Bioenergetik und die Oxidative Burst: Protokolle für die Isolierung und Bewertung der menschlichen Leukozyten und Thrombozyten

Im folgenden Protokoll wird die Messung der bioenergetischen Profile und oxidativen Burst-Reaktionen von menschlichen Blutmonozyten, Lymphozyten, Neutrophilen und Thrombozyten demonstriert. Dies wird erreicht, indem zunächst das Buffy Coat und die plättchenreichen Plasmafraktionen aus frisch entnommenem Blut entnommen werden. In einem zweiten Schritt wird die heterogene Population der weißen Blutkörperchen durch einen Dichtegradienten in mononukleäre und polymorphkernige Zellschichten getrennt.

Als nächstes werden die reinen Monozyten-Neutrophilen- und Lymphozytenpopulationen durch maximale Trennung weiter isoliert und dann für die extrazelluläre Fluss- oder XF-Analyse plattiert. Letztendlich kann die sensitive und reproduzierbare Messung der mitochondrialen Funktion in Monozyten, Lymphozyten und Blutplättchen sowie der oxidative Ausbruch des Sauerstoffverbrauchs von Monozyten und Neutrophilen mit der XF-Technologie gemessen werden. Der Vorteil der Technik, die wir Ihnen heute zeigen werden, besteht darin, dass Sie aus einer kleinen Blutprobe alle wichtigen Zellen vorbereiten können, die sich im Blut des Patienten befinden.

Dabei handelt es sich um Blutplättchen und die Leukozyten in reiner inaktivierter Form und messen deren mitochondriale Funktion. Dies, so denken wir, kann dann verschiedene Krankheiten und Zustände innerhalb des Patienten in Echtzeit widerspiegeln. Diese Methode könnte helfen, wichtige Fragen zum Stoffwechsel zu beantworten, z. B. welche Rolle Lebensstil, Ernährung und pathologischer Stress für die Mitochondrienfunktion spielen.

Dieses Protokoll kombiniert mehrere Technologien zur Isolierung und Bestimmung der zellulären Bioenergetik in verschiedenen Leukozytenpopulationen und in Blutplättchen. Dieser Schritt des Protokolls ist sehr kritisch, da der Dichtegradient und die magnetische Trennung ein präzises Pipettieren erfordern. Darüber hinaus müssen Sie sich darüber im Klaren sein, wo sich die Zellpopulationen während der Fraktionierung befinden.

Wir werden die Isolierung peripherer Blutzellen und die Analyse der zellulären Bioenergetik auf dem 24-Well-extrazellulären Flussanalysator oder dem XF 24 demonstrieren. Diese Methode kann jedoch auch mindestens zwei Stunden vor Beginn des Eingriffs am XF 96 durchgeführt werden. Hydratisieren Sie die Sonden der XF-Sensorkartusche mit XF-Cran-Lösung.

Anschließend wird das frisch entnommene Vollblut 15 Minuten lang bei 500-facher G und Raumtemperatur in einer Zentrifuge mit schwingendem Schaufelrotor heruntergeschleudert. Verwenden Sie eine Transferpipette, um die oberste Schicht mit dem plättchenreichen Plasma zu entfernen, bis ein Zentimeter Plasma über der Erythrozyten-Buffy-Coat-Schicht verbleibt, und stellen Sie das Plasma bei Raumtemperatur für die spätere Verarbeitung beiseite. Übertragen Sie dann den Buffy-Mantel in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen und verdünnen Sie die weißen Blutkörperchen auf 24 Milliliter.

Mit dem basalen RPMI fügen Sie als nächstes drei Milliliter mit geringer Dichte, seine undurchsichtige 1,077, zu jedem der drei konischen 15-Milliliter-Röhrchen hinzu. Führen Sie dann die Spitze einer fünf Milliliter schmalen Pipette in den Boden jedes Röhrchens ein. Im Gegenzug und langsam werden drei Milliliter hoher Dichte freigesetzt, seine undurchsichtigen 1,119.

