Sequentiell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Migration, Proliferation und Differenzierung endogener osteogener Stamm- und Vorläuferzellen bei der Knochenbruchheilung schrittweise zu verfolgen und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Mixovirus, Influenza-Virus-Resistenz, eins oder MX1-positive Zellen in vivo durch Injektion von Polyzytosin-Polyuridylsäure markiert werden, gefolgt von der Eliminierung der residenten MX1-positiven hämatopoetischen Zellen mittels Bestrahlung. Im zweiten Schritt werden wildtypische Knochenmarkzellen systemisch den bestrahlten Mäusen verabreicht.

Anschließend werden durch Nadelbohren im Cal-Bereich der Maus Mikrofrakturen erzeugt. Schließlich erfolgt die sequenzielle intravitale Bildgebung der Mikrofrakturheilung. Letztendlich können diese intravitale Aufnahmen zur Beurteilung der Dynamik des osteogenen Stamm- und Vorläuferzellzuflusses und deren Expansion in die Frakturbereiche genutzt werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht also darin, dass sie die wiederholte in-vivo-Bildgebung osteogener Stamm- und Vorläuferzellen während des Knochenheilungsprozesses ermöglicht. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Therapie der Knochenheilung und der Osteoporose hinein, da sie ein neues Instrument zur Überwachung endogener osteogener Stamm- und Vorläuferzellen bei der Knochenregeneration und -reparatur bietet.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Erzeugung der Mikrofraktur mit minimalem Gewebeschaden sowie die wiederholte in-vivo-Bildgebung der Frakturverletzung, ohne eine schwere Narbenbildung auszulösen, für die Methode wichtig und technisch anspruchsvoll sind. Um MX1-positive Zellen in vivo zu markieren, injizieren Sie zunächst alle zwei Tage über einen Zeitraum von 10 Tagen je 200 µL polyaktisches Polycytilsäure pro 20 g Körpergewicht in einen MX1-Cre-Reporter-Maus intraperitoneal. Danach bestrahlen Sie die injizierten Mäuse mit einer Einzeldosis von 9,5 Gy, um die residenten MX1-positiven hämatopoetischen Zellen zu eliminieren. Transplantieren Sie 24 Stunden später je 1 × 10⁶ Wildtyp-Knochenmarkzellen pro Maus intravenös.

Vier bis sechs Wochen später das Maus unter intraperitonealer Injektion von 50 Mikroliter Ketamin-Xylazin narkotisieren. Nachdem die Sedierung durch Zehenquetschung bestätigt wurde, das Kopfhaar des Maus, das mit Knochenmarkzellen transplantiert wurde, abschneiden und die freigelegte Haut mit einem 70 %igen Alkoholtupfer desinfizieren. Augengel auftragen, um eine Hornhautaustrocknung zu verhindern, und anschließend einen quer verlaufenden Schnitt von weniger als einem Zentimeter Länge über die Kopfhaut führen, beginnend an einem Ohr und endend am anderen. Danach das Tier um etwa 60 Grad drehen und den Schnitt mit einer Pinzette fortführen, bis er etwa zwei bis drei Millimeter vor der Nase endet.

Ziehen Sie die Gewebefalte in Richtung der Tierseiten, um die Haut zu lösen; nun sollten beide Frontalbeine sowie der Schnittpunkt der sagittalen und koronalen Nähte deutlich sichtbar sein. Spülen Sie die offene Fläche mit steriler PBS-Lösung ab und entfernen Sie vorsichtig die restlichen Haare mit Wattestäbchen. Um anschließend Mikrofrakturen am Schädel zu erzeugen, halten Sie den Mäusekopf mit einer Hand fest und führen mit der anderen Hand eine Nadel der Größe 30 gauge.

Verwenden Sie die Nadelspitze mit 30 Gauge, um vorsichtig eine mikroskopisch kleine Perforation auf einer Seite der Frontalbeine nahe dem Schnittpunkt der sagittalen und koronalen Nähte anzulegen. Um eine Durchdringung des Gehirns zu vermeiden, wechseln Sie zu einer größeren Nadelstärke und drehen die neue Nadel, um die Perforationsöffnung auf etwa 0,5 Millimeter Durchmesser zu erweitern. Nachdem eine zweite Perforation am kontralateralen Frontalbein angelegt wurde, tropfen Sie kontinuierlich PBS auf jede Stelle und wischen, bis die Blutung gestoppt ist.

Danach, um Austrocknung zu vermeiden, einen ausreichend großen Tropfen sterile physiologische Kochsalzlösung auf den Schädel geben, um die Fläche vollständig zu bedecken, an der die Vidal-Bilder aufgenommen werden sollen. Zuerst den auf Polygonen basierenden Laserscanner einschalten, um eine simultane Mehrkanal-Bildaufnahme mit einer Bildrate von 30 Bildern pro Sekunde zu ermöglichen. Anschließend den Femtosekunden-Titansaphir-Laser für die Multiphoton-Bildgebung einschalten.

