Name: Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als In-vitro- Modell der Stroke (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Erfahren Sie die exzitotoxische Stimulation von Hirn-Mikroslices als In-vitro-Schlaganfallmodell. Diese Methode nutzt reifes Hirngewebe, reduziert Tierversuche und bewahrt neuronale Schaltkreise für zwei Stunden.

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Diese Arbeit wurde durch Forschungsmittel aus dem National Health and Medical Research Council of Australia, der Hunter Medical Research Institute und der University of Newcastle unterstützt.

Alle Vorgänge werden mit Genehmigung durch die Universität von Newcastle Animal Care und Ethik-Kommission sowie in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften, einschließlich der NSW Tierforschungsgesetz, das NSW Tierforschung Verordnung und der australischen Verhaltenskodex für die durchgeführt Pflege und Verwendung von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken. 1. Dissection von Hirngewebe <ol><li> Sacrifice 12 Wochen alte männliche Ratten durch Enthauptung. Ratten können entweder durch atemberaubende und Enthauptung getötet werden, oder es kann zunächst mit Isofluran (5% Induktion, 1,5-2% Wartung) in 70% N 2 und 30% O 2 anästhesiert werden, und dann enthauptet. </li><li> Entfernen das Gehirn aus dem Schädel so schnell wie möglich (im Idealfall sollte dies in weniger als 2 Minuten durchgeführt werden.) </li><li> Entfernen Sie die Rinde von Freihand-Dissektion. Die Präparation ist in kürzester Zeit möglich durchgeführt werden, mit so wenig Schädigung des Gehirns wie möglich, um maintain die Unversehrtheit der Scheiben. </li><li> Um jegliche Rest Haut zu entfernen, Fell, Blut, usw., tauchen das Gehirn in einer kleinen Menge (3-5 ml) von 37 ° C Krebs-Puffer (118 mM Natriumchlorid, 4,7 mM Kaliumchlorid, 1,3 mM Calciumchlorid, 1,2 mM Kaliumdihydrogenphosphat, 1,2 mM Magnesiumsulfat, 25 mM Natriumhydrogencarbonat, 11,7 mM Glucose, 0,03 mM Dinatrium-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), mit 95% Sauerstoff / 5% Kohlendioxid (Carbogen), pH 7,4) äquilibriert. </li></ol> 2. Vorbereitung der Microslices <ol><li> Legen Sie das Gehirn auf der Bühne eines McIlwain Chopper auf der zwei Scheiben aus Filterpapier platziert wurden und in warmen Krebs-Puffer befeuchtet. Halten das Gehirn und das Filterpapier mit warmem Krebs-Puffer benetzt, aber nicht so feucht, dass freie Flüssigkeit auf der Oberfläche des Papiers, die dazu führen kann, um das Gehirn herum gleiten. </li><li> Schneiden Sie das Gehirn in 250 um koronalen Abschnitte. Als Nährstoffe, Sauerstoff und Abfallstoffe thbei normalerweise mit der Blutversorgung mit einem Fluid, die das Gewebe in isolierten Nervengewebe umgibt ausgetauscht ausgetauscht, die Größe der Scheiben nicht mehr als 400 um dick sein, damit eine angemessene Sauerstoffversorgung und Stoffaustausch stattfindet. </li><li> Drehen Sie den McIlwain Stufe 90 °. </li><li> Gehirn in Scheiben schneiden 250 um sagittal. Hier sind diese Gehirnschnitte (250 &amp;mgr; m × 250 &amp;mgr; m Schnitte mit variabler Länge abhängig von der Dicke des Gewebes) werden als microslices bezeichnet. </li><li> Platzieren Sie die microslices in einen Rundrohr mit 10-15 ml 37 ° C Krebs-Puffer (die Menge von Krebs-Puffer wird auf die Menge des Gewebes abhängen). </li></ol> 3. Equilibrierung Microslices <ol><li> Vorsichtig geschwenkt, bis einzelne microslices aufgehängt sind, und es ihnen ermöglichen, unter der Schwerkraft zu begleichen. </li><li> Vorsichtig den Überstand zu entfernen, die trübe durch Zelltrümmer ausgesetzt sein wird, und 10 ml 37 ° C FrischKrebs-Puffer mit dem Rohr. </li><li> Wiederholung dieser Waschprozedur viermal, was bei der Entfernung der meisten Schmutz führt. </li><li> Danach ins Gleichgewicht microslices die bei 37 ° C unter leichtem Schütteln / Inversion, und ändern Sie das Krebs-Puffer alle 15 min für 1 Stunde in total. </li><li> Zu dieser Zeit, 2 ml 37 ° C Frisch Krebs-Puffer, und übertragen 15-20 microslices (150 ul Microslice Suspension) zu flachen Boden 5 ml Polystyrolröhrchen mit einem extra breiten Bohrung Pipettenspitze mit geglätteten Kanten (die erstellt werden können Schneid ~ 2 mm von dem Ende einer P1000 Tipp). Spread die microslices gleichmäßig über den Boden des Rohres in einer einzelnen Schicht, so dass jedes Microslice nicht weiter als einige wenige Millimeter von der mit Sauerstoff angereicherten Atmosphäre. </li></ol> 4. Exzitotoxische Stimulation <ol><li> Die microslices Bei 37 ° C und ständig passieren über die Oberfläche des 150 ul Microslice Suspension CARBOGEN, mit einer Gasleitung, die Positioned gerade über die Oberfläche des Microslice-Suspension (in mechanische Störung zu vermeiden). </li><li> Gönnen microslices entweder mit 150 ul 5 mM Glutamat + 100 uM Glycin in Krebs-Puffer (exzitotoxische Reiz: Endkonzentration 2,5 mM Glutamat + 50 uM Glycin) oder 150 ul Krebs allein Puffer (Kontrolle nicht stimulierten). Eine Vielzahl von Stimuli können in diesem Schritt verwendet werden (einschließlich, aber nicht beschränkt auf, AMPA-, NMDA + Glycin, KCl-Depolarisation und Sauerstoff / Glucose-Entzug). </li><li> Entfernen Sie die Inkubationslösung zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation (0, 30, 60, 90, 120 und 300 Sekunden), und ersetzen Sie es mit 300 ul eiskaltem Homogenisierung Puffer (30 mM Tris, pH 7,4, 1 mM Ethylenglycol tetraessigsäure, 4 mM EDTA, 100 &amp;mgr; M Ammoniummolybdat, 5 mM Natriumpyrophosphat, 25 mM Natriumfluorid, 1 mM Natriumorthovanadat, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride vollständige Proteaseinhibitor-Cocktail). </li><li> Homogenisieren microslices auf Eis, mit einem Glas-Teflon-Homogenisator Dounce(20 Schläge, 700 rpm). </li><li> Speicher Homogenate bei -80 ° C, und verschiedene Signalmoleküle, Tod Moleküle usw. können durch Western-Blot gemessen werden. </li></ol>

