Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mithilfe von RNA-Interferenzen die Wirkung von Kandidatengenen auf die angeborene Immunantwort zu untersuchen. In Mausmakrophagen werden zu diesem Zweck Maus-Makrophagen-Zelllinien tryps-inisiert und mit Transfektionslösung und den interessierenden SI-RNAs kombiniert, das Gemisch wird dann auf eine 96-Well-Nukleo-VETE-Platte übertragen und ein Maxa 96-Well-Transfektionssystem wird verwendet, um siRNA in die Makrophagen zu transfizieren und nach einer Inkubation mit Zellkultur, Medium, LPS oder andere Aktivatoren der angeborenen Immunität werden auf die transfizierten Makrophagen aufgebracht, um sie zu stimulieren. Schließlich werden Eliza-Messungen durchgeführt, um die Zytokinproduktion zu überwachen und die Wirkung der siRNA-Behandlung auf die angeborene Immunantwort zu beurteilen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der lipidvermittelten Transfektion besteht darin, dass unser Assay robust ist und auf viele Gene im Hochdurchsatzbereich angewendet werden kann. Der Schlüssel zu dieser Methode liegt darin, mit gesunden Zellen zu arbeiten, sie schonend zu behandeln und während des Transfektionsprozesses effizient zu arbeiten. Wie wir zeigen werden, verwendet dieses Protokoll die rohe 2 64 0,7 Maus-Makrophagenzelllinie, die wie im Begleitdokument beschrieben kultiviert wird.

In Vorbereitung auf die INA-Transfektionsplatte werden die Zellen bei 20 % Co-Flüssigkeit gehalten und wachsen ein bis zwei Tage, bis die Zellen nicht mehr als 80 % konfluent sind. Es ist wichtig, daran zu denken, Zellen zu verwenden, die sich zwischen den Passagen drei und 10 befinden. Beginnen Sie diesen Vorgang nach dem Auftauen, indem Sie das 96-Well-Shuttle-System programmieren, das für die Transfektion verwendet wird.

Starten Sie dazu die 96-Well-Shuttle-Software auf dem Computer, der mit dem Shuttle verbunden ist, über das Dateimenü oben links. Wählen Sie eine neue Parameterdatei aus. Markieren Sie die Wells, die transfiziert werden, im angezeigten Schema der 96-Well-Platte.

Ein grünes Feld zeigt die ausgewählten Bohrlöcher an. Wählen Sie das Programm, das der Makrophagen-Zelllinie entspricht, die für rohe 2 64 0,7 Zellen verwendet wird. Wählen Sie DS 1 36 und wählen Sie Anwenden.

Beachten Sie, dass nach der Auswahl eines Programms die Vertiefungen auf der Schaltplanplatte eingefärbt werden. Dunkelblaue leere Kreise kennzeichnen Bohrlöcher, denen kein Programm zugewiesen wurde und die keinen Stromschlag erleiden. Als nächstes bereiten Sie die funktionierende Nukleoeffektorlösung vor, indem Sie die 96-Well-Nukleoeffektorlösung der SF-Zelllinie mit dem gesamten Inhalt des mitgelieferten Ergänzungsröhrchens mischen.

Lassen Sie die gemischten Reagenzien bei Raumtemperatur äquilibrieren. Erwärmen Sie das D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0,25 %-Auslöser in EDTA und PBS bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie die experimentellen S-I-R-N-A-P max-GFP-Kontrollplasmide oder fluoreszenzmarkierten siRNAs vor, indem Sie sie auf Eis auftauen, um adhärente Makrophagen von den Zellkulturschalen zu lösen.

Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 Millilitern PBS. Nach Entfernen des PBS inkubieren Sie die Zellen mit einem Milliliter vorgewarntem 0,25%-Tripsin EDTA pro Platte, bis sich die Zellen abzulösen beginnen. Dies dauert ein bis zwei Minuten.

Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte und bewegen Sie die Lösung während der Inkubation, um die Trypsinisierung zu maximieren. Nachdem sich die Zellen abgelöst haben, fügen Sie neun Milliliter DMEM plus FBS-Mischung hinzu, indem Sie auf und ab pipettieren, und sammeln Sie die Zellen dann, indem Sie sie in ein steriles Röhrchen pipettieren. Zählen Sie die Anzahl der isolierten Makrophagen mit einem Häma-Zytometer.

Rechnen Sie mit etwa 10 Millionen Makrophagen pro 10 Zentimeter großer Platte. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Makrophagen, die pro Vertiefung auf dem 96-Well-Shuttle benötigt werden, um 200.000 Zellen zu erreichen. Pipettieren Sie die berechnete Anzahl der Zellen in ein Zentrifugenröhrchen.

Schleudern Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 150 g bei Raumtemperatur auf eine sterile runde Bodenplatte mit 96 Vertiefungen, die das Mischen erleichtert und gleichzeitig den Reagenzienverlust minimiert. Geben Sie zwei Mikroliter jeder IRNA in jede Vertiefung, die transfiziert werden soll. Beachten Sie, dass dies abhängig von der Anzahl der siRNAs während des Makrophagen-Zentrifugationsschritts erreicht werden kann.

Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Elektroporation, die Schlüssel, die die Zellen sehr schonend behandeln und sehr schnell wirken. Sobald sich die Zellen in einer toxischen Transfektionslösung befinden, aspirieren Sie das Medium aus den Zentrifugenzellen und resuspendieren Sie sie dann vorsichtig in einer Nukleoeffektorlösung. SF, die die Ergänzungslösung enthält.

