Name: Untersuchen proteasomalen Abbau in einem zellfreien System in Pflanzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T17:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Lernen Sie eine zellfreie Methode zur Analyse proteasomalen Proteinabbaus in Pflanzen. Dieses Verfahren nutzt Agrobacterium-Inokulation und Western Blot zur Untersuchung der Proteinstabilität.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Arbeit, die zu dieser Veröffentlichung hat die Finanzierung aus dem Marie-Curie-Programm COFUND &quot;U-Mobility&quot;, die von der Universität von Malaga und der Europäischen Union 7. Rahmenprogramm (FP7/2007-2013) unter GA Nr. 246550 kofinanziert erhalten. Die Arbeit in unserem Labor wird durch Zuschüsse von NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD, und BSF VC unterstützt

1. Die Proteinexpression <ol><li> Wahl des Expressionssystems System auswählen, das heißt, Vektoren und Vektorfreisetzungsverfahren am besten geeignet für die Expression des Proteins von Interesse in der spezifischen Modellorganismus / Zelle. Beachten Sie, dass unser Assay erfordert die Expression der untersuchten Proteine ​​in leicht nachweisbaren Mengen, die am besten durch eine transiente Transformation einer großen Anzahl von Zellen erreicht wird. In Pflanzen, zum Beispiel, ist diese mit binären Plasmide als Expressionsvektoren und Agrobacterium als Abgabesystem am besten erreicht. </li><li> Bau von binären Expressionsvektoren Klonierung der kodierenden Sequenz (en) des Proteins (e) von Interesse in einen Expressionsvektor entweder allein oder in translationale Fusion an ein Epitop-Tag. Verwenden Vektoren passend zum gewählten Expressionssystem und molekularbiologischen Standardverfahren für die Gen-Klonen. Für Agrobacterium-vermittelten Gentransfer beschäftigen binäre Vektoren und führen sie, auch mit Standard Protokolle in einen Agrobacterium-Stamm EHA 105, wie für die nachfolgende Inokulation von Pflanzengeweben. </li><li> Auswahl der Pflanzenarten Aus den Pflanzen in dem das Protein (e) von Interesse exprimiert wird. Beachten Sie, dass, während alle Pflanzenarten anfällig für Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation verwendet werden kann, unser Pflanzenarten der Wahl ist Nicotiana benthamiana, die leicht gewachsen ist, sehr anfällig für Agrobacterium und hat große Blätter, die leicht eingeimpft werden. </li><li> Das Pflanzenwachstum Wachsen einer Pflanze für 4 bis 6 Wochen in einem Topf mit Pro-Mix BX in einem Topf (20 cm x 20 cm x 20 cm) unter umweltkontrollierten Bedingungen (z. B. Wachstumskammer) des langen Tag (dh 16 h von 130 uE -150 m-2 s-1 Licht bei 23 ° C und 8 h Dunkelheit bei 20 ° C) und 40-65% relativer Luftfeuchtigkeit. 1.5.2 Düngung gelegentlich mit handelsüblichen Produkten pro Herstellers. Sobald die Pflanze angebaut wird, wählen SieBlätter mit der Größe von 50 mm x 70 mm oder größer (diese Längenmessungen beinhalten nicht die Blattstiel), Agrobacterium Impfung. </li><li> Inokulation mit Agrobacterium Wachsen Agrobacterium-Stamm, der das binäre Konstrukt getestet Protein (e) von Schritt 1.3 über Nacht bei 28 º C in YEP-Medium (1% Pepton, 1% Hefeextrakt und 0,5% NaCl) mit geeigneten Antibiotika (z. B. 100 mg ergänzt exprimieren / l Streptomycin und 10 mg / l Rifampicin pPZP-RSC2-basierte Vektoren 24-25). 