<ol><li>Lo, E. H., Dalkara, T., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms%2C+challenges+and+opportunities+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms, challenges and opportunities in stroke.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 399-415 (2003).</li>
<li>Wang, Y., Qin, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+mechanisms+of+excitotoxic+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death.</a> Apoptosis. 15, 1382-1402 (2010).</li>
<li>Vogt Weisenhorn, D. M., Roback, L. J., Kwon, J. H., Wainer, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cAMP%2FPKA+and+MAPK+signaling+in+neuronal+cells+is+dependent+on+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Coupling of cAMP/PKA and MAPK signaling in neuronal cells is dependent on developmental stage.</a> Exp. Neurol. 169 (1), 44-55 (2001).</li>
<li>Kharlamov, E., Cagnoli, C. M., Atabay, C., Ikonomovic, S., Grayson, D. R., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+effect+of+protein+synthesis+inhibitors+on+potassium+deficiency-induced+apoptotic+cell+death+in+immature+and+mature+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Opposite effect of protein synthesis inhibitors on potassium deficiency-induced apoptotic cell death in immature and mature neuronal cultures.</a> J. Neurochem. 65 (3), 1395-1398 (1995).</li>
<li>Kristensen, B. W., Noraberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+excitotoxic+profiles+of+ATPA%2C+AMPA%2C+KA+and+NMDA+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of excitotoxic profiles of ATPA, AMPA, KA and NMDA in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Brain Res. 917 (1), 21-44 (2001).</li>
<li>Lecrux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneously+hypertensive+rats+are+highly+vulnerable+to+AMPA-induced+brain+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Spontaneously hypertensive rats are highly vulnerable to AMPA-induced brain lesions.</a> Stroke. 38, 3007-3015 (2007).</li>
<li>Sattler, R., Charlton, M. P., Hafner, M., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+influx+pathways%2C+not+calcium+load%2C+determine+neuronal+vulnerability+to+calcium+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Distinct influx pathways, not calcium load, determine neuronal vulnerability to calcium neurotoxicity.</a> J. Neurochem. 71, 2349-2364 (1998).</li>
<li>Morrison, B. 3rd, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+central+nervous+system+models+of+mechanically+induced+trauma%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">In vitro central nervous system models of mechanically induced trauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15, 911-928 (1998).</li>
<li>McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Neurochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Practical Neurochemistry.</a> , Churchill Livingstone. London. (1975).</li>
<li>Skelding, K. A., Spratt, N. J., Fluechter, L., Dickson, P. W., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha+CaMKII+is+differentially+regulated+in+brain+regions+that+exhibit+differing+sensitivities+to+ischemia+and+excitotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">alpha CaMKII is differentially regulated in brain regions that exhibit differing sensitivities to ischemia and excitotoxicity.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (12), 2181-2192 (2012).</li>
<li>Kavanagh, J. M., Dodd, P. R., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3H%5DMK-801+binding+in+immature+and+mature+chicken+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">3H]MK-801 binding in immature and mature chicken forebrain.</a> Neurosci. Lett. 134 (1), 83-87 (1991).</li>
<li>Kavanagh, J. M., Bunn, S. J., Boyd, T. L., Rostas, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+glutamate+receptor+stimulated+inositol+phospholipid+metabolism+and+45Ca%282%2B%29-accumulation+in+posthatch+chicken+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in glutamate receptor stimulated inositol phospholipid metabolism and 45Ca(2+)-accumulation in posthatch chicken forebrain.</a> Neurosci. Lett. 194 (3), 161-164 (1995).</li>
<li>Sharps, E. S., McCarl, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+performance+liquid+chromatographic+method+to+measure+32P+incorporation+into+phosphorylated+metabolites+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A high performance liquid chromatographic method to measure 32P incorporation into phosphorylated metabolites in cultured cells.</a> Anal. Biochem. 124, 421-424 (1982).</li>
<li>Bradbury, D. A., Simmons, T. D., Slater, K. J., Crouch, S. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurment+of+the+ADP%3AATP+ratio+in+human+leukaemic+cell+lines+can+be+used+as+an+indicator+of+cell+viability%2C+necrosis+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Measurment of the ADP:ATP ratio in human leukaemic cell lines can be used as an indicator of cell viability, necrosis and apoptosis.</a> J. Immunol. Methods. 240 (1-2), 1-2 (2000).</li>
<li>Rodnight, R., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+tissue+metabolism%3A+3.+Study+of+tissue+fragments+with+little+or+no+added+aqueous+phase%2C+and+in+oils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Techniques in tissue metabolism: 3. Study of tissue fragments with little or no added aqueous phase, and in oils.</a> Biochem. J. 57, 649-661 (1954).</li>
<li>Shelanski, M. L., Gaskin, F., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+assembly+in+the+absence+of+added+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microtubule assembly in the absence of added nucleotides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70 (3), 765-768 (1973).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt in Bezug auf eine der Arbeiten innerhalb dieser Handschrift durchgeführt haben.