Verwenden Sie nun eine automatische Pipette auf niedriger Leistungsstufe, um vorsichtig acht Milliliter des verdünnten Blutes zu jedem Gradienten hinzuzufügen, ohne die Schichten zu stören. Dem Gradienten mit niedriger Dichte wurde blauer Farbstoff hinzugefügt, um alle Gradientenschichten sichtbar zu machen. Nach getrennter Trennung der Zellen durch Zentrifugation werden die mononukleären und polymorphkernigen Zellen mit sterilen Glaspipetten entnommen, ohne die anderen Zellbanden zu stören.

Die mononukleären und polymorphkernigen Zellpopulationen aus jedem Röhrchen werden für jeden Zelltyp in einzelne sterile konische 50-Milliliter-Röhrchen gepoolt und vier Volumina RPMI in beide Röhrchen gegeben. Nach dem Schleudern der Zellen werden die Pellets in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt, wieder pelletiert und in 80 Mikrolitern frischem RPMI, ergänzt mit BSA, resuspendiert. Geben Sie dann 20 Mikroliter magnetische Bead-markierte Anti-CD 14- und Anti-CD 15-Antikörper zu den mononukleären bzw. polymorphkernigen Zellfraktionen.

Inkubieren Sie jede Zellsuspension 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius, waschen Sie dann jedes Röhrchen mit einem Milliliter R-P-M-I-B-S-A-Medium und resuspendieren Sie die Pellets in 500 Mikrolitern R-P-M-I-B-S-A. Tragen Sie dann die Zellsuspensionen auf einzelne R-P-M-I-B-S-A-gewaschene LS-Säulen auf und waschen Sie jede Säule dreimal mit drei Millilitern R-P-M-I-B-S-A-Medien. Sammeln Sie die Zellsuspensionsdurchflüsse und Säulenwaschungen in sterile Röhrchen, um die Monozyten und Neutrophilen zu isolieren, entfernen Sie die Säulen nach der letzten Wäsche aus dem Magnetfeld und eluieren Sie die positiv ausgewählten Zellen in ein steriles Röhrchen mit fünf Millilitern R-P-M-I-B-S-A. Um die Lymphozyten zu isolieren, pelletieren Sie den Fluss durch die Waschfraktion der Zellsäule, resuspendieren Sie das Zellpellet in 80 Mikrolitern R-P-M-I-B-S-A und inkubieren Sie die Zellen in 20 Mikrolitern CD 61 und CD 2 35 A Antikörpern für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.

Wiederholen Sie dann die maximale Trennung wie zuvor und sammeln Sie den Durchfluss, der die Lymphozyten enthält, um die Blutplättchen zu isolieren, zentrifugieren Sie, das reservierte plättchenreiche Plasma, und entfernen Sie dann das Plasma und waschen Sie das Zellpellet einmal mit fünf Millilitern sterilem PBS, ergänzt mit einem Mikrogramm pro Milliliter Prostaglandin I, zwei resuspendieren Sie das Plättchenpellet in einem Milliliter frischem PBS-Prostaglandin I zwei Puffer, um die isolierten Monozyten zu plattieren, Lymphozyten, Neutrophile und Blutplättchen. Zählen Sie zunächst die Zellen und bringen Sie sie auf ein geeignetes Volumen im XF-Assay-Medium, um eine Seeding-Dichte von 2,5 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Vertiefung in einem Volumen von 200 Mikrolitern zu ermöglichen. In einer 24-Well-XF-Zellkultur-Mikroplatte, die mit Zell-T beschichtet ist, für Blutplättchen 2,5 mal 10 auf die sieben Zellen pro Well in einem Volumen von 200 Mikrolitern aussäen.

