Bioenergetik und die Oxidative Burst: Protokolle für die Isolierung und Bewertung der menschlichen Leukozyten und Thrombozyten

In dem folgenden Protokoll wird die Messung der bioenergetischen Profile und oxidativer Burst-Antworten menschlicher Blutmonozyten, Lymphozyten, Neutrophilen und Thrombozyten demonstriert. Dies wird erreicht, indem zunächst die Buffy-Coat- und die thrombozytenreiche Plasmafraktion aus frisch entnommenem Blut gewonnen werden. In einem zweiten Schritt wird die heterogene Population der weißen Blutkörperchen mittels Dichtegradienten in mononukleäre und polymorphkernige Zellschichten getrennt.

Anschließend werden die reinen Populationen von Monozyten, Neutrophilen und Lymphozyten durch Maximaltrennung weiter isoliert und anschließend für die extrazelluläre Fluss- oder XF-Analyse ausplattiert. Letztendlich können die empfindliche und reproduzierbare Messung der mitochondrialen Funktion in Monozyten, Lymphozyten und Thrombozyten sowie die oxidative Burst-Aktivität der Sauerstoffverbrauchsrate von Monozyten und Neutrophilen mittels XF-Technologie gemessen werden. Der Vorteil der Technik, die wir Ihnen heute zeigen werden, besteht darin, dass Sie aus einer kleinen Blutprobe alle Hauptzelltypen gewinnen können, die im Blut des Patienten vorhanden sind.

Es handelt sich um Thrombozyten und Leukozyten in reiner inaktivierter Form, bei denen ihre mitochondriale Funktion gemessen wird. Wir sind der Ansicht, dass dies verschiedene Erkrankungen und Zustände des Patienten in Echtzeit widerspiegeln kann. Diese Methode könnte helfen, zentrale Fragen bezüglich des Stoffwechsels zu beantworten, beispielsweise welchen Einfluss Lebensstil, Ernährung und pathologischer Stress auf die mitochondriale Funktion haben.

Dieses Protokoll kombiniert mehrere Technologien zur Isolierung und Bestimmung der zellulären Bioenergetik in verschiedenen Leukozytenpopulationen sowie in Thrombozyten. Dieser Schritt des Protokolls ist sehr kritisch, da die Dichtegradienten- und die magnetische Trennung eine präzise Pipettierung erfordern. Außerdem müssen Sie stets wissen, wo sich die Zellpopulationen während der Fraktionierung befinden.

Wir demonstrieren die Isolierung peripherer Blutzellen und die Analyse der zellulären Bioenergetik mittels eines 24-Well-Extrazellulären-Flux-Analysators oder des XF 24. Dieses Verfahren kann jedoch auch am XF 96 durchgeführt werden. Mindestens zwei Stunden vor Beginn des Verfahrens hydratisieren Sie die Sondenpatrone des XF-Sensors mit XF Cran-Lösung.

Anschließend das frisch entnommene Vollblut 15 Minuten bei 500 × g und Raumtemperatur in einem Zentrifugenrotor mit Schwenkköpfen zentrifugieren. Mit einer Transferpipette die obere Schicht, die das thrombozytenreiche Plasma enthält, so weit entfernen, dass noch ein Zentimeter Plasma über der Erythrozyten-Buffy-Coat-Schicht verbleibt, und das Plasma bei Raumtemperatur für die spätere Verarbeitung beiseite stellen. Danach die Buffy Coat in ein steriles 50-Milliliter-Konischglas überführen und die weißen Blutkörperchen auf 24 Milliliter verdünnen.

Mit basalem RPMI anschließend drei Milliliter niedrigdichtes, trübes Medium mit einer Dichte von 1,077 in jeweils drei 15-Milliliter-Konizflaschen geben. Dann die Spitze einer fünf Milliliter fassenden engen Pipette in das jeweilige Rohrbodenende einführen. Nacheinander und langsam jeweils drei Milliliter hochdichtes, trübes Medium mit einer Dichte von 1,119 zugeben.

