Name: Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Lernen Sie die RNA-Interferenz in murinen Makrophagen mittels Amaxa-Nucleofector-System zur Untersuchung der angeborenen Immunantwort. Diese Methode ermöglicht hochdurchsatzfähige Genfunktionsanalysen.

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Danke an Brad Lackford für die Unterstützung bei der Optimierung einiger der in diesem Manuskript beschriebenen Techniken.

1. Aufrechterhaltung der Makrophagenzellinien <ol><li> Wachsen RAW264.7 und J774A.1 Zelllinien in DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ºC in Gegenwart von 5% CO 2. Zur Aufrechterhaltung der Sterilität wird mit 1% Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep) an die Medien (obwohl dies nicht unbedingt erforderlich). </li><li> Critical Schritt: Stellen Sie sicher, dass die Makrophagen werden in einem gesunden Zustand wächst für eine effiziente Transfektion und siRNA-induzierte Gen Knockdown. Verwenden Zellen zwischen den Passagen 3 und 10 nach frischen Auftauen, da diese Makrophagen Linien zeigen die besten Transfektionseffizienz und pflegen robust nach der Transfektion Überleben in diesem Stadium; nicht mit einem höheren Durchlaufhäufigkeit (&gt; 20), als Transfektionseffizienz und Knock-down sowohl stark vermindert. </li><li> Für eine optimierte siRNA Transfektion Platte Zellen bei 20% Konfluenz und wachsen ein bis zwei Tage, bis die Zellen nicht mehr als 80% Konfluenz erreichen. Overgrown Zellen nicht transfizieren efficiently. </li></ol> 2. Programmierung der 96-Loch-Shuttle System zur Transfektion <ol><li> Startet den 96-well-Shuttle-Software auf dem Computer mit dem Shuttle verbunden. Wählen Sie neue Parameterdatei von der oberen linken Dateimenü. </li><li> Markieren der Vertiefungen, die auf der angezeigten Platte mit 96 Vertiefungen schema transfiziert werden. Ein grünes Feld zeigt an, welche Brunnen ausgewählt. </li><li> Wählen Sie das Programm, das auf die Makrophagen-Zelllinie verwendet (DS-136 für RAW264.7 oder DS-130 für J774A.1), und wählen gelten, unter dem diagramed 96-Well-Platte befindet entspricht. Beachten Sie, dass nach der Programmwahl, die Vertiefungen auf der schematischen Platte wird dunkelblau eingefärbt werden. Leere Kreise zeigen Brunnen, die nicht ein Programm zugewiesen haben und nicht schockiert sein. </li></ol> 3. Vorbereitung der Reagenzien für die Transfektion <ol><li> Herstellung der Arbeits Nucleofector ™ Lösung durch Mischen SF-Zelllinie mit 96 Vertiefungen Nucleofector ™ Lösungmit dem Inhalt des beiliegenden Ergänzungsrohr. Ermöglichen, dass die gemischten Reagenzien bei Raumtemperatur vor der Verwendung äquilibriert. Speichern überschüssige komplette Nucleofector ™ Lösung bei 4 ° C für bis zu 3 Monate für die zukünftige Verwendung. </li><li> Vorwärmen der DMEM, RPMI-1640, 0,25% Trypsin / EDTA und Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) bei 37 ºC vor der Herstellung der zur Transfektion Makrophagen. </li><li> Bereiten Sie die siRNA zur Transfektion durch Auftauen auf Eis. Um die Anzahl der Frost taut der siRNA minimieren, Gefriert neue siRNAs in Aliquots sie das erste Mal verwendet werden. </li><li> In ersten Experimenten verwendet siRNA in einer relativ hohen Dosis von 2 &amp; mgr; M (1:10 verdünnt 20 &amp; mgr; M Bestände). Anschließend titriert siRNAs, die robust Gen auf niedrigere Dosen Knockdown zu induzieren, obwohl typischerweise höhere Dosen sind für eine effiziente Gen Knockdown in Makrophagen im Vergleich zu anderen Zelltypen benötigt. HINWEIS: siRNAs sind aus vielen Quellen erhältlich; recht robust Knock-down kann erhalten werdenVerwendung siGENOME SMARTPOOLs, die Pools von vier siRNAs jedes Gen sind. Als negative Kontrolle, verwenden Sie eine verschiedene nicht-Targeting siRNA Pools oder siRNAs. </li><li> Zur Überwachung der Transfektionseffizienz, Transfektion entweder die pmaxGFP Kontrollplasmid (in den Amaxa Kits bereitgestellt) oder fluoreszenzmarkierten siRNAs parallel zu den experimentellen siRNAs. 