Übertragen Sie die Zellen sofort mit einer Mehrkanalpipette in einen sterilen Trog und übertragen Sie 20 Mikroliter der resuspendierten Zellmischung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte, die die siRNAs enthält, die durch Auf- und Abpipettieren vorsichtig gemischt werden. Als nächstes werden 20 Mikroliter des Zell-INA-Gemischs in die 96-Well-Nukleo-Platte überführt. Es ist wichtig, die Bildung von Blasen während dieses Schritts zu vermeiden, da dies zu Fehlern während der Zellkernbefall führen kann.

Nachdem Sie alle experimentellen Proben in die Transfektionsplatte gelegt haben, decken Sie diese mit dem mitgelieferten Deckel ab und klopfen Sie sehr vorsichtig auf eine harte Oberfläche. Um Blasen zu entfernen, setzen Sie die 96-Well-Platte in das 96-Well-Nukleo-Effektor-Shuttle ein und wählen Sie unten rechts auf dem Programmbildschirm Hochladen und Starten aus. Folgen Sie dann der Programmaufforderung, um die Ergebnisse während des erfolgreichen Wells des Nukleo-Affektionsprozesses zu speichern.

Transfiziert wird auf dem 96-Well-Schaltplan auf dem Bildschirm durch einen grünen Kreis mit einem Pluszeichen dargestellt. Ein roter Kreis mit einem Minuszeichen weist auf einen Fehler hin, der höchstwahrscheinlich auf Blasen oder das Pipettieren des falschen Volumens von Reagenzien unmittelbar nach der Nukleoaffektion zurückzuführen ist. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 80 Mikroliter RPMI 1640 vor der Erwärmung hinzuzufügen.

Mittel seitlich von jedem. Lassen Sie das Medium langsam mit den transfizierten Zellen vermischen, die in diesem Stadium sehr empfindlich sind. Eine zu schnelle Zugabe des Mediums verringert die Lebensfähigkeit erheblich.

Legen Sie die 96-Well-Platte mit den transfizierten Proben und RPMI 1640 für zwei oder mehr Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % CO2. Es ist wichtig, dass sich die Zellen erholen können, bevor sie weiter manipuliert werden. Nachdem Sie die Platte aus dem Inkubator genommen haben, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die Mischung aus jeder Vertiefung vorsichtig in eine 96-Well-Gewebekulturplatte zu übertragen.

Andererseits können Sie mit der Mehrkanalpipette jeweils 100 Mikroliter DMEM mit FBS hinzufügen. Unmittelbar nach der Transfektion und Genesung 24 bis 36 Stunden lang gut inkubieren und eine Durchflusszytometrie durchführen. Um die Transfektionseffizienz von fluoreszenzmarkierter SI irna zu beurteilen, sollten mehr als 99 % der Zellen am Tag nach dem Transfektionsassay transfiziert werden. Für die Transfektionseffizienz des GFP-Plasmids sollten 30 bis 50 % der Zellen GFP exprimieren. Nach der 24- bis 36-stündigen Inkubation bereiten Sie LPS oder andere Aktivatoren der angeborenen Immunität in frischem Medium vor und verdünnen Sie das LPS auf eine Endkonzentration von 20 Nanogramm pro Milliliter in DMEM mit FBS.

Aspirieren Sie dann vorsichtig das Medium aus der 96-Well-Platte und geben Sie das frische Medium mit dem LPS in die Zellen. Legen Sie die Platte in einen Inkubator, um die Reaktion auf LPS oder andere Stimulatoren der angeborenen Immunität zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation zu überwachen. Pipettieren Sie den Überstand aus den Zellen in eine 96-Well-Speicherplatte, um von Eliza analysiert zu werden.

Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu überwachen, fügen Sie 100 Mikroliter eines bis 100 Fluoresceindiacetats in PBS hinzu, um jede Vertiefung ein bis fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren. Überwachen Sie die Fluoreszenz in den Zellen mit einem Plattenleser, wenn sie durch zelluläre Esterasen in lebenden Zellen gespalten wird. Diese Verbindung wird fluoreszierend, um den Nutzen dieses Ansatzes für die Überwachung der angeborenen Immunantwort zu verdeutlichen.

siRNAs, die auf bekannte angeborene immunregulatorische Gene abzielen, wurden in die rohe 2 64 0,7 Makrophagen-Zelllinie transfiziert. Die Zellen wurden dann mit LPS und der Produktion der proinflammatorischen Zytokine stimuliert. IL six und TNF alpha wurden von Eliza überwacht, wie hier gezeigt.

Hemmung des Toll-like-Rezeptors vier, des Rezeptors für LPS, aber nicht für andere TLRs. Unter Verwendung von SIR induzierte eine stark verminderte Produktion von LPS IL sechs und TNF alpha. Es ist zu beachten, dass die Hemmung von IL six mit irna die IL six-Produktion verringerte, aber die TNF-alpha-Produktion nicht beeinflusste.

Diese Daten deuten auf eine gute Wirksamkeit und eine gute Spezifität des siRNA-vermittelten Knockdowns von Kandidatenregulatoren der angeborenen Immunität hin. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Schlüssel zu einer guten Transfektion und einer guten Zellrückgewinnung darin besteht, mit sehr gesunden Zellen zu arbeiten, sie während des Transfektions- und Erholungsprozesses sanft zu behandeln und schnell zu arbeiten, sobald sich die Zellen in einer Nukleoeffektorlösung befinden. Nach diesem Verfahren können viele weitere Assays durchgeführt werden, darunter QPCR zur Überwachung des Gen-Knockdowns und viele andere Assays zur Untersuchung der angeborenen Immunantwort.