Einrichten einer

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein hoch reproduzierbares in-vitro-Modell der Blut-Hirn-Schranke der Ratte aufzubauen. Dies wird erreicht, indem unter einem Stereomikroskop die Sehnerven, das Kleinhirn und die Hirnhäute entfernt, anschließend die beiden Großhirnhemisphären voneinander getrennt und präpariert werden, um ein sauberes Stück Kortex zu erhalten. Der zweite Schritt besteht darin, die Mikrogefäße aus dem Kortex durch enzymatische Behandlung und dichteabhängige Zentrifugation zu isolieren.

Anschließend werden die Mikrogefäße ausplattiert und mit Puromycin inkubiert, um die Endothelzellen von kontaminierenden Zellen wie Parasiten zu reinigen. Reine Kulturen von Gehirn-Endothelzellen proliferieren, bis die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen. Der letzte Schritt besteht darin, die Differenzierung der Ratten-Gehirn-Endothelzellen zu induzieren, indem die Zellen in der oberen Kammer der Insert-Filter kultiviert und mit zuvor vorbereiteten und ausplattierten Ratten-Astrozyten kokoziert werden.

Letztlich kann die differenzierte monolayerartige Schicht von Gehirnendothelzellen durch den Nachweis spezifischer Tight-Junction-Proteine sowie durch den Permeabilitätsindex einer Referenzverbindung charakterisiert werden, der die Endothelzellschicht von der oberen Kammer aus durchdringt. In-vitro-BBB-Modelle wie das hier vorgestellte sind nützlich, um die zelluläre Verteilung zentraler Moleküle zu untersuchen und grundlegende zelluläre und molekulare Mechanismen der BBB-Funktion aufzuklären. Insbesondere ermöglichen solche Modelle die Untersuchung von BBB-Rezeptoren und deren Beteiligung an Endozytose, Vesikeltransport und Transzytose in unseren Händen.

Die in-vitro-BBB-Modelle werden hauptsächlich verwendet, um die gezielte Ansteuerung spezifischer Rezeptoren mit von uns entwickelten Peptidvektoren zu untersuchen. Um die Arzneimittelverabreichung ins zentrale Nervensystem über die Blut-Hirn-Schranke zu erleichtern, nutzen wir ein Verfahren, das als rezeptorvermittelte Transzytose bekannt ist, auch als Trojanisches-Pferd-Ansatz bezeichnet. Eine visuelle Beschreibung ist entscheidend, da Personen, die neu in dieser Methode sind, über Dissektionsfähigkeiten verfügen müssen und ein Mikroskop benötigen, um während des Zellproduktionsprozesses schnell und präzise genug zu sein, um das Überleben des Gewebes sicherzustellen.

Ein weiterer kritischer Punkt ist ein vorzeitiges Beenden der fragilen und der Tele-Salmon-Area, um eine Öffnung der Barriere während der Experimente zu vermeiden. Schließlich wird diese Idee Details entlang des Protokolls aufzeigen, die den Unterschied zwischen roten und visualisierten Protokollen ausmachen, wobei die Durchführung der Prozedur durch mich und meinen Kollegen demonstriert wird. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie zwei T-75-Flaschen mit Kollagen Typ vier und Fibronectin bei einem Mikrogramm pro Quadratzentimeter in steriler Kulturflüssigkeit beschichten und sie im Inkubator bei 37 Grad Celsius haften lassen, bis die Besiedlung der Mikrogefäße erfolgt.

Zwei Tage später das Gehirn aus dem Schädel von drei fünf Wochen alten Vista-Ratten entfernen und die Gehirne in eine mit kaltem Dissektionspuffer gefüllte Petrischale überführen, die auf Eis steht. Die Gehirne ohne Kleinhirn und Sehnerven dissezieren. Anschließend jedes Gehirn unter dem Stereomikroskop der Länge nach halbieren, um die beiden Großhirnhemisphären zu trennen.

