Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Bildgebung und Analyse der neuronalen Vorläufermitose in lebenden Hirnschnitten von Mäusen. Dies wird erreicht, indem zunächst Gehirne von Embryonen seziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, Gehirnschnitte mit einem Vibrato vorzubereiten.

Als nächstes wird die Live-Bildgebung von Hirnschnitten durchgeführt. Der letzte Schritt besteht darin, Informationen aus Filmen zu extrahieren, um die interessierenden Mitoseparameter zu analysieren. Letztendlich wird die Zeitraffermikroskopie verwendet, um zu zeigen, wie sich Vorläuferpopulationen des Gehirns in Echtzeit teilen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. der festen Analyse, besteht darin, dass man einen signifikanten Einblick in die zeitliche Dynamik der Teilung von Neurovorläufern in lebenden Hirnschnitten gewinnen kann. Es kann auch verwendet werden, um zu verstehen, wie genetische Störungen die Teilung von Neurovorläufern beeinflussen können. Obwohl wir diese Methode verwenden, um die kortikale Entwicklung zu verstehen, kann die von uns beschriebene Analyse auf die Untersuchung der Mitose von Stammzellen in anderen Gehirnregionen oder sogar außerhalb des Gehirns angewendet werden.

Verfahren wird Louis Y, ein Postdoktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie diese Prozedur, indem Sie die Mausembryonen entnehmen und die embryonalen Gehirne präparieren, einschließlich des Hinterhirns und der vier Gehirne mit den beiden Gehirnhälften. Mache in einem Eimer mit Eis ein Loch in das Eis für die Einbettformen.

Gießen Sie dann 3%aros Medium in eine Kunststoffform und setzen Sie diese Form in das Loch im Eis ein. Rühren Sie das aros medium mit der Spitze eines digitalen Thermometers um, bis die Temperatur 35 Grad Celsius erreicht. Übertragen Sie dann sofort das Gehirn in das Einbettungsmedium, um überschüssiges HBSS an der Schnittstelle zwischen Gehirn und Aros zu entfernen.

Drehen Sie das Gehirn vorsichtig und vorsichtig wiederholt in der Einbettlösung. Mit der Pinzette bildet sich am Boden der Form, die mit dem Eis in Kontakt kommt, ein Polster aus gelierten Arros. Sobald das Kissen mit der Spitze der Pinzette beim Rühren des Gehirns zu spüren ist, sollte das Gehirn nicht mehr bis zum Boden der Form sinken.

Lass die Aros mindestens fünf Minuten im Eis aushärten, bevor du die Ecken der Form mit einer Rasierklinge abschneidest. Schnitzen Sie vorsichtig einen Aros-Block um das Gehirn und versuchen Sie, die Anzahl der Schnitte zu minimieren, um das eingebettete Gehirn nicht zu stören. Mit dem VT 1000 s erzeugen Viome Scheiben von 200 bis 250 Mikron.

Verdünnen Sie nun Cyto 11 auf eine Endkonzentration von 0,5 bis 1 Mikromolar in dem mit Wachstumsfaktoren ergänzten Scheibenkulturmedium und inkubieren Sie mit einer 12-Well-Platte Scheiben aus einem Gehirn in 2,5 Millilitern der Färbelösung in jeder Vertiefung für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Scheiben dann in 2,5 Millilitern Scheibennährmedium ohne Färbelösung für 20 Minuten. Um die Gehirnabschnitte zu befestigen, geben Sie einen Tropfen Kollagenlösung auf den Boden einer 35 Millimeter großen Mikrotiterschale mit Glasboden.

Verteilen Sie es mit einer Pipettenspitze, die der Größe der Scheibe entspricht. Übertragen Sie dann eine Scheibe in einen Tropfen Kollagen. Lassen Sie die Scheiben 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, bevor Sie sie in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid überführen.

Nach 20 Minuten mit insgesamt 1,2 Millilitern Scheibenkulturmedium in das Glasbodenmikro gut portionieren, jeweils 600 Mikroliter Medium gut auffüllen und mit einer Pipettenspitze verteilen. Lassen Sie die Scheiben mindestens eine Stunde und 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid im Inkubator auffrischen, bevor Sie sie unter den gleichen Bedingungen in die Inkubationskammer des konfokalen Spinning-Disc-Mikroskops überführen. Verwenden Sie für die Live-Bildgebung ein 60-fach-Silikonölobjektiv mit einem Arbeitsabstand von 300 Mikrometern und einer numerischen Apertur von 1,3.

Für die Zellbildgebung werden die Zellen in einem 30-Mikrometer-Z-Stapel mit der Mitte des Z-Stapels etwa 40 Mikrometer unter der Oberfläche der Scheibe angezeigt. Passen Sie bei Bedarf die Laserleistung und die Belichtungszeiten an, um das Photobleaching zu begrenzen, und verwenden Sie die Belichtungszeit zwischen 30 und 200 Millisekunden, abhängig von der Intensität des Cyto 11-Signals. Hier sind repräsentative Daten, die man aus dieser Analyse gewinnen kann, um die mitotischen Figuren in Bild J zu identifizieren.Nachdem Sie den Datensatz für eine Position als Hyperstapel geöffnet haben, wählen Sie eine Z-Ebene aus, in der das Gewebe und die Zellen gesund aussehen.