1.6.2 Zentrifugation der Zellen, resuspendiert in Puffer Infiltration OD 600 = 0,5 [10 mM MgCl 2, 10 mM MES (pH 5,6), 100 &amp;mgr; M Acetosyringon] und Inkubation für 2 h bei Raumtemperatur. Infiltrieren die Kultur in der unterseits von einem Blatt, mit einer 1 ml-Spritze ohne Nadel, beachten Sie, dass die Blätter in situ angeimpft, während der Pflanze verbunden ist. 1.6.3 Nach der Infiltration, wachsen die Anlage für 72 h unter dem Lichtregime von 16 h 130-150 &amp;Nr. 181, E m-2 s-1 Licht bei 23 ° C / 8 h Dunkelheit bei 20 ° C vor der Ernte. </li><li> Die Anwendung der proteasomalen Inhibitoren Um die Vorstellung, dass die getesteten Protein (e) über einen Proteasom-Weg abgebaut unterstützt, verwenden spezifische Proteasom-Inhibitoren MG132 und Lactacystin 28-29, die reduzieren oder sogar blockieren Abbau sollte. Vier Stunden vor der Ernte (siehe Schritt 2.1), infiltrieren die Agrobacterium geimpften Blattflächen mit 10 uM MG132 (EMD Millipore) oder 10 uM Lactacystin (Sigma-Aldrich) oder Modelle behandeln das Blatt mit den jeweiligen Lösemittel, dh 0,1% DMSO oder destilliertes Wasser. </li></ol> 2. Herstellung von zellfreien Extrakten <ol><li> Blatternte Ernte der inokulierten Bereichen des Blattes, üblicherweise ca. 200-400 mg Frischgewicht, und schleifen sie in ein feines Pulver in flüssigem Stickstoff. Alternativ schlagen die Wulst-Gewebe, mit jeder Wulst-Schläger (zB Biospec) oder eine Zahn amalgamator (zB TPC Erweiterte<html> Technologies) direkt in der Abbaupuffer (siehe Schritt 2.2). </li><li> Proteinextraktion Vorbereitung Gesamtproteinextrakt durch Anordnen des Grundgewebes in 500 ul Puffer Abbau [50 mM Tris-HCL (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl 2, 5 mM DTT, 5 mM Adenosin-5&#39;-Triphosphat, und 1x Protease-Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich)]. Beachten Sie, dass der Protease-Inhibitor-Cocktail betrifft hauptsächlich Serin, Cystein, Asparaginsäure, und Metalloproteasen und nicht mit dem 26S-Protease beeinträchtigen. Der Extrakt wird durch zwei aufeinanderfolgende Zentrifugationen bei 12.000 × g für 5 min. </li><li> Protein-Abbaureaktion Übertragen gleichen Volumina Extrakte, normalerweise 20 &amp;mgr; l, um Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren bei Raumtemperatur zur Erhöhung Zeiträume. Typischerweise Probe zum Zeitpunkt Null und 5, 10, 15, 20 und 30 min Zeitpunkten. Stopp-Reaktionen durch Kochen in SDS-Gel-Probenpuffer, und analysieren sie durch Western-Blot. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. Erkennen Proteinabbau durch Immunoblotting <ol><li> Gel-Elektrophorese 3.1.1 Auflösen von Proteinproben durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und Elektrotransfer der aufgetrennten Proteine ​​auf eine Nitrocellulosemembran nach dem Standardprotokoll 30. 3.1.2 Bestimmen der Proteinkonzentration mit der Bradford-Methode (Bio-Rad), und laden 50-80 ug Gesamtprotein pro Spur. Stellen Sie sicher, dass alle Proben gleich geladen. Zum Laden steuert, zu vergleichen, Intensitäten einer ubiquitäres Protein-Arten, wie putative RuBisCo großen Ketten, die als eine Hauptbande mit einer relativen elektrophoretischen Beweglichkeit von etwa 50 kDa wandern, sie können auf Coomassie-Blau-gefärbten Gelen oder Ponceau S-oder erfasst werden Fluoreszenz SYPRO Rubin-gefärbten Nitrozellulosemembranen. </li><li> Blockierung Blockieren der Membran mit 5% Magermilch in TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) für 1 h bei Raumtemperatur. </li&gt; <li> Primärer Antikörper Verdünnte primäre anti-Epitop-Antikörpers in 1% Magermilch in TBST auf die vom Hersteller empfohlene Konzentration und Inkubation mit dem blockierten Membran für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 º C unter leichtem Schütteln. </li><li> Spülung Spülen der Membran in 20 ml TBST für 15 Minuten wieder abgespült und zweimal für 5 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Sekundäre Antikörper Verdünnte sekundäre Antikörper (zB Anti-Kaninchen-IgG) mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) in 1% Magermilch in TBST konjugiert, wie vom Hersteller empfohlen, und Inkubation mit der Membran für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. </li><li> Entdeckung Spülen der Membran wieder wie in Schritt 3.4 beschrieben. Nach dem letzten Spülvorgang in TBST, Visualisierung der Proteine ​​von Interesse mit einem HRP chemilumineszierendes Substrat, meist unter Verwendung eines ECL-Kits. </li></ol>