Verwenden Sie nun eine automatische Pipette auf der niedrigen Einstellung, um vorsichtig acht Milliliter des verdünnten Blutes zu jedem Gradienten hinzuzufügen, ohne die Schichten zu stören. Zur Visualisierung aller Gradientenschichten wurde dem niedrigdichten Gradienten blaue Farbe zugesetzt. Nach der getrennten Zentrifugation der Zellen sammeln Sie die mononukleären und polymorphkernigen Zellen mit sterilen Glaspipetten, ohne die anderen Zellbänder zu stören.

Vereinigen Sie die Populationen mononukleärer und polymorphonukleärer Zellen aus jedem Reagenzglas in jeweils ein steriles 50-Milliliter-Konischglas für jeden Zelltyp und geben Sie vier Volumina RPMI zu beiden Röhrchen hinzu. Nach dem Zentrifugieren der Zellen überführen Sie die Pellets in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, zentrifugieren erneut und resuspendieren in 80 Mikrolitern frischem RPMI, ergänzt mit BSA. Geben Sie anschließend jeweils 20 Mikroliter magnetischer Perlen-markierter anti-CD-14- und anti-CD-15-Antikörper zu den Fraktionen der mononukleären bzw. polymorphonukleären Zellen hinzu.

Inkubieren Sie jede Zellsuspension 15 Minuten bei vier Grad Celsius und waschen Sie jedes Reagenzglas mit einem Milliliter R-P-M-I-B-S-A-Medium. Resuspendieren Sie die Pellets in 500 Mikrolitern R-P-M-I-B-S-A. Tragen Sie anschließend die Zellsuspensionen auf einzelne mit R-P-M-I-B-S-A gewaschene LS-Säulen auf und waschen Sie jede Säule dreimal mit jeweils drei Millilitern R-P-M-I-B-S-A-Medium. Sammeln Sie die Durchläufe der Zellsuspensionen und die Säulenwäschen in sterilen Röhrchen, um die Monozyten und Neutrophilen zu isolieren. Entfernen Sie nach dem letzten Waschschritt die Säulen aus dem Magnetfeld und eluieren Sie die positiv selektierten Zellen mit fünf Millilitern R-P-M-I-B-S-A in ein steriles Röhrchen. Um die Lymphozyten zu isolieren, zentrifugieren Sie die Durchlaufwäsche-Fraktion der Zellsäule, resuspendieren Sie das Zellpellet in 80 Mikrolitern R-P-M-I-B-S-A und inkubieren Sie die Zellen mit 20 Mikrolitern CD 61- und CD 2 35 A-Antikörpern 15 Minuten bei vier Grad Celsius.

Wiederholen Sie dann die maximale Trennung wie zuvor und sammeln Sie den Durchlauf, der die Lymphozyten enthält, um die Thrombozyten zu isolieren. Zentrifugieren Sie das zurückgehaltene thrombozytenreiche Plasma und entfernen Sie anschließend das Plasma. Waschen Sie das Zellpellet einmal mit fünf Millilitern steriler PBS, die mit einem Mikrogramm pro Milliliter Prostacyclin I2 ergänzt wurde. Resuspendieren Sie das Thrombozytenpellet in einem Milliliter frischer PBS-Pufferlösung mit Prostacyclin I2, um die isolierten Monozyten, Lymphozyten, Neutrophilen und Thrombozyten zu plattieren. Zählen Sie zunächst die Zellen und stellen Sie sie in einem geeigneten Volumen im XF-Assay-Medium so ein, dass eine Ansiedlungsdichte von 2,5 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung in einem Volumen von 200 µL erreicht wird. In einer 24-Loch-XF-Zellkultur-Mikroplatte, beschichtet mit Cell-T für Thrombozyten, geben Sie 2,5 × 10⁷ Zellen pro Vertiefung in einem Volumen von 200 µL ein.