Führen Sie einen weiteren Schnitt durch, um das Mittelhirn zu entfernen, und übertragen Sie alle vier Gehirne in eine saubere Petrischale auf Eis mit Dissektionspuffer. Übertragen Sie dann ein Vorderhirn in eine neue Petrischale, die mit kaltem Dissektionspuffer gefüllt ist. Halten Sie es mit einer Pinzette fest und lösen Sie vorsichtig die Hirnhäute von den Rändern des Vorderhirns ab.

Danach das Vorderhirn umdrehen und die Hirnhäute vorsichtig entfernen, ohne sie zu zerreißen. Sicherstellen, dass das Vorderhirn vollständig von den Hirnhäuten befreit ist, und den verbleibenden Teil der Sehnerven durchtrennen. Ziel dieses Arbeitsschritts ist es, die Schicht aus weißer Substanz zu entfernen, um eine Cortexschale zu erhalten.

Beginnen Sie damit, das Vorderhirn am Rand zu fixieren und ziehen Sie dann vorsichtig die Pinzette entlang der Oberfläche, wobei darauf geachtet werden muss, die Oberfläche der Großhirnrinde nicht zu beschädigen. Stellen Sie anschließend sicher, dass das Gehirn frei von den Hirnhäuten ist, indem Sie es umdrehen und überprüfen, ob keine Reste der Hirnhäute oder großen Oberflächengefäße vorhanden sind. Danach, beginnend mit der Entnahme der drei Gehirne aus dem Schädel, sollte die gesamte Zeit für die Dissektion zur Gewebeerhaltung und Zellüberlebensfähigkeit nicht länger als zwei Stunden betragen.

Überführen Sie die Hirnrinden von drei Gehirnen in sechs Milliliter kaltes Dissektionspuffer in einem sieben Milliliter-Down-Homogenisator und dissoziieren Sie anschließend die Hirnrinden mit 10 Auf- und Ab-Bewegungen mit dem ersten Stößel mit größerer Spielfreiheit, gefolgt von 10 Auf- und Ab-Bewegungen mit dem zweiten Stößel mit geringerer Spielfreiheit. Danach überführen Sie sechs Milliliter der Suspension in ein neues 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen und spülen den Down-Homogenisator mit 24 Milliliter kaltem Dissektionspuffer aus. Teilen Sie die Suspension auf drei Falcon-Röhrchen auf, um das Äquivalent einer Hirnrinde pro Röhrchen zu erhalten. Anschließend zentrifugieren Sie bei 1000 ×g für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Die Beobachtung des Pellets zeigt einen rosa Farbverlauf, der den Anteil der Mikrogefäße aus den Kortizes darstellt. Entsorgen Sie nun den Überstand und homogenisieren Sie das Pellet aus einem Kortex mit einem Milliliter enzymatischer Lösung, die eine Mischung aus Kollagenasen Dyse, DNA Typ eins und Gentamycin enthält. Stellen Sie die Röhrchen 30 Minuten lang in einen Schüttler bei 37 Grad Celsius.

Anschießend 1 Milliliter des Verdauungsgemischs mit 10 Milliliter 25 % BSA-HBSS ein Mal verdünnt mischen und die Röhrchen vorsichtig verwirbeln, gefolgt von einer Trennung mittels dichteabhängiger Zentrifugation bei 3.600 G über 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der dichteabhängigen Zentrifugation enthält das Pellet die Mikrogefäße, während die obere Scheibe Myelin, Hirnparenchym und verbleibende Mikrogefäße enthält. Die obere Scheibe und den Überstand vorsichtig in saubere 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen überführen.

Achten Sie darauf, das Mikrogefäße-Pellet nicht zu aspirationieren; vorsichtig den Kolben vortexen und die dichteabhängige Zentrifugation während der zweiten Zentrifugation erneut durchführen. Das resultierende Pellet, das die Mikrogefäße enthält, bei vier Grad Celsius aufbewahren. Nach der zweiten dichteabhängigen Zentrifugation die obere Scheibe und die Snat-Mischung vorsichtig entfernen und die resultierenden Pellets, die die Mikrogefäße aus beiden Zentrifugationen enthalten, mit einem Milliliter kaltem HBSS 1 x resuspendieren.