Hierin wird ein in vitro-Verfahren zur Erzeugung von microslices, die verwendet werden können, um die molekularen Mechanismen der Exzitotoxizität und Ischämie-vermittelten Zelltod in intakten reifen Hirngewebe beteiligt untersuchen beschrieben. Diese Technik produziert lebensfähiges Gewebe (Abb. 1-3), das ist metabolisch ähnlich größer organotypischen 15 Scheiben. Außerdem diese Microslice-Modell eng entspricht der folgenden vermittelten Exzitotoxizität Hirnverletzungen in vivo</...

Die häufigste Form des Schlaganfalls ist ischämischen Schlaganfall, die, wenn eine zerebrale Blutgefäß wird verschlossenen auftritt. Die Gewebe, die aus Ischämie Aufhören des Blutflusses führt verursacht verbreitet Depolarisation von Membranen, die Freisetzung von exzitatorischen Neurotransmittern und anhaltende Erhöhung von intrazellulärem Calcium, was zu der Aktivierung von Zelltod führt Pfade 1. Dieser Prozess wurde &quot;Exzitotoxizität&quot; bezeichnet, und ist ein gemeinsamer Weg in neuronalen Tod beteiligt durch eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Schlaganfall 2 hergestellt. Die Hemmung der Signalwege in Exzitotoxizität und anderen neuronalen Zelltod Kaskaden ist ein attraktiver Ansatz zur neuronalen Schäden nach Schlaganfall zu begrenzen. Die Ermittlung der genauen molekularen Mechanismen der Exzitotoxizität und ischämischen Schlaganfall beteiligt, kann schwierig sein, wenn Sie ganze Tier-Systeme. Als solche primären embryonalen und &quot;neuronale-like &#39;(zB neuroblastoma und Adenokarzinom immortalisierten Linien) Zellkultursysteme werden oft verwendet. Die Hauptvorteile dieser Modelle sind, dass sie leicht zu handhaben, relativ kostengünstig, und Zelltod kann leicht gemessen und quantifiziert werden. Allerdings kann Signalwege von den Kulturbedingungen verwendet, 3,4, und unreife Nervenzellen verändert und verewigt Linien können verschiedene Rezeptoren exprimieren und Signalmoleküle im Vergleich zu Hirn 5-8 reifen. Weiterhin kultivierten Neuronen erlauben nur die Prüfung von einem Zelltyp (oder zwei, wenn eine Co-Kultur-System verwendet wird), wohingegen intakte Hirngewebe ist heterogen, mit einer Vielzahl von Zelltypen, die miteinander interagieren. Organotypischen Kultursysteme (dünne Explantate des Hirngewebes) eingesetzt, und diese Modelle ermöglichen die Untersuchung von heterogenen Populationen von Zellen, wie sie in vivo gefunden. Jedoch kann nur eine begrenzte Menge an Gewebe von jedem Tier bei der Verwendung dieser Technik erhalten werden, können Scheibennicht so lange wie immortalisierte Zelllinien gezüchtet werden, und mittel-bis langfristige Kultur kann in Veränderungen der Signalwege und Rezeptoren in den Scheiben führt. Während reifen Gehirn kann verwendet werden, um organotypischen Slices erzeugen, sind Scheiben aus unreifen Gehirn empfänglicher für Kultur und sind häufiger eingesetzt. Es besteht daher die Notwendigkeit, die Modelle, die nachahmen oder darstellen intakten reifen Gehirn, die einfach zu bedienen sind, in der neuronalen Signalwege untersucht werden können zu entwickeln. Hierin wird ein in vitro-Technik, die intakte Nervengewebe, die verwendet werden, um die molekularen Mechanismen der Zelltod aufzuklären nach einer exzitatorischen oder ischämischen Insult beschrieben. Diese Technik reduziert die Anzahl der benötigten Tiere, ein Experiment durchzuführen, ist reproduzierbar und erzeugt lebensfähigem Gewebe, die in einer ähnlichen Weise metabolisch größer organotypischen Scheiben verhält. Zusätzlich wird die neuronalen, zellulären Interaktionen und postsynaptischen Zusammenarbeitmpartment bleibt teilweise intakt. Die physiologische Puffer verwendet wird, erlaubt die Zellmembranen zu &quot;reseal &#39;und ermöglicht Zellen zu ihrer ursprünglichen Membranwiderstand 9 erholen. Diese Hirnschnitt-Modell ist in der Lage, getreu nachahmen folgenden vermittelten Exzitotoxizität Hirnverletzungen 10 beobachteten Reaktionen und kann verwendet werden, um die molekularen Mechanismen in der Schlaganfall beteiligt zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Guillotine</td><td></td><td></td><td>Wird zum Enthaupten von Tieren verwendet</td></tr><tr><td>Chirurgische Geräte</td><td></td><td></td><td>Pinzetten, Scheren, Pinzetten etc. zur Entnahme und Dissektion des Gehirns</td></tr><tr><td>McIlwain-Häcksler</td><td>McIlwain-Häcksler werden von einer Reihe von Unternehmen hergestellt/vertrieben, darunter Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments und Ted Pella.</td><td></td><td>Wird verwendet, um 100-400 &#181 zu generieren; m Gehirnabschnitte.</td></tr><tr><td>Kunststofftuben mit rundem Boden</td><td>Greiner</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td></td><td></td><td>Zur Aufbewahrung des Gewebes bei 37 °; C</td></tr><tr><td>Befeuchter-/Belüftungsgerät</td><td></td><td></td><td>Zur Aufbewahrung von Mikroscheiben in einer befeuchteten, sauerstoffreichen Umgebung</td></tr><tr><td>Polystyrolröhrchen mit flachem Boden</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dounce Homogenisator</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

