Verwendung eines Caspase Multiplexing-Test zur Apoptose in einer Zelle Hypothalamus Modell ermitteln

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, einen Multiplex-Assay mit hoher Leistung zu demonstrieren, um den Beginn der Apoptose, gemessen durch Caspase, zu bestimmen. Drei sieben. Zuerst werden hypothalamische Neuronen mit der apoptotisch induzierenden gesättigten Fettsäure Palmitinsäure herausgefordert.

Dann wird die Zellviabilität der Neuronen mit einem fluoreszierenden Reagenz und einem Mikroplatten-Reader nach Beginn der Apoptose gemessen. Das Lumino-Substrat DEVD, eine Aminosäuresequenz, die von Caspase drei gespalten wird, wird den Zellen zugesetzt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Lumineszenz mit einem Mikroplatten-Reader zu messen, um die Caspase-Aktivität zu bestimmen, die in Zellen zunimmt, die sich einer Apoptose unterziehen.

Letztendlich kann ein Verhältnis der Caspase-Aktivität pro lebensfähiger Zelle in weniger als fünf bis sechs Stunden erhalten werden. Im 96-Well-Format. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber unseren bestehenden Methoden, wie Western Blots oder Lyse, besteht darin, dass es sich um einen schnellen, kostengünstigen Assay handelt, der die Caspase-Drei-Sieben-Aktivität in mehreren Well-Formaten direkt messen kann.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf diesem Gebiet zu beantworten, wie z. B. die Bestimmung der primären Modulatoren der Apoptose. Der Nutzen dieser Technik besteht darin, dass dieses Multiplexing als genaue Methode zur Beurteilung der Zytotoxizität und Lebensfähigkeit verwendet werden kann. Obwohl der Assay recht einfach ist, ist eine visuelle Demonstration dieser Methode von entscheidender Bedeutung, da sie sicherstellt, dass der Assay erfolgreich abgeschlossen wird.

Diese Methode kann zwar Aufschluss über die Neurodegeneration geben, kann aber auch auf andere Krankheiten und In-vitro-Modelle angewendet werden, wie sie beispielsweise in der Krebsforschung verwendet werden. Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, müssen diese Technik optimieren, da die Endpunkte von der Zelllinie und den Agonisten abhängen. Die Aktivität von Caspase drei und sieben ist vorübergehend.

Abhängig von der Wirksamkeit des Zellstressors kann daher die Bestimmung des geeigneten Zeitpunkts für den Assay der Cast-Base-Aktivität einige Anstrengungen erfordern, um schnell zu beginnen. Tauen Sie eingefrorene 12 Zellen in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf. Nach dem Auftauen werden die Zellen vorsichtig in einen 75 Quadratzentimeter großen, belüfteten Kulturkolben geleitet, 10 Milliliter warme Delcos, modifizierte Eagles, Medium oder DMEM hinzugefügt und den Kolben über Nacht in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Nach 24 Stunden wird das Medium aspiriert und durch frisches Medium ersetzt, um das Wachstum der Zellen fortzusetzen, bis nach zwei bis drei Tagen Wachstum zwischen 70 und 80 % Konfluenz erreicht ist. Zur Zählung erwärmen die Zellen zunächst DMEM und eine x Trypsin, EDTA-Lösung auf 37 Grad Celsius. Das Medium wird aus dem Kolben aspiriert und zweimal mit steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen.

Fügen Sie 500 Mikroliter Tryinlösung hinzu, bevor Sie zwischen zwei und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Zellen werden mit einem Schaber aus dem Kolben gelöst und in fünf Millilitern Medium suspendiert. Geben Sie die Zellen durch ein Zellsieb in ein sauberes 50-Milliliter-Röhrchen.

Es kann notwendig sein, die Zellen mehr als einmal durch das Sieb zu führen, aber wiederholen Sie dies nicht mehr als dreimal, nachdem Sie die Zellen mit einem Hämozytometer-Saatgut gezählt haben. 6.000 Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte mit klarem Boden und schwarzen oder weißen Wänden in einem Endvolumen von 100 Mikrolitern Medium, Inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Übertragen Sie Palmitinsäure in ein steriles Fünf-Milliliter-Glasfläschchen und lösen Sie es in 100%igem DMSO auf.

Nachdem Sie die Stammpalmitinsäurelösung eins bis 10 in DMSO verdünnt haben, fügen Sie sie zu PREWARM DMEM hinzu, um eine endgültige Arbeitskonzentration von 0,1 millimolare Palmitinsäure für Kontrollmedien zu erhalten, fügen Sie die gleiche Konzentration von DMSO hinzu, die zu Medien hinzugefügt wurde, die Palmitinsäure enthalten. Entfernen Sie das Medium in jeder Vertiefung und ersetzen Sie es durch 50 Mikroliter mittlere Plus- oder Minussäure und inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei 5 % Kohlendioxid und 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann fünf Mikroliter Harzreagenzien hinzu und inkubieren Sie nach der Inkubation 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, laden Sie die Platte auf einen Multimode-Mikroplatten-Reader und zeichnen Sie die Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 560 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 590 Nanometern auf.

Um die Zellhaftung zu messen, werden die Ergebnisse als relative Fluoreszenzeinheiten auf derselben Platte dargestellt. 55 Mikroliter DEVD Cast-Reagenz zugeben und zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Wieder unter Verwendung des Mikroplatten-Reader-Datensatzes zur Messung der Caspase-Drei-Sieben-Aktivitätsergebnisse werden die Aktivitätsergebnisse als relative Lumineszenzeinheiten dargestellt, wobei die Lumineszenz direkt proportional zu Caspase drei sieben ist, um die Caspase-Aktivität drei sieben zur Zellzahl zu normalisieren, die Zellviabilität durch Caspase drei sieben Aktivität zu dividieren.

Dieses Protokoll beschreibt die Ergebnisse des Multiplexings von zwei separaten Assays, um die Mechanismen des Zelltods durch Apoptose zu bestimmen. Die Caspaseaktivität war in Zellen, die mit Palmitinsäure konfrontiert waren, signifikant erhöht. Nach zweistündiger Inkubation ist die Integrität der Zellmembran in Gegenwart von Palmitinsäure sichtbar verändert.

Hier ist der mögliche Weg dargestellt, in dem Palmitinsäure Apoptose induziert. Das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen des Stressors, der zur Induktion der Apoptose verwendet wird, hilft bei der Bestimmung der Zeitdauer für die Inkubation des Stressors. Da Caspase-Enzyme aktiviert werden müssen, bevor sie mit dem DEVAD-Substrat interagieren, kann diese Technik nach der Beherrschung in weniger als fünf bis sechs Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Multiplex-Caspase-Assay mit drei sieben Aktivitäten unter Verwendung eines In-vitro-hypothalamischen neuronalen Zellkulturmodells durchführen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Inkubationszeiten von den Zelltypen und den verwendeten Stressoren oder Agonisten abhängen. Die Entwicklung dieser Technik ermöglicht es Forschern im Bereich der Neurowissenschaften, eine zuverlässige und zeitsparende Technik für apoptotische Studien zu verwenden. Nach diesem Verfahren können zusätzliche pharmakologische Assays durchgeführt werden, die auf bestimmte Proteine innerhalb des apoptotischen Prozesses abzielen, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu beschreiben, die degenerative Erkrankungen auslösen.