<ol><li>Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+control+in+ubiquitin-dependent+proteolysis%3A+don%E2%80%99t+Skp+the+F-box+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis.</a> Trends Genet. 14, 236-243 (1998).</li>
<li>Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+and+cullin%2Fring+H2-based+ubiquitin+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases.</a> Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).</li>
<li>Callis, J., Vierstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+in+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein degradation in signaling.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).</li>
<li>Hellmann, H., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+development%3A+regulation+by+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant development: regulation by protein degradation.</a> Science. 297, 793-797 (2002).</li>
<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).</li>
<li>Dharmasiri, S., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+regulated+protein+degradation+in+auxin+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of regulated protein degradation in auxin response.</a> Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).</li>
<li>Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ubiquitination+in+the+regulation+of+plant+defence+against+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).</li>
<li>Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+ubiquitin-26S-proteasome+pathway+in+gibberellin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling.</a> Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).</li>
<li>Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+26S+proteasome+system+in+the+signaling+pathways+of+TGF-beta+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily.</a> Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).</li>
<li>Pagano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+DNA+synthesis+and+mitosis+by+the+Skp2-+p27-Cdk1%2F2+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis.</a> Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).</li>
<li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+of+the+host+SCF+ubiquitin+ligase+machinery+by+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens.</a> Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+plant+transformation%3A+the+biology+behind+the+%26%2334%3Bgene-jockeying%26%2334%3B+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &#34;gene-jockeying&#34; tool.</a> Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li>
<li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).</li>
<li>Schrammeijer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+the+virulence+protein+VirF+of+Agrobacterium+tumefaciens+with+plant+homologs+of+the+yeast+Skp1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein.</a> Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).</li>
<li>Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+induces+expression+of+a+plant+host+F-box+protein+required+for+tumorigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity.</a> Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).</li>
<li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+targeted+proteolysis+in+plant+genetic+transformation+by+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium.</a> Nature. 431, 87-92 (2004).</li>
<li>Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+synthetic+Agrobacterium+T-DNA-protein+complexes+via+the+host+SCFVBF+ubiquitin-ligase+complex+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).</li>
<li>Zhou, P., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+and+degradation+of+the+substrate+recognition+subunits+of+SCF+ubiquitin-protein+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases.</a> Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).</li>
<li>Galan, J. M., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-dependent+degradation+of+multiple+F-box+proteins+by+an+autocatalytic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).</li>
<li>Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tome-1%2C+a+trigger+of+mitotic+entry%2C+is+degraded+during+G1+via+the+APC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC.</a> Cell. 113, 101-113 (2003).</li>
<li>Guardavaccaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+meiotic+and+mitotic+progression+by+the+F+box+protein+b-Trcp1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo.</a> Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).</li>
<li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+counteracts+host-induced+degradation+of+its+F-box+protein+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector.</a> Sci. Signal. 4, (2011).</li>
<li>Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophase+destruction+of+Emi1+by+the+SCFbTrCP%2FSlimb+ubiquitin+ligase+activates+the+anaphase+promoting+complex+to+allow+progression+beyond+prometaphase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase.</a> Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).</li>
<li>Tzfira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pSAT+vectors%3A+a+modular+series+of+plasmids+for+fluorescent+protein+tagging+and+expression+of+multiple+genes+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants.</a> Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).</li>
<li>Goderis, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+modular+plant+transformation+vectors+allowing+flexible+insertion+of+up+to+six+expression+units%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units.</a> Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).</li>
<li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-DNA+binary+vectors+and+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).</li>
<li>Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Delivery of multiple transgenes to plant cells.</a> Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).</li>
<li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+Arabidopsis+26+S+proteasome%3A+biochemical+and+molecular+analyses+revealed+the+presence+of+multiple+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms.</a> J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).</li>
<li>Fenteany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+proteasome+activities+and+subunit-specific+amino-terminal+threonine+modification+by+lactacystin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin.</a> Science. 268, 726-731 (1995).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. Ausobel, F. M., et al. , Wiley-Interscience. New York. (1987).</li>
<li>Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from:
 