exzitotoxische stimulation der hirn microslices als<em&gt; in-vitro-</em&gt; modell der stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Untersuchen molekularen Mechanismen neuropathologischen Bedingungen beteiligt sind, wie Schlaganfall, kann schwierig sein, wenn Sie ganze Tier-Systeme. Als solche primären oder &quot;neuronale-like&quot;-Zellkultursysteme werden üblicherweise verwendet. Während diese Systeme sind relativ einfach zu verarbeiten und sind nützlich Modellsysteme, bei denen verschiedene funktionelle Ergebnisse (wie Zelltod) können leicht quantifiziert werden, wobei die Ergebnisse untersucht und Wege in kultivierten unreifen Neuronen (wie Exzitotoxizität-vermittelten Zelltod Wege) sind nicht notwendigerweise die gleichen wie die in reifen Gehirns beobachtet, oder in intakte Gewebe. Daher besteht die Notwendigkeit, die Modelle, bei denen zelluläre Mechanismen in reifen Nervengewebe untersucht werden entwickeln. Wir haben ein in vitro-Verfahren, das verwendet werden kann, um eine Vielzahl von molekularen Wege in intakte Nervengewebe zu untersuchen entwickelt. Die hier beschriebene Technik nutzt Ratte Rindengewebe, aber diese Technik angepasst werden, um Gewebe zu verwendenaus einer Vielzahl von Arten (wie z. B. Maus, Kaninchen, Meerschweinchen und Huhn) oder Hirnregionen (zB Hippocampus, Striatum, etc.). Zusätzlich kann eine Vielzahl von Reizen / Behandlungen verwendet werden (zum Beispiel excitotoxisch Verabreichung von Inhibitoren, etc.). Abschließend kann die hier beschriebene Hirnschnittmodell verwendet, um eine Vielzahl von molekularen Mechanismen vermittelten Exzitotoxizität beteiligt Gehirnverletzung zu untersuchen.

Microslices erzeugt unter Verwendung dieses Verfahrens lebensfähig sind, und eine Vielzahl von Arten (z. B. Ratte, Maus und Huhn) auf microslices verwendet werden. Drei voneinander unabhängige Maßnahmen der Rentabilität verwendet worden: Atemfrequenz (Abbildung 1), Adenin-Nukleotid-Verhältnisse (Abbildung 2), und Gewebekaliumgehalt (Abbildung 3). Durch diese Maßnahmen hat es sich gezeigt, dass microslices lebensfähig bleiben für mindestens 2 h nach der Erzeugung. <p...

