Sequentiell In-vivo- Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Migration, Proliferation und Differenzierung von endogenen osteogenen Stamm- und Vorläuferzellen bei der Knochenbruchreparatur sequentiell zu verfolgen und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das Mixovirus, die Influenzavirusresistenz, eine oder MX eins-positive Zellen in vivo durch Polyzyniker-Polyzytosäure-Injektion markiert und dann die residenten MX eins-positiven hämatopoetischen Zellen durch Bestrahlung eliminiert werden. Im zweiten Schritt werden den bestrahlten Mäusen systematisch Wildtyp-Knochenmarkzellen verabreicht.

Als nächstes werden Mikrofrakturen im Cal-Bereich der Maus durch Nadelbohren erzeugt. Schließlich wird eine sequentielle intraflächige Bildgebung der Mikrofrakturreparatur durchgeführt. Letztendlich können diese Intravitalbilder verwendet werden, um die Dynamik des osteogenen Stamm- und Vorläuferzelleinstroms und der Expansion in die Frakturstellen zu bewerten.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht also darin, dass sie eine in vivo repetitive Bildgebung von osteogenen Stamm- und Vorläuferzellen während des Verlaufs der Frakturheilung ermöglicht. Die Implikation dieser Technik erstreckte sich auf die Therapie der Frakturheilung und der Osteoporose. Denn diese Methode bietet ein neues Werkzeug für die Überwachung endogener osteogener Stammvorläuferzellen bei der Knochenregeneration und -reparatur.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da eine Erzeugung der Mikrofraktur mit minimaler Gewebeschädigung und die wiederholte In-vivo-Bildgebung der Frakturverletzung ohne Induktion einer schweren Narbenbildung wichtig für die Methode und eine technische Herausforderung darstellen. Um MX-One-positive Zellen in vivo zu markieren, injizieren Sie zunächst einmal jeden zweiten Tag 200 Mikroliter polysaure Poly-Cyto-Ilinsäure pro 20 Gramm MX, ein Cree-Reporter-Mausgewicht intraperitoneal für 10 Tage. Um die residenten MX One positiven hämatopoetischen Zellen zu eliminieren, bestrahlen Sie die injizierten Mäuse mit einer Einzeldosis von 9,5 Gras. Transplantieren Sie nach 24 Stunden einmal 10 Mal 10 auf die sechste Wildtyp-Knochenmarkzelle intravenös pro Maus.

Vier bis sechs Wochen später betäuben Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion mit 50 Mikrolitern Ketamin-Xylazin. Nachdem Sie die Sedierung durch Zehenkneifen bestätigt haben, schneiden Sie das Kopfhautpaar der mit Knochenmarkzellen transplantierten Maus ab und sterilisieren Sie dann die exponierte Haut mit einem 70%igen Alkoholtupfer. Tragen Sie Tränengel auf, um eine Austrocknung der Hornhaut zu verhindern, und machen Sie dann einen weniger als einen Zentimeter langen Querschnitt über die Kopfhaut, der an einem Ohr beginnt und am anderen endet. Drehen Sie das Tier dann mit einer Pinzette um etwa 60 Grad und setzen Sie den Schnitt fort, bis er etwa zwei bis drei Millimeter von der Nase entfernt ist.

Ziehen Sie den Gewebelappen in Richtung der Tierseiten, um die Haut zu trennen, sowohl die Stirnknochen als auch der Schnittpunkt der sagittalen und koronalen Nähte sollten nun deutlich freiliegen. Spülen Sie die offene Oberfläche mit sterilem PBS und wischen Sie anschließend die restlichen Haare vorsichtig mit Wattestäbchen ab. Um dann Mikrofrakturen am Kalb zu erzeugen, halten Sie den Mauskopf mit einer Hand und eine 30-Gauge-Nadel mit der anderen.

Bohren Sie mit der 30-Gauge-Nadelspitze vorsichtig eine Mikropunktion auf einer Seite des Stirnknochens in der Nähe des Schnittpunkts zwischen der sagittalen und der koronalen Naht. Um ein Eindringen in das Gehirn zu vermeiden, wechseln Sie zu einem größeren Messgerät und drehen Sie die neue Nadel, um das Einstichloch auf einen Durchmesser von etwa 0,5 Millimetern zu erweitern. Nachdem Sie eine zweite Punktion am kontralateralen Stirnbein erzeugt haben, tropfen Sie kontinuierlich PBS in jede Stelle und wischen Sie es ab, bis die Blutung aufhört.

Um ein Austrocknen zu vermeiden, tragen Sie dann einen ausreichend großen Tropfen steriler physiologischer Kochsalzlösung auf den Schädel auf, um den Bereich für die Aufnahme der Vidal-Bilder vollständig zu bedecken. Schalten Sie zunächst den polygonbasierten Laserscanner ein, um eine gleichzeitige Mehrkanal-Bilderfassung mit einer Videorate von 30 Bildern pro Sekunde zu ermöglichen. Schalten Sie als Nächstes den Femtosekunden-Titan-Saphir-Laser für die Multiphotonen-Bildgebung ein.