 <a target="_blank" href="imagej.nih.gov/ij">imagej.nih.gov/ij</a> (1997).</li>
<li>Kim, J. H., Kim, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+RING+E3+ubiquitin+ligase+AtAIRP3%2FLOG2+participates+in+positive+regulation+of+high+salt+and+drought+stress+responses%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses).</a> Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieser Assay beruht auf der Expression der untersuchten Proteine ​​in Pflanzengeweben, so tritt offensichtlich das Potential proteasomalen Abbau Verfahren bereits in den lebenden Geweben. Wir untersuchen Protein Destabilisierung jedoch nur in den Extrakten, mit der Zeitnullprobe als erste Bezugspunkt dient. Daher definieren wir als zellfreie Assays. Ein wichtiger Aspekt für den Erfolg dieses Assays ist die richtige Wahl des Expressionsvektors aus dem das Protein getestet (n) erzeugt. Es sei ...

Die Ubiquitin/26S Proteasom-Weg wird als weit verbreitete Mechanismus zur Steuerung der verschiedenen biologischen Reaktionen, einschließlich Transkriptionsregulation, Zellzyklusprogression und Signaltransduktion, Rezeptor-Down-Regulation oder Endozytose ua verarbeitet 1-4 Schwellen. In diesem Weg wird das Zielprotein durch Ubiquitin-Reste, die zunächst über eine Thiolester-Bindung an Ubiquitin-aktivierendes Enzym E1 befestigt sind und dann zu einem Cystein-Aminosäurerest von Ubiquitin-Konjugation Enzym E2 transloziert markiert, und schließlich in Wechselwirkung mit E2 E3-Ubiquitin-Ligase , was Polyubiquitinierung des Proteinsubstrats. Schließlich werden die polyubiquitiniert Proteine ​​durch das 26S-Proteasom erkannt und abgebaut. Bei diesem Mechanismus, der E3-Enzym spezifiziert das Substrat und fungiert als regulatorische Schlüsselkomponente des Ubiquitin/26S Proteasom-System (UPS). E3-Ligasen können unabhängig wie RING-Domäne-Ligasen, oder als Teil eines Multiunter SCF (S handeln,kp1/Cullin/F-box Protein)-Komplex, wie F-Box-Domäne-Ligasen. SCF-vermittelten proteasomalen Abbauwege sind in die Regulation der Transkription, Zellzyklus, Signaltransduktion 5-10 und vielen anderen wichtigen Zellfunktionen beteiligt. Neben diesen kritischen Rolle bei der Regulation von zellulären Prozessen, UPS nimmt die zentrale Bühne in vielen Pflanzen-Pathogen-Interaktionen. Zum Beispiel zunehmende Hinweise darauf, dass verschiedene Pflanzenkrankheitserreger, einschließlich Agrobacterium tumefaciens, verlassen sich auf die Host-USV für die Infektionsprozess 11 zu erleichtern. Agrobacterium entlockt neoplastischen Wucherungen an Pflanzen, die ihren natürlichen Wirten repräsentieren, und es kann auch verwandeln eine breite Palette von anderen Eukaryoten aus Pilzen 1,2 auf menschliche Zellen 12,13. Während der Infektion, Agrobacterium exportiert eine DNA-Element (T-DNA) und mehrere Virulenz (Vir)-Proteine ​​in die Wirtszelle 12-13. Eines dieser Proteine ​​ist VirF die erste F-Box-Protein gefundenvon einem prokaryotischen Genom 14 codiert werden. Im Rahmen der SCF-Ubiquitin-Ligase-Komplex, VirF, und seine funktionellen Homolog Host VBF 15, erleichtern Agrobacterium-Infektion über die USV-vermittelten Proteinabbau, die vermutlich erleichtert Uncoating der bakteriellen Invasion T-DNA aus Bakterien-und der dazugehörigen Wirtsproteine, VirE2 VIP1 und jeweils 16,17. Interessanterweise sind viele F-Box-Proteine, einschließlich VirF, intrinsisch instabil aufgrund ihrer eigenen Proteolyse, die durch autoubiquitination Aktivität 18,19 oder durch andere E3-Ligasen, für das F-Box-Proteine ​​können als Substrate dienen 20-23 vermittelt wird. Bei der Untersuchung von biochemischen Aktivitäten von F-Box-Proteine, andere Ubiquitin-Ligasen, und / oder ihre Substrate, wäre es sehr nützlich, um einen einfachen und zuverlässigen Test für den proteasomalen Abbau zu verwenden. Hier beschreiben wir ein solches Protokoll für die Analyse der Proteinstabilität in einer ZelleFreies System. In diesem Assay wird die Stabilität des UPS Substrat in Gegenwart oder Abwesenheit eines der wesentlichen Bestandteile des proteasomalen Abbau-Weges, wie ein F-Box-Protein, in einem zellfreien System untersucht. Generell sprechen wir die getestet Protein (e) in Pflanzengeweben, bereiten zellfreien Extrakten aus diesen Geweben und überwachen die Mengen des Proteins (e) von Interesse durch Western-Blot. Die USV-abhängigen Mechanismus des Proteinabbaus wird durch die Aufnahme von spezifischen Proteasom-Inhibitoren und / oder mit Koexpression von dominant-negative Form eines SCF-Komponente Cullin demonstriert. Während wir veranschaulichen diesen Test unter Verwendung proteasomalen Abbau des Arabidopsis VIP1 17 Protein durch die F-Box-Protein VBF 15, kann es verwendet werden, um die Stabilität der anderen proteasomalen Substraten zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Protein-Assay-Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase-Inhibitor-Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean-System</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>Halbtrockenes Western-Blotting-SD-Elektrotransfersystem</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Affinitätsgereinigtes Kaninchen Anti-Ha</td><td>ICL Lab</td><td>RHGT-45A-Z</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>BioTrace, NT Nitrozellulose-Transfermembran</td><td>Pall Corporation</td><td>27377-000</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon westliches chemilumineszierendes HRP-Substrat</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>EMD Millipore</td><td>474790-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrat</td><td>Pierce</td><td>35055</td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchen proteasomalen abbau in einem zellfreien system in pflanzen