30-50% erwartet Transfektion des GFP-Plasmid (durch Mikroskopie getestet oder Durchflusszytometrie Tag nach der Transfektion) und&gt; 99% der Transfektion von fluoreszenzmarkierten siRNA (durchflusszytometrisch unmittelbar nach der Transfektion und Gewinnung getestet). </li></ol> 4. Vorbereiten der Makrophagen für die Transfektion <ol><li> Trennen adhärenten Makrophagen aus den Zellkulturschalen durch Trypsinierung. Saugen Sie die Medien und waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml PBS. Nach Entfernen des PBS, inkubiert die Zellen mit vorgewärmtem 0,25% Trypsin / EDTA (1 ml / 10 cm Platte) für 1-2 min, bis die Zellen beginnen, abzunehmen. Die Platte vorsichtig antippen und verschieben Sie die Lösungention während der Inkubation zu Trypsinierung maximieren. </li><li> Nach der Inkubation hinzufügen 9 ml DMEM + FBS Medien, vorsichtig mischen auf und ab, und sammeln die Zellen durch Pipettieren in einem sterilen Röhrchen. </li><li> Zähle die Anzahl der isolierten Makrophagen mit einer Zählkammer. Erwarten Sie etwa 10 Millionen Makrophagen pro 10 cm Platte. Berechnung der Gesamtzahl von Makrophagen erforderlich ist; jede Vertiefung der 96-Well-Shuttle erfordert 200.000 Zellen. Denken Sie daran, im Wert von Zellen, die ein paar zusätzliche Brunnen &#39;in den zum Pipettieren Verluste ermöglichen. </li><li> Pipettieren die berechnete Anzahl von Zellen in ein Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren der Zellen für 10 min bei 150 xg bei Raumtemperatur. Zu schnell Zentrifugieren Sie keine, da dies Makrophagen Gesundheit und Transfektionseffizienz verringern. </li></ol> 5. Nucleofection von Makrophagen mit siRNA <ol><li> Mit einer sterilen 96-Well-Rundbodenplatte (das Mischen erleichtert und minimiert Reagenzienverlust), fügen Sie 2 ul jeder siRNA in jede Vertiefung zu sein transfreflektierte. Hinweis: Je nach der Anzahl der siRNAs, kann dies während des Makrophagen Zentrifugationsschritt durchgeführt werden. </li><li> Saugen Sie das Medium aus dem zentrifugiert Zellen. Erythrozyten vorsichtig resuspendieren in Nucleofector ™ -Lösung SF (mit dem Ergänzungslösung), unter Verwendung von 20 &amp; mgr; l pro 200.000 Zellen pelletiert. Sobald resuspendiert, verwenden Sie die Zellen sofort für eine optimale Transfektion. </li><li> Übertragen resuspendierten Zellen in ein steriles Trog; mit einer Mehrkanalpipette, Transfer 20 ul der resuspendierten Zellgemisch in jede Vertiefung der 96-Well-Platte mit den siRNAs. Vorsichtig mischen oben und unten. </li><li> Transfer 20 ul der Zell / siRNA-Gemisch in die 96-Well-Platte Nucleocuvette ™ kritischer Schritt. Erzeugen von Blasen zu vermeiden, während der Übertragungsschritt so kann Fehler während Nucleofection induzieren. </li><li> Nach dem Platzieren aller Versuchsproben in der Transfektion Platte Bedeckung die 96-well Platte mit dem Deckel versehen und very klopfen Sie leicht auf eine harte Oberfläche, um alle Blasen aus den Proben zu entfernen. </li><li> Zeigen 96-Well-Platte mit Deckel in den 96-Loch-Nucleofector Shuttle und wählen Sie &quot;laden und starten&quot; auf der rechten unteren Ecke des Programmbildschirm. Vor Nucleofection, folgen Sie dem Programm Aufforderung, um die Ergebnisse zu speichern. Hinweis: Während der Nucleofection Prozess, Brunnen erfolgreich transfiziert werden auf der 96-Loch-auf dem Bildschirm schema durch einen grünen Kreis mit einem Pluszeichen dargestellt werden. Ein roter Kreis mit Minuszeichen zeigt einen Fehler an, höchstwahrscheinlich aufgrund von Blasen oder Fehl Pipettieren das richtige Volumen von Reagenzien. </li></ol> 6. Wiederherstellung und Oberflächen von Makrophagen <ol><li> Unmittelbar nach Nucleofection, mit einer Mehrkanalpipette je 80 ul vorgewärmten (37 ° C) RMP1-1640 Medien in jede Vertiefung. Fügen Sie die Medien auf der Seite jeder gut, so dass die Medien langsam mit den transfizierten Zellen, die sehr empfindlich sind in dieser Stufe mischen. Haben die Medien nicht zu schnell, da diesstark vermindern Lebensfähigkeit. </li><li> Platzieren Sie die Platten mit 96 Vertiefungen transfiziert mit Proben und RPMI-1640 in einem 37 ºC-Inkubator