Als Nächstes werden die Mikrogefäße mit 20 Milliliter kaltem HBSS 1× gewaschen und bei 1000 ×g fünf Minuten lang zentrifugiert. Anschließend wird der Überstand dekantiert, wobei darauf zu achten ist, die Mikrogefäße nicht zu verlieren. Das Pellet aus Mikrogefäßen aus einem Cortex wird mit einem Milliliter derselben enzymatischen Lösung homogenisiert, nachdem die Röhrchen vorsichtig verwirbelt wurden.

Digestieren Sie die Mikrogefäße weitere eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einem Schüttler. Danach mischen Sie die digerierten Mikrogefäße aus den drei Kortizes in einem Reagenzglas. Teilen Sie die Mischung erneut auf zwei 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen auf, um die Mikrogefäße zu erhalten, die aus jeweils der Hälfte eines Kortex stammen.

Danach bei 1000 Gs fünf Minuten lang zentrifugieren. Unmittelbar vor dem Ansäen der Mikrogefäße bei Raumtemperatur zwei beschichtete T-75-Flaschen aus dem Inkubator entnehmen und den Überschuss an Beschichtungslösung abpipettieren. Den Überstand verwerfen und das Mikrogefäße-Pellet in einem Milliliter ECM resuspendieren, jedes Gefäß mit ECM auf insgesamt 10 Milliliter auffüllen, angereichert mit vier Mikrogramm pro Milliliter.

Verwenden Sie Pur­my­cin, um den Reinigungsprozess zu starten, und impfen Sie die Mikrogefäße im Kolben aus. Stellen Sie anschließend die Kolben in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO₂, um die Adhäsion der Mikrogefäße an die Kollagen-Fibronectin-Matrix zu ermöglichen, gefolgt vom Reinigungsprozess. 24 Stunden nach der Aussaat der Mikrogefäße waschen Sie den Zelltrümmer mit frischem ECM ab und ersetzen das Kulturmedium durch ECM, das mit vier Mikrogramm pro Milliliter Pur­my­cin ergänzt ist, bis zum fünften Tag im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO₂. 24 Stunden nach der Aussaat der Mikrogefäße beginnen die endothelialen Zellen, auf der Kollagen-Fibronectin-Matrix zu migrieren und sich auszubreiten. Am fünften Tag, um den Reinigungsprozess abzuschließen, waschen Sie den Zelltrümmer mit frischem ECM ab und ersetzen das Kulturmedium durch ECM, das mit zwei Mikrogramm pro Milliliter ergänzt ist.

Puramycin für drei weitere Tage zur Proliferation. Am Tag acht die Zellen waschen und Insulin, Transferrin und Natriumselenit hinzufügen. Bis zum Tag 10 das Kulturmedium so lange ergänzen, bis die Kulturen eine Konfluenz von 90 % erreichen.

Am achten Tag bereiten Sie die Filter von drei 12-Loch-Platten vor, indem Sie sie mit einer Mischung aus Kollagen Typ vier und Fibronectin, jeweils in einer Konzentration von 0,5 Mikrogramm pro Quadratzentimeter in steriler Kulturflüssigkeit, beschichten. Beginnen Sie damit, 1,5 Milliliter sterile Kulturflüssigkeit in die untere Kammer zu geben.

Anschießend 0,5 Milliliter der Mischung in die obere Kammer geben. Die Matrix bei 37 Grad Celsius haften lassen, bis am selben Tag die endothelialen Zellen fünf Tage vor der Einrichtung der Ko-Kultur ausgesät werden. Die Astrozyten aus den Kryoröhrchen bei 37 Grad Celsius auftauen und die Zellen in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen mit 10 Milliliter GCM überführen, zentrifugieren.

Die Suspension bei 120 ×g für acht Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Dann das Astrozyten-Pellet in GCM resuspendieren und mit einer Dichte von 30.000 Zellen pro Quadratzentimeter aufplattieren. Die 12-Loch-Platten am 10. Tag vor der Dissoziation der RBEC mit Trypsin in den Inkubator bei 37 °C, 5 % CO₂ stellen.