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

Der Ubiquitin-Proteasom-Weg für den Proteinabbau wurde als einer der wichtigsten Mechanismen für die Regulierung eines breiten Spektrums von Zellfunktionen in praktisch allen eukaryontischen Organismen entstanden. Insbesondere bei Pflanzen, die Ubiquitin/26S Proteasom-System (UPS) regelt Proteinabbau und trägt wesentlich zur Entwicklung einer Vielzahl von Prozessen, einschließlich Immunantwort, die Entwicklung und den programmierten Zelltod. Darüber hinaus zunehmende Hinweise darauf, dass zahlreiche Pflanzenkrankheitserregern wie Agrobacterium, nutzen die Host-UPS für eine effiziente Infektion, die Bedeutung der USV in Pflanzen-Pathogen-Interaktionen. Die Substratspezifität der USV wird von der E3-Ubiquitin-Ligase, die in Abstimmung mit den E1-und E2-Ligasen wirkt, um spezifische Protein-Moleküle, die für Abbau bestimmt, indem es an diese Ketten von Ubiquitin-Moleküle zu erkennen und zu kennzeichnen erreicht. Eine Klasse der E3-Ligasen ist der SCF (Skp1 / CUllin / F-Box-Protein)-Komplex, der spezifisch das UPS Substrate und richtet sie für Ubiquitinierung über seine F-Box-Protein-Komponente. Um eine mögliche Rolle des UPS in einem biologischen Prozess von Interesse zu untersuchen, ist es wichtig, ein einfaches und zuverlässiges Assay für UPS-vermittelte Proteinabbau zu entwickeln. Hier beschreiben wir einen solchen Assay unter Verwendung einer Pflanzenzelle freies System. Dieser Test kann für Studien über die Rolle der regulierten Proteinabbau in verschiedenen zellulären Prozessen angepasst werden, mit einem besonderen Fokus auf die F-Box-Protein-Substrat-Wechselwirkungen.

Fig. 1, von Zaltsman et al. 17 angepasst, veranschaulicht repräsentative Experimente zum Nachweis von proteasomalen Abbau in einem zellfreien System. Insbesondere zeigen wir, Destabilisierung einer Anlage Verteidigungs Protein VIP1 von der VBF F-Box-Protein über den SCF VBF Weg in N. benthamiana. Arabidopsis VBF-und HA-markierten VIP1 (HA-VIP1)-Proteine ​​wurden transient koexprimiert und HA-Protein innerhalb VIP1 Inhalt Extrakte der Blätter zum Ausdruck ...