mit 5% CO 2 für 2 min; Dies ist wichtig, damit die Zellen sich zu erholen, bevor Manipulation weiter. </li><li> Entfernen Sie den 96-Well-Platte aus dem Inkubator und die Mischung vorsichtig übertragen aus jeder Vertiefung in eine 96-Well-Gewebekulturplatte mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Mit einer Mehrkanalpipette, 100 l vorgewärmten (37 ° C) DMEM + FBS-Medium in jede Vertiefung. </li><li> Inkubieren des 96-Well-Gewebekulturplatte mit Proben in einem 37 ºC-Inkubator mit 5% CO 2 für 24-36 h (Optimierung der genaue Zeitpunkt für die einzelnen siRNAs, wobei diese Zeitbereich arbeitet im allgemeinen gut). </li></ol> 7. Die Stimulation der Makrophagen mit LPS <ol><li> Im Anschluss an die 24 bis 36 Stunden nach der Nucleofection Inkubation vorbereiten LPS (oder andere PAMPs) in frischem Medium. Bereiten Sie genügend frisches Medium für alle Vertiefungen (200 ul medien / Vertiefung der 96-Well-Platte plus ein kleines Extra für Pipettieren). Verdünnte LPS in einer Endkonzentration von 20 ng / ml in DMEM + FBS. </li><li> Saugen Sie vorsichtig Medien aus dem 96-Well-Platte und fügen Sie die frische Medien mit den LPS zu den Zellen. </li><li> Überwachung der Reaktion auf LPS oder andere PAMPs zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation. 6 Stunden ausreichend, um eine robuste inflammatorische Zytokin-Antwort für Cytokine wie IL-6 oder TNF &amp; alpha; zu erzeugen. </li></ol> 8. Überwachung der induzierten angeborenen Immunantwort, Knock-down und Lebensfähigkeit in Makrophagen <ol><li> LPS-induzierte Cytokin-Produktion zu überwachen, Pipetten den Überstand von den Zellen in eine 96-Well Platte. Cytokin-Produktion kann dann durch ELISA gemessen werden. </li><li> Nachdem der Überstand entfernt wird, überwacht die Zelllebensfähigkeit mit Fluorescein-Diacetat (wenn durch zelluläre Esterasen in lebenden Zellen gespalten wird, wird diese Verbindung fluoreszierend). Identifizieren siRNAs, die Zielgene, die die Lebensfähigkeit der Zellen zu steuern mit tseinen Ansatz. Hinweis: Die Transfektion Prozess selbst sollte eine geringe Wirkung auf die Lebensfähigkeit haben, wenn sie richtig durchgeführt wird. <ol><li> In Fluoresceindiacetat (5 mg / ml Stamm in Aceton) in jede Vertiefung (1: 100 endg Verdünnung in PBS). </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für ein bis fünf Minuten, und anschließend die Fluoreszenz in den Zellen unter Verwendung eines Plattenlesegerät (460 nm Anregung, 515 nm Emission) zu überwachen. </li><li> Optional: Um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz in den Vertiefungen ist einheitlich, lysieren die Zellen mit Puffer wie RIPA; Dies stellt eine gleichförmige Fluoreszenzsignal in dem Bohrloch, wie einige Plattenleser so konfiguriert sind, nur einen kleinen Teil des Schachtes zu überwachen; Wenn die Zellen nicht gleichförmig überzogen, könnte das Fluorescein-Diacetat ein ungenaues Lesen zu geben. </li></ol></li><li> Als eine Alternative zur Überwachung Zelllebensfähigkeit, überwachen siRNA-induzierte Gen-Knockdown von qPCR unter Verwendung von RNA aus den anhaftenden Zellen. <ol><li> Nachdem der Überstand wird von den Zellen entfernt (Schritt 8.1), Add RLT-Puffer (die Lyse und Konservierung von RNA verwendet wird) direkt auf die anhaftenden Zellen, um sie zu lysieren. </li><li> Isolieren RNA mit einem RNA Vorbereitung Kit wie die RNeasy Mini-Kit, und verwenden qPCR mit Gen-spezifischen Primern, um Gen-Knockdown relativ zu siRNA Behandlung steuern überwachen. Verwenden Primer an Βactin oder GAPDH zur Normalisierung. </li></ol></li><li> Als eine weitere Alternative zu anderen Aspekten der angeborenen Immunantwort zu überwachen, überwacht die phagozytische Fähigkeit der Makrophagen durch Zugabe von FITC-markierte E. coli Partikel direkt auf die anhaftenden Zellen unter Verwendung eines Kits. Nach Herstellerprotokoll, das nur ein paar Stunden dauert, zu überwachen Phagozytose mit einem Plattenleser oder Mikroskopie. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen. Dieser Artikel wurde von Lonza, Inc. gesponsert