Stellen Sie die Leistung und Wellenlänge auf 880 Nanometer für die zweite harmonische Erzeugungsbildgebung des Schädeldaches und auf 440 Nanometer für die GFP- und TD-Tomato-Anregung ein, schalten Sie die Festkörperlaser bei 491 Nanometer und 561 Nanometer ein. Schalten Sie anschließend die Photomultiplier-Röhren-Detektoren für jedes Signal ein: einen Bandpassfilter mit 435 ± 20 Nanometer für die zweite harmonische Erzeugung, einen Bandpassfilter mit 528 ± 19 Nanometer für GFP und einen Bandpassfilter mit 590 ± 20 Nanometer für TD-Tomato. Platzieren Sie nun das Tier auf einer motorisierten Mikroskopstufe mit XYZ-Achsen auf einer elektrischen Heizplatte, die auf 37 Grad Celsius eingestellt ist.

Verwenden Sie Klebeband, um die Maus in Position zu halten, und geben Sie dann einen Tropfen des warmen, auf 2 % Methylcellulose basierenden Gels auf den Schädel. Um Austrocknung zu vermeiden, platzieren Sie ein Deckglas über dem Bildgebungsareal. Verwenden Sie anschließend ein 30×-Wasserimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,9 sowie die XY- und Z-Achsen-Steuerung, um das SHG-Signal aus dem Knochengewebe zu detektieren.

Um die Oberfläche des Schädels zu finden, identifizieren Sie eine wichtige markante Stelle, beispielsweise den Schnittpunkt zwischen den sagittalen und den koronalen Nähten, und nehmen Sie ein Bild auf. Markieren Sie die XY-, Z-Koordinaten der markanten Stelle und suchen Sie anschließend mithilfe der SHG- und Fluoreszenzsignale als Orientierungshilfe nach der Verletzungsstelle. Sobald jeder interessierende Bereich gefunden ist, nehmen Sie ein Bild der besten Fokusebene auf, die die SHG- und Fluoreszenzsignale der interessierenden Zellen enthält.

Speichern Sie die XY- und Z-Koordinaten sowie den Abstand zum Schnittpunkt der Sagittal- und Koronalsymphyse, um deren präzise Lage für die nächste Runde der Bildgebung zu definieren. Anschließend werden 3D-zelluläre und Knochenstrukturen der Frakturverletzung erfasst. Aufnahmen in Z-Stapelintervallen von etwa zwei bis fünf Mikrometern mit einer Tiefe von etwa 100 Mikrometern von der Endoknochenoberfläche aus aufzeichnen.

Entfernen Sie abschließend nach der Bildgebung beider Verletzungsstellen mit mehreren Tropfen steriler Kochsalzlösung das 2 %ige Methylcellulose-Gel vom Schädel. Bestreichen Sie die Oberfläche anschließend mit Antibiotika, bedecken Sie den Schädel mit den Hautlappen, nähen Sie die Kopfhaut mit einer hypoallergenen Nahtfadenart wieder zu und halten Sie das Tier in einer warmen Rekonvaleszenzkammer, bis es ausreichend bei Bewusstsein ist. Wiederholen Sie nach drei bis fünf Tagen die Schritte der intravitale Bildgebung, um die zellulären Veränderungen während der Heilung der Fraktur zu verfolgen.

In diesem repräsentativen Experiment wurden zwei Mikrofrakturen an den Stirnbeinen von genetisch veränderten MX1-Tomato-Osteocalcin-GFP-Mäusen nach Bestrahlung und Knochenmarkersatz erzeugt. Die sequenzielle 3D-intravitale Bildgebung der Mikrofrakturen zeigte eine Rekrutierung der tomato-positiven osteogenen Stamm- und Vorläuferzellen an die Frakturstelle am zweiten Tag sowie deren Expansion am fünften Tag. Obwohl zu diesem Zeitpunkt keine GFP-positiven Osteoblasten nachgewiesen wurden, begann am zwölften Tag eine Teilmenge der osteogenen Vorläuferzellen nahe der Frakturoberfläche, sich in tomato-positive, GFP-positive Osteoblasten zu differenzieren, wie durch den Pfeil angezeigt. Die Anreicherung neuer Osteoblasten und die Bildung neuen Knochens am 21. Tag zeigen, dass die Migration und Proliferation der osteogenen Vorläuferzellen ein wesentlicher Mechanismus zur Versorgung mit neuen Osteoblasten für die Frakturheilung war. Um zu prüfen, ob diese Methode eine konsistente und quantitative Erfassung der Anzahl osteogener Vorläuferzellen während der Frakturheilung ermöglicht, wurden MX1-YFP-positive osteogene Stamm- und Vorläuferzellen über einen Zeitraum von 14 Tagen nach der Verletzung verfolgt.

Kleinere Zahlen von Vorläuferzellen wurden bereits drei Tage nach der Verletzung durchgängig an der Verletzungsstelle nachgewiesen. Die Zellzahlen stiegen kontinuierlich bis zum siebten Tag an und erreichten am zehnten Tag ein Maximum, das bis zum 14. Tag aufrechterhalten wurde. Die Kinetik der Bildung der osteogenen Vorläuferzellen wurde durch die zeitliche Messung der YFP-Signalintensität quantifiziert und mit den mittels intravitalem Mikroskopieren beobachteten Ergebnissen korreliert.

Die Vorläuferzellen wurden erstmals am dritten Tag beobachtet, erreichten am zehnten Tag ein Maximum und blieben bis zum 14. Tag auf einem ähnlich hohen Intensitätsniveau. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass geschickte Nahttechniken und eine möglichst geringe Blutung die Bildung von Narben verringern und die Hintergrund-Autofluoreszenz senken können. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Migration, Proliferation und Differenzierung endogener osteogener Stammvorläuferzellen während des Knochenheilungsprozesses abbildet und verfolgt.