Wir haben eine Hirnschnittmodell, das verwendet werden kann, um die molekularen Mechanismen der Exzitotoxizität-vermittelten-Hirn-Verletzungen beteiligt untersuchen entwickelt. Diese Technik erzeugt lebensfähigen reifen Hirngewebe und reduziert die für Experimente erforderlichen Tiernummern, unter Beibehaltung der neuronalen, zellulären Interaktionen und postsynaptischen Fächer teilweise intakt.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zytotoxische Stimuli auf Gehirnmikroschnitte anzuwenden, um ein in-vitro-Modell eines Schlaganfalls zu erstellen. Dies wird erreicht, indem zunächst Mikroschnitte aus einem frisch isolierten Gehirn hergestellt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Mikroschnitte unter leichtem Rühren zu equilibrieren.Nach der Gleichgewichtseinstellung sind die Gewebeschnitte bereit, einer Vielzahl experimenteller Behandlungen unterzogen zu werden. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass die Gewebeschnitte mindestens zwei Stunden nach der Herstellung vital bleiben. Der Hauptvorteil unserer Methode gegenüber anderen etablierten Techniken, wie primären embryonalen neuronalen Kulturen, liegt darin, dass unsere Technik Schnitte aus reifem Hirngewebe verwendet, die mehr als eine Zellart enthalten und daher dem intakten Hirngewebe besser entsprechen.Der erste Schritt besteht darin, frisches Gehirngewebe zu gewinnen. Tauchen Sie das Gehirn in eine kleine Menge warmer Krebs-Pufferlösung. Um eventuell verbliebene Haut, Fell oder Blut zu entfernen, bereiten Sie einen Macle-Wain-Schneider mit zwei Filterpapierblättern vor, die mit warmer Krebs-Puffer

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Photothrombose ist eine schnelle, minimal-invasive Technik zur Induktion von kleinen und gut abgegrenzt Infarkt in Bereiche von Interesse in sehr reproduzierbar. Es ist besonders geeignet für die Untersuchung zellulären und molekularen Reaktionen zugrunde Plastizität des Gehirns in transgenen Mäusen.

Photothrombotic Ischämie: eine minimal-invasive und reproduzierbare photochemische kortikale Läsion Modell für Mouse Stroke Studies

Ein Protokoll für entorhino-Hippocampus organotypischen Kulturen, die Wiedergabe von vielen Aspekten der ischämischen Hirnschädigung ermöglicht, wird vorgestellt. Durch das Studium der Veränderungen der Leitungsbahnen in Zusätzlich zu den Veränderungen in den Nervenzellen ist dieses Protokoll ein vielseitiges Werkzeug, um plastische Veränderungen im Nervengewebe nach Verletzungen zu studieren.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Hier stellen wir die Methodik zur Erzeugung eines fokalen Schlaganfalls in der weißen Substanz der Maus durch lokale Injektion eines irreversiblen endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS)-Inhibitors (L-Nio) vor. Vorgestellt werden zwei stereotaktische Varianten, die retrograde neuronale Verfolgung und die Markierung und Dissektion von frischem Gewebe, die die Anwendungsmöglichkeiten dieser Technik erweitern.

Ein vielseitiges Mausmodell von Subcortical Weiß Matter Stroke für das Studium der axonalen Degeneration and White Matter Neurobiologie

Wir präsentieren eine Methode, die bieten weitere Einblicke in die frühe Ereignisse zugrunde liegenden Neurodegeneration und basiert auf der etablierten Ex-Vivo -Gehirn-Technik verbindet die Vorteile eines in Vivo und in Vitro Experimente. Darüber hinaus stellt es eine einzigartige Gelegenheit zum direkten Vergleich von behandelten und unbehandelten Gruppe in der gleichen anatomischen Ebene.