Es wurden zahlreiche Studien veröffentlicht, in denen einzelne Gene von siRNA in murinen Makrophagen gezielt worden. Während Lipid-vermittelte Transfektion wurde verwendet, um siRNA zur Makrophagenzelllinien auf einer individuellen Basis zu liefern, leiden diese Verfahren unter potentiellen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit, begrenzte Knock-down, und die Variabilität von Gen zu Gen. Um robustere Assays, die verwendet werden könnten, um Gene in Mittel- oder Hochdurchsatzverfahren zielen entwickeln optimierten wir Tech...

In diesem Protokoll beschreiben wir effiziente Verfahren, um Gene in Maus-Makrophagen-Zelllinien unter Verwendung von siRNAs zu hemmen und die Wirkung dieser Behandlungen auf die angeborene Immunantwort zu überwachen. Diese Verfahren werden in 96-Well-Format durchgeführt, so dass für RNAi-Screens in Mittel- oder Hochdurchsatz-Mode. In Reaktion auf eine Infektion, montieren Menschen sofort angeborenen Immunantwort und eine langsamere, aber bestimmte adaptive Immunantwort. Diese schnelle angeborenen Immunantwort beinhaltet die Rekrutierung und Aktivierung von phagozytierenden angeborenen Immunzellen einschließlich Makrophagen ein. Klassisch aktivierte Makrophagen sind im akuten Entzündungsreaktionen beteiligt und produzieren antimikrobielle Proteine ​​und Verbindungen, Zytokine und Chemokine, und präsentieren Antigene 2,3. Alternativ aktivierte Makrophagen spielen eine Rolle bei der Regulierung der Immunität, die Aufrechterhaltung der Toleranz, die Gewebereparatur und Wundheilung 4-8. Aufgrund ihrer breiten Palette von Funktionen, Makrophagen eine Rolle bei zahlreichen Krankheiten, darunter Arteriosklerose, Arthritis und Krebs 9 spielen. Somit hat das Studium der Makrophagen für einige Zeit in einer Vielzahl von Krankheitsfelder ein Schlüsselbereich der Forschung. Trotz ihrer großen Bedeutung in der angeborenen Immunantwort kann Makrophagen werden herausfordernde Zellen, mit zu arbeiten. Insbesondere ist es schwierig, eine effiziente Transfektion mit Lipidreagenzien in Makrophagen ohne assoziierte Toxizität 10,11 erhalten. Außerdem, selbst wenn siRNA wirksam an Makrophagen geliefert, die Robustheit der RNAi-induzierten Gens oft Knockdown kann ziemlich moderat sein und kann von Gen zu Gen variieren. Um diese technischen Herausforderungen zu überwinden, haben wir Transfektion und Zuschlagsverfahren 12-16 in zwei Maus-Makrophagen-Zelllinien, RAW264.7 17 und J774A.1 18 optimiert. Dieser Ansatz nutzt die Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System zur Transfektion; Dieses Systemverwendet eine Kombination von Spezialreagenzien und Elektroporation von Zellen in 96-well Format 19 transfizieren. Nach der Transfektion beschreiben wir Methoden zur Zellgewinnung und Lebensfähigkeit zu maximieren und die anschließende siRNA-induzierte Gen Knockdown zu maximieren. Um den Nutzen dieses Ansatzes zu verdeutlichen, beschreiben wir ein Protokoll für siRNA auf diese Makrophagen-Zelllinien, diese Zellen zu stimulieren mit Lipopolysaccharid (LPS) und überwachen die angeborene Immunantwort auf der Ebene der Produktion von mehreren pro-inflammatorischen Zytokinen. Wir stellen Beispieldaten, in denen wir den Toll-like Rezeptor (TLR) Familie, deren Mitglieder spüren LPS und andere Erreger associated molecular patterns (PAMPs), um angeborene Immunität regulieren Ziel.

<table><tbody><tr><td>Amaxa Nucleofector 96-Well-Shuttle-System</td><td>Lonza</td><td>AAM-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa SF Zelllinie 96-Well-Nukleofector</td><td>Kit Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 Maus-Makrophagen-Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 Maus-Makrophagen-Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>siGenome smartpool siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>variiert je nach auf dem Gen</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-Targeting-Kontroll-siRNA-Pool</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-13-20</td><td></td></tr><tr><td>Block-iT Fluoreszenz-Oligo für die Elektroporation</td><td>Invitrogen</td><td>13750062</td><td></td></tr><tr><td>Ultrareines E. coli O111:B4 LPS</td><td>List Biological Laboratories</td><td>421</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Invitrogen mit hohem Glukosegehalt</td><td></td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung (Pen/Streptomycin)</td><td>Fisher</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Gewebekulturplatten</td><td>Fisher</td><td>07-200-89 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Sterilplatten mit rundem Boden (nicht beschichtet)</td><td>Fisher</td><td>07-200-745</td><td></td></tr><tr><td>Maus IL-6 Duoset ELISA-Kit</td><td>R& D Biosystems</td><td>DY406</td><td></td></tr><tr><td>Maus TNF&alpha; Duoset ELISA-Kit</td><td>R& D Biosystems</td><td>DY410</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceindiacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378</td><td></td></tr><tr><td>RLT-Puffer</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini-Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant Phagozytose-Assay-Kit</td><td>Invitrogen</td><td>V-6694</td><td></td></tr></tbody></table>

mit rna-interferenz, um die angeborene immunantwort in makrophagen der maus untersuchen