Gezielte Proteinabbau stellt einen wichtigen Regulationsmechanismus für die Zellfunktion. Es tritt über eine konservierte Ubiquitin-Proteasom-Weg, der Polyubiquitinketten an das Zielprotein, die dienen dann als molekulare &quot;Tags&quot; für die 26S-Proteasom isst. Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige zellfreien Assays für den proteasomalen Abbau von Proteinen.

Untersuchen proteasomalen Abbau in einem zellfreien System in Pflanzen

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Stabilität eines Proteins in einem zellfreien System zu analysieren. Dies wird erreicht, indem Oceana Biana mit verschiedenen Agrobacterium-Stämmen, die den gewünschten Protein enthaltenden binären Konstrukt tragen, beimpft wird.Das Gesamtprotein wird anschließend aus den Pflanzenblättern extrahiert. Die Blätter werden in Mikrozentrifugenröhrchen überführt und für zunehmende Zeiträume bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden die Proteinproben mittels SDS-Acrylamidgel-Elektrophorese aufgetrennt und elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosemembran übertragen.Um das Protein von Interesse mithilfe eines spezifischen Antikörpers nachzuweisen, werden Ergebnisse erhalten, die anhand einer Western-Blot-Analyse die Proteinstabilität in Gegenwart oder Abwesenheit eines spezifischen proteasomalen Inhibitors zeigen. Hier beschreiben wir eine einfache Methodik, um die Stabilität des INE-Protosom-Cyst-Substrats in Gegenwart oder Abwesenheit einer der essentiellen Komponenten des proteasomalen Abbaupfads in einem zellfreien System zu untersuchen. Diese Methoden können somit Einblicke in einen sichereren proteasomalen Abbau liefern.Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, beispielsweise Untersuchungen der Rolle regulierter Protein-Degradation bei vielfältigen zellulären Prozessen. In dieser Demonstration wird NCOA hamana verwendet. Die Pflanze ist leicht zu kultivieren, hochgradig empfänglich für Agrobakterien und weist große Blätter auf, die leicht zu infizieren sind.Züchten Sie eine Pflanze vier bis sechs Wochen lang in einem Topf mit Promix B unter umweltkontrollierten Bedingungen mit Langtag und 40 bis 65 % relativer Luftfeuchtigkeit. Düngen Sie die Pflanze gelegentlich mit handelsüblichen Produkten gemäß den Herstelleranweisungen. Sobald die Pflanze gewachsen ist, wählen Sie Blätter mit einer Größe von 50 Millimetern mal 70 Millimetern oder größer aus.Für die Agrobakterium-Inokulation Agrobakterienstämme, die den binären Konstrukt tragen und das getestete Protein exprimieren, über Nacht bei 28 Grad Celsius in YEP-Medium unter Zusatz der geeigneten Antibiotika kultivieren. Nach der Zentrifugation der Zellen resuspendieren Sie diese in Infiltrationspuffer auf eine optische Dichte von 0,5 bei 600 Nanometern und inkubieren zwei Stunden bei Raumtemperatur. Infiltrieren Sie die Kultur mit einer einmilliliterigen Kanüllenspritze in die AAL-Seite eines Blattes. Nach der Infiltration die Pflanze 72 Stunden lang unter demselben Lichtregime wachsen lassen. Vor der Ernte, vier Stunden vor der Ernte, infiltrieren Sie die mit Agrobakterien inokulierten Blattareale mit 10 Mikromolar Inhibitor oder Mock.Bearbeiten Sie das Blatt mit den jeweiligen Lösungsmitteln, entnehmen Sie die infizierten Bereiche des Blattes, üblicherweise 200 bis 400 Milligramm Frischgewicht, und mahlen Sie diese in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver. Bereiten Sie anschließend den Gesamtproteinauszug vor, indem Sie das gemahlene Gewebe in 500 Mikroliter Abbaupuffer geben. Klären Sie den Auszug durch zwei aufeinanderfolgende Zentrifugationen bei 12.000 ×g für jeweils fünf Minuten, um die Proteinabbauraktion durchzuführen.