Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, microRNAs zu definieren, die Östrogenrezeptoren regulieren können. Dies wird erreicht, indem zunächst die Zellen auf eine maximale Östrogenreaktion durch Kultur vorbereitet werden, um eine optimale Konfluenz und Depletion der östrogenen Aktivität zu erreichen. Der zweite Schritt besteht darin, die transkriptionelle Aktivität der Östrogenrezeptoren durch Behandlung mit Östradiol für die erforderliche Anzahl von Zeitpunkten zu induzieren.

Für Vergleiche sind entsprechende Kontrollen enthalten. Als nächstes wird die RNA, einschließlich der microRNA-Population, extrahiert und in CD NA bekanntes Östrogen reguliert. Die Zielgene werden dann mit QPCR gemessen, um zu bestätigen, dass das Behandlungsprotokoll erfolgreich war.

Der letzte Schritt besteht darin, das genomweite Mikro-RNA-Expressionsmuster mit Hilfe von groß angelegten Screening-Technologien zu bestimmen. Abschließend wird eine konfirmatorische Analyse mittels QPCR durchgeführt. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich Brustkrebs zu beantworten, z. B. ob und wie Östrogen die Mikro-RNA-Expression beeinflusst.

Obwohl diese Methode Einblicke in Brustkrebs geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie andere Krebsarten oder Zelltypen angewendet werden, die entweder den Östrogenrezeptor alpha oder den Bitter exprimieren. Die sieben MC-Zellen, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden fünf Tage vor der Behandlung in einer sterilen Haube vorbereitet. Entfernen Sie das Medium aus dem Kolben T 75 mit einer sterilen Weidepipette, die an ein Vakuum angeschlossen ist.

Waschen Sie die anhaftenden Zellen vorsichtig zweimal mit PBS und lösen Sie die Zellen durch Trypsin. Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler gemäß dem Protokoll des Herstellers. Beschriften Sie sechs 100-Milliliter-Platten und geben Sie 10 Milliliter Medium auf jede Platte.

Plattieren Sie etwa 2 Millionen Zellen pro Platte und verteilen Sie die Zellen durch leichtes Schwenken der Platte. Inkubieren Sie die Zellen 24 bis 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2, bis die Zellen zu etwa 80 % zusammenfließen. Nehmen Sie die Zellen zwei bis vier Tage später aus dem 37 Grad Celsius heißen Inkubator und beobachten Sie unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie zu etwa 80 % zusammenfließen.

Die Zellkonfluenz ist ein wichtiger Faktor, da sie den Zell-zu-Zell-Kontakt und Verhaltensweisen wie die Signalübertragung und Proliferation von Zelle zu Zelle beeinflusst. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und fügen Sie dann das entsprechende Medium mit 5%FBS hinzu, das gefiltert wurde, um östrogene Verbindungen zu entfernen. Mit Dexter beschichtete, mit Holzkohle behandelte FBS oder D-C-C-F-B-S inkubieren die Zellen am folgenden Tag 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und fügen Sie das entsprechende 0,5%ige D-C-C-F-B-S-Medium hinzu und inkubieren Sie die Zellen am Tag der Behandlung für weitere 48 Stunden. Bereiten Sie die Reagenzien für die Zellbehandlung in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen vor. Zuerst werden 30 Milliliter des entsprechenden 0,5%-D-C-C-F-B-S-Mediums zugegeben, gefolgt von drei Mikrolitern einer 0,1 Millimolar E mit zwei Liganden-Stoffwaschzellen zweimal mit PBS.

Achten Sie darauf, so viel PBS wie möglich zu entfernen. Mischen Sie den Inhalt jedes Röhrchens vorsichtig und geben Sie 10 Milliliter zu den Zellen in jeder Platte. Es sollte ein Ligand pro Platte vorhanden sein.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 für einen gewählten Zeitraum zwischen null und 72 Stunden. Tauschen Sie das Medium nach Abschluss der Behandlung für den gewünschten Zeitraum nach Bedarf aus. Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator und bringen Sie sie zu einem Abzug.