Scrollen Sie in der Zeit zurück, um den Zeitpunkt zu identifizieren, an dem die Zelle in die Mitose eintritt. Die Zelle kann sich über Z-Ebenen bewegen, aber die zeitliche Auflösung und die zuvor beschriebenen Zack-Parameter wurden optimiert, um diesen Prozess zu ermöglichen. Notieren Sie in einer Tabelle die vier D-Koordinaten der Zelle im Hyperstapel, wenn sie in die Mitose eintritt.

Wenn Sie diese Koordinaten kennen, wird verhindert, dass dieselbe Zelle mehrmals gezählt wird. Scrollen Sie in der Zeit vorwärts und notieren Sie die Zeit, zu der die Zelle von einer Phase in eine andere übergeht. Dokumentieren Sie die Dauer jeder mitotischen Phase für eine bestimmte Zelle, um eine 3D-Rekonstruktion der Zellen und eine Quantifizierung der Rotation während der Metaphase durchzuführen.

Nachdem mehrere mitotische Zellen identifiziert wurden, verwenden Sie die Koordinaten einer Zelle und scrollen Sie in der Zeit bis zum Anfang vorwärts. Metaphase dreht den gesamten Hyper-Stack, so dass der Ventrikelrand planer ist. Verwenden Sie das Winkelwerkzeug, um den Winkel zu bestimmen, der für diese Drehung angewendet werden soll.

Identifizieren Sie die Z-Ebene, in der die interessierende Zelle in dieser Ebene am sichtbarsten ist. Verwenden Sie das Rechteckauswahlwerkzeug, um eine Auswahl zu zeichnen, die die gesamte Zelle umfasst. Identifizieren Sie dann die Z-Ebenen, die die gewünschte Zelle enthalten, und verwenden Sie den Befehl zum Duplizieren von Bildern, um einen Unterstapel zu erstellen.

Lassen Sie im Dialogfeld den doppelten Hyperstapel für die Slices aktiviert. Der Parameter "Z" entspricht den Z-Ebenen, einschließlich der gesamten Zelle, und der Parameter "T" der Rahmen entspricht dem aktuellen Zeitpunkt. Generieren Sie danach eine 3D-Rekonstruktion der Zelle.

Zum aktuellen Zeitpunkt. Der Schichtabstand entspricht dem Intervall zwischen den einzelnen Bildern der Z-Ebene in Mikrometern. Drehen Sie die resultierende 3D-Rekonstruktion mithilfe der Bildlaufleiste so, dass der Rand der Metaphasenplatte sichtbar ist.

Die Anzahl des Frames entspricht dem Beta-Winkel. Notieren Sie sich diese Nummer. Messen Sie dann den Winkel zwischen der Horizontalen und der Ausrichtung bys.

Präparieren der Metaphasenplatte senkrecht. Dies ist der Winkel-Alpha-Datensatz. Diese Winkel gelten für alle Metaphasen-Zeitpunkte der interessierenden Zelle.

Der Drehwinkel zwischen den Zeitpunkten t und t minus eins entspricht dem absoluten Wert der Differenz zwischen einem Winkel bei t und diesem Winkel bei T minus eins entlang der dorsalen ventralen Achse. Die Mitose lässt sich am einfachsten in dorsalen Regionen von Hirnschnitten abbilden, da der Basalfortsatz der R-GCs kürzer ist und daher weniger wahrscheinlich durch ein Viom durchtrennt wird. Entlang der ROS-Verhätschachse liefern Schnitte in den Verhätschelregionen der dorsalen Hirnrinde die konsistentesten Ergebnisse.

Dies sind Beispiele für eine gute und eine schlechte Region für die Bildgebung. In einer guten Region. Die Zellkerne sind elliptisch geformt und viele mitotische Zellen werden am Rand des Ventrikels vor der Zeitraffer-Bildgebung in einer schlechten Region beobachtet, sehr wenige mitotische Zellen werden am Rand des Ventrikels beobachtet und die Zellkerne sind rund.

Hier ist ein Beispiel für eine gute Schnitte, die vor der Live-Bildgebung mit einem Mikroskop mit geringer Vergrößerung beobachtet wurde, und hier sind einige Beispiele von Cyto 11-markierten Zellen in verschiedenen Phasen der Mitose. Hier ist eine Montage einer Region am Rand des Ventrikels zu sehen, in der zwei neurale Vorläuferzellen die verschiedenen Phasen der Mitose durchlaufen, die nach diesem Verfahren in verschiedenen Farben markiert sind. Andere Methoden, wie z.B. die neutrale Elektroporation von DNA-Konstrukten, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z.B. was ist das Schicksal der sich teilenden Zellen und wie verhält sich das Zytoskelett?

Es ist auch am besten, sekundäre Methoden nach CY 11 zu verwenden, um die Mitose zu verfolgen, wie z. B. H-zwei-VGFP-transgene Mäuse. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gehirnschnitte manipuliert, welche Matching-Parameter am besten geeignet sind und wie die Daten analysiert werden.