Überführen Sie gleiche Volumina der Extrakte, üblicherweise 20 Mikroliter, in Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie diese bei Raumtemperatur über zunehmende Zeiträume hinweg. Typischerweise werden die Zeitpunkte null Minuten sowie 5, 10, 15, 20 und 30 Minuten verwendet. Beenden Sie die Reaktionen durch Kochen mit einem SDS-Gel-Probenpuffer, bevor Sie sie mittels Western Blot analysieren.Trennen Sie die Proteininhalte mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, indem Sie zunächst die Proteinmenge mit der Bradford-Methode bestimmen und 50 bis 80 Mikrogramm Gesamtprotein pro Linie auftragen. Achten Sie darauf, dass alle Proben gleichmäßig aufgetragen werden, um Ladekontrollen zu ermöglichen. Vergleichen Sie die Intensitäten ubiquitär vorkommender Proteine, wie beispielsweise der vermuteten großen Rubis-Ketten, die als hauptsächliches Band mit einer relativen elektrophoretischen Mobilität von etwa 50 Kilodalton wandern.Nach dem elektrophoretischen Transfer der aufgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulosemembran gemäß Standardprotokollen blockieren Sie die Membran eine Stunde bei Raumtemperatur mit 5 % Magermilch in TBST. Verdünnen Sie anschließend den primären Anti-Epitop-Antikörper in 1 % Magermilch in TBST auf die vom Hersteller empfohlene Konzentration. Inkubieren Sie den Antikörper mit der blockierten Membran eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren.Anschließend die Membran einmal für 15 Minuten und dann zweimal je fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 20 Millilitern TBST unter leichtem Schütteln waschen. Danach den sekundären mit HRP konjugierten Antikörper gemäß Herstellerangaben in 1 % Magermilch in TBST verdünnen. Den sekundären Antikörper nach einer weiteren TBST-Waschung unter leichtem Schütteln eine Stunde bei Raumtemperatur mit der Membran inkubieren und die Proteine von Interesse mit einem HRP-basierten Nachweissystem detektieren, repräsentative Experimente zeigen eine Destabilisierung eines pflanzlichen Abwehrproteins.Der Abbau von Veep one durch das VBFF-Box-Protein über den SCF-Weg wurde in N hamana nachgewiesen. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die Mengen von Veep one signifikant verringert waren, wenn es zusammen mit VBF exprimiert wurde, während sie in Abwesenheit der Ko-Expression mit VBF relativ stabil blieben. Auf den proteasomalen Abbau-Mechanismus der VBF-vermittelten Destabilisierung von Veep one wurde aus der Hemmung durch den Proteasom-Inhibitor MG 132 geschlossen.Die Quantifizierung dieser Ergebnisse zeigte eine nahezu vollständige Hemmung von V one durch VBF, die praktisch durch MG 132 blockiert wurde. Die leicht höheren Spiegel von V one in Gegenwart von MG 132 lassen sich höchstwahrscheinlich durch die Hemmung der endogenen Aktivität des VBF-Homologs erklären. Nach dem Abspielen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Proteinabbau über den beginnenden Proteasomweg untersucht.Dasselbe experimentelle Design könnte für beliebige andere Organismen verwendet werden und kann durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie beispielsweise die Rolle regulierter Protein-Degradation in vielfältigen zellulären Prozessen.