Da bei diesem Verfahren eine giftige Guana-Diumthiocyanat-Phenollösung verwendet wird, verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Geben Sie dann ein bis zwei Milliliter Guad-Diumthiocyanat-Phenollösung zu den Zellen in jeder Platte. Es ist sicherzustellen, dass das Volumen der Zellen nicht mehr als 10 % des Volumens der Guad-Diumthiocyanat-Phenollösung beträgt und dass die Platte mit der Lösung bedeckt ist.

Lassen Sie die Zellen eine Minute lang ruhen. Verwenden Sie anschließend einen Gummischaber, um die Zellen abzukratzen, und geben Sie die Zellen in eine Mikrozentrifuge. Röhrenzellen können in dieser Lösung bei minus 80 Grad Celsius wochenlang gelagert werden.

Die Extraktion von RNA von hoher Qualität ist für den Erfolg dieses Verfahrens sehr wichtig. Daher müssen die weiteren Schritte unter RNA durchgeführt werden. Freie Bedingungen Um die Gesamt-RNA aus jeder Behandlung zu extrahieren, wirbeln Sie eine Zellmischung für eine Minute und drehen Sie sich schnell.

200 Mikroliter Chloroform pro Milliliter Guad-Diumthiocyanat-Phenollösung zugeben. 15 Sekunden lang vortexen und zwei bis drei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, bei 11.000 U/min und 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Die obere wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen.

Fügen Sie 1,5 Volumen 100%iges Ethanol hinzu und mischen Sie es durch Pipettieren. Übertragen Sie die Lösung in eine Spin-Säule und reinigen Sie die RNA durch Mikro-RNA-Spin-Säulen-Aufreinigung, gefolgt von der 1D-NA-Degradation von DN a gemäß dem Protokoll des Herstellers. Anschließend wird die RNA in 60 Mikrolitern RNAs, freiem Wasseraliquot, ein bis zwei Mikrolitern RNA zur Quantifizierung und Qualitätsanalyse angedeutet und der Rest der RNA bei minus 80 Grad Celsius gelagert.

Nach der Bestätigung, dass die Behandlung von Zellen zu einer Regulierung bekannter östrogenresponsiver Ziele wie mRNA führte, wird die Mikro-RNA-Profilierung sowohl mit dem Micropower Flow Microfluidik, Microarrays als auch mit doppelt markierten Sonden, Arrays mit niedriger Dichte oder D-L-P-L-D-A durchgeführt, um ein Mikro-RNA-Profiling mit D-L-P-L-D-A durchzuführen, nehmen Sie die D-L-P-L-D-A-Platten aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie bei Raumtemperatur ruhen, während die reverse Transkriptionsreaktion zur Erzeugung von CDNA aus den RNA-Proben ausgeführt wird. Wenn die D-L-P-L-D-A-Platten die Raumtemperatur erreicht haben, werden 100 Mikroliter CDNA mit den Dual-Label-Sonden gemischt. PCR-Mastermix in jede der acht Füllöffnungen einer Platte.

Zentrifugieren Sie die Array-Platten. Öffnen Sie kurz das Q-R-T-P-C-R-System, und überprüfen Sie, ob der Block für eine 384-Well-Platte bestimmt ist. Richten Sie den Lauf ein.

Wählen Sie mit der SDS-Software die relative Quantifizierung aus. Wählen Sie die Well-Nummer und den Array-Typ aus, und geben Sie Beispielbeschreibungen ein, um die Wells zu definieren. Führen Sie das Array unter den standardmäßigen Bedingungen für thermische Zyklen aus.

Wenn der Lauf abgeschlossen ist, speichern Sie die Ergebnisse, exportieren Sie die Ergebnisse nach Microsoft Excel, und speichern Sie sie für weitere Analysen. Eine Methode, um die Regulation der microRNA zu bestätigen, ist die Cyanid-D-Q-P-C-R-Analyse. Der erste Schritt besteht darin, Primer zu entwerfen, bei denen die Sequenz der reifen microRNA, die dem Forward-Primer entspricht, aus bloßem based.org gewonnen werden kann.