Ein alternativer Ansatz zur primären Ereignissen in Neurodegeneration mit Ex Vivo Ratte Gehirnscheiben studieren

Mikroglia, die ansässigen Immunzellen des Gehirns, reagieren schnell auf Änderungen ihrer Umgebung mit morphologischen Veränderungen. Dieses Protokoll beschreibt, wie zwei-Photonen-Mikroskopie zu verwenden, um die Anziehungskraft der Mikroglia Prozesse gegenüber Serotonin oder ATP in akuten Hirnschnitten von Mäusen zu studieren.

Zwei-Photon Imaging der Mikroglia Prozesse Anziehung in Richtung ATP oder Serotonin im akuten Gehirnscheiben

Hier beschreiben wir die Herstellung von rhinalen Kortex-Hippocampus organotypischen Scheiben. Unter einem allmählichen und kontrollierten Serumentzug zeigen diese Scheiben sich entwickelnde epileptische Ereignisse und können als Ex-vivo-Modell der Epileptogenese angesehen werden. Dieses System stellt ein hervorragendes Werkzeug zur Überwachung der Dynamik spontaner Aktivität sowie zur Beurteilung des Fortschreitens neuroinflammatoratorischer Merkmale im Verlauf der Epileptogenese dar.

Ein Modell der Epileptogenese in rhinalen Kortex-Hippocampus Organotypischen Schnittkulturen

Hier wird das photothrombotische Schlaganfallmodell beschrieben, bei dem ein Schlaganfall durch den intakten Schädel erzeugt wird, indem eine permanente mikrovaskuläre Okklusion mittels Laserbeleuchtung nach Verabreichung eines lichtempfindlichen Farbstoffs induziert wird.

Modellierung von Schlaganfällen bei Mäusen: Fokale kortikale Läsionen durch Photothrombose

Das Protokoll zielt darauf ab, Methoden für die Enzephalomomyosynangiose - Transplantation eines vaskulären Temporalis-Muskellappens auf der Pialoberfläche des ischämischen Hirngewebes - zur Behandlung des akuten ischämischen Schlaganfalls ohne Moyamoya bereitzustellen. Die Wirksamkeit des Ansatzes bei der Steigerung der Angiogenese wird anhand eines vorübergehenden Verschlussmodells der mittleren Hirnarterien bei Mäusen bewertet.

Ein Modell für die Enzephalomyosynangiose-Behandlung nach einem durch Verschluss der mittleren Hirnarterie induzierten Schlaganfall bei Mäusen

Dieses Protokoll enthält eine ausführliche Beschreibung eines Schritt-für-Schritt-Ansatzes für ein chronisches Schädelfenster- und mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell, das für die in vivo Zweiphotonenmikroskopie mit fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären optimiert ist.

Mikrovaskuläres Embolismus-Mausmodell für die In-vivo-Zweiphotonenmikroskopie mit fluoreszierenden Polystyrol-Mikrosphären

Es wird vermehrt Hinweise darauf, dass ischämischen Präkonditionierung (PC) - verleiht einen transienten Schutz einer nachfolgenden Beschädigung ischämischen - eine schonende ischämischen Herausforderung an das Gehirn. Wir haben festgestellt, bilateralen Arteria carotis communis Okklusion (BCCAO) als Vorbehandlung Stimulus bis Anfang ischämischen Toleranz (IT), um transiente fokale zerebrale Ischämie (induziert durch Mitte Zerebralarterie, MCAO) induzieren in C57Bl6 / J Mäusen.

Bilaterale Arteria carotis communis Occlusion als adäquate Vorbehandlung Stimulus zu frühe ischämische Toleranz zu Focal zerebraler Ischämie induzieren

Erfahren Sie die exzitotoxische Stimulation von Hirn-Mikroslices als In-vitro-Schlaganfallmodell. Diese Methode nutzt reifes Hirngewebe, reduziert Tierversuche und bewahrt neuronale Schaltkreise für zwei Stunden.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als

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