assaying-proteasomal-degradation-in-a-cell-free-system-in-plants

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine Methode, um Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen zu überwachen beschrieben. A Degron-destabilisierten GFP-(GFP-DGN) und eine stabile GFP-dgnFS Fusionsprotein erzeugt und transduziert in die Zelle mit einem lentiviralen Expressionsvektor. Diese Technik ermöglicht eine stabile GFP-dgn/GFP-dgnFS exprimierenden Zelllinie, in dem Ubiquitin-Proteasom-Aktivität leicht beurteilt werden kann, mit Epifluoreszenz oder Durchflusszytometrie generieren.

Überwachung des Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen unter Verwendung eines Degron (DGN)-destabilisiert Green Fluorescent Protein (GFP)-basierte Reporter Protein

In diesem Video demonstrieren wir einen zellbasierten Proteinaggregationsassay mit Proteasom-Inhibitoren, die die Proteasomaktivität blockieren und verhindern, dass fehlgefaltete, mutierte Proteine, die mit einer fluoreszierenden Markierung fusioniert sind, einen Ubiquitin-abhängigen proteasomalen Abbau durchlaufen, was zu ihrer Akkumulation im Zellzytoplasma führt. Anschließend werden die Proteinaggregate mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht und quantifiziert.

Protein Aggregate Formation Assay: Eine Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung der Proteinaggregation in kultivierten Zellen nach Induktion durch Proteasom-Inhibitoren

Dieses Video beschreibt einen Abbauassay für fehlgefaltete Proteine mittels Cycloheximid-Behandlung zusammen mit Detergenzfraktionierung. Diese Methode hilft dabei, die Dynamik fehlgefalteter Proteine zu untersuchen und die tiefgreifenden Mechanismen des Proteinumsatzes aufzudecken.

Assay für den Abbau von fehlgefalteten Proteinen: Eine Technik zur Überwachung des Abbaus fehlgefalteter Proteine mittels Cycloheximid-Behandlung und Detergenzfraktionierung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Reinigung und Charakterisierung von Pflanzenproteinkomplexen. Wir zeigen, dass durch Immunpräzipitation ein einzelnes Protein in einem Komplex, so können wir seine post-translationale Modifikationen und seinen Interaktionspartner zu identifizieren.

Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Hier beschreiben wir einen robusten biologischen Assay zur Quantifizierung der relativen Rate der Proteolyse durch das Ubiquitin-Proteasom-System. Die Assay-Auslesung ist die Hefewachstumsrate in Flüssigkulturen, die von den zellulären Konzentrationen eines Reporterproteins abhängt, das ein Abbausignal enthält, das mit einem essentiellen Stoffwechselmarker fusioniert ist.

Reporter-basierten Wachstumstest für die systematische Analyse von Proteinabbau

Dieser Artikel beschreibt einen auf Hefewachstum basierenden Assay zur Bestimmung der genetischen Anforderungen für den Proteinabbau. Es demonstriert auch eine Methode zur schnellen Extraktion von Hefeproteinen, die sich für Western Blotting eignet, um die Abbauanforderungen biochemisch zu bestätigen. Diese Techniken können angepasst werden, um den Abbau einer Vielzahl von Proteinen zu überwachen.

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dieser Bericht beschreibt Protokolle zur Messung der Abbauraten von fehlgefalteten Proteinen entweder durch Western Blot oder fluoreszenzbasierte Assays. Die Methoden können für die Analyse anderer fehlgefalteter Proteine und für das Hochdurchsatz-Screening eingesetzt werden.

Assays für den Abbau fehlgefalteter Proteine ​​in Zellen

Hier präsentieren wir ein Interaktom-Capture-Protokoll, das auf Arabidopsis thaliana Blatt-Mesophyll-Protoplasten angewendet wird. Diese Methode beruht kritisch auf in vivo UV-Vernetzung und ermöglicht die Isolierung und Identifizierung von p-mRNA-bindenden Proteinen aus einer physiologischen Umgebung.

MRNA Interactome Capture aus Pflanzenprotoplasten

Protein-Protein und Protein-Metabolit Interaktionen sind entscheidend für alle Zellfunktionen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das parallele Analyse dieser Interaktionen mit einem Protein der Wahl ermöglicht. Unser Protokoll wurde optimiert für die Anlage Zellkulturen und verbindet Affinitätsreinigung mit Massenspektrometrie-basierte Protein und Metabolit Erkennung.

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Präsentiert wird hier ein phosphoprotemischer Ansatz, nämlich Stop-and-Go-Extraktionsspitze Phosphoproteomic, die hohen Durchsatz und tiefe Abdeckung von Arabidopsis phosphoproteome bietet. Dieser Ansatz beschreibt den Überblick über osmotische Stresssignale in Arabidopsis.

Phosphoproteomic Strategie zur Profilierung osmotischer Stresssignalisierung bei Arabidopsis

Dieses Protokoll beschreibt den Workflow für die metabolische Markierung von seneszenten und nicht teilenden Zellen mit gepulstem SILAC, ungezielter Massenspektrometrie-Analyse und einer optimierten Berechnung der Proteinhalbwertszeiten.

Messung von Proteinumsatzraten in seneszenten und nicht teilenden kultivierten Zellen mit metabolischer Markierung und Massenspektrometrie

Lernen Sie eine zellfreie Methode zur Analyse proteasomalen Proteinabbaus in Pflanzen. Dieses Verfahren nutzt Agrobacterium-Inokulation und Western Blot zur Untersuchung der Proteinstabilität.

Untersuchen proteasomalen Abbau in einem zellfreien System in Pflanzen

Weitere Videos entdecken