Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als In-vitro- Modell der Stroke

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zytotoxische Stimulation auf Mikroschnitte des Gehirns anzuwenden, um ein in vitro Schlaganfallmodell zu erstellen. Dazu werden zunächst Mikroscheiben aus einem frisch isolierten Gehirn vorbereitet. Der zweite Schritt besteht darin, die Mikroscheiben unter leichtem Rühren auszugleichen.

Nach dem Äquilibrieren sind die Mikroscheiben bereit, eine Vielzahl von experimentellen Manipulationen zu erhalten. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass Mikroschnitte mindestens zwei Stunden nach der Generierung lebensfähig sind. Der Hauptvorteil unserer Technik gegenüber anderen bestehenden Techniken, wie z. B. primären embryonalen, neuronalen Kulturen, besteht darin, dass unsere Technik Scheiben von reifem Hirngewebe verwendet, die mehr als einen Zelltyp enthalten und daher repräsentativer für intaktes Hirngewebe sind.

Der erste Schritt besteht darin, frisches Hirngewebe zu gewinnen. Tauchen Sie das Gehirn in eine kleine Menge warmen Krebspuffer. Um Haut-, Fell- oder Blutreste zu entfernen, bereiten Sie den Makel Wain Chopper mit zwei Blättern Filterpapier vor, das mit warmem Krebspuffer angefeuchtet ist.

Wenn Sie fertig sind, platzieren Sie das Gehirn auf der Bühne des Häckslers. Halten Sie das Gehirn und das Filterpapier mit warmem Crebs-Puffer feucht, während Sie daran arbeiten, ein Verrutschen des Gehirns zu verhindern. Vermeiden Sie es, dass sich zu viel Flüssigkeit auf der Oberfläche ansammelt.

Schneiden Sie das Gehirn in 250 Mikrometer große koronale Schnitte. Drehen Sie als Nächstes den Tisch um 90 Grad und erstellen Sie 250 Mikrometer große sagittale Scheiben. Nach diesem Schritt werden die Hirnschnitte als Mikroschnitte bezeichnet.

Legen Sie die Mikroscheiben in eine runde untere Zwei mit 10 bis 15 Millilitern warmem Crebs-Puffer. Bewegen Sie das Röhrchen vorsichtig, bis einzelne Mikroscheiben suspendiert sind, und lassen Sie sie dann unter der Schwerkraft absetzen. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, der aufgrund von suspendierten Zellresten trüb ist, und geben Sie 10 Milliliter frischen, warmen, geschlichenen Puffer in das Röhrchen.

Wiederholen Sie den Waschvorgang viermal, um den Großteil des Schmutzes nach dem gründlichen Waschen zu entfernen. Äquilibrieren Sie die Mikroscheiben bei 37 Grad Celsius durch leichtes Schütteln oder Inversion und wechseln Sie den Krebs-Puffer alle 15 Minuten für insgesamt eine Stunde. Nach dieser Zeit fügen Sie zwei Milliliter frischen 37 Grad Celsius heißen Krebspuffer hinzu und geben Sie 15 bis 20 Mikroscheiben in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen aus Polystyrol mit flachem Boden.

Verteilen Sie die Mikroscheiben mit einer extra breiten Öffnung und glatten Kanten gleichmäßig in einer einzigen Schicht über den Boden des Röhrchens, so dass jede Mikroscheibe nicht weiter als wenige Millimeter von der sauerstoffhaltigen Atmosphäre entfernt ist. Sobald sie richtig angeordnet sind, inkubieren Sie die Mikroscheiben in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad, um die Mikroscheiben richtig mit Sauerstoff zu versorgen. Führen Sie den Carbogen kontinuierlich über die Suspension der Mikroscheiben, wobei die Gasleitung knapp über der Oberfläche positioniert ist, um eine mechanische Unterbrechung der Mikroscheiben zu vermeiden, um einen direkten Kontakt mit dem Gas zu erzielen.

Es ist wichtig, dass die Mikroscheiben richtig belüftet werden. Es ist wichtig, dass die Gasleitung im richtigen Abstand von der Oberfläche der Microsite-Suspension platziert wird. Mehrere Leitungen können miteinander verschmolzen werden, so dass mehrere Stimulationen stattfinden können.

Gleichzeitig kann eine Vielzahl von Reizen eingesetzt werden. In diesem Beispiel werden die Mikroscheiben einer AMPA-Stimulation unterzogen. Behandeln Sie die Mikroscheiben allein mit einem zytotoxischen Stimulus oder Krebspuffer

Für eine Kontrolle auf stimulierte Gruppe. Entfernen Sie die Inkubationslösung zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation und ersetzen Sie sie zum gewünschten Zeitpunkt durch 300 Mikroliter eiskalten Homogenisierungspuffer. Homogenisieren Sie die Mikroscheiben nach der Stimulation auf Eis mit einem Teflon-Daunenhomogenisator aus Glas und lagern Sie das Homogene bei minus 80 Grad Celsius, bis es für die weitere Analyse bereit ist.

Die Atemfrequenz zeigt, dass Mikroscheiben, die aus dem Vorderhirn der Hühner entnommen wurden, bis zu zwei Stunden nach der Erzeugung lebensfähig sind. Die hohen A-TP- und niedrigen A-DP-Werte, die in Mikroschnitten gefunden werden, sind ebenfalls charakteristisch für lebensfähige Zellen. In diesem Beispiel wurde der Kaliumgehalt des Gewebes gemessen und es wurde festgestellt, dass er nach der Dissektion knapp über dem Hintergrund lag, aber nach der Inkubation mit Krebspuffer anstieg, die Zugabe von WABE und EGTA führte zu einem Rückgang des Kaliumgehalts im Gewebe, was zeigt, dass Mikroscheiben normalerweise aktiv Kalium pumpen und dass die Spiegel nicht auf Kalium zurückzuführen sind, das in abgestorbenem Gewebe oder interstitiellen Räumen eingeschlossen ist.

Hier wurden Mikroschnitte aus dem Striatum und dem sensorischen Kortex männlicher Ratten erzeugt und mit Hilfe von kaliumreichem Crebs-Puffer depolarisiert. Die Rate der Phosphorylierung von Glue N zwei B variierte zwischen dem Kortex und dem Striatum, während die Rate der Phosphorylierung von Glue a um eins zwischen den beiden Bereichen ähnlich war. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.