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Makrophagen sind wichtige phagozytäre angeborene Immunzellen. Wenn Makrophagen auf einen Krankheitserreger treffen, produzieren sie antimikrobielle Proteine und Verbindungen, um den Erreger abzutöten, produzieren verschiedene Zytokine und Chemokine, um andere Immunzellen zu rekrutieren und zu stimulieren, und präsentieren Antigene, um die adaptive Immunantwort zu stimulieren. Daher ist die Fähigkeit, Makrophagen mit Techniken wie RNA-Interferenz (RNAi) effizient zu manipulieren, entscheidend für unsere Fähigkeit, diese wichtige angeborene Immunzelle zu untersuchen. Makrophagen können jedoch technisch schwierig zu transfizieren sein und einen ineffizienten RNAi-induzierten Gen-Knockdown aufweisen. In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur effizienten Transfektion von zwei Maus-Makrophagen-Zelllinien (RAW264.7 und J774A.1) mit siRNA unter Verwendung des Amaxa Nucleofector 96-Well-Shuttle-Systems und beschreiben Verfahren zur Maximierung der Wirkung von siRNA auf den Gen-Knockdown. Darüber hinaus sind die beschriebenen Methoden für die Arbeit im 96-Well-Format geeignet, was Studien mit mittlerem und hohem Durchsatz ermöglicht. Um die Nützlichkeit dieses Ansatzes zu demonstrieren, beschreiben wir Experimente, die RNAi verwenden, um Gene zu hemmen, die die Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte Zytokinproduktion regulieren.

Um die Effizienz der Transfektion unter Verwendung dieses Ansatzes zu demonstrieren, verfolgten wir die Aufnahme von FITC-markierter siRNA unter Verwendung eines Durchflusszytometers (Abbildung 1). Um die Brauchbarkeit des Ansatzes zur Überwachung der angeborenen Immunantwort zu veranschaulichen, transfizierten wir siRNAs bekannten angeborenen Immunregulationsgene in die RAW264.7 Makrophagen-Zelllinie, die Zellen stimuliert mit LPS und dann überwacht Produktion der proinflam...

In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur effizienten Transfektion von murinen Makrophagen-Zelllinien mit siRNAs unter Verwendung des Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systems, zur Stimulation der Makrophagen mit Lipopolysaccharid und zur Überwachung der Auswirkungen auf die Produktion von entzündlichen Zytokinen.

Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe der RNA-Interferenz die Wirkung von Kandidatengenen auf die angeborene Immunantwort zu untersuchen. Um dies in Maus-Makrophagen durchzuführen, werden Zelllinien von Maus-Makrophagen abgelöst, mit Transfektionslösung und den gewünschten siRNAs kombiniert, und das Gemisch wird anschließend auf eine 96-Well-Nukleovette-Platte übertragen. Ein Maxa-96-Well-Transfektionssystem wird verwendet, um die siRNA in die Makrophagen einzubringen. Nach einer Inkubation mit Zellkulturmedium werden LPS oder andere Aktivatoren der angeborenen Immunität den transfizierten Makrophagen zugesetzt, um sie zu stimulieren. Schließlich werden ELISA-Analysen durchgeführt, um die Zytokinproduktion zu überwachen und die Wirkung der siRNA-Behandlung auf die angeborene Immunantwort zu bewerten.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der lipidvermittelten Transfektion liegt darin, dass unser Assay robust ist und auf viele Gene im Hochdurchsatzverfahren angewendet werden kann. Der Schlüssel zu dieser Methode besteht darin, mit gesunden Zellen zu arbeiten, sie schonend zu behandeln und während des Transfektionsprozesses effizient vorzugehen. Wie wir zeigen werden, verwendet dieses Protokoll die rohe 2 64 0.7 Maus-Makrophagen-Zelllinie, die gemäß der beiliegenden Dokumentation kultiviert wird.Zur Vorbereitung der INA-Transfektionsplatte werden die Zellen bei 20 % Konfluenz angesät und ein bis zwei Tage lang kultiviert, bis sie maximal 80 % konfluent sind. Es ist wichtig, Zellen im Passagenbereich drei bis zehn zu verwenden. Nach dem Auftauen wird das Verfahren durch die Programmierung des 96-Well-Shuttle-Systems, das für die Transfektion verwendet wird, eingeleitet.Führen Sie dazu die 96-Well-Shuttle-Software auf dem mit dem Shuttle verbundenen Computer über das Dateimenü oben links aus. Wählen Sie eine neue Parameterdatei aus. Markieren Sie die Vertiefungen, die auf dem angezeigten Schema der 96-Well-Platte transfiziert werden sollen.Eine grüne Box zeigt die ausgewählten Wells an. Wählen Sie das Programm aus, das der für die rohen 2 64 0,7-Zellen verwendeten Makrophagenzelllinie entspricht. Wählen Sie DS 1 36 aus, dann „select“ und „apply“.Beachten Sie, dass nach der Auswahl eines Programms die Vertiefungen in der schematischen Platte eingefärbt werden. Dunkelblaue leere Kreise kennzeichnen Vertiefungen, denen kein Programm zugewiesen wurde und die nicht elektrisch stimuliert werden. Bereiten Sie anschließend die Arbeitslösung für den Nukleoeffektor vor, indem Sie die SF-Zelllinien-96-Well-Nukleoeffektorlösung mit dem gesamten Inhalt des beigefügten Supplementrohrs mischen.Lassen Sie die gemischten Reagenzien bei Raumtemperatur equilibrieren. Erwärmen Sie D-M-E-M-R-P-M-I 1640 mit 0,25 % Trypsin-EDTA und PBS auf 37 Grad Celsius. Bereiten Sie das experimentelle S-I-R-N-A-P max GFP-Kontrollplasmid oder fluoreszenzmarkierte siRNAs vor, indem Sie sie auf Eis auftauen, um adhärente Makrophagen von den Zellkulturschalen zu lösen.Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit je 10 Milliliter PBS. Anschließend entfernen Sie den PBS und inkubieren die Zellen mit je einem Milliliter vorgewärmtem 0,25 %igem Trypsin-EDTA pro Platte, bis die Zellen beginnen, sich abzulösen. Dies dauert ein bis zwei Minuten.Tippen Sie vorsichtig auf die Platte und bewegen Sie die Lösung während der Inkubation, um die Trypsinisierung zu maximieren. Nachdem sich die Zellen gelöst haben, geben Sie neun Milliliter DMEM plus FBS hinzu und mischen vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Sammeln Sie anschließend die Zellen durch Pipettieren in ein steriles Röhrchen. Zählen Sie die Anzahl der isolierten Makrophagen mithilfe eines Hema-Zytometers.Erwarten Sie etwa 10 Millionen Makrophagen pro 10-Zentimeter-Platte. Berechnen Sie die Gesamtanzahl der Makrophagen, die benötigt wird; jede Vertiefung der 96-Loch-Platte benötigt 200.000 Zellen. Pipettieren Sie die berechnete Zellzahl in ein Zentrifugenröhrchen.Zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 150 G und Raumtemperatur in eine sterile 96-Well-Rundbodenplatte, wodurch die Vermischung erleichtert und der Reagenzverlust minimiert wird. Geben Sie zwei Mikroliter jeder IRNA in jedes zu transfectierende Loch. Beachten Sie, dass dies je nach Anzahl der siRNAs während des Makrophagen-Zentrifugationsschritts erfolgen kann.Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Elektroporation, wobei entscheidend ist, die Zellen sehr schonend zu behandeln und sehr schnell zu arbeiten. Sobald sich die Zellen in einer toxischen Transfektionslösung befinden, aspirations das Medium von den Zellen nach der Zentrifugation und resuspendieren Sie diese dann vorsichtig in der Nukleofektor-Lösung. SF unter Zusatz der Supplementlösung.