Spülen Sie den vorkodierten Filter mit DMM F 12 Medium, füllen Sie die Kammer mit ECM auf und stellen Sie sie am selben Tag bis zur RBEC-Besiedlung wieder in den Inkubator. Waschen Sie die RBEC zweimal mit DPBS ohne Calcium und Magnesium. Geben Sie pro T 75-Flasche vier Milliliter warme Trypsin-EDTA-Lösung bei 37 Grad Celsius genau 30 Sekunden lang zu und entfernen Sie anschließend 3,5 Milliliter der Trypsin-EDTA-Lösung.

Dabei darauf achten, dass die endothelialen Zellen stets von einer Schicht aus Trypsin-EDTA bedeckt sind. Anschließend die Ablösung der Zellen mittels mikroskopischer Beobachtung verfolgen. Sobald die Zellschicht beginnt, sich von der Matrix zu lösen, vorsichtig an den Rand des T-75-Fläschchens klopfen, bis alle Zellen im Suspens.

Geben Sie drei Milliliter ECM in jeden T-75-Flasche und überführen Sie die Flasche in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um durch Spülen des Mediums alle Zellen zu gewinnen.

Lösen Sie die Zellsuspension sehr vorsichtig durch viermaliges Auf- und Abpipettieren mit einer 10-Milliliter-Pipette, die mit einer gelben Spitze ausgestattet ist. Zählen Sie die Zellen in der Suspension und impfen Sie sie am folgenden Tag unverzüglich mit hoher Dichte auf die vorcodierten und vorgefüllten Filter auf. Wechseln Sie das Medium des oberen Kompartiments zweimal, um Zelltrümmer zu entfernen und eine Störung der Zellschicht während des Mediumwechsels zu vermeiden.

Neigen Sie die Platte leicht und nähern Sie sich mit der Aspirationspipette nicht zu stark an, wobei stets etwas Medium über der Zellmonoschicht verbleibt, um eine Austrocknung der Zellmonoschicht während des Mediumwechsels zu vermeiden. Waschen Sie jeweils nur sechs Inserts gleichzeitig. 24 Stunden nach der Aussaat muss die Zellmonoschicht konfluent sein.

Dann am selben Tag, einen Tag vor der Einrichtung der Kokultur, ersetzen Sie am Tag 12 das Kulturmedium der Astrozyten durch 1,5 Milliliter ergänztes Differenzierungsmedium, was als erster Tag der Differenzierung definiert ist. Ersetzen Sie das Kulturmedium der Filter, die die RBEC enthalten, durch Differenzierungsmedium. Danach überführen Sie die RBEC-Filter unter diesen Bedingungen in die Vertiefungen, die die Astrozyten enthalten.

In-vitro-Modelle differenzieren sich und exprimieren junction-assoziierte Proteine innerhalb von drei Tagen, wobei die optimale Differenzierung noch drei weitere Tage anhält. Hier wurde die Zellmonoschicht mit Menton immungefärbt, um eine konfluente monoschichtige Gehirnendothelzellschicht mit nicht überlappenden Morphologien und den typischen spindelförmigen Zellen mit endothelialer Morphologie sowie die Expression von Tight-Junction-Proteinen, darunter ZO-1 und Occludin, sichtbar zu machen. Die Dichtheit der Monoschicht im 12-Well-BBB-Modell wurde durch die Messung des Transports von Lucifer Yellow bewertet.

Die Ergebnisse werden als Permeabilität oder PE in 10 hoch minus drei Zentimetern pro Minute angegeben, und die Barriere gilt als permeabel oder offen, wenn der PE-Wert von LY über 0,6 × 10⁻³ cm/min liegt. In den letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Publikationen und Übersichtsarbeiten Informationen über statische und dynamische in-vitro-BBB-Modelle verschiedener Spezies bereitgestellt. Solche Modelle sind jedoch nach wie vor schwierig zu handhaben, und die Reproduzierbarkeit der Barrierequalität bleibt ein wesentliches Ziel.

Nachdem Wissenschaftler dieses Video angesehen haben, sollten sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein In-vitro-Modell der PBB herstellt und charakterisiert.