Stellen Sie die Leistung und Wellenlänge auf 880 Nanometer für die Abbildung des Schädeldachknochens der zweiten Harmonischen bei 440 Nanometern für die GFP- und TD-Tomatenanregung ein, schalten Sie die Festkörperlaser 491 Nanometer und 561 Nanometer ein. Schalten Sie dann die Photomultiplier-Röhrendetektoren für jedes Signal ein: einen 435-plus- oder -minus-20-Nanometer-Bandpassfilter für die Erzeugung der zweiten Harmonischen, einen 528-plus/minus 19-Nanometer-Bandpassfilter für GFP und einen 590-plus/minus 20-Nanometer-Bandpass für TD-Tomaten. Platzieren Sie nun das Tier auf einem motorisierten Mikroskoptisch der XYZ-Achse auf einem elektrischen Heizkissen, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist.

Halten Sie die Maus mit Klebeband in Position und tragen Sie dann einen Tropfen warmes Gel auf 2%iger Methylcellulosebasis auf den Schädel auf. Um ein Austrocknen zu vermeiden, legen Sie ein Deckglas auf den Bildgebungsbereich. Verwenden Sie dann ein 30-fach-Wasserimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 0,9 und den XY- und Z-Achsen-Controller, um das SHG-Signal von den Knochen zu erfassen.

Um die Oberfläche des Kalbes zu finden, identifizieren Sie eine wichtige Orientierungsstelle, wie z. B. den Schnittpunkt zwischen den sagittalen Nähten und den koronalen Nähten, und nehmen Sie ein Bild auf. Markieren Sie die XY- und Z-Koordinaten des Orientierungspunkts und suchen Sie dann weiter nach der Stelle der Verletzung, indem Sie die SHG- und Fluoreszenzsignale als Anhaltspunkte verwenden. Wenn jede Region von Interesse gefunden ist, nehmen Sie ein Bild der besten Fokusebene auf, die die SHG- und Fluoreszenzsignale der interessierenden Zellen enthält.

Speichern Sie die XY- und Z-Koordinaten und den Abstand zum Schnittpunkt der sagittalen und koronalen Naht, um ihre genaue Position für die nächste Bildgebungsrunde zu definieren. Dann werden 3D-Zell- und Knochenstrukturen der Frakturverletzung gesammelt. Nehmen Sie Bilder in Z-Stapelintervallen von etwa zwei bis fünf Mikrometern mit einer Tiefe von etwa 100 Mikrometern von der Endoknochenoberfläche auf.

Nach der Bildgebung an beiden Verletzungsstellen verwenden Sie schließlich mehrere Tropfen sterile Kochsalzlösung, um das 2%ige Methylcellulosegel aus dem Schädel zu entfernen. Bestreichen Sie nun die Oberfläche mit Antibiotika und bedecken Sie den Schädel mit den Hautlappen, verschließen Sie die Kopfhaut wieder mit hypoallergenem Nahtfaden und halten Sie das Tier in einer warmen Erholungskammer, bis es wieder ausreichend Bewusstsein erlangt hat. Wiederholen Sie nach drei bis fünf Tagen die Intravital-Bildgebungsschritte, um die zelluläre Veränderung während der Heilung der Fraktur zu verfolgen.

In diesem repräsentativen Experiment wurden zwei Mikrofrakturen an den Stirnknochen von genetischem MX-Ein-Tomaten-Osteocalcin, GFP-Mäusen nach Bestrahlung und Knochenmarkersatz erzeugt. Die sequentielle 3D-Intravitalbildgebung der Mikrofrakturen zeigte eine Verlagerung der tomatenpositiven osteogenen Stamm- und Vorläuferzellen innerhalb der Frakturstelle am zweiten Tag. sowie deren Expansion am fünften Tag. Obwohl zu diesem Zeitpunkt keine GFP-positiven Osteoblasten nachgewiesen wurden, initiierte am Tag 12 eine Untergruppe von Osteovorläuferzellen in der Nähe der Frakturoberfläche die Differenzierung von tomatenpositiven GFP-positiven Osteoblasten, wie durch den Pfeil angedeutet, die Akkumulation neuer Osteoblasten und die Neubildung von Knochen an Tag 21 deutet darauf hin, dass die Migration und Proliferation der osteogenen Vorläuferzellen ein wichtiger Mechanismus für die Versorgung mit neuen Osteoblasten für die Heilung der Fraktur war. Um zu testen, ob diese Methode eine konsistente und quantitative Ausgabe der Osteovorläuferzahl während der Frakturheilung liefert, wurden MX one YFP-positive osteogene Stamm- und Vorläuferzellen 14 Tage nach der Verletzung verfolgt.

Eine kleine Anzahl der Vorläuferzellen wurde konsistent an der Verletzungsstelle nach drei Tagen nachgewiesen. Die Zellzahlen stiegen am siebten Tag kontinuierlich an und erreichten am 10. Tag einen Höhepunkt der Population, der nach 14 Tagen anhielt. Die Kinetik der Erzeugung der Osteo-Vorläuferzellen wurde durch Messung der YFP-Signalintensität über die Zeit quantifiziert und mit der intravitalen Mikroskopie korreliert.

Die Vorläuferzellen wurden erstmals am dritten Tag beobachtet, erreichten am 10. Tag ihren Höhepunkt und blieben bis zum 14. Tag in einer ähnlich hohen Intensität. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass geschickte Nahttechniken und minimale Blutungen die Bildung von Narben reduzieren und die Hintergrund-Autofluoreszenz verringern können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Migrationsproliferation und Differenzierung endogener osteogener Stammvorläuferzellen im Prozess der Frakturreparatur abbilden und verfolgen können.