählen Sie den grünen Filter, um nach einem ausreichend hellen Dendriten zu suchen.

Wenn du auf einen ausreichend hellen Dendriten von Interesse triffst und ein interessantes Segment im Sichtfeld zentrierst, schließe den Verschluss. Stellen Sie die Software auf die optische Konfiguration 3D SIM 4 88 und die Kameraeinstellungen wie folgt ein. Stellen Sie den Auslesemodus auf em ein.

Gain ein Megahertz 16 Bit. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 Millisekunden ein. Stellen Sie die Laserleistung auf 5 % einStellen Sie die EM-Verstärkung auf 200 ein.

Wenn die Fokussiergeschwindigkeit auf extra fein eingestellt ist, fokussieren Sie auf das Objekt von Interesse. Passen Sie die Kameraeinstellungen schnell wie folgt an. Um einen Intensitätswert zwischen 30, 040 und 5.000 zu erhalten, stellen Sie die Laserleistung auf 0 % bis 20 % ein. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 50 Millisekunden bis zwei Sekunden ein.

Stellen Sie den Auslesemodus auf em ein. Gain ein Megahertz 16 Bit. Stellen Sie die EM-Verstärkung auf null bis 300 ein.

Stellen Sie die Konvertierungsverstärkung auf eins x bis 5,1 x ein. Stellen Sie das Format für live auf kein Benning ein. Legen Sie das Format für die Erfassung auf kein Benning fest.

Konfigurieren Sie als Nächstes die Einstellungen der drei DZ-Stacks im ND-Sequenzfenster wie folgt, und stellen Sie den Bereich auf zwei Mikrometer ein. Stellen Sie die Schrittweite auf 120 Nanometer ein und klicken Sie auf die Ausgangsposition. Wählen Sie dann im Lambda-Bereich die optische Konfiguration, 3D SIM 4 88, aus.

Nachdem Sie 3D-SIM als Aufnahmemodus ausgewählt haben, führen Sie die ND-Sequenzerfassung durch und speichern Sie die Rohdaten Dendriten und dendritische Dornen, die mit konfokaler und sim-Mikroskopie abgebildet wurden. Die Aufnahmen wurden aus konfokalen und SIM-Bildern rekonstruiert. Dendriten wurden verfolgt und die Stacheln wurden automatisch mit der Software klassifiziert, nachdem Hauptparameter wie Halslänge, Halsdurchmesser und Kopfdurchmesser angepasst wurden.

Die eingerahmten Bereiche zeigen einen einzelnen dendritischen Dorn, der mit Konfokal- und Sim-Mikroskopie abgebildet und aus den entsprechenden Z-Stapeln rekonstruiert wurde, was Unterschiede in der Auflösung und Genauigkeit der resultierenden 3D-Rekonstruktionen zeigt. Laut SIM ergab eine höhere Auflösung, quantitative Analyse des Kopf- und Halsdurchmessers, dass die SIM-Mikroskopie für dieselben dendritischen Dornen signifikant kleinere Abmessungen misst als die konfokale Mikroskopie, was darauf hindeutet, dass SIM in der Lage ist, kleinere Veränderungen in der Morphologie der dendritischen Wirbelsäule zu erkennen. Während dieser Prozedur ist es wichtig, daran zu denken, Rohbilder von hoher Qualität zu erhalten, um eine validere spätere Rekonstruktion desselben Bildes zu ermöglichen.

Die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie kann auch für die Bildgebung lebender Zellen effektiv sein und ermöglicht die Untersuchung der Dynamik von Zellen wie Hela-Zellen, Neuronen oder E-Coli-Bakterien. Nachdem man sich dieses Video angesehen hat, sollte man ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Standarderklärungen von primären Hippocampus-Neuronen in einer Superauflösung vorbereitet, visualisiert und darstellt.