Nachdem die Zellen auf die Platte zentrifugiert wurden, die Endvolumina der Vertiefungen mit XF-Medium auf 660 Mikroliter auffüllen und die Platten vor dem XF-Assay 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Während dieser Inkubationszeit die 75 Mikroliter der Assayreagenzien in der angegebenen Reihenfolge in die Injektionsöffnungen der XF-Sensor-Kartusche geben. Falls Oxidative-Burst-Messungen durchgeführt werden sollen, kann PMA nach Antimycin über eine folgende Injektionsöffnung zugegeben werden. Danach die Kartusche auf den extrazellulären Flussanalysator setzen, um das Assay zu starten. Die bioenergetischen Profile von Leukozyten und Thrombozyten können mithilfe des Seahorse-XF-Extrazellulärer-Fluss-Analysators bestimmt werden, der den Sauerstoffverbrauch in Zellen in Echtzeit nichtinvasiv misst.

Jede Zellart wird wie in der Tabelle gezeigt in fünffacher Wiederholung auf der XF 24-Mikroplatte ausgesät. Repräsentative Werte für die basale Atmung und den oxidativen Burst, wie sie während des Assays gemessen wurden, sowie die durchschnittlichen Protein-Konzentrationen pro Mulde werden nach Zellart dargestellt. Die Sauerstoffverbrauchsrate wird auf den Gesamtproteingehalt der entsprechenden Mulden bezogen und als pmol pro Minute pro Mikrogramm Protein angegeben. Die basale Sauerstoffverbrauchsrate wird anschließend aus den ersten drei Messungen ermittelt.

Oligomycin, ein Inhibitor der mitochondrialen ATP-Synthase, wird in das XF-Medium injiziert, um die Sauerstoffverbrauchsrate abzuschätzen, die mit der ATP-Synthese gekoppelt ist, und wird als ATP-gekoppelt dargestellt. Die verbleibende Sauerstoffverbrauchsrate abzüglich der nicht mitochondrialen Sauerstoffverbrauchsrate kann dem Protonenleck zugeschrieben werden. Die Zugabe des Entkoppelungsmittels FCCP ermöglicht die Bestimmung der maximalen Sauerstoffverbrauchsrate, gefolgt von der Injektion von Antimycin A, einem Inhibitor der mitochondrialen Atmung, um die nicht mitochondrialen Quellen des Sauerstoffverbrauchs zu messen. Die Reservkapazität ist ein Maß für die zusätzliche Leistung, die die Mitochondrien unter erhöhtem Energiebedarf erbringen können, und kann als Differenz zwischen der maximalen Atmungsrate und der basalen berechnet werden, um die oxidative Burst-Kapazität von Monozyten und Neutrophilen zu bestimmen.

Es wird ein P-M-A-A-P-K-C-Agonist injiziert, und der Anstieg der Sauerstoffverbrauchsrate wird mit der Bildung von Oxidantien durch die N-A-D-P-H-Oxidase verknüpft. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bereits innerhalb von drei Stunden nach der Blutentnahme durchgeführt werden, ohne die eigentliche Analyse einzuschließen, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Während des Verfahrens ist es wichtig, sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten, indem jeder Schritt in einem biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt wird und sterile Puffer sowie Medien bei Raumtemperatur verwendet werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Protokolle durchgeführt werden, wie beispielsweise die FACS-Analyse zur Bestimmung der Zellreinheit, des Aktivierungszustands der Leukozyten sowie zur Untersuchung der zellulären Bioenergetik in Unterpopulationen von Leukozyten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun eine ziemlich klare Vorstellung davon haben, wie man Thrombozyten, Lymphozyten, Monozyten und Neutrophile vorbereitet, sie in den Seahorse-Gerät gibt und den oxidativen Burst sowie die mitochondriale Funktion anhand dieser Daten misst. Anschließend können Sie Ihre Patientengruppen analysieren und ermitteln, wie sich ihre Bioenergetik in Echtzeit verändert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Patientenproben äußerst gefährlich sein kann.

Daher müssen Sie persönliche Schutzausrüstung tragen und während dieses Verfahrens einen Sicherheitswerkbank für biologische Arbeitsgänge verwenden.