Überführen Sie die Zellen unverzüglich mit einer Mehrkanalpipette in eine sterile Wanne und übertragen Sie 20 Mikroliter der resuspendierten Zellmischung in jede Vertiefung einer 96-Loch-Platte, die die siRNAs enthält, vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mischen. Danach übertragen Sie 20 Mikroliter der Zell-INA-Mischung in die 96-Loch-Nukleovektorplatte. Es ist entscheidend, die Bildung von Blasen während dieses Schritts zu vermeiden, da dies Fehler während der Nukleotransfektion verursachen kann.Nachdem alle experimentellen Proben in die Transfektionsplatte gegeben wurden, bedecken Sie diese mit dem beigefügten Deckel und klopfen sie sehr vorsichtig auf eine harte Oberfläche. Um eventuelle Blasen zu entfernen, stellen Sie die 96-Loch-Platte in den 96-Loch-Nukleofektor-Shuttle und wählen unten rechts auf dem Programmbildschirm „Upload und Start“. Befolgen Sie dann die Programmhinweise, um die Ergebnisse während des Nukleofektionsprozesses erfolgreich zu speichern.Transfizierte Wells werden auf dem 96-Well-Schema auf dem Bildschirm durch einen grünen Kreis mit einem Pluszeichen dargestellt. Ein roter Kreis mit einem Minuszeichen weist auf einen Fehler hin, der höchstwahrscheinlich auf Luftblasen oder das Pipettieren des falschen Reagenzvolumens unmittelbar nach der Nukleofizierung zurückzuführen ist. Geben Sie mithilfe einer Mehrkanalpipette 80 Mikroliter vorgewärmtes RPMI 1640 hinzu.Medium an die Seite jedes Wells geben. Das Medium langsam mit den transfizierten Zellen vermischen lassen, die in diesem Stadium sehr empfindlich sind. Zu schnelles Hinzufügen des Mediums verringert die Vitalität stark.Stellen Sie die 96-Well-Platte mit transfizierten Proben und RPMI 1640 für zwei oder mehr Minuten in einen 37 °C warmen Inkubator mit 5 % CO2. Es ist entscheidend, dass die Zellen sich vor weiteren Manipulationen erholen können. Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und überführen Sie vorsichtig die Mischung aus jedem Well mit einer Mehrkanalpipette in eine 96-Well-Zellkulturplatte.Danach erneut mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter DMEM mit FBS zu jedem hinzufügen. Die Zellen 24 bis 36 Stunden inkubieren, unmittelbar nach der Transfektion und Erholungsphase Durchflusszytometrie durchführen. Um die Transfektionseffizienz von fluoreszenzmarkiertem SI-RNA zu beurteilen, sollten am Tag nach der Transfektion mehr als 99 % der Zellen transfiziert sein. Für die Transfektionseffizienz des GFP-Plasmids sollten 30 bis 50 % der Zellen GFP exprimieren. Nach der 24- bis 36-stündigen Inkubation LPS oder andere Aktivatoren der angeborenen Immunität in frischem Medium vorbereiten und das LPS in DMEM mit FBS auf eine Endkonzentration von 20 Nanogramm pro Milliliter verdünnen.Entfernen Sie anschließend vorsichtig das Medium aus der 96-Well-Platte und geben Sie frisches Medium, das LPS enthält, zu den Zellen hinzu. Stellen Sie die Platte in einen Inkubator, um die Reaktion auf LPS oder andere Stimulatoren der angeborenen Immunität zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation zu überwachen. Pipettieren Sie das Überstandmedium der Zellen in eine 96-Well-Speicherplatte zur Analyse mittels ELISA.Nachdem das Überstand entfernt wurde, um die Zellviabilität zu überwachen, 100 Mikroliter einer 1:100-Verdünnung von Fluorescein-Diacetat in PBS in jede Vertiefung geben und bei Raumtemperatur eine bis fünf Minuten inkubieren. Die Fluoreszenz in den Zellen mittels eines Plattenlesegeräts überwachen, nachdem sie durch zelluläre Esterasen in lebenden Zellen gespalten wurde. Diese Verbindung wird fluoreszierend, um die Nützlichkeit dieses Ansatzes zur Überwachung der angeborenen Immunantwort zu veranschaulichen.siRNAs, die gegen bekannte Gene der angeborenen Immunregulation gerichtet sind, wurden in die Makrophagenzelllinie RAW 264.7 transfiziert. Die Zellen wurden anschließend mit LPS stimuliert, und die Produktion der proinflammatorischen Zytokine IL-6 und TNF-α wurde mittels ELISA überwacht, wie hier gezeigt.Hemmung des Toll-ähnlichen Rezeptors vier, des Rezeptors für LPS, jedoch nicht anderer TLRs. Unter Verwendung von SIR wurde eine stark verminderte Produktion von LPS-induziertem IL sechs und TNF alpha beobachtet. Beachten Sie, dass die Hemmung von IL sechs mittels irna die Produktion von IL sechs verringerte, jedoch keine Auswirkung auf die Produktion von TNF alpha hatte.Diese Daten deuten auf eine gute Wirksamkeit und Spezifität der siRNA-vermittelten Herunterregulation von Kandidatenregulatoren der angeborenen Immunität hin. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Schlüssel zu einer guten Transfektion und einer guten Zellrückgewinnung darin besteht, mit sehr gesunden Zellen zu arbeiten, sie während des Transfektions- und Rückgewinnungsprozesses schonend zu behandeln und schnell zu arbeiten, sobald sich die Zellen in einer Nukleofektionslösung befinden. Nach diesem Verfahren können viele andere Assays durchgeführt werden, einschließlich QPCR zur Überwachung der Genherunterregulation und zahlreicher weiterer Assays zur Untersuchung der angeborenen Immunantwort.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt einen Reporterzell-basierten Assay zum Screening potenzieller bioaktiver Nanopartikel, die die Signalübertragung des Toll-like-Rezeptors (TLR) hemmen. Der Assay beinhaltet die Einführung von Lipopolysacchariden (LPS), gemischt mit Peptid-Gold-Nanopartikel-Hybriden, in Reportermakrophagen, die die Reporterproteine exprimieren – sezernierte embryonale alkalische Phosphatase (SEAP) und Luciferase. Die Reduktion des LPS-induzierten TLR-Signals, das durch die Hybride vermittelt...