Konvertieren Sie dann alle UES in ts, bereiten Sie die CD NA vor, legen Sie ein Mikrogramm Gesamt-RNA und ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen auf. Fügen Sie eine Negativkontrolle mit Wasser anstelle von Gesamt-RNA hinzu. Befolgen Sie die Anweisungen für Poly-A-Tailing und erste Strang-CD-nna.

Synthese von microRNA aus einer Mikro-RNA, Erststrang-cDNA-Synthese und Q-R-T-P-C-R-Protokoll. Die resultierende CD NA eins bis 10 mit gereinigtem Wasser verdünnen und bei minus 20 Grad Celsius lagern. Es wird eine Reaktionsplatte mit 1 96-Well-Platte erhalten.

Bereiten Sie den A-Q-P-C-R-Mastermix vor. Für jeden Mikro-R-N-A-Q-P-C-R-Master fügen Sie jeweils zwei PicaMole des spezifischen Forward-Primers und des Universal-Primers hinzu. Fünf Mikroliter zwei X-Q-P-C-R Mastermix und gereinigtes Wasser.

Aliquotieren Sie die Mischung in jeden. Nun, zum Schluss fügen Sie 16 Nanogramm Poly a CD NA für jede Probe hinzu und fügen Sie Negativkontrollen hinzu. Das endgültige Reaktionsvolumen sollte 10 Mikroliter pro Vertiefung betragen. Stellen Sie sicher, dass für jede Probe, für jede Mikro-RNA sowohl für technische Replikate als auch für Negativkontrollen dreifache Vertiefungen vorhanden sind.

Darüber hinaus müssen ein oder mehrere Referenzgene enthalten sein, in der Regel U sechs s nrp, RNA und/oder eine microRNA, die auf der Q-R-T-P-C-R-Systemsoftware nicht verändert wird. Reporter und Ziel zuordnen Geben Sie das Reaktionsvolumen ein. Wählen Sie die Methode des vergleichenden Schwellenwertzyklus aus und definieren Sie die Probenvertiefungen.

Laufplatten mit den Standardeinstellungen für den Lauf. Stellen Sie sicher, dass am Ende des Laufs für alle Cyan-Düsenläufe eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt wird. Speichern Sie die Ergebnisse und exportieren Sie alle Daten, einschließlich der CT-Werte, nach Microsoft Excel.

Die effiziente Extraktion von qualitativ hochwertiger RNA aus den Proben ist ein wichtiger Faktor für den Erfolg dieser Studie. Nach der Extraktion werden die RNA-Konzentrationen mit einem Spektralphotometer gemessen, wie in diesem repräsentativen Ergebnis gezeigt. Jeder Peak, der in der oberen Abbildung dargestellt ist, stellt eine Probe und einen erfolgreichen Extraktionsprozess dar, der reine RNA ergibt.

Im Gegensatz dazu zeigt eine schlecht extrahierte RNA, die in der unteren Abbildung dargestellt ist, keinen klaren Absorptionspeak bei 260 Nanometern. Für die RNA-Qualitätskontrolle wurde die RNA-Integrität gemessen und die Ergebnisse mit einer RNA-Leiter verglichen. Die 18 s und 28 S-R-R-N-A sollten Peaks in einer qualitativ hochwertigen RNA-Probe aufweisen, wie hier gezeigt.

Eine degradierte RNA-Probe hätte weniger klare Peaks und eine reduzierte relative Menge der 18 s und 28 S-R-R-N-A, wie hier gezeigt. Die Analyse der Mikro-NA-Population kann separat durchgeführt werden. Die Ergebnisse des micro RNA Microarrays aus einem Vergleich zwischen Vehikel und E zwei behandelten Proben werden durch diese Heatmap grafisch dargestellt.