Nachdem Sie die Zellen auf die Platte gedreht haben, bringen Sie das endgültige Well-Volumen mit XF-Medien auf bis zu 660 Mikroliter und inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius vor dem XF-Assay während der Inkubationsladung, geben Sie 75 Mikroliter der Assay-Reagenzien in der aufgeführten Reihenfolge in die Injektionsöffnungen der XF-Sensorpatrone. Wenn oxidative Burst-Messungen durchgeführt werden sollen, kann PMA nach dem Antimycin injiziert werden, und eine anschließende Beladung der Injektionsöffnung setzt die Kartusche auf den extrazellulären Flussanalysator, um den Assay zu starten. Die bioenergetischen Profile von Leukozyten und Blutplättchen können mit dem extrazellulären Flussanalysator Seahorse XF bestimmt werden, der den Sauerstoffverbrauch in Zellen in Echtzeit nicht-invasiv misst.

Jeder Zelltyp wird auf der XF 24 Mikroplatte mit fünf Replikaten plattiert, wie gerade in der Tabelle gezeigt. Repräsentative basale und oxidative Burst-Werte, die während des Assays gemessen wurden, und die durchschnittlichen Proteinkonzentrationen pro Vertiefung werden nach Zelltyp demonstriert. Die Werte der Sauerstoffverbrauchsrate werden auf den Gesamtproteingehalt in den entsprechenden Vertiefungen normiert und als p mol pro Minute pro Mikrogramm Protein ausgedrückt. Der basale Sauerstoffverbrauch wird dann durch die ersten drei Messungen ermittelt.

Oligomycin, ein Inhibitor der mitochondrialen A-TP-Synthase, wird in das XF-Medium injiziert, um die Sauerstoffverbrauchsrate gekoppelt an eine TP-Synthese abzuschätzen, und wird als TP-gebunden dargestellt. Die Restsauerstoffverbrauchsrate abzüglich der nicht-mitochondrialen Sauerstoffverbrauchsrate kann auf ein Protonenleck zurückgeführt werden. Die Zugabe des Entkopplungs-FCCP ermöglicht die Bestimmung der maximalen Sauerstoffverbrauchsrate, gefolgt von der Injektion von Antimycin a und einem Inhibitor der mitochondrialen Atmung, um die nicht-mitochondrialen Quellen des Sauerstoffverbrauchs zu messen. Die Reservekapazität ist ein Maß für die Menge an zusätzlicher Arbeit, die die Mitochondrien bei erhöhtem Energiebedarf leisten können, und kann als Differenz zwischen der maximalen Atmungsrate und der basalen berechnet werden, um die oxidative Burst-Kapazität von Monozyten und Neutrophilen zu bestimmen.

Der P-M-A-A-P-K-C-Agonist wird injiziert und die Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs ist mit der Oxidationsmittelproduktion durch N-A-D-P-H-Oxidase verbunden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in nur drei Stunden nach der Blutentnahme durchgeführt werden, wobei der Assay selbst nicht berücksichtigt wird, wenn er ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, indem jeder Schritt in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt und sterile Puffer und Medien bei Raumtemperatur verwendet werden. Nach diesem Verfahren können wir andere Protokolle durchführen, wie z. B. Faxanalysen, um die Reinheit der Zellen, den Aktivierungszustand der Leukozyten und auch die zelluläre Bioenergetik in Leukozyten-Subpopulationen zu bestimmen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun eine ziemlich klare Vorstellung davon haben, wie Sie Blutplättchen, Lymphozyten, Monozyten und Neutrophile vorbereiten und in das Seepferdchen einsetzen und den oxidativen Ausbruch und die mitochondriale Funktion anhand dieser Daten messen können. Dann können Sie Ihre Patientenpopulationen analysieren und in Echtzeit feststellen, wie sich ihre Bioenergetik verändert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Patientenproben äußerst gefährlich sein kann.

Daher müssen Sie während dieses Verfahrens eine persönliche Schutzausrüstung tragen und eine biologische Sicherheitswerkbank verwenden.