Ein Assay zum Screening bioaktiver Nanopartikel auf die Hemmung der Toll-like-Rezeptor-Signalgebung

Wir beschreiben ein Protokoll, um die antivirale Zytokin-Produktion in Mäusen mit einem Modell-Herpesvirus, murinen Gammaherpesvirus-68 (γ HV68) infiziert, die für die menschliche Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpesvirus (KSHV) und Epstein-Barr-Virus (EBV) eng verwandt ist, zu messen. Mit Hilfe genetisch veränderter Mausstämme und embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF), untersuchten wir die antivirale Zytokin-Produktion in vivo und ex vivo. "Reconstituting" den Ausdruck der angeborenen...

Zergliedern Angeborene Immunsystem Signaling in Viral Evasion von Zytokin-Produktion

Wir beschreiben hier ein einfaches Protokoll zur Isolierung von Maus-Peritonealmakrophagen. Diesem Verfahren folgt eine RNA-Extraktion, um eine Genexpressionsanalyse bei der Stimulation von Toll-like-Rezeptoren durchzuführen.

Isolierung von Murine Peritonealmakrophagen zur Durchführung Genexpressionsanalyse Nach Toll-like Rezeptoren Stimulation

Wir beschreiben die Erkennung des NLRP3-Inflammasome-Aktivierung auf zellulärer Basis mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Färbung für aktive Caspase-1 und den Adapter, ASC. Ein Laktat-Dehydrogenase-Release-Assay wird vorgestellt, um Pyroptotic Lyse auf Basis einer Bevölkerung zu erkennen. Diese Techniken können angepasst werden, um viele Aspekte der Inflammasome Biologie zu studieren.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Wir beschreiben eine Methode der Verwendung von Polyethyleneimine (PEI)-superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln für transfecting Makrophagen mit SiRNA beschichtet. Diese Nanopartikel können effizient SiRNA zu Makrophagen in Vitro und in Vivo und Stille Ziel Genexpression liefern.

Polyethyleneimine beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln als Vehikel für die Lieferung von kleinen interferierende RNA an Makrophagen In Vitro und In Vivo

Ein Ansatz ist für Echtzeit-Erkennung der angeborenen Immunantwort zu kutanen Verwundung und Staphylococcus Aureus Infektion der Mäuse beschrieben. Durch Vergleich LysM EGFP Mäuse (die fluoreszierenden Neutrophile besitzen) mit einem LysM EGFP immungeschwächte Maus Sorte gekreuzt, wir vorab unser Verständnis der Infektion und der Entwicklung von Ansätzen zur Bekämpfung der Infektion.

Ein Mausmodell zu beurteilen, angeborene Immunantwort auf Staphylococcus Aureus -Infektion

Makrophagen, insbesondere primäre Makrophagen, sind eine Herausforderung zu transfetieren, da sie sich auf die Detektion von Molekülen ohne Selbstherkunft spezialisieren. Wir beschreiben ein Protokoll, das eine hocheffiziente Transfektion von primären Makrophagen mit mRNA ermöglicht, die aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden generiert werden.

Hocheffiziente Transfektion von primärer Makrophagen mit In Vitro transscribed mRNA

Um die Wirkung eines Chemokins auf die Makrophagenrekrutierung in vivo zu testen, wurde die gesamte Mount-in-situ-Hybridisierung verwendet, um die ektopische Expression des Chemokins zu erkennen, und Immunstaining wurde verwendet, um Makrophagen zu kennzeichnen. Live-Bildgebung wurde für die Echtzeitbeobachtung der Makrophagenmigration verwendet.

Ein ektopisches Chemokin-Expressionsmodell zum Testen der Makrophagenrekrutierung in Vivo

Dieses Protokoll bietet Forschern eine schnelle, indirekte Methode zur Messung der TLR-abhängigen NF--B/AP-1-Transkriptionsfaktoraktivität in einer murinen Makrophagenzelllinie als Reaktion auf eine Vielzahl von polymeren Oberflächen und adsorbten Proteinschichten, die die Mikroumgebung des Biomaterials Implantate modellieren.

Ein Makrophagen-Reporter-Zell-Assay zur Untersuchung der toll-like Receptor-vermittelten NF-kB/AP-1-Signalisierung auf adsorbierten Proteinschichten auf polymeren Oberflächen

Wir demonstrieren ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Untersuchung der Genfunktion in peritonealen Gewebe-residenten Makrophagen in vivo unter Verwendung lentiviraler Vektoren.

Lentivirale Vektorpräparation für die effiziente Gen- und microRNA-Modulation von geweberesidenten Makrophagen in der Bauchhöhle in vivo bei Mäusen

Lernen Sie die RNA-Interferenz in murinen Makrophagen mittels Amaxa-Nucleofector-System zur Untersuchung der angeborenen Immunantwort. Diese Methode ermöglicht hochdurchsatzfähige Genfunktionsanalysen.

Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen

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