Bloßes a, bloßes B und bloßes C werden in den beiden behandelten Proben von E hochreguliert, wie in rot dargestellt, während nur D, nur e, bloßes F und bloßes G in den beiden behandelten Proben von E herunterreguliert werden, wie in grün dargestellt. Die Auswahl der Mikro-RNA hängt von ihrer Bedeutung und Expression ab. Ein P-Wert von weniger als 0,05 wird in der Regel als signifikant angesehen und sollte für die weitere Validierung mit QPCR ausgewählt werden.

Die doppelt markierten Sonden mit niedriger Dichte verwenden eine A-Q-P-C-R-basierte Methode, um nach regulierten microRNAs zu suchen. In einem 384-Well-Format sind hier Amplifikationsplots für microRNA aus dem D-L-P-L-D-A-Format dargestellt. Die Amplifikation exprimierter microRNAs wird durch steigende RN-Werte angezeigt.

Validierungen können mit zwei QPCR-Nachweismethoden durchgeführt werden, um eine Verzerrung der Methode zu verhindern und eine gründliche Bestätigung und Untersuchung der Mikro-NA-Regulierungen zu ermöglichen. Die erste Methode nutzt die Detektion von Cyanidfarbstoffen, um die Schmelzkurve einer microRNA als Kontrolle für die Amplifikation zu analysieren. Spezifität. Die Amplifikation des beabsichtigten Fragments führt zu einem klar definierten, gleichmäßigen Peak, wie im linken Feld gezeigt.

Mehrere Peaks würden beobachtet, wenn der Primer unspezifisch ist oder wenn bestimmte Mengen an Primer-Dimer gebildet werden, wie in der rechten Abbildung dargestellt. In diesem Fall können die Daten nicht für die Expressionsanalyse verwendet werden. Die zweite Methode, die doppelt markierte Sonden, QPCR-Analyse, ist spezifischer, da nur die Amplifikation der Ziel-Mikro-RNA in den Amplifikationsplots jedes Ziels nachgewiesen wird.

Micro-RNA kann beobachtet werden, wie hier für beide QPCR-Assays gezeigt. Ein Vergleich mit einem Referenzgen ist erforderlich, um die relative Expression von Genen zwischen zwei Proben zu bestimmen. Ein Beispiel für ein geeignetes Referenzgen in diesen Brustkrebszelllinien ist der A-R-H-G-D-I-A-A-A RO GDP-Dissoziationshemmer.

Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, ändert sich der mRNA-Spiegel von A-R-H-G-D-I-A zwischen dem Vehikel und den mit Liganden behandelten Proben nicht. Ein Referenzgen, das für die Mikro-RNA-Analyse weithin akzeptiert ist, ist U six snrp, RNA. Die etwa 110 Nukleotide lange, nicht-kodierende kleine nukleäre RNA, die im nukleären Prem funktioniert.

Ein Spleißen, wie in dieser Abbildung U sechs Expressionsniveaus sind in den gezeigten Proben ungefähr gleich, was Berechnungen der variablen Niveaus der microRNA ermöglicht. Diese letzte Abbildung zeigt eine grafische Darstellung der Mikro-R-N-A-Q-P-C-R-Ergebnisse von zwei behandelten Zellen des Vehikels und der E zwei behandelten Zellen, wobei die relativen Expressionsniveaus einer spezifischen Mikro-RNA von nur 135 A über einen Zeitverlauf verglichen werden. Diese microRNA wurde bis zu 24 Stunden nach der Behandlung mit E zwei als nicht reguliert nachgewiesen, aber 72 Stunden nach der Behandlung wurde nach diesem Verfahren eine signifikante Regulation festgestellt.

Andere Methoden, wie z.B. die Chromatin-Immunpräzipitation des SDR-N-Rezeptors, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z.B. ob die microRNA direkt vom Rezeptor durch Bindung an CIS-regulatorische Chromatinregionen reguliert wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Östrogen-vermittelte Regulation von microRNAs auf robuste Weise analysieren können. Es ist sehr wichtig, die verschiedenen Kontrollen und die Replikation der Schritte, wie in diesem Protokoll beschrieben, durchzuführen, um sicherzustellen, dass Sie echte Vorschriften und keine biologischen oder technischen Variationen erkennen.